通過abph2改良植物的農(nóng)學(xué)特性的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)植物的農(nóng)學(xué)特性的方法和組合物。本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)Abph2序列在宿主植物或植物細(xì)胞中的表達(dá)的方法，所述方法用于調(diào)節(jié)農(nóng)學(xué)特性諸如改變穗數(shù)量和增加產(chǎn)量。
【專利說明】通過ABPH2改良植物的農(nóng)學(xué)特性
[0001]相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002]本專利申請要求2012年3月14日提交的美國臨時申請N0.61/610690的權(quán)益，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0003]政府支持
[0004]本文所述發(fā)明受政府整體或部分支持，美國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)號為2011-67013-30031，由國家食品與農(nóng)業(yè)研究所(Nat1nal Institute of Food and Agriculture)以農(nóng)業(yè)和食品研究計劃競爭性贈款項目(Agriculture and Food Research Initiative CompetitiveGrants Program)資助。美國政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本公開涉及改良作物特性領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0006]植物形態(tài)和多樣性在很大程度上依賴于葉序的建立，所述葉序起始于莖尖分生組織(SAM)中的一團(tuán)干細(xì)胞。葉和產(chǎn)生分枝與花的腋生分生組織以規(guī)則模式起始于莖尖分生組織(SAM)。莖尖分生組織頂端的細(xì)胞用作干細(xì)胞，所述干細(xì)胞分裂以連續(xù)置換子細(xì)胞至周圍區(qū)域，其中它們進(jìn)入分化的葉或花原基。分生組織從而能夠在發(fā)育期間通過平衡細(xì)胞增殖與細(xì)胞進(jìn)入新的原基中來調(diào)節(jié)它們的尺寸。SAM提供植物體的所有地上部分。
[0007]在交叉對生(對生)模式中，葉片沿莖成對對生排列，連續(xù)的每一對(葉片)成90度取向。例如，例子，莎草屬(Cyprus)具有交叉對生模式。在二列(互生)模式中，單個葉片交替排列在莖的兩側(cè)。例如，玉米具有互生葉序。在旋生葉序中，單個葉片偏置角度約為137.5度。例子包括擬南芥(Arabidopsis)和其他植物。植物中葉序在發(fā)育過程中能夠改變。在玉米中，如上所述莖上的主葉排列成互生葉序，而穗上的外皮排列為旋生葉序。
[0008]生長素是控制葉序模式的重要因素。對玉米葉序突變體的研究表明細(xì)胞分裂素，以及它與生長素的串?dāng)_，在這個過程中起重要作用。
[0009]干細(xì)胞調(diào)控的中心概念通過CLAVATA/WUSCHEL(CLV/WUS)基因的信號途徑是已知的。在擬南芥(Arabidopsis)中CLV1、CLV2或CLV3活性的喪失導(dǎo)致莖端中未分化細(xì)胞的積累，表明CLV基因一起促進(jìn)了干細(xì)胞及時過渡至分化途徑、或抑制干細(xì)胞分裂、或兩者都有(Fletcher 等人(1999) Science283:1911-1914 ;Taguchi_Sh1bare 等人(2001) Genes andDevelopmentl5:2755-5766 ；和 Trotochaud 等人(1999)Plant Cellll:393-405 ；Merton等人(1954)Am.J.Bot.41:726-32 和 Szymkowiak 等人(1992)Plant Cell4:1089-100 ；Yamamoto 等人(2000)B1chim.B1phys.Acta.1491:333-40)。已經(jīng)報道了 CLV1/2 的玉米直系同源物為 TDl 和 FEA2 (Taguch1-Sh1bara 等人(2001) Genes Dev.6515:2755-66)。期望能夠控制苗和花分生組織的尺寸和外觀，從而提供提高的葉、花、和果實的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明的目的是為了提供用于調(diào)節(jié)分生組織發(fā)育的新型方法和組合物。
[0010]調(diào)節(jié)葉序和花序發(fā)育在改良作物植物的農(nóng)學(xué)特性中起重要作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]在一個實施例中，本公開提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有調(diào)節(jié)的Abph2的表達(dá)，所述方法包括以下步驟:(a)將包含可操作地連接至啟動子的多核苷酸序列的重組構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞中，其中所述多核苷酸序列的表達(dá)調(diào)節(jié)Abph2表達(dá)；(b)在步驟(a)后從可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)選擇(b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體并在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出調(diào)節(jié)的Abph2的表達(dá)。
[0012]一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有調(diào)節(jié)的Abph2的表達(dá)，所述方法包括:(a)將包含可操作地連接至啟動子的多核苷酸的重組構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞中，其中所述多核苷酸序列的表達(dá)調(diào)節(jié)Abph2的表達(dá)或活性；(b)在步驟(a)后從可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)選擇(b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組構(gòu)建體并在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時，表現(xiàn)出Abph2的表達(dá)的改變。
[0013]一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有調(diào)節(jié)的Abph2的表達(dá)，所述方法包括調(diào)節(jié)多核苷酸的表達(dá)，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列或與SEQ IDNO:1至少70%相同的序列。
[0014]一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有調(diào)節(jié)的Abph2的表達(dá)，所述方法包括調(diào)節(jié)多核苷酸的表達(dá)，所述多核苷酸編碼選自以下的氨基酸序列:SEQ ID N0:1和6-31、它們的功能結(jié)構(gòu)域、以及與SEQ ID NO:1和6_31至少70%相同的序列。
[0015]一種增加玉米植物產(chǎn)量的方法，所述方法包括轉(zhuǎn)基因改變Abph2基因的表達(dá)，使得每株玉米植物收獲的穗的數(shù)量相對于未經(jīng)此類轉(zhuǎn)基因改變的玉米植物增加。
[0016]【專利附圖】

【附圖說明】和序列表
[0017]根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可以更全面地理解本公開，以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。此序列表中以一個字母代碼表示核苷酸序列字符，以三個字母代碼表示氨基酸，如Nucleic Acids Researchl3:3021-3030 (1985)和B1chemical Journal219 (N0.2):345-373(1984)所描述的 IUPAC-1UBMB 標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，2):345-373(1984)，其以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循37C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)定。
[0018]圖1顯示了 Abph2突變型植物在大約第5葉后具有對生和交互對生葉片，并且莖分生組織比野生型植物寬。在一些遺傳背景中，Abph2植物發(fā)育了多個莖。圖1B和IC顯示在ABPH2植物中莖分生組織更寬。
[0019]圖2顯示了 Abph2的插入?yún)^(qū)域和基于作圖的克隆方法以分離Abph2等位基因。
[0020]圖3顯示了 Abph2基因座從它在7號染色體上的原始位置至新的染色體位置的可能易位。在原始位置和易位后的位置之間的近似染色體距離是大約800kb?！癎RX”表示谷氧還蛋白基因?！癇RF”表不分支超家族基因。
[0021]圖4A顯示了靶向EMS敲除篩選被用于開發(fā)兩種獨立的Abph2表型回復(fù)突變體，其在谷氧還蛋白基因中有突變。圖4B和圖4C分別顯示了兩種獨立突變體V65M和C75T。
[0022]圖5A顯示了 pAbph2::ABPH2_YFP轉(zhuǎn)基因擬表型Abph2A，并由熒光成像確認(rèn)(圖5B)。
[0023]圖6A顯示了與野生型植物相比Abph2在葉原基中的表達(dá)模式。圖6B中顯示了Abph2在花藥中的表達(dá)模式。
[0024]圖7A顯示了 ABPH2 (GRX)和FEA4 (bZIP)在核內(nèi)如何相互作用的模型。圖7B通過雙分子熒光互補顯示了 FEA4和ABPH2的相互作用(nYFP-ABPH2+cYFP_FEA4)。圖7C是負(fù)對照(nYFP-ASl+cYFP-FEA4)。
[0025]圖8經(jīng)由酵母雙雜交相互作用顯示了 ABPH2 (GRX)和FEA4(bZIP相互作用因子)的相互作用。SD/-LW無亮氨酸和色氨酸的合成缺陷性培養(yǎng)基；SD/-AHLW無腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸和色氨酸的合成缺陷性培養(yǎng)基。
[0026]圖9顯示了調(diào)控分生組織尺寸的途徑的示意圖，并且顯示了 ABPH2和FEA4的功能相互作用。
[0027]序列描述(表1)以及所附序列表遵循如37C.F.R.§ 1.821-1.825所列出的關(guān)于專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。此序列表中以一個字母代碼表示核苷酸序列字符，以三字母代碼表示氨基酸，如Nucleic AcidsRes.13 =3021-3030(1985)和B1chemicalJ.219(2) =345-373(1984)中，它們引入本文以供參考。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循如37C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)定。
[0028]表1
[0029]

【權(quán)利要求】
1.制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有調(diào)節(jié)的Abph2的表達(dá)，所述方法包括: a.將包含可操作地連接至啟動子的多核苷酸的重組構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞中，其中多核苷酸序列的表達(dá)調(diào)節(jié)Abph2的表達(dá)或活性； b.在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及 c.選擇(b)的所述轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組構(gòu)建體并在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出Abph2的表達(dá)的改變。
2.制備轉(zhuǎn)基因植物 的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有調(diào)節(jié)的Abph2的表達(dá)，所述方法包括調(diào)節(jié)所述多核苷酸的表達(dá)，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列或與SEQ ID NO:1至少70%相同的序列。
3.制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有調(diào)節(jié)的Abph2的表達(dá)，所述方法包括調(diào)節(jié)所述多核苷酸的表達(dá)，所述多核苷酸編碼選自以下的氨基酸序列:SEQ ID ΝΟ:1和6-31、它們的功能結(jié)構(gòu)域、以及與SEQ ID NO:1和6_31至少70%相同的序列。
4.增加玉米植物的產(chǎn)量的方法，所述方法包括轉(zhuǎn)基因改變Abph2基因的表達(dá)，使得每株玉米植物收獲的穗的數(shù)量相對于未經(jīng)轉(zhuǎn)基因改變的玉米植物是增加的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述Abph2基因編碼具有SEQID NO:1的氨基酸序列或與SEQ ID NO:1至少70%相同的序列的多肽。
6.提高植物的農(nóng)學(xué)特性的方法，所述方法包括: a.將包含分離的多核苷酸的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞中，所述多核苷酸以有義方向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子，其中所述多核苷酸包含: 1.SEQ ID NO:2或5的核苷酸序列； ii編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列、或基于ClustalV比對方法在與SEQ ID I進(jìn)行比較時與SEQ ID NO:1至少70%相同的序列； ii1.編碼選自以下的氨基酸序列的核苷酸序列:SEQID NO:1和6_31、它們的功能結(jié)構(gòu)域、以及與SEQ ID NO:1和6-31至少70%相同的序列；或 iv.能夠在嚴(yán)格條件下與(i)的所述核苷酸序列雜交的核苷酸序列； b.在步驟(a)之后再生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及 c.選擇(b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體并在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變，所述農(nóng)學(xué)特性選自:穗分生組織尺寸、果仁行數(shù)、葉片數(shù)、花序數(shù)、花序內(nèi)的分枝數(shù)、花數(shù)、果實數(shù)、種子數(shù)、生物量和產(chǎn)量。
7.鑒定Abph2的等位基因的方法，所述方法包括以下步驟: a.對一個突變型玉米植物群體進(jìn)行基因篩選； b.鑒定一種或多種表現(xiàn)出不同程度的Abph2表型的突變型玉米植物； c.從具有不同的Abph2表型的所述突變型玉米植物中鑒定所述Abph2等位基因。
8.鑒定Abph2的更弱等位基因的方法，所述方法包括以下步驟: a.使用一種或多種核苷酸序列進(jìn)行基因改組，所述核苷酸序列編碼SEQ ID ΝΟ:1和6-31、或與SEQ ID NO:1和6-31約70%相同的蛋白質(zhì)、或它們的片段；b.將來自步驟(a)的所述經(jīng)改組的序列轉(zhuǎn)化進(jìn)一個可再生的植物細(xì)胞群體中； c.從步驟(b)的所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的可再生的植物細(xì)胞群體中再生轉(zhuǎn)化植物群體； d.對于Abph2表型，篩選來自步驟(c)的轉(zhuǎn)化植物群體；以及 e.從表現(xiàn)出Abph2表型的轉(zhuǎn)化植物中鑒定具有所期望的Abph2表型的植物。
9.植物，其中所述內(nèi)源性Abph2基因的表達(dá)相對于對照植物是減少的。
10.植物，其中所述內(nèi)源性Abph2基因的表達(dá)相對于對照植物是增加的。
11.植物，其中所述內(nèi)源性Abph2基因的表達(dá)被改變使得在胚胎形成期間相對于對照植物所述Abph2基因的表達(dá)被改變。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項所述的植物，其中所述Abph2的表達(dá)被轉(zhuǎn)基因改變。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項所述的植物，其中所述Abph2的表達(dá)通過引起誘變而被改變。
14.制備根據(jù)權(quán)利要求11所述的植物的方法，所述方法包括以下步驟: a.將突變導(dǎo)入所述內(nèi)源性Abph2基因中；以及 b.檢測所述突變 。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述步驟(a)和(b)利用定向誘導(dǎo)基因組局部突變(TILLING)方法完成，并且其中所述突變對于改變所述內(nèi)源性Abph2基因的表達(dá)或其活性是有效的。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述突變是位點特異性突變。
17.制備根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物的方法，其中所述方法包括以下步驟: a.使用轉(zhuǎn)座子將插入序列導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞的所述內(nèi)源性Abph2基因中； b.從步驟(a)的所述可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述轉(zhuǎn)座子插入序列； c.從步驟(b)選擇轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含步驟(a)的所述插入序列并表現(xiàn)出Abph2的表達(dá)的改變。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述植物選自:擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、加拿大雙低油菜(canola)、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
19.植物，所述植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含以有義方向可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO:1和6-31、它們的功能結(jié)構(gòu)域、以及與SEQ ID NO:1和6-31至少70%相同的序列，其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變，所述農(nóng)學(xué)特性選自:增大的穗分生組織、果仁行數(shù)、種子數(shù)、生物量和產(chǎn)量。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物，其中所述植物選自:擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、加拿大歡低油菜、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的植物的種子。
22.在植物中表達(dá)異源性多核苷酸的方法，所述方法包括: a.用包含Abph2多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化可再生的植物細(xì)胞，所述Abph2多核苷酸可操作地連接至第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是莖尖分生組織優(yōu)選的啟動子; b.在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及 c.選擇(b)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體并且其中所述異源性多核苷酸還在所述轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述植物選自:擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、加拿大歡低油菜、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
24.植物，所述植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至第二多核苷酸的Abph2多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是莖尖分生組織優(yōu)選的啟動子并且其中所述異源性多核苷酸在所述植物中表達(dá)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的植物，其中所述植物選自:擬南芥、番茄、玉米、大豆、向日葵、高粱、加拿大歡低油菜、小麥、苜猜、棉花、稻、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
26.鑒定具有至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變的第一玉米植物或第一玉米種質(zhì)的方法，所述方法包括在所述第一玉米植物或所述第一玉米種質(zhì)中檢測與所述表型相關(guān)的標(biāo)記基因座的至少一種多態(tài)性，其中所述標(biāo)記基因座編碼包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列選自:SEQ ID NO:1和6-31、或與SEQ ID NO:1和6-31約70%相同的蛋白質(zhì)，其中在與對照植物進(jìn)行比較時所述多肽在植物或其植物部分中的表達(dá)導(dǎo)致至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變，所述農(nóng)學(xué)特性選自:穗分生組織尺寸、果仁行數(shù)、花序數(shù)、花序內(nèi)的分枝數(shù)、花數(shù)、果實數(shù)和種子數(shù)。
27.玉米植物，所述玉米植物在其基因組中包含谷氧還蛋白基因，其中所述谷氧還蛋白基因位于包含SEQ ID NO:5的基因組區(qū)域內(nèi)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的玉米植物，其中SEQID NO:5由7號染色體中的BRF基因界定。
29.漸滲包含遺傳變化的玉米植物的方法，其中所述遺傳變化導(dǎo)致編碼氨基酸序列的多核苷酸的表達(dá)的改變，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO:1和6-31、它們的功能結(jié)構(gòu)域、以及與SEQ ID NO:1和6-31至少70%相同的序列，所述方法包括:(a)選擇表現(xiàn)出Abph2表型或其變體的玉米植物，以及(b)將所述玉米植物與一種或多種原種玉米種質(zhì)雜交。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述Abph2表型的選擇是標(biāo)記輔助的。
31.編碼氨基酸序列的分離的多核苷酸，所述氨基酸序列選自SEQID NO:6-31、它們的功能結(jié)構(gòu)域、以及與SEQ ID NO:6-31至少70%相同的序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的多核苷酸是重組的。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的多核苷酸在異源宿主中表達(dá)。
【文檔編號】C12N9/02GK104169424SQ201380013650
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月14日
【發(fā)明者】D.P.賈克森, S.M.艾倫, R.約翰遜, V.拉卡, F.楊 申請人:納幕爾杜邦公司, 冷泉港實驗室