專(zhuān)利名稱：具有改良生長(zhǎng)特性的植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于改良植物生長(zhǎng)特性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)增加植物莖干組織中E2F二聚化配偶體(DP)編碼基因的表達(dá)和/或通過(guò)增加植物莖干組織中DP蛋白質(zhì)的活性來(lái)改良植物生長(zhǎng)特性的方法。本發(fā)明還涉及在莖干優(yōu)選的控制元件控制下的DP編碼基因轉(zhuǎn)化的植物，相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，該植物具有改良的生長(zhǎng)特性。
由于世界人口的持續(xù)增加，提高農(nóng)業(yè)效率一直是研究的主要目標(biāo)。農(nóng)作物和園藝改良的常規(guī)手段利用選育技術(shù)來(lái)鑒定具有期望特性的植物。然而，這種選育技術(shù)具有若干缺點(diǎn)，即這些技術(shù)一般是勞動(dòng)密集型的，而且產(chǎn)生通常含有異質(zhì)遺傳組分的植物，這并非總是產(chǎn)生自親本植物傳遞過(guò)來(lái)的期望性狀。相反，分子生物學(xué)的發(fā)展已經(jīng)使人們能夠更精確地操作植物的種質(zhì)。植物的基因工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(通常以DNA或RNA的形式)和繼之將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入植物。這類(lèi)技術(shù)導(dǎo)致具有多種改良的經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)藝學(xué)或園藝性狀的植物的開(kāi)發(fā)。具體的目標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀包括高的產(chǎn)量和生物量。
改良一種或多種植物生長(zhǎng)特性的能力將在農(nóng)作物改良、植物育種、觀賞植物的生產(chǎn)、樹(shù)木栽培、園藝、林學(xué)以及在藻類(lèi)或植物的生產(chǎn)領(lǐng)域具有多種應(yīng)用(用作生物反應(yīng)器，例如用于藥物如抗體或疫苗的生產(chǎn)，或用于有機(jī)廢物的生物轉(zhuǎn)化，或在高產(chǎn)的藻類(lèi)和植物的實(shí)例中用作燃料)。
相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，已發(fā)現(xiàn)在植物莖干組織中，DP編碼基因表達(dá)的增加和/或DB蛋白質(zhì)活性的增加使植物具有改良的生長(zhǎng)特性。
DP蛋白質(zhì)是廣泛保守的蛋白質(zhì)并且涉及細(xì)胞周期的控制(Gutierrez等人(2002)Current Opinion in Plant Biology 5480-486)。DP因子與E2F因子一起作用，形成能夠起始S期特異基因轉(zhuǎn)錄的異二聚體。Magyar等人，2000(FEBS letters，48679-97)報(bào)道了E2F因子、DP因子和E2F-DP樣(DEL)因子的鑒別?；谛蛄斜容^，如Vandepoele等人，2002(Plant Cell14(4)903-16，在此處完整引入作為參考)所述，將編碼這些蛋白質(zhì)的擬南芥屬(Arabidopsis)基因劃分為不同的種類(lèi)。此外，由Magyar等人報(bào)道(在此處也完整引入作為參考)了典型DP蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性。例如，Magyar等人的圖3A和B顯示在擬南芥DP蛋白質(zhì)中特征性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域的位置。Vandepoele等人的圖5很好地說(shuō)明由于存在一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域，DP蛋白質(zhì)與相關(guān)的蛋白質(zhì)，如E2F因子和DEL不相同。
以Pioneer Hi-Bred之名公布的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO00/47614表明使用組織特異性或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子控制DP表達(dá)提供不同的生長(zhǎng)特性。具體而言，其表明(i)使用種子特異性啟動(dòng)子將刺激細(xì)胞分裂速率，產(chǎn)生增加的種子生物量；(ii)使用強(qiáng)表達(dá)的早期雄花穗特異性啟動(dòng)子將增加這一完整生殖結(jié)構(gòu)的發(fā)育；和(iii)使用根特異性啟動(dòng)子將產(chǎn)生更大的根和更快的生長(zhǎng)(即更多的生物量積累)。然而，在該申請(qǐng)中沒(méi)有產(chǎn)生或例證具有這類(lèi)不同生長(zhǎng)特性的植物。
后來(lái)以Consejo Superior De Investigaciones Cientificas為名申請(qǐng)的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO01/21644僅表明可以通過(guò)重組DP的表達(dá)控制植物生長(zhǎng)，而沒(méi)有例證。盡管陳述“特別有用的是使用組織特異性啟動(dòng)子或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制表達(dá)的核酸”，沒(méi)有提到或例證使用這類(lèi)核酸轉(zhuǎn)化并且具有改良生長(zhǎng)特性的植物的應(yīng)用。
盡管存在上述啟示，使用現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)還沒(méi)有產(chǎn)生改良的轉(zhuǎn)基因植物，其說(shuō)明如現(xiàn)有技術(shù)所啟示的，使用DP在改良植物生長(zhǎng)特性中是無(wú)效的。
出人意料地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)增加植物莖干組織中DP蛋白質(zhì)的活性和/或通過(guò)增加DP編碼基因在植物莖干組織中的表達(dá)來(lái)改良植物生長(zhǎng)特性。
本發(fā)明提供相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，用于改良植物生長(zhǎng)特性的方法，其包括特別在植物莖干組織中增加DP蛋白質(zhì)或其同源物活性和/或在植物莖干組織中增加DP編碼基因或其功能變體的表達(dá)。
有利地，相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，本發(fā)明方法的操作使植物具有多種改良的生長(zhǎng)特性，特別是增加的生物量。所述改良的生長(zhǎng)特性可以是穩(wěn)定的并且可以遺傳至下一代。
術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)特性”在下文詳述的關(guān)于生長(zhǎng)的其他特性中包括增加的生物量。
術(shù)語(yǔ)“生物量”指產(chǎn)生的生物物質(zhì)的量。生物量的增加可以是在相對(duì)于對(duì)應(yīng)的參考植物的生物量(例如相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物的生物量)的植物的一個(gè)或多個(gè)部分。本發(fā)明植物的特征在于增加的地上生物量，其對(duì)于農(nóng)作物植物的營(yíng)養(yǎng)組織生長(zhǎng)特別重要。例如，對(duì)于青貯飼料玉米，典型的經(jīng)濟(jì)價(jià)值參數(shù)是地上生物量和葉的能量含量；對(duì)于樹(shù)和甘蔗，典型的經(jīng)濟(jì)價(jià)值參數(shù)是莖的地上生物量。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“增加的生物量”還可以包括增加的產(chǎn)量，特別是增加的種子產(chǎn)量。
本文所定義的術(shù)語(yǔ)“增加的產(chǎn)率”意指相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，在如下的一個(gè)或多個(gè)方面的增加(i)植物一個(gè)或多個(gè)部分增加的生物量(重量)，特別是地上(可收獲)部分，增加的根生物量或增加的任何其他可收獲部分的生物量，(ii)增加的種子產(chǎn)率，其可能源于增加的種子生物量(粒重)，可以是每株植物粒重的增加或單個(gè)種子基礎(chǔ)上的增加，并且所述粒重的增加可以是因改變的種子大小所致，如種子長(zhǎng)度和/或種子寬度和/或種子面積；(iii)增加的(飽滿)種子數(shù)；(iv)增加的種子大小，其還可以影響種子的組成；(v)增加的種子體積，這也可能影響種子的組成；(vi)增加的收獲指數(shù)，其可以表達(dá)為可收獲部分如種子的產(chǎn)量占總生物量的比率；和(vii)增加的千籽粒重(TKW)，其是從所計(jì)的飽滿種子數(shù)和它們的總重量推斷的。增加的TKW可能源于增加的種子大小和/或粒重。
以玉米為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為以下一個(gè)或多個(gè)方面每公頃或每英畝植物數(shù)的增加、每株植物穗的增加、畦數(shù)、每畦種子數(shù)、粒重、千籽粒重、穗長(zhǎng)度/直徑的增加。以稻為例，產(chǎn)量的增加可以表現(xiàn)在下列的一個(gè)或多個(gè)方面的增加每公頃或每英畝的植物數(shù)、每株植物圓錐花序數(shù)、每個(gè)圓錐花序的小穗數(shù)、每個(gè)圓錐花序的花數(shù)、種子飽滿率的增加、千籽粒重的增加等等。產(chǎn)量的增加還可以產(chǎn)生改變的構(gòu)造或可以作為改變的構(gòu)造的結(jié)果發(fā)生。
因?yàn)楸景l(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)率，相對(duì)于處于其生活周期的相應(yīng)階段的對(duì)應(yīng)野生型植物的生長(zhǎng)速率而言，這些植物很可能顯示出增加的生長(zhǎng)速率(在它們至少部分的生活周期期間)。增加的生長(zhǎng)速率可以是植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)特異性的，或可以基本存在于整個(gè)植物中。具有增加的生長(zhǎng)速率的植物甚至可以呈現(xiàn)提早開(kāi)花。生長(zhǎng)速率的增加可以發(fā)生在植物生命周期的一個(gè)或多個(gè)階段或基本在整個(gè)植物生命周期中。在植物生命周期中早期增加的生長(zhǎng)速率可以反映增強(qiáng)的活力。生長(zhǎng)速率的增加可以改變植物的收獲周期，使得植物能夠比可能的情形更晚播種和/或更早收獲。如果生長(zhǎng)速率充分增加，可能允許播種相同植物物種的更多種子(例如播種和收獲稻類(lèi)植物，接著播種和收獲更多的稻類(lèi)植物，所有這些都在一個(gè)常規(guī)的生長(zhǎng)期內(nèi))。類(lèi)似地，如果生長(zhǎng)速率充分增加，可能允許播種不同植物物種的更多種子(例如播種和收獲稻類(lèi)植物，接著，例如，播種和任選地收獲大豆、馬鈴薯或任何其它合適的植物)。在一些植物的情形下從同一根莖收獲增加的次數(shù)也是可能的。改變植物的收獲周期可能導(dǎo)致每英畝年生物量產(chǎn)量的增加(由于(比方說(shuō)在一年里)任何特定植物生長(zhǎng)和收獲的次數(shù)增加)。與野生型相似物相比，生長(zhǎng)速率的增加還可以使能夠在更廣闊的地域栽培轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)榉N植作物的地域限制通常由種植時(shí)(早季)或收獲時(shí)(晚季)不利的環(huán)境條件所決定的。如果縮短收獲周期，可以避免這類(lèi)不利條件。可以通過(guò)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)繪生長(zhǎng)曲線得到多個(gè)參數(shù)來(lái)確定生長(zhǎng)速率，這類(lèi)參數(shù)可以是T-Mid(植株達(dá)到其最大大小的50％所需的時(shí)間)和T-90(植物達(dá)到其最大大小的90％所需的時(shí)間)等等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)特性”還包括植物構(gòu)造。本發(fā)明的植物呈現(xiàn)改變的構(gòu)造，其為由于增加的生物量而表現(xiàn)出的地上部分改變的形狀和尺寸。這一特性對(duì)于多種觀賞植物是有利的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“構(gòu)造”包括植物的外觀或形態(tài)，包括任何一種或多種結(jié)構(gòu)特性或結(jié)構(gòu)特性的組合，所述結(jié)構(gòu)特性如植物的細(xì)胞、組織、器官或植物的細(xì)胞、組織或器官的組的形狀、尺寸、數(shù)量、位置、質(zhì)地、排列和模式。特別優(yōu)選的是具有下列任一項(xiàng)或多項(xiàng)的植物增加的分蘗(或相應(yīng)的植物部分)的數(shù)量、尺寸、形狀；增加的枝條和/或葉的數(shù)量。
在植物處于無(wú)脅迫條件，或植物相對(duì)于對(duì)照植物暴露于多種脅迫下發(fā)生任何前述生長(zhǎng)特性的改良。植物通常通過(guò)更為緩慢地生長(zhǎng)來(lái)應(yīng)答暴露的脅迫。在嚴(yán)重脅迫的條件中，植物甚至可以完全停止生長(zhǎng)。另一方面，中等脅迫在本文中定義為當(dāng)植物暴露于此而不導(dǎo)致植物完全停止生長(zhǎng)的任何脅迫。由于耕作方法(灌溉、施肥、殺蟲(chóng)劑處理)的進(jìn)展，栽培的農(nóng)作物植物常常不會(huì)遭遇到嚴(yán)重脅迫。因此，中等脅迫誘導(dǎo)的受損的生長(zhǎng)經(jīng)常是農(nóng)業(yè)上的不理想特性。中等脅迫是植物可能接觸的典型脅迫。這些脅迫可以是植物可以被暴露于其的日常生物的和/或非生物的(環(huán)境的)脅迫。典型的非生物或環(huán)境脅迫包括由反常的熱或冷/冰凍溫度產(chǎn)生的溫度脅迫；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過(guò)量的水)。非生物脅迫還可以由化學(xué)藥品產(chǎn)生。生物脅迫一般是由病原體，如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲(chóng)產(chǎn)生的那些脅迫。
在多種植物物種可以有利地修飾上述生長(zhǎng)特性。
本文所用得術(shù)語(yǔ)“植物”包括整個(gè)植物、植物和部分植物的祖先和后代，包括種子、莖干、莖、根(包括塊莖)以及植物細(xì)胞、組織和器官。術(shù)語(yǔ)“植物”還因此包括懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)、胼胝體組織、葉、種子、根、莖干、配子體、孢子體、花粉和小孢子。在本發(fā)明的方法中特別有用的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，特別是單子葉和雙子葉植物，包括選自如下物種的飼料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木金合歡屬物種(Acacia spp.)、槭樹(shù)屬物種(Acerspp.)、獼猴桃屬物種(Actinidia spp.)、七葉樹(shù)屬物種(Aesculus spp.)、新西蘭貝殼杉(Agathis australis)、Albizia amara、Alsophila tricolor、須芒草屬物種(Andropogon spp.)、落花生屬物種(Arachis spp.)、檳榔(Arecacatechu)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、Baikiaea plurijuga、樺木屬(Betula spp.)、蕓苔屬(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫鉚(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱纓花屬物種(Calliandra spp.)、大葉茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬物種(Capsicum spp.)、決明屬物種(Cassia spp.)、距豌豆(Centroemapubescens)、木瓜屬物種(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、變異小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂屬物種(Crataegus spp.)、香瓜屬物種(Cucumis spp.)、柏木屬物種(Cupressus spp.)、Cyatheadealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅屬物種(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、榅桲(Cydoniaoblonga)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(bǔ)(Davallia divaricata)、山馬蟥屬物種(Desmodium spp.)、粗糙蚌貝蕨(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、鐮扁豆屬物種(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartia spp.、穇子(Eleusinecoracana)、畫(huà)眉草屬物種(Eragrestis spp.)、刺桐屬物種(Erythrina spp.)、桉屬物種(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、蕎麥屬物種(Fagopyrum spp.)、費(fèi)約果(Feijoa sellowiana)、草莓屬物種(Fragariaspp.)、千斤拔屬物種(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geraniumthunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺屬物種(Grevillea spp.)、Guibourtiacoleosperma、巖黃芪屬物種(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthiaaltissima)、扭黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小連翹(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭藍(lán)(Indigo incarnata)、鳶尾屬物種(Iris spp.)、Leptarrhenapyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaenaleucocephala、Loudetia simplex、羅頓豆(Lotonus bainesii)、百脈根屬物種(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、蘋(píng)果屬物種(Malus spp.)、Manihotesculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、粉芭蕉(Musa sapientum)、煙草屬物種(Nicotianum spp.)、驢食豆屬物種(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻屬物種(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬物種(Pennisetum spp.)、Perseagratissima、碧冬茄屬物種(Petunia spp.)、菜豆屬物種(Phaseolus spp.)、檳榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠屬物種(Photiniaspp.)、白云杉(Picea glauca)、松屬物種(Pinus spp.)、豌豆(Pisumsativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬物種(Populus spp.)、牧豆樹(shù)(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、歐洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子屬物種(Ribes spp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosa spp.)、懸鉤子屬物種(Rubus spp.)、柳屬物種(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitysverticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendrongiganteum)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶屬物種(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、車(chē)軸草屬物種(Trifolium spp.)、小麥屬物種(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔屬物種(Vacciniumspp.)、野豌豆屬物種(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、錐穗沃森花(Watsonia pyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zeamays)、莧菜、洋薊、蘆筍、椰菜、孢子甘藍(lán)、卷心菜、油菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣綠甘藍(lán)、亞麻、羽衣甘藍(lán)、小扁豆、油料種子油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、squash tea、樹(shù)、草(包括飼料草)和藻類(lèi)等。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特性，植物是農(nóng)作物植物，如浮游植物、大豆、向日葵、油菜、油菜籽、棉花、苜蓿、番茄、土豆、萵苣、煙草、木瓜、南瓜、楊樹(shù)、桉樹(shù)、松樹(shù)、leguminosa、亞麻、lupinus和高梁。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述植物是單子葉植物，如甘蔗、洋蔥或竹子。進(jìn)一步優(yōu)選的植物是谷類(lèi)，如稻、玉米(包括飼料玉米)、小麥、大麥、粟、燕麥和黑麥。
術(shù)語(yǔ)“DP”意指E2F二聚化配偶體。如名稱所示，DP蛋白質(zhì)能夠與E2F/DEL轉(zhuǎn)錄因子二聚化。這可以通過(guò)，例如，如Magyar等人，2000(FEBSletters，48679-97)所述的雙雜交測(cè)定或通過(guò)免疫沉淀檢測(cè)。Magyar等人報(bào)道了典型的DP蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，其在此處完整引入作為參考。例如，Magyar等人的圖3A和B顯示在擬南芥DP蛋白質(zhì)中的特征性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域的位置。Vandepoele等人，2002(Plant Cell 14(4)903-16)的圖5很好地說(shuō)明由于存在一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域，DP蛋白質(zhì)與相關(guān)的蛋白質(zhì)，如E2F因子和DEL不相同。圖3顯示在擬南芥(Arabidopsis thaliana)DPb序列中這些結(jié)構(gòu)域的位置。本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于可獲得的知識(shí)將能夠容易地鑒別DP蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特性，DP蛋白質(zhì)由SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 2的同源物代表這類(lèi)同源物的具體實(shí)例包括Magyar等人2000(FEBS，486(1)79-87)所述的擬南芥DP蛋白質(zhì)、Ramirez-Parra和Gutierrrez，2000(FEBS，86(1)73-8)所述的普通小麥(Triticum aestivum)DP蛋白質(zhì)和以Du Pont名稱公布的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO99/53075中的鳳仙花屬(Impatiens)、大豆和玉米的DP蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，本文所定義的DP蛋白質(zhì)或其同源物指與DP蛋白質(zhì)，例如，與SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23中任一個(gè)具有一定的序列同一性的多肽，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
如Vandepoele等人，2002(Plant Cell 14(4)903-16)所示，可以將擬南芥的DP蛋白質(zhì)細(xì)分為兩個(gè)不同類(lèi)別，DPa和DPb。本文所用的術(shù)語(yǔ)“同源物”也包括兩類(lèi)成員。在本發(fā)明的方法中可以方便地使用這些不同類(lèi)別的DP蛋白質(zhì)或其編碼核酸。
用于本發(fā)明方法中的DP核酸或DP蛋白質(zhì)優(yōu)選獲自從植物，優(yōu)選來(lái)自雙子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自十字花科(Brassicaceae)，更加優(yōu)選地來(lái)自擬南芥(Arabidopsis thaliana)。根據(jù)另一實(shí)施方案，DP多肽是DPb多肽。“DPb”指相對(duì)于AtDPa更接近于AtDPb的蛋白質(zhì)。可以如下文所述通過(guò)計(jì)算序列同一性百分?jǐn)?shù)，或者通過(guò)建立保守基序的存在來(lái)將查詢序列分類(lèi)為DPa或是DPb。鑒別查詢序列為DPa或DPb的另一方法是將查詢序列導(dǎo)入系統(tǒng)樹(shù)，如在圖5所示的那個(gè)。相對(duì)于AtDPa，DPb蛋白質(zhì)應(yīng)該聚類(lèi)更接近于AtDPb。
用于本發(fā)明方法中優(yōu)選的DP多肽或同源物是與DP蛋白質(zhì)，例如，與SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23代表的DP蛋白質(zhì)中任一個(gè)具有一定序列同一性的那些，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％?？梢越?jīng)由一般存在于所有DP蛋白質(zhì)中的保守區(qū)計(jì)算百分?jǐn)?shù)同一性。這一區(qū)域從殘基CEKVES(如從SEQ ID NO2的位置111)附近開(kāi)始至FVLKTM(如，到SEQ ID NO 2的位置290)附近；見(jiàn)圖3。
在DP蛋白質(zhì)亞類(lèi)中有三個(gè)基序是特別保守的，所述亞類(lèi)包括擬南芥的DPb。在這里由SEQ ID NO 9(基序1，LDIXXDDA)、SEQ ID NO 10(基序2，KKKK/RR)和SEQ ID NO 11(基序3，AXGXDK)代表這些“DPb”基序的共有序列(見(jiàn)圖3)。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法中使用的DP多肽或同源物中存在這些基序。圖3顯示具有“DPb”基序位置的DP蛋白質(zhì)的比對(duì)。由該比對(duì)所見(jiàn)，精制共有序列是可能的。例如，在基序1的位置4有Q或H殘基的高概率，并且在位置5有G或A殘基的高概率。同樣地，在基序3的位置2有V、T或A殘基的高概率，并且在位置4有P或A殘基的高概率。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到SEQ ID NO 9、10或11所代表的DPb基序，其可以通過(guò)例如1或2個(gè)錯(cuò)配與共有的DPb基序而不同，但沒(méi)有任何功能損失。
還可以使用上述新鑒別的“DPb”基序搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，并鑒別同源的DPb多肽和編碼序列。
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、基序和盒的鑒別在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)將是容易做到的。可以通過(guò)PRODOM(http//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/jj/prodomsrchjj.html)、PIR(http//pir.georgetown.edu/)、PROSITE(http//au.expasy.org/PROSITE/)或pFAM(http//pFAM.wustl.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域信息。為這類(lèi)結(jié)構(gòu)域搜索而設(shè)計(jì)的軟件程序包括，但不限于MotifScan、MEME、SIGNALSCAN和GENESCAN。MotifScan是優(yōu)選的軟件程序并且可獲自http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN，該程序使用PROSITE和pFAM的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域信息。MEME算法(版本3.0)可以在GCG程序包或在http//www.sdsc.edu/MEME/meme找到。SIGNALSCAN版本4.0可獲自http//biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html。GENESCAN可在http//gnomic.stanford.edu/GENESCANW.html找到。
DP多肽或同源物可以在(公共的)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中找到。DP蛋白質(zhì)同源物在序列數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)和鑒別的方法是本領(lǐng)域公知的。這些方法涉及使用由本發(fā)明提供的序列，例如SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23(或SEQ ID NO 1)篩選序列數(shù)據(jù)庫(kù)。用于序列比對(duì)和比較的不同的搜索算法和軟件是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。優(yōu)選使用計(jì)算序列同一性百分比并進(jìn)行序列之間相似性統(tǒng)計(jì)分析的BLAST軟件。被稱為BLAST程序的程序組具有5個(gè)不同的執(zhí)行程序三個(gè)為核苷酸序列查詢而設(shè)計(jì)(BLASTN、BLASTX和TBLASTX)，兩個(gè)為蛋白質(zhì)序列查詢而設(shè)計(jì)(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，Trends in Biotechnology76-80，1994；Birren等人，GenomeAnalysis，1543，1997)。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可以公開(kāi)獲自生物技術(shù)信息國(guó)家中心。有用的序列數(shù)據(jù)庫(kù)包括，但不限于Genbank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank)、歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL)(http/w.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html)或它的譯本或MIPS數(shù)據(jù)庫(kù)(http//mips.gsf.de/)。
用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選DP多肽具有與SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23中任一個(gè)至少40％序列同一性?？梢允褂门鋵?duì)全球比對(duì)程序執(zhí)行Needleman-Wunsch算法(J.Mol.Biol.48443-453，1970)來(lái)計(jì)算序列同一性百分?jǐn)?shù)，該算法最大化配對(duì)數(shù)且最小化空位數(shù)。為了計(jì)算上述百分?jǐn)?shù)，可以使用具有空位開(kāi)放罰分為10并且空位延伸罰分為0.1的程序needle(EMBOSS包)。對(duì)于蛋白質(zhì)，優(yōu)選使用具有字長(zhǎng)為3的blosum62矩陣。對(duì)于核酸，使用由EMBOSS包提供的，字長(zhǎng)為11的矩陣“DNA-full”。Needleman-Wunsch算法最適于從蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)上分析相關(guān)的蛋白質(zhì)序列。備選地，可以在如以上提到的保守區(qū)、結(jié)構(gòu)域或基序中進(jìn)行計(jì)算，分析相關(guān)的蛋白質(zhì)，并確定如以上提到的序列同一性百分?jǐn)?shù)。
符合“DP多肽或其同源物”定義的多肽的實(shí)例是擬南芥DPb(SEQID NO 2和對(duì)應(yīng)的編碼序列SE ID NO 1)。在圖3中給出了SEQ ID NO 12到23代表的DP蛋白質(zhì)的其他實(shí)例，以及它們的Genbank登錄號(hào)、它們的編碼序列和它們的蛋白質(zhì)序列。目前可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)如Genbank獲得擬南芥和稻(Oryza sativa)的基因組序列，并且正在測(cè)序其他基因組。因此，期望使用程序BLASTX或BLASTP或其他程序，通過(guò)與SEQ ID NO 1到4或12到23中任一個(gè)進(jìn)行序列比對(duì)，可以容易地鑒別更多的同源物。
盡管其可能呈現(xiàn)“至少40％同一性”的相對(duì)低序列同源性，DP蛋白質(zhì)都具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域，是高度保守的。應(yīng)該理解的是，術(shù)語(yǔ)DP多肽或其同源物不限于由SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23代表的序列，而是具有DP特征性特點(diǎn)，即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，所述多肽可以用于本發(fā)明的方法。具有這類(lèi)特性的DP多肽保留了DP蛋白質(zhì)的相似功能活性和/或生物活性，或至少部分的功能活性和/或生物活性。生物活性是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于其天然環(huán)境下的活性?？梢酝ㄟ^(guò)，例如在Magyar等人，2000(FEBS letters，48679-97)所述的雙雜交或使用免疫共沉淀檢測(cè)二聚化活性(即，DP與E2F轉(zhuǎn)錄因子二聚化的能力)。
DP多肽/蛋白質(zhì)或其同源物是由“DP編碼核酸”或由“DP編碼基因”編碼；該術(shù)語(yǔ)在此可互換使用，并意指編碼上述DP多肽或其同源物的核酸。DP編碼核酸的實(shí)例包括由SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一個(gè)代表的那些。DP的編碼核酸及其功能變體可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。DP編碼核酸的功能變體包括這類(lèi)核酸的部分和/或能夠與DP編碼核酸雜交的核酸。用于本發(fā)明方法中的功能變體(部分或雜交序列)是編碼多肽的那些，所述多肽具有DP特征性特點(diǎn)，即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述功能變體可以用于本發(fā)明的方法中。
本文所用的術(shù)語(yǔ)部分指包含至少80個(gè)核苷酸的DNA片段，并且該部分編碼的多肽具有DP的特征性特點(diǎn)，即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些部分可以用于本發(fā)明的方法?？梢岳缤ㄟ^(guò)對(duì)DP編碼核酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)缺失來(lái)制備所述部分。所述部分優(yōu)選地是SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一個(gè)代表的核酸的部分，并且該部分符合上述要求。
DP編碼核酸的另一功能變體是能夠與DP編碼核酸雜交，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下雜交的核酸。本文定義的這類(lèi)雜交序列在長(zhǎng)度上是至少80個(gè)核苷酸并且編碼的多肽具有DP特征性特點(diǎn)，即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這類(lèi)雜交序列可以用于本發(fā)明的方法。所述雜交序列優(yōu)選能夠與SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一個(gè)代表的核酸雜交，并且該雜交序列符合上述要求。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜交”意指在雜交過(guò)程中與基本同源的互補(bǔ)核酸序列的退火。雜交過(guò)程可以完全發(fā)生在溶液中，即兩條互補(bǔ)核酸都在溶液中。雜交過(guò)程還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖凝膠珠子或任何其它樹(shù)脂上。此外雜交過(guò)程可還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上，或通過(guò)例如照相平版印刷術(shù)固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者稱之為核酸陣列或微陣列，或稱之為核酸芯片)。為了使得雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學(xué)變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成條件等的影響。
在簡(jiǎn)化的嚴(yán)格條件，優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成條件等的影響。在簡(jiǎn)化的嚴(yán)格條件，優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。嚴(yán)格條件的實(shí)例如下表1所示嚴(yán)格條件是那些至少如，例如條件A-L的嚴(yán)格性；并且簡(jiǎn)化的嚴(yán)格條件是至少如，例如條件M-R的嚴(yán)格性。
表1雜交和洗滌條件的實(shí)例

“雜交體長(zhǎng)度”是雜交核酸的預(yù)期長(zhǎng)度。當(dāng)已知序列的核酸雜交時(shí)，可以通過(guò)比對(duì)序列和鑒別本文所述的保守區(qū)來(lái)確定雜交體長(zhǎng)度。
在雜交和洗脫緩沖液中可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；在雜交完成后洗脫15分鐘。雜交和洗脫可以另外地包括5×Denhardt試劑、0.5-1.0％SDS、100μg/ml變性的片段化的鮭精DNA、0.5％焦磷酸鈉和高達(dá)50％甲酰胺。*Tb-Tr對(duì)于預(yù)期長(zhǎng)度少于50個(gè)堿基對(duì)的雜交體，雜交溫度應(yīng)該比雜交體的熔解溫度Tm低5-10℃，根據(jù)下列方程式確定Tm。對(duì)于長(zhǎng)度少于18個(gè)堿基對(duì)的雜交體，Tm(℃)＝2×(A+T的堿基數(shù))+4×(G+C的堿基數(shù))。對(duì)于長(zhǎng)度在18和49個(gè)堿基對(duì)之間的雜交體，Tm(℃)＝81.5+16.6×lg(Na+)+0.41×(％G+C)-(600/N)，其中N是雜交體中的堿基數(shù)，并且(Na+)是雜交緩沖液中鈉離子的濃度(對(duì)于1×SSC，(Na+)＝0.165M)。±本發(fā)明包括以PNA或修飾的核酸取代的任何一個(gè)或多個(gè)DNA或RNA雜交配偶體的取代物。
用于本發(fā)明方法中的DP編碼核酸的其他功能變體包括DP編碼核酸的等位變體、剪接變體、由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性產(chǎn)生的變體、DP編碼核酸的家族成員和由一個(gè)或多個(gè)間插序列，如內(nèi)含子、間隔序列或轉(zhuǎn)座子間斷的變體。每個(gè)上述功能變體均能夠編碼多肽，所述多肽具有DP特征性特點(diǎn)，即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；這些功能變體可以用于本發(fā)明的方法中。DP編碼核酸或其功能變體可以是DNA或其互補(bǔ)鏈、RNA、cDNA、基因組DNA、合成DNA的整體或部分形式的雙鏈或單鏈核酸。
SEQ ID NO3表示的序列是SEQ ID NO 1剪接變體的實(shí)例。在稻中發(fā)現(xiàn)剪接變體的其他實(shí)例，其中兩個(gè)DPb蛋白質(zhì)各自具有兩個(gè)不同的剪接形式AAO72709.1和AY224589，其是同一基因組DNA的剪接變體，以及AAO72671.1和AY224551，其是同一基因組DNA的剪接變體且編碼其他DPb蛋白質(zhì)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“剪接變體”包括其中選擇的內(nèi)含子和/或外顯子已經(jīng)被切除、替換或添加的核酸的變體。適用于本發(fā)明方法中的剪接變體編碼的多肽具有DP特征性特點(diǎn)，即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。可以在自然界中發(fā)現(xiàn)這類(lèi)剪接變體，或可以通過(guò)選擇性保留蛋白質(zhì)的這些功能片段來(lái)制備這類(lèi)剪接變體。制備剪接變體的方法在本領(lǐng)域是熟知的。
另一DP編碼核酸的功能變體是DP編碼基因的等位變體。等位變體天然存在，且囊括在本發(fā)明的方法之內(nèi)的是這些天然等位基因的用途。等位變體還包含單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多數(shù)生物體的天然存在的多態(tài)品系中，SNP和INDEL構(gòu)成了最大的一類(lèi)序列變體。適于在本發(fā)明方法中使用的等位變體是編碼多肽的那些，所述多肽具有DP特征性特點(diǎn)，即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
DP編碼核酸或其功能變體可衍生自任何天然或人工來(lái)源。所述來(lái)源可以是微生物來(lái)源，如細(xì)菌、酵母或真菌，或植物、藻類(lèi)或動(dòng)物(包括人)來(lái)源。可以通過(guò)精確的人工操作，在組合物和/或基因組環(huán)境中，從該核酸的天然形式修飾其。優(yōu)選植物來(lái)源的核酸，無(wú)論來(lái)自同一植物物種(例如，對(duì)其被導(dǎo)入的物種)或者無(wú)論來(lái)自不同植物物種?？梢詮碾p子葉物種，優(yōu)選十字花科，更優(yōu)選從擬南芥分離該核酸。更優(yōu)選地，從擬南芥分離的DP編碼基因是由SEQ ID NO 1或3表示的，并且編碼的DP氨基酸序列是如由SEQ ID NO 2或4表示的。其他優(yōu)選的序列由SEQ ID NO 12、14、16、18、20和22表示，并且對(duì)應(yīng)的氨基酸序列由SEQ ID NO 13、15、17、19、21或23表示。
用于本發(fā)明方法中的DP編碼核酸序列可以與，例如與SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20或22中任一個(gè)的DP編碼核酸序列具有序列同一性，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
蛋白質(zhì)的“同源物”涵蓋相對(duì)于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入、且與其所衍生自的未修飾蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。為了產(chǎn)生這樣的同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸可以被具有相似性能(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打斷α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-片層結(jié)構(gòu)的趨勢(shì))的其它氨基酸所取代。保守置換表是本領(lǐng)域熟知的(例如參見(jiàn)Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。用于本發(fā)明的方法中的同源物是那些多肽，其具有DP的特征性特點(diǎn)，即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。具有這類(lèi)特性的DP多肽保留與DP蛋白質(zhì)相似的功能活性和/或生物活性，或DP蛋白質(zhì)的至少部分功能活性和/或生物活性。
同源物的兩個(gè)特殊形式，即直系同源物和旁系同源物，其用于描述基因遺傳關(guān)系的進(jìn)化概念。術(shù)語(yǔ)“直系同源物”涉及在不同生物中的基因，其由于祖先關(guān)系是同源的。術(shù)語(yǔ)“旁系同源物”涉及某物種基因組內(nèi)的基因復(fù)制，產(chǎn)生旁系同源基因。本文所用的術(shù)語(yǔ)“同源物”還包括DP蛋白質(zhì)的旁系同源物和直系同源物，其也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。
通過(guò)進(jìn)行交互Blast搜索可以容易地找到DP蛋白質(zhì)在其他植物物種中的直系同源物所述搜索涉及使用如BLAST程序，以查詢基因或蛋白質(zhì)(例如，SEQ ID NO 1到4，或12到23中任一個(gè))搜索一個(gè)或多個(gè)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。從這一搜索產(chǎn)生的最高級(jí)別的目標(biāo)基因繼之被用作相似BLAST搜索中的查詢序列。那些與原始查詢序列具有最高匹配的基因被認(rèn)為是直系同源基因。例如，為了找到擬南芥基因的稻直系同源物，可以在稻數(shù)據(jù)庫(kù)，如在NCBI網(wǎng)址(http//www.ncbi.nim.nih.gov)提供的Oryza sativa Nipponbare數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTN或TBLASTX分析。下一步，在擬南芥序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，使用最高級(jí)別的稻序列進(jìn)行反向BLAST搜索。可以使用該方法從許多不同物種，例如，從玉米中鑒別直系同源物。
可以通過(guò)在“查詢”DP蛋白質(zhì)衍生的相同物種的序列中進(jìn)行Blast搜索，可以容易地找到DP蛋白質(zhì)的旁系同源物。從Blast搜索所選擇的序列中，可以鑒別真正的旁系同源物為具有最高序列同一性的那些。
用于本發(fā)明的方法中的直系同源物和旁系同源物是那些多肽，所述多肽具有DP特征性特點(diǎn)，即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，DP旁系同源物還包括如下文所述的DPb基序。
可以天然產(chǎn)生并且可以從自然界中分離如上文所定義的DP編碼核酸的功能變體和DP蛋白質(zhì)的同源物。一旦知曉同源物的序列及其對(duì)應(yīng)的編碼序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠，例如通過(guò)PCR技術(shù)從生物材料，如基因組文庫(kù)分離對(duì)應(yīng)的DP核酸。實(shí)施例1中描述了這類(lèi)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)實(shí)例。備選地，當(dāng)序列未知時(shí)，可以基于來(lái)自已知DP蛋白質(zhì)的探針，經(jīng)由雜交技術(shù)從生物材料分離新的DP蛋白質(zhì)。備選地和/或另外地，可以經(jīng)由涉及，例如突變(取代、插入或缺失)或衍生的技術(shù)，人工制備DP編碼核酸的功能變體或DP蛋白質(zhì)的同源物。本文稱這些功能變體為“衍生物”，只要該衍生物是具有DP特征性特點(diǎn)的多肽，其也可用于本發(fā)明的方法，所述DP特征性特點(diǎn)即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或者在核酸的情況下，衍生物編碼這類(lèi)多肽。
使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成等等，或通過(guò)重組DNA操作，可以很容易地制備蛋白質(zhì)的氨基酸變體。對(duì)DNA序列進(jìn)行操作以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，在DNA的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生取代突變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、快速變換的定點(diǎn)誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其它定點(diǎn)誘變方案。
同源物還可以是取代變體的形式。術(shù)語(yǔ)DP蛋白質(zhì)的“取代變體”指那些變體，其中氨基酸序列中的至少一個(gè)殘基已經(jīng)被除去，而將一個(gè)不同的殘基插入到它的位置上。氨基酸取代一般是單殘基的，但是取決于對(duì)多肽構(gòu)成的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大約1到10個(gè)氨基酸殘基，缺失為大約1到20個(gè)殘基。優(yōu)選地，氨基酸取代包括保守氨基酸取代。
同源物還可以是蛋白質(zhì)的“插入變體”的形式，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被引入到DP蛋白質(zhì)中的預(yù)定位點(diǎn)。插入片段可包括氨基末端和/或羧基末端融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的序列內(nèi)插入。通常，氨基酸序列內(nèi)的插入片段約為1到10個(gè)氨基酸。氨基或羧基末端融合蛋白質(zhì)或肽的實(shí)例包括如用于酵母雙雜合系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、A蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG-表位、lacZ、CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
“缺失變體”形式的同源物的特征在于從該蛋白質(zhì)除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
DP多肽或其同源物可以是肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)或酶形式的衍生物，其特征在于與天然產(chǎn)生的DP蛋白質(zhì)的氨基酸相比，天然和非天然生成氨基酸的取代和/或缺失和/或添加。與其衍生自的氨基酸序列相比，衍生物還可以包括一個(gè)或多個(gè)非氨基酸取代物。這類(lèi)非氨基酸取代物包括，例如，非天然產(chǎn)生的氨基酸、報(bào)告分子或其他配體，其共價(jià)地或非共價(jià)地連接于氨基酸序列。可以連接這類(lèi)報(bào)告分子以利于DP蛋白的檢測(cè)。
用于本發(fā)明方法中的DP多肽的另一類(lèi)型是DP蛋白質(zhì)的活性片段。DP蛋白質(zhì)的“活性片段”包含DP蛋白質(zhì)的至少80個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，所述殘基與天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或其的部分保持相似的生物活性和/或功能活性。適用于本發(fā)明方法的活性片段包括具有DP特征性特點(diǎn)的多肽，所述DP特征性特點(diǎn)即(i)二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此外，活性片段包括在第二個(gè)或第三個(gè)或其他內(nèi)部甲硫氨酸殘基開(kāi)始的DP蛋白質(zhì)的片段；這些片段源自在內(nèi)部ATG密碼子起始的蛋白質(zhì)翻譯。
可以通過(guò)導(dǎo)入遺傳修飾(優(yōu)選在編碼DP的基因或其同源物的基因座上)增加DP多肽或其同源物的活性，或者DP編碼基因或其功能變體的表達(dá)。本文所定義的基因座意指包括目標(biāo)基因和編碼區(qū)上游或下游10KB的基因組區(qū)。
例如，遺傳修飾可以通過(guò)以下的任何一種(或多種)方法引入TDNA激活、TILLING、定點(diǎn)誘變、定向進(jìn)化、同源重組，或通過(guò)將DP編碼核酸或編碼DP多肽或其同源物的功能變體導(dǎo)入植物。在導(dǎo)入遺傳修飾之后，繼之選擇增加DP多肽活性的任選步驟，該增加的活性使植物具有改良的生長(zhǎng)特性。
T-DNA激活標(biāo)簽(Hayashi等人，Science(1992)1350-1353)涉及在目標(biāo)基因的基因組區(qū)域或基因編碼區(qū)域上游或下游10KB中插入通常包含啟動(dòng)子(也可以是翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子)的T-DNA，如此構(gòu)型以便啟動(dòng)子指引靶基因表達(dá)。通常，破壞靶基因天然啟動(dòng)子對(duì)其的表達(dá)調(diào)控，而使該基因處于新引入的啟動(dòng)子的控制之下。該啟動(dòng)子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通過(guò)農(nóng)桿菌屬感染隨機(jī)插入到植物基因組中，并導(dǎo)致靠近該插入的T-DNA的基因過(guò)量表達(dá)。由于接近引入的啟動(dòng)子的基因過(guò)量表達(dá)，所得的轉(zhuǎn)基因植物顯示出顯性表型。待引入的啟動(dòng)子可以是能指導(dǎo)基因在所需的生物體[在這一實(shí)例中為植物]中表達(dá)的任何啟動(dòng)子。例如，組成型、組織偏好的、細(xì)胞類(lèi)型偏好的以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子都適合用于T-DNA激活。
也可以使用TILLING技術(shù)(靶向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù))，把遺傳修飾引入到DP編碼基因的基因座中。這是一種誘變技術(shù)，可用于產(chǎn)生和/或鑒定、并最終分離能顯示DP活性的DP蛋白質(zhì)。TILLING還能夠選擇攜帶這類(lèi)突變變體的植物。這些突變變體甚至可表現(xiàn)出比該基因的天然形式所表現(xiàn)的更高的DP活性。TILLNG將高密度誘變與高通量篩選方法結(jié)合起來(lái)。TILLING一般遵循的步驟是(a)EMS誘變(Redei和Koncz，1992；Feldmann等，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制備和個(gè)體合并；(c)目標(biāo)區(qū)域的PCR擴(kuò)增；(d)變性和退火以允許形成異源雙鏈；(e)DHPLC，其中庫(kù)中異源雙鏈的存在檢測(cè)為色譜圖中額外的峰值；(f)鑒定突變個(gè)體；和(g)突變PCR產(chǎn)物的測(cè)序。TILLING的方法是本領(lǐng)域熟知的(McCallumNat Biotechnol.2000 Apr；18(4)455-7，由Stemple 2004(TILLING-ahigh-throughput harvest for functional genomics.Nat Rev Genet.20045(2)145-50)綜述)。
可利用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生DP編碼核酸的變體或其編碼活性蛋白質(zhì)的功能變體?？商峁┒喾N方法獲得定點(diǎn)誘變；最常見(jiàn)的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley編著http//www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
定向進(jìn)化也可用于產(chǎn)生DP編碼核酸的變體。這包括重復(fù)的DNA改組，接著進(jìn)行合適的篩選和/或選擇以產(chǎn)生DP編碼核酸的變體或其編碼DP多肽部分的變體，或其具有修飾的生物活性部分的變體(Castle等人，(2004)Science 304(5674)1151-4；美國(guó)專(zhuān)利5,811,238和6,395,547)。
TDNA激活、TILLING和定點(diǎn)誘變是能夠產(chǎn)生新的等位基因，以及保留DP功能并因此可用于本發(fā)明的方法中的DP變體的技術(shù)的實(shí)例。
同源重組能夠在基因組的指定選擇位置引入選定的核酸。同源重組是生物學(xué)中通常使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用于較低等的生物體如酵母或苔蘚physcomitrella。用于在植物中進(jìn)行同源重組的方法不僅已在模式植物中描述(Offringa等Extrachromosomal homologous recombination and genetargeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.1990EMBO J.1990年10月；9(10)3077-84)，而且在禾谷類(lèi)作物例如稻中描述(Terada R等人，Nat.Biotechnol.2002 Efficient gene targeting byhomologous recombination in rice；Lida和Terada，Curr Opin Biotechnol.2004 15(2)132-8A tale of two integrations，transgene and T-DNAgenetargeting by homologous recombination in rice)。靶標(biāo)核酸(其可以是DP核酸或如前述定義的它的變體)不需要靶向于DP基因的位點(diǎn)，但是可以被導(dǎo)入在，例如，高表達(dá)的區(qū)域。例如，待靶向的核酸(其可以是DP核酸或如前述定義的它的變體)不需靶向到DP編碼基因的基因座中，但是可以被引入到高表達(dá)的區(qū)域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替換內(nèi)源基因，或是額外引入到內(nèi)源基因中。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，可以通過(guò)在植物中導(dǎo)入并表達(dá)編碼DP多肽或其同源物的核酸或其功能變體來(lái)改良植物的生長(zhǎng)特性，其中所述的核酸是在植物莖干組織中特異性地表達(dá)的。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，DP的編碼核酸或其功能變體的提高或增加的表達(dá)是可以預(yù)期的。在本領(lǐng)域中已經(jīng)很好地證明了提高或增加基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法，其包括，例如由合適的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)表達(dá)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的使用?？梢栽诙嗪塑账岱钱愒葱问降暮线m位置(通常在上游)上導(dǎo)入分離的核酸，用作啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件，使DP編碼核酸或其功能變體的表達(dá)上調(diào)。例如，通過(guò)突變、缺失和/或取代可體內(nèi)改變內(nèi)源啟動(dòng)子(參見(jiàn)Kmiec，美國(guó)專(zhuān)利No.5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或可以在合適的方向和距離本發(fā)明基因合適的距離將分離的啟動(dòng)子導(dǎo)入植物細(xì)胞，使得以控制該基因的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，在莖干組織中特異性增加DP多肽的活性，并且優(yōu)選這是由在莖干組織中特異性增加的DP編碼核酸的表達(dá)介導(dǎo)的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“莖干”包括植物的全部氣生部分。典型的莖干組織包括，但不限于莖、枝條、葉、芽、花、生殖器官、種子和莖干衍生的結(jié)構(gòu)如匍匐莖、球莖、鱗莖或塊莖的組織。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中DP的編碼基因是在幼生莖干組織中優(yōu)先表達(dá)。
優(yōu)選地，由有效連接于DP編碼基因的莖干特異性啟動(dòng)子可獲得DP編碼基因的莖干特異性表達(dá)。因此，相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案提供了改良植物生長(zhǎng)特性的方法，其包括將在莖干組織中特異性表達(dá)的DP蛋白質(zhì)的編碼核酸導(dǎo)入植物。
本文定義的術(shù)語(yǔ)“莖干特異性啟動(dòng)子”指在莖干中至少5倍強(qiáng)于在其他植物器官(如根)的啟動(dòng)子，并且該啟動(dòng)子優(yōu)先，但并非專(zhuān)有地在植物的氣生部分表達(dá)。本文中可互換使用術(shù)語(yǔ)“組織特異性”啟動(dòng)子與“組織偏好的”啟動(dòng)子。備選地，可以通過(guò)選擇性轉(zhuǎn)化技術(shù)，如用于轉(zhuǎn)化氣生組織的彈道(ballistic)的使用來(lái)介導(dǎo)DP編碼基因的莖干特異性表達(dá)。備選地，可以通過(guò)T-DNA標(biāo)簽獲得莖干特異性表達(dá)，該技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域研究人員是眾所周知的，并且包括在植物中隨機(jī)地導(dǎo)入啟動(dòng)子和選擇那些其中在莖干組織中DP表達(dá)特異性地增加的植物。
如果期望表達(dá)多肽，通常應(yīng)該在多核苷酸編碼區(qū)的3′末端包括聚腺苷酸化區(qū)域。聚腺苷酸化區(qū)域可以衍生自天然基因、多種其他植物基因或來(lái)自T-DNA。加入的3′末端序列可以衍生自，例如，胭脂堿合酶或章魚(yú)堿合酶基因，或備選地來(lái)自另一植物基因，或來(lái)自任何其他真核生物基因。
還可以將內(nèi)含子序列加至5′非翻譯區(qū)或部分編碼序列的編碼序列，以增加在胞質(zhì)中積聚的成熟信使的數(shù)量。已經(jīng)顯示，在植物和動(dòng)物的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包括可剪接的內(nèi)含子可在mRNA和蛋白質(zhì)水平上同時(shí)增加高達(dá)1000倍的基因表達(dá)，Buchman和Berg，Mol.Cell biol.84395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.11183-1200(1987)。通常當(dāng)此類(lèi)內(nèi)含子被置于接近轉(zhuǎn)錄單位的5′末端時(shí)，其提高的基因表達(dá)最大。玉米內(nèi)含子Adh1-S內(nèi)含子1、2和6、Bronze-1內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域公知的；參見(jiàn)The Maize Handbook，第116章，F(xiàn)reeling和Walbot編輯，Springer，N.Y.(1994)。
本發(fā)明還提供了用于促進(jìn)在本發(fā)明方法中有用的核酸序列的導(dǎo)入和/或表達(dá)的遺傳構(gòu)建體和載體。
因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供遺傳構(gòu)建體，其包括(a)DP的編碼核酸或其功能變體；(b)能夠在莖干組織中驅(qū)動(dòng)(a)的核酸表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)的轉(zhuǎn)錄控制序列；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建。遺傳構(gòu)建體可插入到載體中，該載體可以是商購(gòu)的，適于轉(zhuǎn)化到植物中，并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中維持和表達(dá)目標(biāo)基因。優(yōu)選地，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體是植物表達(dá)載體，其適于在植物細(xì)胞、組織、器官或整個(gè)植物中導(dǎo)入和/或維持和/或表達(dá)核酸。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的實(shí)例是SEQ ID NO 8表示的，并且在稻β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子控制下，之后為雙轉(zhuǎn)錄終止序列的DP基因(見(jiàn)圖2)。
本發(fā)明提供如上所述的遺傳構(gòu)建體，其中控制序列(b)是莖干組織優(yōu)選的啟動(dòng)子，如β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子或具有與β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子同等表達(dá)譜的啟動(dòng)子。
根據(jù)(a)的核酸有利地是任何DP編碼核酸，如上文所述的任何核酸。優(yōu)選的核酸是SEQ ID NO 1、2、12、14、16、18、20或22表示的核酸或如上文所述它的功能變體，或是SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21或23表示的蛋白質(zhì)或如上文所述其同源物的編碼核酸。
在本發(fā)明的方法中還提供了上述構(gòu)建體的用途。
植物用包含目標(biāo)序列(即DP編碼核酸或其功能變體)的載體轉(zhuǎn)化。目標(biāo)序列與一個(gè)或多個(gè)控制序列(至少與一個(gè)啟動(dòng)子)有效地連接，優(yōu)選地連接于啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子(b)在植物中可操作并且優(yōu)選是植物衍生的。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄控制序列”和“啟動(dòng)子”在文中可以互換使用，且指能對(duì)與它們有效連接的序列的表達(dá)起作用的調(diào)控核酸序列。上述術(shù)語(yǔ)涵蓋來(lái)源于經(jīng)典真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA盒，帶或不帶CCAAT盒序列)以及根據(jù)發(fā)育和/或外界刺激，或以組織特異性方式改變基因表達(dá)的另外的調(diào)控元件(即，上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。該術(shù)語(yǔ)還包括經(jīng)典原核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在這種情況下，它可能包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”也涵蓋合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能夠在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)，激活或增強(qiáng)這種表達(dá)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“有效連接”指啟動(dòng)子序列與目的基因之間的功能性連接，以便啟動(dòng)子序列能啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，將目標(biāo)基因以正義方向有效連接于啟動(dòng)子。
有利地，本發(fā)明的方法可以使用任何具有莖干組織特異性表達(dá)模式的啟動(dòng)子。當(dāng)與強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子(如強(qiáng)的組成型/普遍存在的CaMV35S啟動(dòng)子)比較時(shí)，這些啟動(dòng)子在根中具有較低的表達(dá)水平。
這類(lèi)啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例是本文中SEQ ID NO 7表示的稻β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子EXPB9。可以從稻(日本栽培種)染色體10，BAC OSJNBa0082M15分離這一啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子位于Genbank登錄號(hào)AF261277表示的mRNA的編碼EXPB9基因的上游。本文所用的術(shù)語(yǔ)“莖干特異性啟動(dòng)子”因此還意指具有相同或相似活性的啟動(dòng)子，如在稻中的稻β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子EXPB9。在本文中相似的活性意指比β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子EXPB9最多高或低20倍的活性，優(yōu)選地最多高或低10倍，或高或低5倍，或高或低3倍的活性。
測(cè)量啟動(dòng)子強(qiáng)度的一個(gè)方法是通過(guò)使用啟動(dòng)子β葡糖醛酸酶融合?？梢詫⒃搯?dòng)子融合到編碼的β葡糖醛酸酶的埃希氏大腸桿菌(Escherichiacoli)UidA基因，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物。從植物材料提取蛋白質(zhì)并且測(cè)定GUS活性(Jefferson等人，1987，EMBO J.20；6(13)3901-7)。繼之按照提取蛋白質(zhì)的每mg單位中的光密度計(jì)算啟動(dòng)子活性。
優(yōu)選地，在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期間或在幼生莖干組織中表達(dá)莖干優(yōu)先的啟動(dòng)子。因此，優(yōu)選在萌發(fā)之后從組織中測(cè)量GUS活性。優(yōu)選地，在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期間，例如在萌發(fā)之后2周，優(yōu)選萌發(fā)之后4周進(jìn)行這些測(cè)量。
莖干組織優(yōu)先的啟動(dòng)子的另一實(shí)例是原葉綠素還原酶啟動(dòng)子。
任選地，遺傳構(gòu)建體還可以包括一個(gè)或多個(gè)終止子序列。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄終止序列”包括位于轉(zhuǎn)錄單位末端的控制序列，其標(biāo)志初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的3′加工和聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄的終止。其他調(diào)控元件，如轉(zhuǎn)錄或翻譯增強(qiáng)子，可以被引入遺傳構(gòu)建體中。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將知道合適的終止子和增強(qiáng)子序列。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括在特定細(xì)胞類(lèi)型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制起點(diǎn)。一個(gè)實(shí)例是需要遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中作為附加型基因元件(如質(zhì)?；蝠ち?維持的情況。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括，但不限于f1起點(diǎn)和colE1。
遺傳構(gòu)建體任選地可包含選擇標(biāo)記基因。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“選擇性標(biāo)記基因”包括賦予表達(dá)該基因細(xì)胞表型，以便于鑒定和/或選擇用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的任何基因。合適的標(biāo)記可選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，其引入新的新陳代謝性狀或允許可視選擇。選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括能賦予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox)的基因，或提供陳代謝性狀的基因(如允許植物利用甘露糖作為唯一碳源的manA)?？梢晿?biāo)記基因?qū)е骂伾男纬?例如β-葡糖苷酸酶，GUS)、發(fā)光(如熒光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。
本發(fā)明還包括通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的植物。本發(fā)明因此提供了可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的植物，該植物中已經(jīng)導(dǎo)入了DP的編碼核酸或如上定義的它的功能變體。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生具有改良的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括在植物中導(dǎo)入和表達(dá)DP編碼核酸或其功能變體。
因此，本發(fā)明提供的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括(a)將DP的編碼核酸或其功能變體導(dǎo)入植物細(xì)胞，優(yōu)選導(dǎo)入如上所述的遺傳構(gòu)建體；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞。
DP編碼核酸或其功能變體或遺傳構(gòu)建體定義如上。相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，由上述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物具有改良的植物生長(zhǎng)特性，這類(lèi)生長(zhǎng)特性是上述的任何生長(zhǎng)特性。
優(yōu)選通過(guò)轉(zhuǎn)化將DP編碼核酸或遺傳構(gòu)建體“導(dǎo)入”植物細(xì)胞中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”涵蓋把外源多核苷酸向宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移，而不管轉(zhuǎn)移的方法如何。能夠隨后無(wú)性繁殖的植物組織，無(wú)論是通過(guò)器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生，都可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。組織的選擇決定于被轉(zhuǎn)化的特定的植物物種。例示性的靶組織包括葉盤(pán)(leaf disk)、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子、胼胝體組織、已存在的分生組織(如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)以及誘導(dǎo)的分生組織(如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時(shí)或穩(wěn)定地被引入到宿主細(xì)胞中，并可保持非整合狀態(tài)，例如，作為質(zhì)粒?？蛇x擇地，它可以整合到宿主基因組中。優(yōu)選地，將DP的編碼核酸穩(wěn)定地整合到植物細(xì)胞的基因組中，其可以通過(guò)，例如使用在被導(dǎo)入基因組的核酸側(cè)翼具有T-DNA邊界的植物轉(zhuǎn)化載體或植物表達(dá)載體而獲得。
植物物種的轉(zhuǎn)化目前是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利地，多種轉(zhuǎn)化方法都可用于引入目的基因到合適的祖代細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、能增加游離DNA攝入的化學(xué)品、直接注射DNA到植物中、基因槍顆粒轟擊、使用病毒或花粉進(jìn)行轉(zhuǎn)化以及顯微注射。方法可選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，1987年6月，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R.D.等，1985Bio/Technol 3，1099-1102)；顯微注射到植物材料中(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA包被顆粒轟擊(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)選方法是農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。
優(yōu)選使用任何通過(guò)農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因稻的熟知方法，例如在任何以下文獻(xiàn)中描述的方法公開(kāi)的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，1996，199，612-617)、Chan等人(Plant Mol.Biol.1993，22(3)491-506)、Hiei等人(Plant J.1994，6(2)271-282)，其公開(kāi)的內(nèi)容如同其陳述的全部?jī)?nèi)容那樣并入本文作為參考。至于玉米轉(zhuǎn)化，優(yōu)選的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996，14(6)745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002，129(1)13-22)中所述，其公開(kāi)的內(nèi)容如同其陳述的全部?jī)?nèi)容那樣并入本文作為參考。
通常在轉(zhuǎn)化之后，由與DP編碼基因共轉(zhuǎn)化的一種或多種的標(biāo)記的存在選擇植物細(xì)胞或細(xì)胞群。
可以隨后經(jīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的再生技術(shù)，使用產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、細(xì)胞群或植物組織產(chǎn)生完整的轉(zhuǎn)化植物。因此，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞可以包括選擇和/或再生和/或生長(zhǎng)至成熟的步驟。
DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，可評(píng)價(jià)推斷轉(zhuǎn)化植物中目標(biāo)基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組結(jié)構(gòu)，例如使用Southern分析?？蛇x擇地或另外地，新引入DNA的表達(dá)水平可使用Northern和/或Western分析進(jìn)行監(jiān)控，兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可通過(guò)各種方法進(jìn)行繁殖，如通過(guò)無(wú)性繁殖或經(jīng)典育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可以自花授精以產(chǎn)生純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化株，而T2植物可進(jìn)一步通過(guò)經(jīng)典的育種技術(shù)進(jìn)行繁殖。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以是各種形式的。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如，所有的細(xì)胞都被轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如，在植物中，轉(zhuǎn)化的根莖被嫁接到未轉(zhuǎn)化的接穗中)。
本發(fā)明還提供宿主細(xì)胞，其含有編碼DP或其功能變體的分離的核酸分子或如上提到的遺傳構(gòu)建體。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明還提供已經(jīng)用DP編碼基因或其功能變體或本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并且包含其的植物細(xì)胞、組織、器官和整個(gè)植物，以及植物的部分和其無(wú)性繁殖體。本發(fā)明顯然延及由上述任何方法可獲得的植物。本發(fā)明延及特異性在莖干組織中具有增加的DP編碼核酸的表達(dá)水平和/或增加的DP蛋白質(zhì)的水平和/或活性的植物。本發(fā)明還包括原代轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織、器官或整個(gè)植物或植物部分的后代，所述后代的唯一要求是與其衍生自的親本植物呈現(xiàn)相同的基因型特性。相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，根據(jù)本發(fā)明的植物具有改良的生長(zhǎng)特性。本發(fā)明還延及根據(jù)本發(fā)明的植物的任何部分，優(yōu)選地，可收獲的部分，例如，但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖培養(yǎng)物、莖、根狀莖、根、塊莖、球莖和棉纖維。
本發(fā)明還涉及在莖干優(yōu)選的啟動(dòng)子控制下的編碼DP蛋白質(zhì)或其同源物的核酸用于改良任何一種或多種的上述生長(zhǎng)特性的用途。
可以在育種程序中使用DP的編碼核酸或其功能變體，或DP多肽或其同源物，其中可以鑒別遺傳性連接于DP編碼基因或其功能變體的DNA標(biāo)記?？梢允褂肈P編碼基因或其功能變體，或DP蛋白質(zhì)或其同源物定義分子標(biāo)記?？梢噪S后在育種程序中使用這一DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記來(lái)選擇具有改變的生長(zhǎng)特性的植物。DP的編碼基因或其功能變體優(yōu)選是SEQ IDNO 1、3、12、14、16、18、20或22中任一個(gè)代表的核酸。
還可以在標(biāo)記輔助的育種程序中使用DP編碼基因的等位變體或其功能變體。這類(lèi)育種方案有時(shí)需要通過(guò)植物的誘變處理，在植物中引入等位基因變異，例如使用EMS誘變；備選地，該程序可以以天然起源的等位變體的采集開(kāi)始。然后通過(guò)例如PCR進(jìn)行等位變體的鑒定。然后通過(guò)例如PCR進(jìn)行等位變體的鑒定。接著是篩選步驟，用于選擇所討論序列的優(yōu)良等位變體，其在植物中產(chǎn)生改良的生長(zhǎng)特性。一般通過(guò)監(jiān)控含有所討論序列的不同等位變體(例如，SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20或22中任一個(gè)的不同等位變體)的植物的生長(zhǎng)特性來(lái)進(jìn)行篩選。監(jiān)控生長(zhǎng)特性可以在溫室或野外進(jìn)行。此外任選的步驟包括使已鑒定優(yōu)良等位變體的植物與另一種植物雜交。例如，這可用于產(chǎn)生目標(biāo)表型特征的組合。DP編碼核酸還可用作探針，以對(duì)基因進(jìn)行遺傳和物理作圖，這些基因是與之連鎖的性狀的一部分和標(biāo)志。這些信息可用于植物育種，以開(kāi)發(fā)具有所需表型的種系。DP編碼核酸或其功能變體的這種應(yīng)用，僅僅需要長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸的核酸序列。DP編碼核酸或其功能變體可用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(Maniatis)可使用DP編碼核酸或其功能變體進(jìn)行探測(cè)。然后可以使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1174-181)對(duì)所得的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖譜。此外，該核酸可用于探測(cè)Southern印跡，該Southern印跡含有代表親本和明確的遺傳雜交后代的一組個(gè)體的限制性核酸內(nèi)切酶處理的基因組DNA。記錄到DNA多態(tài)性的分離，并用于計(jì)算DP編碼核酸或其功能變體在前面使用該群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
植物基因來(lái)源的探針的制備和在遺傳作圖中的用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中。眾多出版物描述過(guò)使用上面所述的方法或其變通形式對(duì)特定的cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，F(xiàn)2雜交群體、回交群體、隨機(jī)交配群體、近親同基因系及其他的個(gè)體組可用于作圖。這類(lèi)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
核酸探針也可用于物理作圖(即，把序列置于物理圖上；參見(jiàn)Hoheisel等人in Non mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346頁(yè)，以及其中引用的參考文獻(xiàn))。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針可用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)。雖然目前的FISH作圖方法偏向于使用大的克隆(幾個(gè)到幾百KB；參見(jiàn)Laan等人(1995)Genome Res.513-20)，但是靈敏度的提高允許使用較短的探針進(jìn)行FISH作圖。
許多用于遺傳和物理作圖的各種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述DP編碼核酸實(shí)施。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 1195-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等人(1988)Science 2411077-1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(1990)Nucleic AcidRes.183671)、放射雜交作圖(Walter等人(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。為實(shí)施這些方法，使用核酸序列設(shè)計(jì)和制備引物對(duì)，以用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)。這類(lèi)引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在采用基于PCR遺傳作圖的方法中，可能有必要鑒定跨越相應(yīng)于本發(fā)明核酸序列區(qū)域作圖的親本之間DNA序列的差異。然而，這對(duì)作圖方法通常不是必要的。
DP編碼核酸或其功能變體，或DP多肽或其同源物也可用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。由于這些分子可用于改良植物的生長(zhǎng)特性，它們也是有用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如除草劑或生長(zhǎng)刺激物。本發(fā)明因此提供了一種組合物，其包含DP編碼核酸或其功能變體，或DP多肽或其同源物，連同合適的載體、稀釋劑或賦形劑，用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。
根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生如上所述的具有改良的生長(zhǎng)特性的植物。這些改良的生長(zhǎng)特性也可與其它經(jīng)濟(jì)學(xué)上有利的性狀組合，如進(jìn)一步增產(chǎn)性狀、對(duì)各種脅迫的耐受性、修飾各種結(jié)構(gòu)特征和/或生化和/或生理學(xué)特征的性狀。
本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下附圖進(jìn)行描述，其中

圖1顯示了二元載體pEXP::AtDPb的圖譜，用于在稻中表達(dá)處于稻β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子(帶有內(nèi)參PRO0061的β-EXPB9啟動(dòng)子)控制下的擬南芥DPb基因(內(nèi)參CDS006)。AtDPb表達(dá)盒還包括T-玉米醇溶蛋白和T-rbcS-δGA雙轉(zhuǎn)錄終止序列。這一表達(dá)盒被定位在胭脂堿Ti質(zhì)粒的左邊界(LB重復(fù)，LB Ti C58)和右邊界(RB重復(fù)，RB Ti C58)之間。在T-DNA中還有其他的選擇性標(biāo)記和篩選性標(biāo)記，它們均在組成型啟動(dòng)子控制下，并后跟polyA或T-NOS轉(zhuǎn)錄終止序列。這一載體還包括用于細(xì)菌復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)(pBR322起點(diǎn)+bom)和用于細(xì)菌選擇的選擇性標(biāo)記(Spe/SmeR)。
圖2給出本申請(qǐng)中描述的序列的一些實(shí)例。SEQ ID NO 2還顯示在DP蛋白質(zhì)中特別保守的下劃線區(qū)域。
圖3顯示具有SEQ ID NO 9(基序1)、10(基序2)和11(基序3)表示的保守共有DPb基序位置的DP蛋白質(zhì)的比對(duì)。顯示了AtDPb的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域。用虛線括號(hào)標(biāo)明全部DP蛋白質(zhì)通用的高度保守區(qū)的位置。使用CLUSTAL W(Higgins等人，(1994)Nucleic Acids Res.224673-4680)，以BLOSSUM 62矩陣和參數(shù)GAPOPEN 10、GAPEXT 0.05以及GAPDIST 8完成對(duì)整個(gè)序列的多序列比對(duì)。還提供序列的Genbank登錄號(hào)。
圖4顯示對(duì)應(yīng)于圖3的多比對(duì)的分支進(jìn)化樹(shù)。使用Clustal W產(chǎn)生分支進(jìn)化樹(shù)。還提供序列的Genbank登錄號(hào)。
圖5顯示DP蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)生圖的圖示。該系統(tǒng)發(fā)生圖給出的分支長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)之間的距離與序列之間的進(jìn)化距離成比例。該進(jìn)化樹(shù)圖示由Clustal W產(chǎn)生。通過(guò)僅存在于DPb中的KKKK/RR基序的存在或缺失可以將兩組DP蛋白質(zhì)(DPa和DPb)彼此區(qū)分開(kāi)。
實(shí)施例本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下實(shí)施例進(jìn)行描述，其僅僅是為了例證說(shuō)明。
DNA操作除非另外說(shuō)明，否則重組DNA技術(shù)按照(Sambrook(2001)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，CSH，紐約)或Ausubel等人(1994)、Current Protocols in Molecular Biology、Current Protocols的卷1和2中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。植物分子操作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)(BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)發(fā)表)中進(jìn)行了描述。
實(shí)施例1擬南芥DPb的克隆使用擬南芥幼苗cDNA文庫(kù)(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板，PCR擴(kuò)增擬南芥DPb基因(內(nèi)參CDS006)。對(duì)從幼苗提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以后，把cDNA克隆到pCMV Sport 6.0中。cDNA文庫(kù)的平均插入片段大小為1.5kb，而且菌落的原始數(shù)為1.59×107cfu。原始滴度確定為9.6×105cfu/ml，而且在第一輪擴(kuò)增以后變成6×1011cfu/ml。菌落的質(zhì)粒提取以后，200ng的模板用于50μl PCR混合物。用于PCR擴(kuò)增的引物包含用于Gateway重組克隆(斜體)的AttB位點(diǎn)，其中prm0319的序列為5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGACAACTACTGGGTCTAATTCT 3′(SEQ ID NO 5)和prm0320的序列為5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAATTCTCCGGCTTCAT3′(SEQ ID NO 6)。使用Hifi Tag DNA聚合酶，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR。同樣使用標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增和純化期望長(zhǎng)度的PCR片段。隨后進(jìn)行Gateway方法的第一步，BP反應(yīng)，在此期間將PCR片段與pDONR201質(zhì)粒在體內(nèi)重組以產(chǎn)生“進(jìn)入克隆”(entry clone)，p0424。作為Gateway技術(shù)部分的質(zhì)粒pDONR201購(gòu)自Invitrogen。
實(shí)施例2載體構(gòu)建((pEXP::AtDPb)繼之在LR反應(yīng)中使用進(jìn)入克隆p0424和用于稻轉(zhuǎn)化的指定載體p3169。該載體包含位于T-DNA邊界內(nèi)的以下部分作為功能性元件植物選擇性標(biāo)記；植物篩選標(biāo)記；旨在與已克隆到進(jìn)入克隆中的目標(biāo)序列進(jìn)行體內(nèi)重組的LR的Gateway表達(dá)盒。用于目標(biāo)基因莖干組織優(yōu)選表達(dá)的稻β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子(內(nèi)參PRO061)位于這一Gateway盒的上游。在LR重組步驟之后，將產(chǎn)生的表達(dá)載體pEXP::AtDPb(圖1)轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌屬菌株LBA4044，其隨后被轉(zhuǎn)化到稻植株中。使轉(zhuǎn)化的稻植株生長(zhǎng)，然后檢驗(yàn)實(shí)施例3中所述的多種生長(zhǎng)特性。
實(shí)施例3用pEXP::AtDPb轉(zhuǎn)化的T0、T1和T2稻植物的評(píng)估產(chǎn)生大約15到20個(gè)獨(dú)立的T0轉(zhuǎn)化株。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到溫室生長(zhǎng)并收獲T1種子。6個(gè)事件得以保留，其中T1后代發(fā)生轉(zhuǎn)基因存在/缺乏的3∶1分離?！盁o(wú)效植物”或“無(wú)效分離體”或“無(wú)效合子”是與轉(zhuǎn)基因植物以相同方式處理的植物，但是轉(zhuǎn)基因已經(jīng)從其分離。還可以將無(wú)效植物描述為純合的陰性轉(zhuǎn)化體。對(duì)于每一個(gè)這些事件，通過(guò)PCR選擇大約10個(gè)含有轉(zhuǎn)基因的T1幼苗(雜合子和純合子)和大約10個(gè)缺少轉(zhuǎn)基因的T1幼苗(無(wú)效合子)。
基于T1評(píng)估的結(jié)果，選擇在T1水平上顯示改良的生長(zhǎng)特性的三個(gè)事件用于在T2中的進(jìn)一步鑒定和更多的個(gè)體。通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記表達(dá)篩選來(lái)自陽(yáng)性T1植物(雜合子和純合子都有)的種子組。對(duì)于每個(gè)選擇的事件，隨即選擇雜合子種子組用于T2評(píng)估。在每個(gè)種子組中移植相同數(shù)目的陽(yáng)性和陰性種子于溫室中用于評(píng)估(即，對(duì)于每個(gè)事件，生長(zhǎng)40個(gè)植物，其中20個(gè)是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和20個(gè)是轉(zhuǎn)基因陰性)。因此，對(duì)于三個(gè)事件，在T2代總共評(píng)估120個(gè)植物。
轉(zhuǎn)移T1和T2植物至溫室，并如下所述地評(píng)估其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)參數(shù)。
(I)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用為不均衡設(shè)計(jì)校正的雙因子ANOVA(方差分析)作為所觀察的植物表型特性數(shù)值的統(tǒng)計(jì)評(píng)估模型。提交數(shù)值至t檢驗(yàn)或F檢驗(yàn)。通過(guò)比較t值與t分布，或備選地通過(guò)比較F值與F分布獲得p值。p值代表無(wú)效假定的可能性(無(wú)效假定是“沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的影響”)是正確的。
對(duì)一事件的全部植物的全部值進(jìn)行t-檢驗(yàn)。對(duì)于每一事件和每一生長(zhǎng)特性重復(fù)這類(lèi)t檢驗(yàn)。進(jìn)行t檢驗(yàn)以檢查在一個(gè)轉(zhuǎn)化事件內(nèi)的基因作用，本文中又被稱為“線性特異性作用”。在t檢驗(yàn)中，設(shè)定顯著線性特異性作用的域值在10％de概率水平。因此，t檢驗(yàn)的p值低于10％的數(shù)據(jù)意味著在基因存在產(chǎn)生的株系的轉(zhuǎn)基因植物中觀察到表型。在轉(zhuǎn)化事件的一個(gè)群體之內(nèi)，一些事件可以低于這一域值。這一差異可能是由于轉(zhuǎn)基因在基因組中的位置不同?；蚩赡軆H在基因組的某些位置上具有作用是常見(jiàn)的。因此，上述“線性特異性作用”也被稱為“位置依賴的作用”。
在所有事件的全部植物測(cè)量的全部值進(jìn)行F檢驗(yàn)。對(duì)于每個(gè)生長(zhǎng)特性重復(fù)F檢驗(yàn)。進(jìn)行F測(cè)驗(yàn)以檢查基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的作用，并檢驗(yàn)基因的總效應(yīng)，亦稱之為“基因作用”。顯著性整體基因效應(yīng)的顯著性域值設(shè)置為5％概率水平。因此，F(xiàn)檢驗(yàn)的p值低于5％的數(shù)據(jù)意指非正確的基因存在和/或基因組中轉(zhuǎn)基因位置產(chǎn)生的觀察到的表型?！盎蜃饔谩笔寝D(zhuǎn)基因植物中基因的廣泛適用性的指標(biāo)。
(II)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)測(cè)量選擇的植物在溫室生長(zhǎng)。每種植物獲得獨(dú)特的barcode標(biāo)簽以明確地聯(lián)系表型數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的植物。選擇的植物生長(zhǎng)在10cm直徑盆中的土壤中，生長(zhǎng)環(huán)境設(shè)置如下光周期＝11.5小時(shí)，日光強(qiáng)度＝30000勒克斯或更高，日間溫度＝28℃或更高，夜間溫度＝22℃，相對(duì)濕度＝60-70％。轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的無(wú)效合子并排生長(zhǎng)在隨機(jī)的位置。從播種階段直至成熟階段(該階段是沒(méi)有生物量增加的階段)，植物每周通過(guò)數(shù)字成像機(jī)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從至少6個(gè)不同角度對(duì)每個(gè)植物拍攝數(shù)字圖像(2048×1536象素，16百萬(wàn)色)。下述參數(shù)是使用圖像分析軟件以自動(dòng)化的方式從數(shù)字圖像獲得。
地上面積植物地上面積通過(guò)計(jì)數(shù)排除背景后地上植物部分的像素總數(shù)測(cè)定。這個(gè)值為在同一時(shí)間點(diǎn)從不同角度拍攝的圖像的平均數(shù)，并通過(guò)校準(zhǔn)將其轉(zhuǎn)化為以平方毫米表達(dá)的物理表面值。實(shí)驗(yàn)顯示，這種方式測(cè)定的地上植物面積與植物地上部分的生物量相關(guān)。
平均起來(lái)，T1代的pEXP::DPb轉(zhuǎn)基因植物顯示地上面積的8％增加以及F檢驗(yàn)中0.08的p值。三個(gè)最佳陽(yáng)性T1株系中的一個(gè)顯示地上面積的30％增加和t檢驗(yàn)的0.01的p值。在T2代中，這一株系顯示地上面積的18％增加和t檢驗(yàn)的0.03的p值。
實(shí)施例4由β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)使用“BP重組反應(yīng)”將β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子克隆入GatewayTM系統(tǒng)(Life Technologies)的pDONR201進(jìn)入質(zhì)粒。通過(guò)測(cè)序確定克隆的插入片段的同一性和堿基對(duì)組成，并且還經(jīng)由限制性消化檢驗(yàn)產(chǎn)生的質(zhì)粒。
為了將啟動(dòng)子克隆在報(bào)告基因之前，隨即在“LR重組反應(yīng)”(GatewayTM)中使用每個(gè)進(jìn)入克隆和指定載體。對(duì)這一指定載體通過(guò)在GUS基因前的Gateway重組盒的置換的設(shè)計(jì)，將啟動(dòng)子有效連接到埃希氏大腸桿菌β葡糖醛酸酶(GUS)基因上。繼之將產(chǎn)生的含有有效連接于GUS啟動(dòng)子的報(bào)告載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株LBA4044，并且隨后使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)入稻植物。
從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因稻植物。植物在正常條件下生長(zhǎng)。
使用90％冰冷的丙酮覆蓋植物或植物的部分，并在4℃孵育30分鐘。使用Tris緩沖液[在1升雙蒸水中的15.76g Trizma HCl(Sigma T3253)和2.922g NaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0]洗滌3次，每次5分鐘后，所述材料使用Tris/鐵氰酸鹽(ferricyanate)/X-Gluc溶液[10ml Tris緩沖液中的9.8ml Tris緩沖液和0.2ml鐵氰酸鹽母液(0.33g鐵氰化鉀(Sigma P3667))+500μl DMSO中的0.2ml X-Gluc母液(26.1mg X-Gluc(EuropaBioproducts ML 113A))]覆蓋。真空過(guò)濾15到30分鐘。37℃下孵育植物或植物的部分16小時(shí)直至可見(jiàn)藍(lán)色顯影。用Tris緩沖液洗滌樣品3次，共5分鐘。以50％、70％和90％乙醇(每種30分鐘)連續(xù)提取葉綠素。
序列表計(jì)算機(jī)可讀形式序列表的聲明我們?cè)诖舜_認(rèn)此處提交的序列表是依據(jù)第27條bis(1)，并符合WIPOST.25標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。計(jì)算機(jī)可讀形式中記錄的信息對(duì)應(yīng)于書(shū)面的序列表(第27條a(2))。在此申明該序列表沒(méi)有包含超出所提交的專(zhuān)利申請(qǐng)內(nèi)容的材料。
<110>克羅普迪塞恩股份有限公司<120>具有改良生長(zhǎng)特性的植物及其制備方法<130>CD-113-PCT<150>EP 04102392.0<151>2004-05-28<150>US 60/576,250<151>2004-06-02<160>23<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1158<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgacaacta ctgggtctaa ttctaatcac aaccaccatg aaagcaataa taacaacaat 60aaccctagta ctaggtcttg gggcacggcg gtttcaggtc aatctgtgtc tactagcggc120agtatgggct ctccgtcgag ccggagtgag caaaccatca ccgttgttac atctactagc180gacactactt ttcaacgcct gaataatttg gacattcaag gtgatgatgc tggttctcaa240ggagcttctg gtgttaagaa gaagaagagg ggacagcgtg cggctggtcc agataagact300ggaagaggac tacgtcaatt tagtatgaaa gtttgtgaaa aggtggaaag caaaggaagg360acaacttaca atgaggttgc agacgagctt gttgctgaat ttgcacttcc aaataacgat420ggaacatccc ctgatcagca acagtatgat gagaaaaaca taagacgaag agtatatgat480gctttaaacg tcctcatggc tatggatata atatccaagg ataaaaaaga aattcaatgg540agaggtcttc ctcggacaag cttaagcgac attgaagaat taaagaacga acgactctca600cttaggaaca gaattgagaa gaaaactgca tattcccaag aactggaaga acaatatgta660ggccttcaga atctgataca gagaaatgag cacttatata gctcaggaaa tgctcccagt720ggcggtgttg ctcttccttt tatccttgtc cagactcgtc ctcacgcaac agtagaagtg780gagatatcag aagatatgca gctcgtgcat tttgatttca acagcactcc atttgagctc840
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Glu Ile Gln Trp Arg Gly Leu Pro Arg Thr Ser Leu Ser Asp Ile Glu180 185 190Glu Leu Lys Asn Glu Arg Leu Ser Leu Arg Asn Arg Ile Glu Lys Lys195 200 205Thr Ala Tyr Ser Gln Glu Leu Glu Glu Gln Tyr Val Gly Leu Gln Asn210 215 220Leu Ile Gln Arg Asn Glu His Leu Tyr Ser Ser Gly Asn Ala Pro Ser225 230 235 240Gly Gly Val Ala Leu Pro Phe Ile Leu Val Gln Thr Arg Pro His Ala245 250 255Thr Val Glu Val Glu Ile Ser Glu Asp Met Gln Leu Val His Phe Asp260 265 270Phe Ash Ser Thr Pro Phe Glu Leu His Asp Asp Asn Phe Val Leu Lys275 280 285Thr Met Lys Phe Cys Asp Gln Pro Pro Gln Gln Pro Asn Gly Arg Asn290 295 300Asn Ser Gln Leu Val Cys His Asn Phe Thr Pro Glu Asn Pro Asn Lys305 310 315 320Gly Pro Ser Thr Gly Pro Thr Pro Gln Leu Asp Met Tyr Glu Thr His325 330 335Leu Gln Ser Gln Gln His Gln Gln His Ser Gln Leu Gln Ile Ile Pro340 345 350Met Pro Glu Thr Asn Asn Val Thr Ser Ser Ala Asp Thr Ala Pro Val355 360 365Lys Ser Pro Ser Leu Pro Gly Ile Met Asn Ser Ser Met Lys Pro Glu370 375 380Asn385<210>3<211>1442<212>DNA<213>擬南芥<400>3tcaaaatcag aaactttcct tgacaaattt taacaaatct ctttctcgtt ttctattgaa 60ttctccagta gcgcggtagt tagttttagg tggaagaaga atgacaacta ctgggtctaa120
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Met Thr Thr Thr Gly Ser Asn Ser Asn His Asn His His Glu Ser Asn1 5 10 15Asn Asn Asn Asn Asn Pro Ser Thr Arg Ser Trp Gly Thr Ala Val Ser20 25 30Gly Gln Ser Val Ser Thr Ser Gly Ser Met Gly Ser Pro Ser Ser Arg35 40 45Ser Glu Gln Thr Ile Thr Val Val Thr Ser Thr Ser Asp Thr Thr Phe50 55 60Gln Arg Leu Asn Asn Leu Asp Ile Gln Gly Asp Asp Ala Gly Ser Gln65 70 75 80Gly Ala Ser Gly Val Lys Lys Lys Lys Arg Gly Gln Arg Ala Ala Gly85 90 95Pro Asp Lys Thr Gly Arg Gly Leu Arg Gln Phe Ser Met Lys Gly Leu100 105 110Ile Ser Phe Ser Ala Pro Ile Met Leu Ser Ser Lys Cys Leu Ser Ile115 120 125Cys Glu Lys Val Glu Ser Lys Gly Arg Thr Thr Tyr Asn Glu Val Ala130 135 140Asp Glu Leu Val Ala Glu Phe Ala Leu Pro Asn Asn Asp Gly Thr Ser145 150 155 160Pro Asp Gln Gln Gln Tyr Asp Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Val Tyr165 170 175Asp Ala Leu Asn Val Leu Met Ala Met Asp Ile Ile Ser Lys Asp Lys180 185 190Lys Glu Ile Gln Trp Arg Gly Leu Pro Arg Thr Ser Leu Ser Asp Ile195 200 205Glu Glu Leu Lys Asn Glu Arg Leu Ser Leu Arg Asn Arg Ile Glu Lys210 215 220Lys Thr Ala Tyr Ser Gln Glu Leu Glu Glu Gln Val Met Asn Ile Ile225 230 235 240Asp Thr Leu Gly Leu Ser Ala Ser Cys Leu Gln Asn Leu Ile Gln Arg245 250 255Asn Glu His Leu Tyr Ser Ser Gly Asn Ala Pro Ser Gly Gly Val Ala260 265 270
Leu Pro Phe Ile Leu Val Gln Thr Arg Pro His Ala Thr Val Glu Val275 280 285Glu Ile Ser Glu Asp Met Gln Leu Val His Phe Asp Phe Asn Ser Thr290 295 300Pro Phe Glu Leu His Asp Asp Asn Phe Val Leu Lys Thr Met Lys Phe305 310 315 320Cys Asp Gln Pro Pro Gln Gln Pro Asn Gly Arg Asn Asn Ser Gln Leu325 330 335Val Cys His Asn Phe Thr Pro Glu Asn Pro Asn Lys Gly Pro Ser Thr340 345 350Gly Pro Thr Pro Gln Leu Asp Met Tyr Glu Thr His Leu Gln Ser Gln355 360 365Gln His Gln Gln His Set Gln Leu Gln Ile Ile Pro Met Pro Glu Thr370 375 380Asn Asn Val Thr Ser Ser Ala Asp Thr Ala Pro Val Lys Ser Pro Ser385 390 395 400Leu Pro Gly Ile Met Asn Ser Ser Met Lys Pro Glu Asn405 410<210>5<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物正向引物<400>5ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgaca actactgggt ctaattct58<210>6<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物反向引物<400>6ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt caattctccg gcttcat47<210>7<21l>1243<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)<400>7aaaaccaccg agggacctga tctgcaccgg ttttgatagt tgagggaccc gttgtgtctg 60gttttccgat cgagggacga aaatcggatt cggtgtaaag ttaagggacc tcagatgaac 120ttattccgga gcatgattgg gaagggagga cataaggccc atgtcgcatg tgtttggacg 180gtccagatct ccagatcact cagcaggatc ggccgcgttc gcgtagcacc cgcggtttga 240ttcggcttcc cgcaaggcgg cggccggtgg ccgtgccgcc gtagcttccg ccggaagcga 300gcacgccgcc gccgccgacc cggctctgcg tttgcaccgc cttgcacgcg atacatcggg 360atagatagct actactctct ccgtttcaca atgtaaatca ttctactatt ttccacattc 420atattgatgt taatgaatat agacatatat atctatttag attcattaac atcaatatga 480atgtaggaaa tgctagaatg acttacattg tgaattgtga aatggacgaa gtacctacga 540tggatggatg caggatcatg aaagaattaa tgcaagatcg tatctgccgc atgcaaaatc 600ttactaattg cgctgcatat atgcatgaca gcctgcatgc gggcgtgtaa gcgtgttcat 660ccattaggaa gtaaccttgt cattacttat accagtacta catactatat agtattgatt 720tcatgagcaa atctacaaaa ctggaaagca ataagaaata cgggactgga aaagactcaa 780cattaatcac caaatatttc gccttctcca gcagaatata tatctctcca tcttgatcac 840tgtacacact gacagtgtac gcataaacgc agcagccagc ttaactgtcg tctcaccgtc 900gcacactggc cttccatctc aggctagctt tctcagccac ccatcgtaca tgtcaactcg 960gcgcgcgcac aggcacaaat tacgtacaaa acgcatgacc aaatcaaaac caccggagaa1020gaatcgctcc cgcgcgcggc ggcgacgcgc acgtacgaac gcacgcacgc acgcccaacc1080ccacgacacg atcgcgcgcg acgccggcga caccggccgt ccacccgcgc cctcacctcg1140ccgactataa atacgtaggc atctgcttga tcttgtcatc catctcacca ccaaaaaaaa1200aaggaaaaaa aaacaaaaca caccaagcca aataaaagcg aca 1243<210>8<211>3077<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>表達(dá)盒
<400>8aaaaccaccg agggacctga tctgcaccgg ttttgatagt tgagggaccc gttgtgtctg 60gttttccgat cgagggacga aaatcggatt cggtgtaaag ttaagggacc tcagatgaac 120ttattccgga gcatgattgg gaagggagga cataaggccc atgtcgcatg tgtttggacg 180gtccagatct ccagatcact cagcaggatc ggccgcgttc gcgtagcacc cgcggtttga 240ttcggcttcc cgcaaggcgg cggccggtgg ccgtgccgcc gtagcttccg ccggaagcga 300gcacgccgcc gccgccgacc cggctctgcg tttgcaccgc cttgcacgcg atacatcggg 360atagatagct actactctct ccgtttcaca atgtaaatca ttctactatt ttccacattc 420atattgatgt taatgaatat agacatatat atctatttag attcattaac atcaatatga 480atgtaggaaa tgctagaatg acttacattg tgaattgtga aatggacgaa gtacctacga 540tggatggatg caggatcatg aaagaattaa tgcaagatcg tatctgccgc atgcaaaatc 600ttactaattg cgctgcatat atgcatgaca gcctgcatgc gggcgtgtaa gcgtgttcat 660ccattaggaa gtaaccttgt cattacttat accagtacta catactatat agtattgatt 720tcatgagcaa atctacaaaa ctggaaagca ataagaaata cgggactgga aaagactcaa 780cattaatcac caaatatttc gccttctcca gcagaatata tatctctcca tcttgatcac 840tgtacacact gacagtgtac gcataaacgc agcagccagc ttaactgtcg tctcaccgtc 900gcacactggc cttccatctc aggctagctt tctcagccac ccatcgtaca tgtcaactcg 960gcgcgcgcac aggcacaaat tacgtacaaa acgcatgacc aaatcaaaac caccggagaa1020gaatcgctcc cgcgcgcggc ggcgacgcgc acgtacgaac gcacgcacgc acgcccaacc1080ccacgacacg atcgcgcgcg acgccggcga caccggccgt ceacccgcgc cctcacctcg1140ccgactataa atacgtaggc atctgcttga tcttgtcatc catctcacca ccaaaaaaaa1200aaggaaaaaa aaacaaaaca caccaagcca aataaaagcg acaatttaaa tcaactaggg1260atatcacaag tttgtacaaa aaagcaggct tcacaatgac aactactggg tctaattcta1320atcacaacca ccatgaaagc aataataaca acaataaccc tagtactagg tcttggggca1380cggcggtttc aggtcaatct gtgtctacta gcggcagtat gggctctccg tcgagccgga1440gtgagcaaac catcaccgtt gttacatcta ctagcgaeac tacttttcaa cgcctgaata1500
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tgccataata ctcgaac 3077<210>9<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Dpb基序1<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(5)<223>Xaa不能天然產(chǎn)生的氨基酸<400>9Leu Asp Ile Xaa Xaa Asp Asp Ala1 5<210>10<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Dpb基序2<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa可以是Arg或Lys<400>10Lys Lys Lys Xaa Arg1 5<210>11<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Dpb基序3<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>Xaa不能天然產(chǎn)生的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>Xaa不能天然產(chǎn)生的氨基酸<400>11Ala Xaa Gly Xaa Asp Lys1 5<210>12<211>1550<212>DNA<213>玉米(Zea mays)<400>12gctccatttt gccccctcgc tcttcacttc ctccgctccg cttgttgtct ccttccctag 60ggtttgtcca gctccgcgct cagcctcgct cgctagctcc cgctctcctc gatcccgcgg 120ccccgatcag cgcgatctcc gcgcggccat ggtctccggc gcggcgcaca acccgggcgg 180gggcgccgcc gcccagacca cccagcgctc gccgccgcag ctgggggccc ggacggccct 240cgccacgccg ccgccggtct ccgggcgsgc cgcgcactcc gcgtctacta gcggcggcac 300cgctggttca ccaccgtcca gccgcagcga gcagcacgcc cccgacggtg ctgtcaaggg 360tcccgccctc gcgcgctgcg cccgcagcgg cggcggcggc gtccacgccc gccagcgaca 420gcacgttcct ccgcttgaac tcgacatcaa csgcgacgac gcgccgtcgt cgcaggctcc 480cacgagcaag aagaaaagga gaagcacacg ggcagtgggt cctgataaag gtaaccgggg 540actgcgccag tttagtatga aagtttgtga gaaagttgaa agtaaaggga gaacaacata 600taatgaggtg gcagatgaac ttgttgctga gtttacagac cccaataata atattgaggc 660accagaccct gataacccta atgcgcaaca atatgatgaa aaaaatattc gacgaagagt 720ttatgatgct ttaaatgttc tgatggctat ggacattata tctaaagata aaaaggagat 780ccagtggaag ggcttgccgc ggactagtat aagtgatatt gaagaattga agactgagct 840tgtgggactg aaaggtagaa ttgagaagaa aagtgtttac ttacaggagc tacaagatca 900atatgtaggt ttgcaaaacc tgattcaacg aaatgagcaa ctatatggtt caggaaacac 960accttctggt ggagtggctt tgccattcat cctagtccag acccgacctc atgcaaccgt1020ggaagttgag atatcagaag atatgcagct ggttcatttt gacttcaata gcactccatt1080tgagctgcat gatgactcat atgtcctaaa agaaatgcgg ttctgtggaa gagaacaaca1140
tgatggaact caagagtcga tatcaaatgg aggtgagagt tcaaacgtgt caaatattta 1200ttggcaacaa gcacagcata tggagatgcc aaacaatggc acagttaggt tatcaagctc 1260accgcctatt ccagggatat taaaagggcg tgtgaagcac gagcactagc gcttcggttt 1320tggtttcact ggcgttgtcg tctgagagca gtttgtttta ttacttttct ccgttgtgta 1380aagcgcctgt aaattattag gcaaggggga gggtagtagc tctgatctga tttasctctg 1440attggtagaa cgacgggtgt aattctatat ccttgattcg gttctttcgg tatggttgag 1500aaaagggttg acatgtaatt tgtrgrgcat tataaaaact aaaattgttg 1550<210>13<211>386<212>PRT<213>玉米<220>
<221>misc_feature<222>(40)..(40)<223>Xaa不能天然產(chǎn)生的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(102)..(102)<223>Xaa不能天然產(chǎn)生的氨基酸<400>13Met Val Ser Gly Ala Ala His Asn Pro Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gln1 5 10 15Thr Thr Gln Arg Ser Pro Pro Gln Leu Gly Ala Arg Thr Ala Leu Ala20 25 30Thr Pro Pro Pro Val Ser Gly Xaa Ala Ala His Ser Ala Ser Thr Ser35 40 45Gly Gly Thr Ala Gly Ser Pro Pro Ser Ser Arg Ser Glu Gln His Ala50 55 60Pro Asp Gly Ala Val Lys Gly Pro Ala Leu Ala Arg Cys Ala Arg Ser65 70 75 80Gly Gly Gly Gly Val His Ala Arg Gln Arg Gln His Val Pro Pro Leu85 90 95Glu Leu Asp Ile Asn Xaa Asp Asp Ala Pro Ser Ser Gln Ala Pro Thr100 105 110
Ser Lys Lys Lys Arg Arg Ser Thr Arg Ala Val Gly Pro Asp Lys Gly115 120 125Asn Arg Gly Leu Arg Gln Phe Ser Met Lys Val Cys Glu Lys Val Glu130 135 140Ser Lys Gly Arg Thr Thr Tyr Asn Glu Val Ala Asp Glu Leu Val Ala145 150 155 160Glu Phe Thr Asp Pro Asn Asn Asn Ile Glu Ala Pro Asp Pro Asp Asn165 170 175Pro Asn Ala Gln Gln Tyr Asp Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Val Tyr180 185 190Asp Ala Leu Asn Val Leu Met Ala Met Asp Ile Ile Ser Lys Asp Lys195 200 205Lys Glu Ile Gln Trp Lys Gly Leu Pro Arg Thr Ser Ile Ser Asp Ile210 215 220Glu Glu Leu Lys Thr Glu Leu Val Gly Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys225 230 235 240Lys Ser Val Tyr Leu Gln Glu Leu Gln Asp Gln Tyr Val Gly Leu Gln245 250 255Asn Leu Ile Gln Arg Asn Glu Gln Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Thr Pro260 265 270Ser Gly Gly Val Ala Leu Pro Phe Ile Leu Val Gln Thr Arg Pro His275 280 285Ala Thr Val Glu Val Glu Ile Ser Glu Asp Met Gln Leu Val His Phe290 295 300Asp Phe Asn Ser Thr Pro Phe Glu Leu His Asp Asp Ser Tyr Val Leu305 310 315 320Lys Glu Met Arg Phe Cys Gly Arg Glu Gln His Asp Gly Thr Gln Glu325 330 335Ser Ile Ser Asn Gly Gly Glu Ser Ser Asn Val Ser Asn Ile Tyr Trp340 345 350Gln Gln Ala Gln His Met Glu Met Pro Asn Asn Gly Thr Val Arg Leu355 360 365Ser Ser Ser Pro Pro Ile Pro Gly Ile Leu Lys Gly Arg Val Lys His370 375 380
Glu His385<210>14<211>1306<212>DNA<213>稻<220>
<221>misc_feature<222>(654)..(654)<223>n是a、c、g或t<400>14ccctccatcc atccatcccc cacctccgct ctctagggtt tctcccccgc ctcctccccc 60ccaatctcgc cgccgcgatg gtctccggcg cggcgcattc ggcctccacc agtggcggcg 120gcggggggag cgagggctcc cccaccggcc gcgccgcgcc gggcatgcag ggcggcggca 180gcgccgccac gcccgccgcc tcggcctccg cgtccacgcc ggccagcgag accaccgtcg 240cccgccgcct cgacggcctc gacatccagg gcgacgacgc gccctcgtcg cagcccgcca 300cgagcaagaa gaaaaaaagg gggacacgtg caacgggccc tgacaagggt ggccgtggat 360tgcgccaatt tagtatgaaa gtttgtgaga aagttgaaag caaagggaga acaacctaca 420acgaggtggc agatgagctt gtagctgagt ttgcagaccc caacaataat tttgcatcac 480ctgatcctga caaccctaac acaccacaat ttgatgagaa aaatatacga cgaagggttt 540atgatgcatt gaatgtcctg atggctatgg atattatatc taaggataaa aaggaaattc 600agtggaaggg cttgcctcgg acaagtatga gcgatgttga agaattgaag gttnagatca 660tcggactgaa aggtaggatc gacaagaaaa atgcatattt gcaggagtta gaagatcaat 720atgtaggttt gcaaaacctg attcaacgaa acgagcagct ttatggttca ggaaatgctc 780cttcaggagg agtggcattg ccatttatcc tagttcagac acgtcctcat gctacagtag 840aagtggagat atcagaagat atgcagctgg tgcattttga tttcaatagc actccatttg 900aactgcatga cgattccttt gtactgaaag cattggggtt ctctggcaaa gaaccagatg 960atacgcaagc ctgggttgga aatggaggtg agtgctcaac cacacctatc tatcatcaat1020caccccaagt tgcgaggcca aacggagtta gactaccaac atcgccccct attcccggta1080tacttaaagg gcgtgtcaag catgaacatt aggggttact atgatttgtt gatggtgtga1140
ggtacttggt ttatttgtta ctccccaatt ttcccttttt gtaactttac atgtagaaag 1200agcctgtaca ttagatcaat gggggaaaaa tggcgggtct agtttagttt cactggtaga 1260agatcgatgg gcatgttgac aaaccatatg cctaacttaa cttgta 1306<210>15<211>344<212>PRT<213>稻<220>
<221>misc_feature<222>(193)..(193)<223>Xaa不能天然產(chǎn)生的氨基酸<400>15Met Val Ser Gly Ala Ala His Ser Ala Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Set Glu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Ala Ala Pro Gly Met Gln Gly20 25 30Gly Gly Ser Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Thr Pro35 40 45Ala Ser Glu Thr Thr Val Ala Arg Arg Leu Asp Gly Leu Asp Ile Gln50 55 60Gly Asp Asp Ala Pro Set Ser Gln Pro Ala Thr Ser Lys Lys Lys Lys65 70 75 80Arg Gly Thr Arg Ala Thr Gly Pro Asp Lys Gly Gly Arg Gly Leu Arg85 90 95Gln Phe Ser Met Lys Val Cys Glu Lys Val Glu Ser Lys Gly Arg Thr100 105 110Thr Tyr Asn Glu Val Ala Asp Glu Leu Val Ala Glu Phe Ala Asp Pro115 120 125Asn Asn Asn Phe Ala Ser Pro Asp Pro Asp Asn Pro Asn Thr Pro Gln130 135 140Phe Asp Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Val Tyr Asp Ala Leu Asn Val145 150 155 160Leu Met Ala Met Asp Ile Ile Ser Lys Asp Lys Lys Glu Ile Gln Trp165 170 175Lys Gly Leu Pro Arg Thr Ser Met Ser Asp Val Glu Glu Leu Lys Val180 185 190
Xaa Ile Ile Gly Leu Lys Gly Arg Ile Asp Lys Lys Asn Ala Tyr Leu195 200 205Gln Glu Leu Glu Asp Gln Tyr Val Gly Leu Gln Asn Leu Ile Gln Arg210 215 220Asn Glu Gln Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Ala Pro Ser Gly Gly Val Ala225 230 235 240Leu Pro Phe Ile Leu Val Gln Thr Arg Pro His Ala Thr Val Glu Val245 250 255Glu Ile Ser Glu Asp Met Gln Leu Val His Phe Asp Phe Asn Ser Thr260 265 270Pro Phe Glu Leu His Asp Asp Ser Phe Val Leu Lys Ala Leu Gly Phe275 280 285Ser Gly Lys Glu Pro Asp Asp Thr Gln Ala Trp Val Gly Asn Gly Gly290 295 300Glu Cys Ser Thr Thr Pro Ile Tyr His Gln Ser Pro Gln Val Ala Arg305 310 315 320Pro Asn Gly Val Arg Leu Pro Thr Ser Pro Pro Ile Pro Gly Ile Leu325 330 335Lys Gly Arg Val Lys His Glu His340<210>16<211>1140<212>DNA<213>稻<400>16atggtctccg gcgtcgccca ccgcccggac gacgacggcg ggcgcgccgc ctcgacgttc 60cagcgcccgc cgcagccggc cggcgcgcgg ccgtccctgg ccacgccgcc gccctcgggc120ggagcgcaat ccgcttcgac gagcggcggg agcgcgggct ccccgtccag ccgcagcgag180cagcatgtcc ccgcagccgc aggcatggcg gcgggggcgg cggcggcctc tactccgatt240agtgagaata ccttcctccg cctcaacgac cttgacatcc acggcgacga tgcgccttcc300tcacaggctc caacgagcaa gaagaagaag agaggagcac gagcagttgg tcctgacaaa360ggtggcaggg ggctgcgcca gtttagtatg aaggtttgtg agaaagttga aagtaaaggg420agaacaacat acaacgaggt ggcagatgaa cttgttgccg aatttgcaga tcccaataac480
agcattttgc caccagatcc ggataatccc aatgcacaac aatatgacga gaaaaatata 540cggagaaggg tttatgatgc tctgaatgtt ctgatggcta tggagattat atctaaagat 600aaaaaggaaa ttcagtggaa ggggttgcct cgaaccagta taaatgatat tgaagatttg 660cagacggaac ttgtaggact gaaaagtagg attgagaaga aaaatacata tttgcaggag 720ctgcaagacc aatttgtagg tatgcaaaag ttgatacaaa gaaatgaaca gctatatggt 780tcaggaaaca ttccctcggg tggagttgca ttaccattta tccttgttca gacacggcct 840catgcaactg tggaagttga aatatcagaa gatatgcaac ttgtacattt tgactttaat 900agcacaccat ttgagttgca tgatgactca tttgtactga aagcaatgag ttcttgtgga 960gaagaacaaa tcgacggtat tcatgatcta atttcaaatg gaggtgagag ctcaagcatg1020ccaaatattt ataggcagca agtgcagcaa cctgcaagat caactaatgg tacagctaga1080ttgccaagct caccccctat tccaggaata ctgaaagggc gagtgaagca cgagcattag1140<210>17<211>379<212>PRT<213>稻<400>17Met Val Ser Gly Val Ala His Arg Pro Asp Asp Asp Gly Gly Arg Ala1 5 10 15Ala Ser Thr Phe Gln Arg Pro Pro Gln Pro Ala Gly Ala Arg Pro Ser20 25 30Leu Ala Thr Pro Pro Pro Ser Gly Gly Ala Gln Ser Ala Ser Thr Ser35 40 45Gly Gly Ser Ala Gly Ser Pro Ser Ser Arg Ser Glu Gln His Val Pro50 55 60Ala Ala Ala Gly Met Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ser Thr Pro Ile65 70 75 80Ser Glu Asn Thr Phe Leu Arg Leu Asn Asp Leu Asp Ile His Gly Asp85 90 95Asp Ala Pro Ser Ser Gln Ala Pro Thr Ser Lys Lys Lys Lys Arg Gly100 105 110Ala Arg Ala Val Gly Pro Asp Lys Gly Gly Arg Gly Leu Arg Gln Phe
115 120 125Ser Met Lys Val Cys Glu Lys Val Glu Ser Lys Gly Arg Thr Thr Tyr130 135 l40Asn Glu Val Ala Asp Glu Leu Val Ala Glu Phe Ala Asp Pro Asn Asn145 150 155 160Ser Ile Leu Pro Pro Asp Pro Asp Asn Pro Asn Ala Gln Gln Tyr Asp165 170 175Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Val Tyr Asp Ala Leu Asn Val Leu Met180 185 190Ala Met Glu Ile Ile Ser Lys Asp Lys Lys Glu Ile Gln Trp Lys Gly195 200 205Leu Pro Arg Thr Ser Ile Asn Asp Ile Glu Asp Leu Gln Thr Glu Leu210 215 220Val Gly Leu Lys Ser Arg Ile Glu Lys Lys Asn Thr Tyr Leu Gln Glu225 230 235 240Leu Gln Asp Gln Phe Val Gly Met Gln Lys Leu Ile Gln Arg Asn Glu245 250 255Gln Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Ile Pro Ser Gly Gly Val Ala Leu Pro260 265 270Phe Ile Leu Val Gln Thr Arg Pro His Ala Thr Val Glu Val Glu Ile275 280 285Ser Glu Asp Met Gln Leu Val His Phe Asp Phe Asn Ser Thr Pro Phe290 295 300Glu Leu His Asp Asp Ser Phe Val Leu Lys Ala Met Ser Ser Cys Gly305 310 315 320Glu Glu Gln Ile Asp Gly Ile His Asp Leu Ile Ser Asn Gly Gly Glu325 330 335Ser Ser Ser Met Pro Asn Ile Tyr Arg Gln Gln Val Gln Gln Pro Ala340 345 350Arg Ser Thr Asn Gly Thr Ala Arg Leu Pro Ser Ser Pro Pro Ile Pro355 360 365Gly Ile Leu Lys Gly Arg Val Lys His Glu His370 375<210>18<211>1041
<212>DNA<213>稻<400>18atggtctccg gcgcggcgca ttcggcctcc accagtggcg gcggcggggg gagcgagggc 60tcccccaccg gccgcgccgc gccgggcatg cagggcggcg gcagcgccgc cacgcccgcc 120gcctcggcct ccgcgtccac gccggccagc gagaccaccg tcgcccgccg cctcgacggc 180ctcgacatcc agggcgacga cgcgccctcg tcgcagcccg ccacgagcaa gaagaaaaaa 240agggggcctg gaacacgtgc aacgggccct gacaagggtg gccgtggatt gcgccaattt 300agtatgaaag tttgtgagaa agttgaaagc aaagggagaa caacctacaa cgaggtggca 360gatgagcttg tagctgagtt tgcagacccc aacaataatt ttgcatcacc tgatcctgac 420aaccctaaca caccacaatt tgatgagaaa aatatacgac gaagggttta tgatgcattg 480aatgtcctga tggctatgga tattatatct aaggataaaa aggaaattca gtggaagggc 540ttgcctcgga caagtatgag cgatgttgaa gaattgaaga cagagatcat cggactgaaa 600ggtaggatcg acaagaaaaa tgcatatttg caggagttag aagatcaatt tgtaggtctt 660caaaacttgg cacagcgaaa cgagcagctt tatggttcag gaaatgctcc ttcaggagga 720gtggcattgc catttatatt ggtgcagaca cgtcctcatg ctacagtaga agtggagata 780tcagaagata tgcagctggt gcattttgat ttcaatagca ctccatttga actgcatgac 840gattcctttg tactgaaagc attggggttc tctggcaaag aaccagatga tacgcaagcc 900tgggttggaa atggaggtga gtgctcaacc acacctatct atcatcaatc accccaagtt 960gcgaggccaa acggagttag actaccaaca tcgcccccta ttcccggtat acttaaaggg1020cgtgtcaagc atgaacatta g 1041<210>19<211>346<212>PRT<213>稻<400>19Met Val Ser Gly Ala Ala His Ser Ala Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Ser Glu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Ala Ala Pro Gly Met Gln Gly20 25 30
Gly Gly Ser Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Thr Pro35 40 45Ala Ser Glu Thr Thr Val Ala Arg Arg Leu Asp Gly Leu Asp Ile Gln50 55 60Gly Asp Asp Ala Pro Ser Ser Gln Pro Ala Thr Ser Lys Lys Lys Lys65 70 75 80Arg Gly Pro Gly Thr Arg Ala Thr Gly Pro Asp Lys Gly Gly Arg Gly85 90 95Leu Arg Gln Phe Ser Met Lys Val Cys Glu Lys Val Glu Ser Lys Gly100 105 110Arg Thr Thr Tyr Asn Glu Val Ala Asp Glu Leu Val Ala Glu Phe Ala115 120 125Asp Pro Asn Asn Asn Phe Ala Ser Pro Asp Pro Asp Asn Pro Asn Thr130 135 140Pro Gln Phe Asp Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Val Tyr Asp Ala Leu145 150 155 160Asn Val Leu Met Ala Met Asp Ile Ile Ser Lys Asp Lys Lys Glu Ile165 170 175Gln Trp Lys Gly Leu Pro Arg Thr Ser Met Ser Asp Val Glu Glu Leu180 185 190Lys Thr Glu Ile Ile Gly Leu Lys Gly Arg Ile Asp Lys Lys Asn Ala195 200 205Tyr Leu Gln Glu Leu Glu Asp Gln Phe Val Gly Leu Gln Asn Leu Ala210 215 220Gln Arg Asn Glu Gln Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Ala Pro Ser Gly Gly225 230 235 240Val Ala Leu Pro Phe Ile Leu Val Gln Thr Arg Pro His Ala Thr Val245 250 255Glu Val Glu Ile Ser Glu Asp Met Gln Leu Val His Phe Asp Phe Asn260 265 270Ser Thr Pro Phe Glu Leu His Asp Asp Ser Phe Val Leu Lys Ala Leu275 280 285Gly Phe Ser Gly Lys Glu Pro Asp Asp Thr Gln Ala Trp Val Gly Asn290 295 300
Gly Gly Glu Cys Ser Thr Thr Pro Ile Tyr His Gln Ser Pro Gln Val305 310 315 320Ala Arg Pro Asn Gly Val Arg Leu Pro Thr Ser Pro Pro Ile Pro Gly325 330 335Ile Leu Lys Gly Arg Val Lys His Glu His340 345<210>20<211>957<212>DNA<213>稻<400>20atggtctccg gcgcggcgca ttcggcctcc accagtggcg gcggcggggg gagcgagggc 60tcccccaccg gccgcgccgc gccgggcatg cagggcggcg gcagcgccgc cacgcccgcc120gcctcggcct ccgcgtccac gccggccagc gagaccaccg tcgcccgccg cctcgacggc180ctcgacatcc agggcgacga cgcgccctcg tcgcagcccg ccacgagcaa gaagaaaaaa240agggggcctg gaacacgtgc aacgggccct gacaagggtg gccgtggatt gcgccaattt300agtatgaaag tttgtgagaa agttgaaagc aaagggagaa caacctacaa cgaggtggca360gatgagcttg tagctgagtt tgcagacccc aacaataatt ttgcatcacc tgatcctgac420aaccctaaca caccacaatt tgatgagaaa aatatacgac gaagggttta tgatgcattg480aatgtcctga tggctatgga tattatatct aaggataaaa aggaaattca gtggaagggc540ttgcctcgga caagtatgag cgatgttgaa gaattgaaga cagagatcat cggactgaaa600ggtaggatcg acaagaaaaa tgcatatttg caggagttag aagatcaatt tgtaggtctt660caaaacttgg cacagcgaaa cgagcagctt tatggttcag gaaatgctcc ttcaggagga720gtggcattgc catttatatt ggtgcagcat tggggttctc tggcaaagaa ccagatgata780cgcaagcctg ggttggaaat ggaggtgagt gctcaaccac acctatctat catcaatcac840cccaagttgc gaggccaaac ggagttagac taccaacatc gccccctatt cccggtatac900ttaaagggcg tgtcaagcat gaacattagg ggttactatg atttgttgat ggtgtga 957<210>21<211>318<212>PRT<213>稻
<400>21Met Val Ser Gly Ala Ala His Ser Ala Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Ser Glu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Ala Ala Pro Gly Met Gln Gly20 25 30Gly Gly Ser Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Thr Pro35 40 45Ala Ser Glu Thr Thr Val Ala Arg Arg Leu Asp Gly Leu Asp Ile Gln50 55 60Gly Asp Asp Ala Pro Ser Ser Gln Pro Ala Thr Ser Lys Lys Lys Lys65 70 75 80Arg Gly Pro Gly Thr Arg Ala Thr Gly Pro Asp Lys Gly Gly Arg Gly85 90 95Leu Arg Gln Phe Ser Met Lys Val Cys Glu Lys Val Glu Ser Lys Gly100 105 110Arg Thr Thr Tyr Asn Glu Val Ala Asp Glu Leu Val Ala Glu Phe Ala115 120 125Asp Pro Asn Asn Asn Phe Ala Ser Pro Asp Pro Asp Asn Pro Asn Thr130 135 140Pro Gln Phe Asp Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Val Tyr Asp Ala Leu145 150 155 160Asn Val Leu Met Ala Met Asp Ile Ile Ser Lys Asp Lys Lys Glu Ile165 170 175Gln Trp Lys Gly Leu Pro Arg Thr Ser Met Ser Asp Val Glu Glu Leu180 185 190Lys Thr Glu Ile Ile Gly Leu Lys Gly Arg Ile Asp Lys Lys Asn Ala195 200 205Tyr Leu Gln Glu Leu Glu Asp Gln Phe Val Gly Leu Gln Asn Leu Ala210 215 220Gln Arg Asn Glu Gln Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Ala Pro Ser Gly Gly225 230 235 240Val Ala Leu Pro Phe Ile Leu Val Gln His Trp Gly Ser Leu Ala Lys245 250 255Asn Gln Met Ile Arg Lys Pro Gly Leu Glu Met Glu Val Ser Ala Gln260 265 270
Pro His Leu Ser Ile Ile Asn His Pro Lys Leu Arg Gly Gln Thr Glu275 280 285Leu Asp Tyr Gln His Arg Pro Leu Phe Pro Val Tyr Leu Lys Gly Val290 295 300Ser Ser Met Asn Ile Arg Gly Tyr Tyr Asp Leu Leu Met Val305 310 315<210>22<211>1640<212>DNA<213>歐洲山楊(Populus tremula)x美洲山楊(Populus tremuloides)<400>22caaatccaaa caacacgcgt ctctcttctg ttgctttatc atcaacctaa cccaaaccgc 60cactcctctt ctcttgtata actgaccgtt cccgtcactc tcccttttcc ttttcgttta 120ttaattcggt ataatttccc atcttttata tcttaatggt cgctggtggg gcccacctgg 180aagatggaga caggcaccct tcgtcggcct ccagaagagg aggaggagga ggagccacca 240cgggctcctg ggtgtctggc caatcggtgt caactagcgg cagcgtgggg tctccatcca 300gcaggagcga gcatgccatg gccactcccg ctagtgacag cactttctta aggttgaacc 360atctcgacat tcacgccgat gatgccgcca ctcaagatgc cgccgctaat aagaagaaaa 420agagaggtca acgggctgtt ggagctgata agagtggtag aggacttcgt caatttagca 480tcaaagtttg tgaaaaggtg gaatccaaag gaacaactac ttacaacgag gtagcagatg 540aacttgtcgc agagtttgct gacccaagca atagtgtttc caccccagat cagcaacaat 600atgacgagaa aaacatacgg cggagggtat atgatgctct gaatgtactc atggcattag 660atattatatc taaggataaa aaggaaatac agtggaaagg tcttccccga acaagcctaa 720gtgatattga agaattgaag gttgagcgtc ttggattgag aaatagattc gaaaagaaag 780ctgcctattt gcaagaactg gaggaacaat ttgtaggtct tcagaacctg atacagcgaa 840atgaacaact gtacagctca ggaaatgctc ctagtggtgg tgtgtcgttg ccttttattc 900tggtgcagac acgccctcat gcaactgttg aagtggagat atcagaagat atgcagctgg 960ttcactttga ttttaatagc actcccttcg agctccatga cgataattac gttctcaagg1020caatgaaatt ttgtgagaga cctcagagcg atggtatggc acccaatcca cctgctgatg1080
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權(quán)利要求
1.相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，改良植物生長(zhǎng)特性的方法，其包括在植物莖干組織中特異性增加DP多肽或其同源物的活性，和/或增加植物莖干組織中DP編碼基因或其功能變體的表達(dá)，以及任選選擇具有改良生長(zhǎng)特性的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中優(yōu)選在編碼DP多肽或其同源物的基因座上引入遺傳修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)所述增加活性和/或增加表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中通過(guò)定點(diǎn)誘變、定向進(jìn)化、同源重組、TILLING、T-DNA激活中的任一種或多種，以及通過(guò)將編碼DP多肽或其同源物的DP編碼核酸或其功能變體導(dǎo)入植物來(lái)實(shí)現(xiàn)所述遺傳修飾。
4.相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，改良植物生長(zhǎng)特性的方法，其包括將DP編碼核酸或其功能變體導(dǎo)入植物，并在莖干組織中特異性表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述功能變體是部分DP編碼核酸，或者能夠與DP編碼核酸雜交的序列，其中所述功能變體編碼的多肽具有(i)屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域的二聚化活性；和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的方法，其中所述DP編碼核酸或其功能變體，或DP多肽或其同源物是植物來(lái)源的，優(yōu)選來(lái)自雙子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自十字花科，進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自擬南芥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的方法，其中所述DP編碼核酸是(i)包括SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20或22，或其中任一個(gè)序列的功能變體的核酸，其中所述核酸或功能變體編碼的多肽包含(i)屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域的二聚化活性；和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或(ii)編碼SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21或23代表的蛋白質(zhì)，或編碼其中任一個(gè)序列的同源物的核酸，其中所述蛋白質(zhì)或同源物包含(i)屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域的二聚化活性；和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求4到7中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸或其功能變體在啟動(dòng)子的控制下，能夠在莖干組織中特異性表達(dá)所述DP編碼核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述啟動(dòng)子具有與β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)譜。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的方法，其中相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，所述改良的植物生長(zhǎng)特性是增加的生物量。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的方法，其中相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，所述改良的植物生長(zhǎng)特性是增加的產(chǎn)量，特別是增加的種子產(chǎn)量。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)的方法，其中相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，所述改良的植物生長(zhǎng)特性是增加的生長(zhǎng)速率。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的方法，其中所述改良的植物生長(zhǎng)特性是改變的構(gòu)造，特別是分蘗或?qū)?yīng)植物部分的增加的數(shù)量、尺寸、形狀中的一個(gè)或多個(gè)；枝條和/或葉的增加的量。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是單子葉植物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)的方法獲得的植物。
16.遺傳構(gòu)建體，其包括(a)DP編碼核酸或其功能變體；(b)能夠在莖干組織中驅(qū)動(dòng)核酸(a)表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄控制序列；及任選的(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的遺傳構(gòu)建體，其中所述控制序列能夠在幼生莖干組織中特異性表達(dá)所述DP編碼核酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的遺傳構(gòu)建體，其中所述控制序列是具有與β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)譜的啟動(dòng)子。
19.轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)所定義的遺傳構(gòu)建體。
20.轉(zhuǎn)基因植物或植物的部分，其包含權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)所定義的遺傳構(gòu)建體。
21.相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，產(chǎn)生具有改良生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(a)將根據(jù)權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞。
22.相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，具有改良生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物，所述改良生長(zhǎng)特性由導(dǎo)入所述植物的，在莖干特異性啟動(dòng)子控制下的DP編碼核酸或其功能變體產(chǎn)生。
23.根據(jù)權(quán)利要求15、19、20或22的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗或谷類(lèi)，如稻、小麥、大麥、玉米、粟、黑麥、燕麥或高梁。
24.權(quán)利要求15、19、20、22和23中任一項(xiàng)所定義的植物的部分，優(yōu)選可收獲部分，例如植物的種子或無(wú)性繁殖體。
25.權(quán)利要求15、19、20、22、23和24所定義的植物的后代，其中所述后代與其來(lái)源的親本植物呈現(xiàn)一種或多種相同的基因型特性。
26.直接來(lái)源于權(quán)利要求15、19、20、22、23到25中任一項(xiàng)所定義的植物或后代的產(chǎn)物。
27.在莖干特異性啟動(dòng)子控制下，DP編碼核酸或其功能變體用于改良植物生長(zhǎng)特性的用途，所述植物生長(zhǎng)特性選自以下一種或多種增加植物生物量、增加產(chǎn)量、增加種子產(chǎn)量、改變植物構(gòu)造和增加生長(zhǎng)速率。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)增加莖干組織中DP蛋白質(zhì)的活性或通過(guò)增加植物莖干組織中DP編碼基因的表達(dá)來(lái)改良植物生長(zhǎng)特性的方法。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明方法產(chǎn)生的，具有改良生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1993039SQ200580025230
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月28日
發(fā)明者V·弗蘭卡德, C·魯茲 申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司