專利名稱：改變植物生長特性的方法
本申請涉及一種改變植物的生長特性的方法。更為具體地說，本發(fā)明涉及通過改變編碼甲硫氨酸氨肽酶(MAP蛋白)的核酸的表達(dá)和/或通過改變植物中MAP蛋白的水平和/活性，來改變植物生長特性的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)改變和/或MAP蛋白水平和/或活性改變的植物，該植物具有相對于相應(yīng)的野生型植物發(fā)生改變的生長特性。
基于不斷增長的世界人口，提高農(nóng)業(yè)效率仍然是農(nóng)業(yè)研究的一個主要目標(biāo)。農(nóng)作物和園藝提高的傳統(tǒng)方式采用選擇育種技術(shù)來識別具有需要的特性的植物。然而，這種選擇育種技術(shù)具有幾個缺點，即，這些技術(shù)通常是勞動密集型的，因此導(dǎo)致經(jīng)常含有異源性遺傳組分的植物，可能不總是具有從親本植物傳承的需要的性質(zhì)。相反，分子生物學(xué)的進(jìn)步已經(jīng)允許人類更精確地改變植物的胚質(zhì)。植物的遺傳工程學(xué)使分離和操縱遺傳材料(通常以DNA或RNA的形式)以及隨后將遺傳材料導(dǎo)入植物成為可能。這種技術(shù)已經(jīng)導(dǎo)致具有例如提高的產(chǎn)量的多種改良的經(jīng)濟學(xué)、農(nóng)藝學(xué)或園藝學(xué)特性的植物的產(chǎn)生。
影響一個或更多的植物生長特性的能力將在多個領(lǐng)域具有許多應(yīng)用，例如產(chǎn)量提高、作物育種、生產(chǎn)觀賞植物、樹木的培植、園藝、林學(xué)、生產(chǎn)藻類或作物(例如用作生物反應(yīng)器、生產(chǎn)醫(yī)藥品例如抗體或疫苗、或有機廢料的生物轉(zhuǎn)化、或在高產(chǎn)藻類或植物的情形下用作燃料)等領(lǐng)域。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)改變植物中編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)和/或改變植物中MAP蛋白的水平和/或活性使植物具有改良的生長特性。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種相對于相應(yīng)的野生型植物改變植物生長特性的方法，包括改變植物中編碼甲硫氨酸氨肽酶(MAP)蛋白核酸的表達(dá)和/或改變植物中MAP蛋白的水平和/或活性。
這里所用的術(shù)語“改變”用來指位置和/或時間的提高、減少和/或改變。改變編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)或改變MAP蛋白本身的水平和/或活性，包括在特定的細(xì)胞或組織中，與相應(yīng)野生型植物中MAP基因或蛋白的表達(dá)、水平和/或活性相比較時，改變基因的表達(dá)和/或基因產(chǎn)物，即多肽的水平和/或活性。改變的基因表達(dá)可以由改變內(nèi)源性MAP基因的表達(dá)產(chǎn)生和/或可以由改變預(yù)先導(dǎo)入植物的MAP基因的表達(dá)而產(chǎn)生。類似地，改變MAP蛋白的水平和/或活性可以由于改變內(nèi)源性MAP核酸或蛋白的表達(dá)和/或可以由于改變預(yù)先導(dǎo)入植物的MAP核酸或蛋白的表達(dá)?？梢酝ㄟ^例如化學(xué)方法和/或重組方法來達(dá)到改變核酸/基因的表達(dá)和/或改變基因產(chǎn)物/蛋白的水平和/或活性的效果。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施方案，改變編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)和/或改變MAP蛋白的水平和/或活性可以通過重組方法來實現(xiàn)。這種重組方法可以包括直接和/或間接方法。
例如，一種間接重組方法可以包括向植物中導(dǎo)入能夠改變MAP基因表達(dá)的核酸和/或能夠改變MAP蛋白水平和/或活性的核酸。這些能被導(dǎo)入植物中的核酸的例子包括編碼與MAP基因啟動子結(jié)合或與MAP蛋白相互作用的轉(zhuǎn)錄因子或活化劑或抑制劑的核酸。檢測這些類型的相互作用的方法和分離編碼這種相互作用者的核酸的方法包括酵母單雜交或酵母雙雜交篩查，其中MAP基因/蛋白用作誘餌。因此，改變編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)和/或改變MAP蛋白水平和/或活性可以通過降低或增高控制MAP基因表達(dá)或直接或間接使MAP蛋白活化(失活)的因子的水平而實現(xiàn)。進(jìn)一步地，改變MAP蛋白的水平和/或活性可以通過改變能夠與MAP蛋白相互作用的因子的水平而實現(xiàn)。這種因子可以包括MAP蛋白的配體或天然靶標(biāo)/底物。這種靶標(biāo)的例子包括真核起始因子eIF2，是蛋白翻譯起始復(fù)合物的一部分。
還包括一種改變MAP基因的表達(dá)和/或改變MAP蛋白的水平和/或活性的間接重組方法，即提供抑制或刺激驅(qū)動例如內(nèi)源性MAP基因的MAP基因表達(dá)的調(diào)控元件。例如，導(dǎo)入植物的調(diào)控元件可以是能夠驅(qū)動內(nèi)源性MAP基因表達(dá)的啟動子。
優(yōu)選的改變編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)和/或改變MAP蛋白的水平和/或活性的重組方法包括向植物中導(dǎo)入能夠改變編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)的核酸和/或能夠改變MAP蛋白水平和/或活性的核酸。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種如上所述的改變植物生長特性的方法，其中改變表達(dá)、水平和/或活性通過向植物中導(dǎo)入能夠改變編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)和/或能夠改變MAP蛋白的水平和/或活性的核酸。根據(jù)該方法一個更直接和優(yōu)選的具體實施方式
，如下所述，該核酸是一種編碼MAP蛋白或其變體的核酸，或是編碼MAP蛋白的核酸的變體。編碼MAP蛋白的核酸可以是野生型，即，天然的或內(nèi)源性的?；蛘?，該核酸可以是異源性的，即，來自同種或另一物種，該核酸可以作為轉(zhuǎn)基因?qū)?。該轉(zhuǎn)基因的組成和/或基因組環(huán)境可以通過精密的人工操作而從其天然形式充分地改變。
另外地或可選地，可以通過化學(xué)方法達(dá)到改變編碼MAP蛋白核酸的表達(dá)和/或改變MAP蛋白本身的水平和/或活性的效果。這種化學(xué)方法可以涉及外源性應(yīng)用一種或多種能改變MAP核酸(內(nèi)源性基因或?qū)胫参?的表達(dá)和/或能夠改變MAP蛋白(內(nèi)源性基因或?qū)胫参?的水平和/或活性的化合物或元件。這里定義的術(shù)語“外源性應(yīng)用”用來表示將合適的化合物或元件與植物接觸或給予植物、植物細(xì)胞、組織或器官。該化合物或元件可以以適合植物攝入的方式外源性地應(yīng)用于植物(例如通過施用到土壤中通過根來吸收，或在一些植物中直接施用于葉子，如通過噴霧)。外源性應(yīng)用可能在野生型植物或預(yù)先用MAP核酸/基因或其它轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行。
適合外源性應(yīng)用的合適化合物或元件包括MAP蛋白或MAP核酸。可選地，合適的化合物和元件包括那些能夠直接或間接與MAP蛋白結(jié)合或使其活化或失活的物質(zhì)。合適的化合物還包括能夠識別或模擬MAP蛋白功能的抗體。這些抗體可以包括“植物抗體(plantibodies)”、單鏈抗體、IgG抗體和重鏈camel抗體及其片段。其它合適的化學(xué)改變MAP基因或蛋白表達(dá)、活性和/或水平的化合物和元件包括誘導(dǎo)突變的物質(zhì)，例如N-亞硝基-N-乙基脲(N-nitroso-N-ethylurea)、吖丙啶(ethylene imine)、甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate)和硫酸二乙酯。突變形成也可以通過暴露于離子放射，例如X線或γ線或紫外光來實現(xiàn)。引入突變和檢測突變效果的方法(例如通過監(jiān)測基因表達(dá)和/或蛋白活性)是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種改變植物生長特性的方法，包括外源性應(yīng)用一種或多種能改變MAP基因的表達(dá)和/或能夠改變MAP蛋白的水平和/或活性的化合物或元件。
文獻(xiàn)中描述甲硫氨酸氨肽酶(MetAP或MAP)負(fù)責(zé)在蛋白質(zhì)合成期間去除肽的起始甲硫氨酸殘基(Bradshaw和Yi，2002，EssaysBiochem3865-78)。甲硫氨酸氨肽酶是屬于金屬酶家族的一種特異性的和普遍存在的酶。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞具有兩類甲硫氨酸氨肽酶(MAP1和MAP2)，而原核細(xì)胞只有一種。已知MAP2也已知為真核起始因子2α(eIF2α)相關(guān)蛋白p67。已經(jīng)證明大鼠p67除了它的肽酶功能外，也通過防止起始因子2的α亞基的磷酸化而在翻譯調(diào)控中發(fā)揮重要作用。相應(yīng)地，除了其肽酶活性外，MAP2蛋白具有非蛋白水解功能，以保護(hù)eIF2α不被磷酸化(POEP)，eIF2α在磷酸化狀態(tài)時是沒有活性的(DattaR等人Biochimie.2001 83919-31)。已經(jīng)研究了多種生物體的MAP蛋白，關(guān)于它們的功能和它們的結(jié)構(gòu)?；谛蛄蟹治?，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MAP蛋白具有MAP標(biāo)簽以及肽酶結(jié)構(gòu)域。例如，MAP1蛋白的典型的結(jié)構(gòu)特性是一個MAP1標(biāo)簽(PROSITE PS00680＝[MFY]-x-G-H-G-[LIVMC]-[GSH]-x(3)-H-x(4)-[LIVM]-x-[HN]-[YWVH])以及一個pFAM PEPTIDASE_M24結(jié)構(gòu)域。MAP2蛋白的典型的結(jié)構(gòu)特性包括一個MAP2標(biāo)簽(PROSITE PS01202＝[DA]-[LIVMY]-x-K-[LIVM]-D-x-G-x-[HQ]-[LIVM]-[DNS]-G-x(3)-[DN])以及一個pFAM PEPTIDASE_M24結(jié)構(gòu)域。MAP2蛋白，例如植物MAP2蛋白，另外在N末端還包括至少一個富含賴氨酸的結(jié)構(gòu)域。在Li和Chang，(1995)Proc Natl Acad Sci USA.92(26)12357-61中已經(jīng)描述了從酵母中分離的MAP蛋白，在Li和Chang，(1996)Biochem Biophys Res Commun 227152-159中已經(jīng)描述了人MAP蛋白，且從鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)中克隆了6個MAP cDNAs，而且在體內(nèi)和體外鑒定了相應(yīng)的蛋白(Giglione等人EMBO J.2000195916-29)。一個鼠耳芥MAP蛋白的例子在此由SEQ ID NO 2表示，SEQ ID NO 1表示其編碼序列。另一個鼠耳芥MAP蛋白的例子在此由SEQ ID NO 4表示，SEQ ID NO 3表示其編碼序列。
這里采用的術(shù)語“MAP蛋白”包括甲硫氨酸氨肽酶(MAP)，例如SEQID NO 2或4的MAP及其變異體(或基本與其類似的蛋白)。術(shù)語“MAP基因”或“MAP核酸”或“編碼MAP蛋白的核酸”這里可以交互使用，也包括MAP核酸變體，例如SEQ ID NO 1或3的變體，術(shù)語“變體”、“基本類似”這里可以交互使用。變體MAP蛋白或編碼MAP蛋白的變體核酸包括(i)MAP核酸，例如SEQ ID NO 1或3的MAP核酸的功能部分；(ii)能夠與MAP核酸，例如與SEQ ID NO 1或3的MAP核酸雜交的序列；
(iii)MAP核酸，例如SEQ ID NO 1或3的MAP核酸的可變剪接變體；(iv)MAP核酸，例如SEQ ID NO 1或3的MAP核酸的等位基因變體；以及(v)MAP蛋白，例如SEQ ID NO 2或4的MAP蛋白的同源物、衍生物和活性片段。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的方法也可以用變體MAP蛋白或變體MAP核酸實行。合適的變體包括SEQ ID NO 2或4和/或SEQ ID NO 1或3的變體，然而，應(yīng)當(dāng)清楚本發(fā)明的應(yīng)用既不限于SEQ ID NO 1或3代表的核酸的應(yīng)用也不限于編碼SEQ ID NO 2或4所代表的氨基酸序列的核酸的應(yīng)用，而是其它編碼SEQ ID NO 2變體的核酸均可以用于本發(fā)明的方法。
對于根據(jù)本發(fā)明的方法的應(yīng)用，MAP蛋白優(yōu)選包括下列結(jié)構(gòu)域的任意一個或兩個a)MAP標(biāo)簽(Signature)b)肽酶_M24結(jié)構(gòu)域優(yōu)選的MAP蛋白包含上述級別順序的所有結(jié)構(gòu)域。
術(shù)語“變體”也包括以互補物、DNA、RNA、cDNA或基因組DNA形式的變體。變體核酸可以被全部或部分合成，可以為雙鏈核酸或單鏈核酸。術(shù)語“變體”也包括由于遺傳密碼的簡并性的變體；基因或蛋白的家族成員；以及被一個或多個例如內(nèi)含子或轉(zhuǎn)座子的插入序列中斷的變體。
一種編碼MAP蛋白的變體核酸為編碼MAP蛋白的核酸的功能部分。簡便地，本發(fā)明的方法也可以用編碼MAP蛋白的核酸的部分進(jìn)行操作。功能部分指來源于或制備于原始(較大)的DNA分子的DNA片段，該部分保留原始DNA至少一部分的功能，當(dāng)植物中表達(dá)時，賦予植物改變的生長特性。該部分可以包括許多基因，含有或沒有附加的調(diào)控元件或可以包括間隔序列。該部分可以通過在核酸中生成一個或多個缺失和/或截短而形成?，F(xiàn)有技術(shù)中熟知向核酸引入截短和缺失的技術(shù)。通過用要測驗功能的部分簡單地替代實際實施例所采用的序列，可以按照實施例部分的描述的方法容易地確定適合本發(fā)明的方法的部分。
另一種編碼MAP蛋白的核酸的變體為能夠與編碼MAP的核酸雜交的序列，例如，與編碼SEQ ID NO 2或4所代表的蛋白的任意核酸雜交?？梢匀菀椎卮_定適合用于本發(fā)明方法的雜交序列，例如按照實施例部分描述的方法，用雜交序列簡單地替代實際實施例所采用的序列。
這里采用的術(shù)語“雜交”指在雜交過程中與基本同源互補核苷酸序列退火。雜交過程可以完全在溶液中進(jìn)行，即，互補核酸都在溶液中。依賴于這一過程的分子生物學(xué)工具包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR；以及所有以此為基礎(chǔ)的方法)、差減雜交、隨機引物延伸、核酸酶S1作圖、引物延伸、反轉(zhuǎn)錄、cDNA合成、RNAs差異顯示、以及DNA序列確定。雜交過程的發(fā)生也可以其中一個互補核酸固定于基質(zhì)，例如磁珠、瓊脂糖凝膠或其它樹脂。依賴于這一過程的分子生物學(xué)工具包括分離聚腺苷酸(A+)mRNA。此外，雜交過程的發(fā)生可以其中一個互補核酸固定于固體支持物，例如硝酸纖維素或尼龍膜，或者用如照相平版的方式固定于例如硅玻璃支持物(后者已知為核酸陣列或微陣列或核酸芯片)。依賴于這一過程的分子生物學(xué)工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、克隆雜交、斑點雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了允許雜交的發(fā)生，核酸分子通常被加熱或用化學(xué)方法變性從而由雙鏈熔解為兩條單鏈和/或從單鏈核酸中去除發(fā)卡結(jié)構(gòu)或其它的二級結(jié)構(gòu)。例如溫度、鈉鹽濃度和雜交緩沖液成分的條件都影響著雜交的嚴(yán)格性。雜交的高度嚴(yán)格性條件包括較高的溫度和/或低鹽濃度(包括NaCl和檸檬酸鈉(Na3-citrate)的鹽)和/或雜交緩沖液中甲酰胺的存在和/或降低雜交緩沖液中例如SDS(十二烷基硫酸鈉去垢劑)的化合物的濃度和/或從雜交緩沖液中排除葡聚糖硫酸鹽或聚乙二醇(提高分子擁擠度)等化合物。常規(guī)的雜交條件參見，例如Sambrook(2001)分子克隆實驗室手冊，第3版，冷泉港實驗室出版社，CSH，紐約，但熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到根據(jù)核酸序列的已知或期望的同源性和/或長度可以設(shè)計許多不同的雜交條件。特別優(yōu)選足夠低的雜交嚴(yán)格度條件(至少在第一種情形)來分離與本發(fā)明先前定義的不同的核酸。低嚴(yán)格度條件的例子為4-6x SSC/0.1-0.5％w/v SDS，37-45℃，2-3小時。根據(jù)雜交中涉及核酸的來源和濃度，可以采用可選的嚴(yán)格度條件，例如中等嚴(yán)格度條件。中等嚴(yán)格度條件的例子包括1-4x SSC/0.25％w/v SDS，≥45℃，2-3小時。特異性雜交表示在嚴(yán)格條件下雜交。高嚴(yán)格度條件的例子包括0.1-2XSSC，0.1XSDS，以及1X SSC，0.1X SDS，60℃，2-3小時。
本發(fā)明的方法也可以應(yīng)用編碼MAP蛋白的核酸的可變剪接變體，例如SEQ ID NO 1或3的可變剪接變體。這里應(yīng)用的術(shù)語“可變剪接變體”包括核酸序列的變體，其中選擇的內(nèi)含子和/或外顯子已經(jīng)被切除、替代或加入。這種剪接變體可以在自然界中找到或人工制造。現(xiàn)有技術(shù)中熟知制造這種剪接變體的方法。可以容易地確定適合用于本發(fā)明方法的剪接變體，例如，可以按照實施例部分描述的方法，用剪接變體簡單地替代實際實施例所采用的序列。
另一個在本發(fā)明的改變植物生長特性方法的實踐中可應(yīng)用的MAP核酸變體為MAP基因的等位基因變體，例如SEQ ID NO 1或3的等位基因變體。自然界中存在的以及本發(fā)明的方法所包含的等位基因變體為這些天然等位基因的應(yīng)用。等位基因變體也包括單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，以及小插入/缺失多態(tài)性(INDELs)。INDELs的大小通常小于100bp。在多數(shù)生物體的自然發(fā)生的多態(tài)系中，SNPs和INDELs組成了最大一組的序列變體。適合用于本發(fā)明方法的等位基因變體可以容易地被確定，例如按照實施例部分描述的方法，用等位基因變體簡單地替代實際實施例所采用的序列。
本發(fā)明提供了改變植物生長特性的方法，包括改變植物中編碼MAP蛋白的核酸的可變剪接變體或等位基因變體的表達(dá)和/或改變植物中可變剪接變體或等位基因變體編碼的MAP蛋白的水平和/或活性。
本發(fā)明方法的實踐中可采用的變體MAP蛋白的一個例子為MAP蛋白的同源物。特定MAP蛋白的“同源物”包括相對于特定MAP蛋白而言具有氨基酸的替代、缺失和/或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，且具有與MAP蛋白類似的生物學(xué)和功能活性。MAP蛋白的同源物可以通過基因工程和/或蛋白工程技術(shù)人工制造。為生產(chǎn)這種同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸可以被其他具有類似性質(zhì)(例如類似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-片層結(jié)構(gòu)的傾向性)的氨基酸替代。現(xiàn)有技術(shù)中熟知保守的替代目錄(參見如Creighton(1984)蛋白質(zhì)，W.H.Freeman and Company)。
另外和/或可選地，特定MAP蛋白的同源物存在于自然界，且可以在與特定MAP蛋白來源相同或不同物種中找到。兩種特殊類型的同源物，直向同源物(orthologues)和共生同源物(paralogues)是用來描述基因的遺傳關(guān)系的進(jìn)化概念。術(shù)語直向同源物(orthologues)涉及在不同的生物體中根據(jù)遺傳關(guān)系確定的同源性基因。術(shù)語“共生同源物”涉及在物種的基因組內(nèi)導(dǎo)致共生同源(paralogues)基因的基因副本。因此這里采用的術(shù)語MAP的“同源物”(homologue)也包括了可用于對本發(fā)明方法的實踐中的MAP蛋白的共生同源物(paralogues)和種直向同源物(orthologues)。
本發(fā)明的方法中應(yīng)用的同源物具有以漸增的優(yōu)選順序的至少20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的與SEQ ID NO 2或SEQID NO4的序列同一性，優(yōu)選在SEQ ID NO 2或4的全長范圍。
序列同一性的百分比可以用成對整體對比程序，執(zhí)行Needleman-Wunsch算法(J.Mol.Biol.48443-453，1970)，使匹配數(shù)目最大化以及缺口數(shù)目最小化來計算。為計算上述的百分比，采用Align X程序(Vector NTI Suite5.5的一部分)，采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)和可變參數(shù)缺口開放罰分10(Gap opening penalty10)和缺口延伸罰分0.1(Gap extension penalty0.1)。
多種來源的MAP蛋白的多重序列對比用標(biāo)準(zhǔn)固定參數(shù)和可變參數(shù)缺口開放罰分10(GAP opening penalty10)和缺口延伸罰分0.2(GAPextension penalty0.2)的ClustalX程序產(chǎn)生。用BoxShade軟件(可在http//www.isrec.isb-sib.ch/ftp-server/boxshade/獲得)計算該多重線性對比的蛋白之間的同一性百分比。表I給出了這些百分比的總覽。
表I不同MAP蛋白之間的序列同一性
本發(fā)明的方法有用的同源物可以從任何來源獲得(直接或間接，即如果隨后進(jìn)行改變)，只要當(dāng)在植物中表達(dá)時，導(dǎo)致生長特性的改變。該核酸可以從微生物來源中分離，例如細(xì)菌、酵母或真菌，或來源于植物、藻類、昆蟲或動物(包括人類)。
編碼MAP同源物的核酸優(yōu)選分離自植物。更優(yōu)選的，該核酸來自雙子葉植物，優(yōu)選來十字花科(Brassicaceae)，進(jìn)一步優(yōu)選來自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)?；谛蛄型葱缘乃?，鼠耳芥屬MAP蛋白已經(jīng)再分為不同的種類(Giglione et al.(2000，EMBO J.19p5916-5929)。在鼠耳芥屬中識別了MAP1類(具有A、B、C和D異構(gòu)體)和MAP2類(具有A和B異構(gòu)體)。這些種類和異構(gòu)體(isoform)也包括在這里采用的術(shù)語“同源物”中。方便地，這些MAP蛋白的不同種類或異構(gòu)體或它們的編碼核酸均可以用于本發(fā)明的方法。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了這里前文描述的方法，其中MAP核酸或MAP蛋白從植物中獲得，優(yōu)選來自雙子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選來自十字花科(Brassicaceae)，更加優(yōu)選來自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)。根據(jù)另一具體實施方式
，MAP核酸或蛋白為MAP2核酸或蛋白或MAP1核酸或蛋白。根據(jù)本發(fā)明的另一具體實施方式
，MAP核酸密碼子或MAP蛋白為SEQ ID NO2或4所代表的MAP蛋白的異構(gòu)體。根據(jù)本發(fā)明的另一具體實施方式
，MAP核酸密碼子或MAP蛋白為SEQ ID NO2所代表的鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)MAP2B蛋白。
其它優(yōu)選的MAP同源物和其編碼序列可以在(公共)序列數(shù)據(jù)庫中得到，在序列數(shù)據(jù)庫中檢索和識別MAP同源物的方法完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的技術(shù)范圍內(nèi)。這種方法，涉及用本發(fā)明提供的序列，例如SEQ ID NO2或4(或SEQ ID NO1或3)，優(yōu)選用計算機可讀形式，篩查序列數(shù)據(jù)庫?？捎玫男蛄袛?shù)據(jù)庫包括但并不限于Genbank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank)，歐洲分子生物學(xué)實驗室核酸數(shù)據(jù)庫(EMBL)(http/w.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html)或其版本或MIPS數(shù)據(jù)庫(http//mips.gsf.de/)?，F(xiàn)有技術(shù)中已知不同的序列比對和對比的檢索法和軟件。這種軟件包括例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。優(yōu)選采用BLAST軟件，其計算序列一致性的百分比并對兩個序列間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計分析。涉及BLAST的一套程序具有5個不同的執(zhí)行工具3個為核苷酸序列查詢設(shè)計(BLASTN、BLASTX、和TBLASTX)，兩個為蛋白質(zhì)序列查詢設(shè)計(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，Trends in Biotechnology76-80，1994；Birren et al.，GenomeAnalysis，1543，1997)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過National Centre for Biotechnology Information公共獲得。
其它植物物種的MAP蛋白的直向同源物(orthologues)可以通過進(jìn)行一個互補Blast檢索而容易地找到。該方法包括采用諸如BLAST的程序，用感興趣的基因或蛋白質(zhì)(例如SEQ ID NO 1、2、3或4)查詢一個或多個基因數(shù)據(jù)庫。接著用從搜索中得到的最高級別的目標(biāo)基因作為查詢序列再進(jìn)行類似的BLAST搜索。只有那些與原始查詢序列(SEQ ID NO 1、2、3或4)具有最高度匹配的基因被認(rèn)為是真正的直向同源物(orthologous)基因。例如，為了找到鼠耳芥基因的稻直向同源物(orthologues)，可以對稻數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTN或TBLASTX分析，例如(但并不限于)在NCBI網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)可獲得的稻Nipponbare數(shù)據(jù)庫，或稻的基因組序列(indica或japonica品種)。下一步，得到的稻序列被用來用鼠耳芥屬數(shù)據(jù)庫進(jìn)行反向BLAST分析。該方法可以被用來識別來自其它許多不同的物種得到的直向同源物(orthologues)，例如從玉米。
通過對與MAP蛋白來源的同樣物種的序列進(jìn)行Blast搜索可以容易地找到MAP蛋白的共生同源物(paralogues)。從通過Blast搜索選擇的序列，可以通過尋找序列之間的一致性或保守的典型MAP結(jié)構(gòu)域來識別真正的共生同源物(paralogues)。對鼠耳芥MAP蛋白共生同源物(paralogues)的搜索已經(jīng)由Giglione等人完成(2000，EMBO J.19p5916-5929)。
采用缺省參數(shù)和采用SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 1作為搜索序列進(jìn)行BLAST，導(dǎo)致下列MAP核酸和蛋白的識別。實質(zhì)上與SEQ ID NO1(AtMAP2B)相同的序列已經(jīng)以Genbank登錄號NM-115862(基因組DNA)、BT000063(At3g59990mRNA)、AY084710、AY065161和AF300880公開。SEQ ID NO 1和2的異構(gòu)體，這里命名為AtMAP2A，在數(shù)據(jù)庫中以Genbank登錄號AF250964找到。另一不同種類的異構(gòu)體在數(shù)據(jù)庫中以Genbank登錄號AF250960((AtMAP1A以及這里用SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4表示)、AF250961(AtMAP1B)、AF250962(AtMAP1C)和AF250963(AtMAP1D)找到。
已經(jīng)識別了來自不同植物品種的MAP同源物，該同源物可用于本發(fā)明的方法。植物中的MAP蛋白具有很高程度的保守性(參見表I)。這種同源物包括例如來自稻的MAP蛋白，在Genbank數(shù)據(jù)庫中以登錄號BAD03108公開，登錄號為AK122063的稻蛋白，登錄號為AK107616的稻蛋白以及登錄號為AY105027的玉米蛋白。編碼農(nóng)作物的MAP同源物的基因可以特異地用于本發(fā)明的方法在農(nóng)作物中的實踐。在本發(fā)明的另一具體實施方式
中，編碼雙子葉植物MAP同源物的基因可以用于在單子葉植物中實踐本發(fā)明的方法，反之亦然。
鼠耳芥和稻的基因組序列現(xiàn)在在公共數(shù)據(jù)庫中可以獲得，例如Genbank，其它基因組目前正在測序。因此，期望通過采用Blast X或BlastP程序或其它程序與SEQ ID NO 1或3或與SEQ ID NO 2或4的序列比對將容易地確認(rèn)更多同源物。
可以用上述詳細(xì)說明的所有同源物、共生同源物(paralogues)，和直向同源物(orthologues)構(gòu)建種系發(fā)生樹。按照上面的描述用ClustalX 進(jìn)行多重序列比對。用在http//evolution.genetics.washington.edu/phylip.html可獲得的Phylip軟件包構(gòu)建種系發(fā)生樹。一個或更多的鼠耳芥6MAP蛋白附近的序列簇鑒定適合用于本發(fā)明的方法的蛋白及其相應(yīng)的基因。
上述對比序列、計算序列一致性、搜索同源物、直向同源物或共生同源物或構(gòu)建種系發(fā)生樹的分析，優(yōu)選用全長序列?？蛇x地，這些軟件分析可以在MAP蛋白或DNA序列的保守區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。相應(yīng)地，這些分析可以基于保守區(qū)域、功能結(jié)構(gòu)域、基序或盒之間的序列一致性的對比和計算的基礎(chǔ)上。
對例如SEQ ID NO 5(MAP1標(biāo)簽)、SEQ ID NO 6(MAP2標(biāo)簽)、SEQID NO 7(AtMAP1A的肽酶_M24結(jié)構(gòu)域)、SEQ ID NO 8(AtMAP2B的肽酶_M24結(jié)構(gòu)域)、SEQ ID NO 9(AtMAP2B的富含賴氨酸結(jié)構(gòu)域)所代表的這種結(jié)構(gòu)域或基序的識別，也在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，并涉及篩查計算機可讀形式的MAP蛋白中保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、基序和盒的存在。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域信息在PRODOM(http//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/jj/prodomsrchjj.html)、PIR(http//pir.georgetown.edu/)、PROSITE(http//au.expasy.org/PROSITE/)或pFAM(http//pfam.wustl.edu/)數(shù)據(jù)庫中可以獲得。為檢索這種結(jié)構(gòu)域而設(shè)計的軟件程序包括但并不限于MotifScan、MEME、SIGNALSCAN和GENESCAN。MotifScan一種優(yōu)選的軟件程序，且在(http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)中可以獲得，該程序利用PROSITE和pFAM的蛋白結(jié)構(gòu)域信息。MEME算法(版本3.0)可以在GCG軟件包中找到；或在http//www.sdsc.edu/MEME/meme中。SIGNALSCAN版本4.0的信息可以在http//biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html獲得。GENESCAN可以在http//gnomic.stanford.edu/GENESCANW.html找到。
術(shù)語“MAP標(biāo)簽(signature)”表示MAP特異性的結(jié)構(gòu)域。這種MAP標(biāo)簽的例子是MAP1或MAP2標(biāo)簽。MAP1標(biāo)簽在PROSITE數(shù)據(jù)庫中描述，登錄號為PS00680，這里用共有序列SEQ ID NO 5[MFY]-x-G-H-G-[LIVMC]-[GSH]-x(3)-H-x(4)-[LIVM]-x-[HN]-[YWVH]表示。在MAP1蛋白中，MAP1標(biāo)簽可以位于肽酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)。MAP2標(biāo)簽進(jìn)一步在PROSITE數(shù)據(jù)庫中描述，登錄號為PS01202，這里用共有序列SEQ ID NO 6[DA]-[LIVMY]-x-K-[LIVM]-D-x-G-x-[HQ]-[LIVM]-[DNS]-G-x(3)-[DN]表示。對于MAP2蛋白，MAP2標(biāo)簽優(yōu)選位于肽酶結(jié)構(gòu)域的上游。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到MAP標(biāo)簽可以不同于上述的共有MAP標(biāo)簽，而不失去其功能，例如具有1或2個錯配。在Drosophila MAP2蛋白中發(fā)現(xiàn)了一個例子(參見圖3)，在MAP2標(biāo)簽的第十二個位置具有一個K，而不是D、N或S。
這里采用的術(shù)語“肽酶_M24結(jié)構(gòu)域”指一種肽酶結(jié)構(gòu)域，存在MAP蛋白中。肽酶_M24結(jié)構(gòu)域在pFAM數(shù)據(jù)庫中描述，登錄號為PF00557。該結(jié)構(gòu)域的共有序列沒有在pFAM數(shù)據(jù)庫中給出，但是接近500個蛋白分類為具有PEPTIDASE_M24結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域可以通過其折疊和三級結(jié)構(gòu)識別，而不是通過其一級結(jié)構(gòu)，該一級結(jié)構(gòu)為可變的。因此，不同的MAP蛋白也表現(xiàn)出該肽酶_M24結(jié)構(gòu)域一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)的實質(zhì)上的可變(參見圖3)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地知道怎樣在蛋白序列中確定肽酶_M24結(jié)構(gòu)域的存在。一個例子是將蛋白序列提交到能夠確定保守結(jié)構(gòu)域的軟件程序中，例如這里前述的MotifScan程序。肽酶_M24結(jié)構(gòu)域的一個例子在SEQ ID NO 7中給出，它是AtMAP1A的肽酶_M24結(jié)構(gòu)域。另一個例子在SEQ ID NO 8中給出，它是AtMAP2B的肽酶_M24結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法采用的MAP蛋白具有肽酶_M24結(jié)構(gòu)域，其與SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8至少70％相同。
任選地，例如MAP2蛋白的情況，本發(fā)明采用的MAP蛋白具有至少一個富含賴氨酸結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選這種富含賴氨酸結(jié)構(gòu)域位于N端和MAP標(biāo)簽之間。術(shù)語“富含賴氨區(qū)域”指富含賴氨酸氨基酸的氨基酸區(qū)域。典型地，富含賴氨酸結(jié)構(gòu)域為多于50％的氨基酸為賴氨酸(K)的氨基酸序列。例如，在AtMAP2B中，富含賴氨酸結(jié)構(gòu)域的14個連續(xù)殘基的12個為賴氨酸，相當(dāng)于85％的賴氨酸。任意地，可以出現(xiàn)連續(xù)賴氨酸的一段序列，例如，一段至少3個賴氨酸殘基，例如4、5、6或更多的賴氨酸殘基。相應(yīng)地，存在不同MAP蛋白的富含賴氨酸結(jié)構(gòu)域之間的實質(zhì)性的變異，如圖3中所示。鼠耳芥MAP2B蛋白的富含賴氨酸結(jié)構(gòu)域用SEQ ID NO 9表示。
基于上述結(jié)構(gòu)域的的存在和保守性，本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)能夠容易地識別不同生物體的MAP蛋白，例如從植物中(參見Giglione等人，(2000)，EMBO J.19p 5916-5929)。
這里上述的一些變體可以自然發(fā)生。一旦已知變體的序列及其相應(yīng)的編碼序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠從生物材料中分離相應(yīng)的MAP基因或變體，例如通過PCR技術(shù)。實施例1中描述了這種試驗的一個例子。
可選地和/或另外地，上文提到的變體可以通過包括如突變(替代、插入或缺失)或衍生的技術(shù)人工制造。這些變體在這里指“衍生物”，該衍生物也可以用于本發(fā)明的方法。蛋白的衍生物可以容易地用現(xiàn)有技術(shù)中已知的肽合成技術(shù)制成，例如固相肽合成以及類似的技術(shù)，或通過重組DNA操作?，F(xiàn)有技術(shù)中熟知操作DNA序列來產(chǎn)生蛋白的替代、插入或缺失變體的方法。例如，在DNA中預(yù)先確定的位點產(chǎn)生替代突變的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，包括M13誘變，T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)，QuickChange定點誘變(Stratagene，San Diego，CA)，PCR-介導(dǎo)的定點誘變或其它定點誘變方案。
衍生物的一個例子為替代變體。術(shù)語蛋白質(zhì)的“替代變體”指那些氨基酸序列中至少一個殘基被去除且一個不同的殘基插入該位置的變體。氨基酸的替代通常為單個殘基，但可以根據(jù)位于多肽的功能限制而成簇替代；插入將通常以大約1-10個氨基殘基的順序，缺失可以在1-20個殘基的范圍。氨基酸替代優(yōu)選包括保守氨基酸的替代。
其它衍生物為“插入變體”，其中MAP蛋白的預(yù)先確定的位置插入了一個或多個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合以及序列內(nèi)單個或多個氨基酸的插入。通常在氨基酸序列內(nèi)的插入為大約1到10個氨基酸的順序。氨基端或羧基端融合的例子包括在酵母雙雜交系統(tǒng)采用的轉(zhuǎn)錄活化劑的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或活性結(jié)構(gòu)域、噬菌體包膜蛋白，(組氨酸)6-標(biāo)簽，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，蛋白A，麥芽糖結(jié)合蛋白，雙氫葉酸還原酶，標(biāo)簽·100抗原決定簇，c-myc表位，F(xiàn)LAG-表位，lacZ，CMP(鈣調(diào)蛋白(calmodulin)結(jié)合肽)，HA表位，蛋白C表位和VSV表位。
其它MAP蛋白的衍生物為“缺失變體”，以從蛋白中去除一個或多個氨基酸為特征。
與天然發(fā)生的MAP蛋白相比，MAP蛋白的另一“衍生物”以替代、和/或缺失和/或添加自然發(fā)生或非自然發(fā)生的氨基酸為特征。與其來源的氨基酸序列相比，一個衍生物也可以包括一個或多個非氨基酸替代。這種非氨基酸替代包括例如，非自然發(fā)生的氨基酸、報告分子或其它配基、與氨基酸序列共價或非共價的連接。可以結(jié)合這種報告分子以有助于MAP蛋白的檢測。
另一個可用于本發(fā)明的方法的MAP蛋白的變體為MAP蛋白的活性片段。MAP蛋白的活性片段包括MAP蛋白質(zhì)的至少5個連續(xù)的氨基酸殘基，該殘基保留了與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)或其一部分類似的生物學(xué)和/或功能活性。合適的片段包括起始自第2或第3或更遠(yuǎn)的內(nèi)部的甲硫氨酸殘基的MAP蛋白片段。這些片段源于蛋白質(zhì)翻譯，自內(nèi)部的ATG密碼子開始。用于本發(fā)明方法的實踐的MAP蛋白的功能片段可以具有一個或多個MAP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，而保留它在本發(fā)明的方法中的功能。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，改變植物生長特性的方法包括提高或增加編碼MAP蛋白的核酸表達(dá)。獲得提高或增加基因表達(dá)或基因產(chǎn)物的方法現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有許多文件記載，包括例如通過強啟動子驅(qū)動的過表達(dá)，運用轉(zhuǎn)錄增強子或翻譯增強子。這里采用的術(shù)語“過表達(dá)”表示比原始野生型表達(dá)水平增加的任意形式的表達(dá)?？紤]到它所可操作地連接的啟動子，優(yōu)選將核酸引入植物和/或在植物中過表達(dá)的核酸為有義方向。本發(fā)明的方法中編碼MAP蛋白的核酸優(yōu)選在植物中過表達(dá)，例如SEQ ID NO 1的MAP核酸或其變體，例如SEQ ID NO 1的一部分或能夠與其雜交的序列。然而，必須清楚本發(fā)明的應(yīng)用并非局限于SEQ ID NO 1所示的核酸的應(yīng)用，也不局限于編碼SEQ ID NO 2的氨基酸序列的核酸序列，而其它編碼SEQ ID NO 2的同源物、衍生物或活性片段的核酸序列均可應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。
可選地和/或另外地，植物細(xì)胞中增加的MAP基因的表達(dá)或提高的MAP蛋白的水平和/或活性可通過突變而達(dá)到。例如這些突變可能是造成MAP基因的調(diào)控改變的原因，導(dǎo)致基因相對于野生型基因更多地表達(dá)。突變也可以導(dǎo)致蛋白構(gòu)象的改變，導(dǎo)致MAP蛋白更多的活性和/或更高的水平。為了獲得具有改變的生長特性的植物，這種突變或這種突變基因可以被選擇或分離和/或?qū)胪换虿煌闹参锓N類。這種突變子的例子包括MAP基因的顯性陽性突變株。
改變基因的表達(dá)(通過直接或間接方法)包括改變基因的轉(zhuǎn)錄水平。改變的轉(zhuǎn)錄水平可能足夠誘發(fā)一定的表型效應(yīng)，例如通過共抑制機理。這里過表達(dá)轉(zhuǎn)基因的總體效應(yīng)是，細(xì)胞中的與引入的轉(zhuǎn)基因有同源性的天然基因編碼的蛋白質(zhì)具有較小的活性。因此根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，提供了一種改變植物生長特性的方法，包括抑制或降低編碼MAP蛋白的基因的表達(dá)或降低MAP蛋白的水平和/或活性。降低細(xì)胞中蛋白的表達(dá)、水平和/或活性的例子在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有許多文件說明，包括，例如通過反義技術(shù)，RNAi技術(shù)，小干擾RNAs(siRNAs)和微RNA(miRNA)下調(diào)表達(dá)。
另一個下調(diào)基因表達(dá)或基因靜默的方法包括采用核酶，如Atkins等人1994(WO94/00012)，Lenee等人1995(WO95/03404)，Lutziger等人2000(WO00/00619)，Prinsen等人1997(WO97/3865)以及Scott等人1997(WO97/38116)所描述的。
基因靜默也可以通過插入突變而達(dá)到(例如，T-DNA插入或轉(zhuǎn)座子插入)，或通過Angell和Baulcombe 1998(WO98/36083)，Lowe等人1989(WO98/53083)，Lederer等人1999(WO99/15682)或Wang等人1999(WO99/53050)所描述的基因靜默策略。
內(nèi)源性MAP基因的表達(dá)也可以通過突變下調(diào)。為了得到具有改良的生長特性的植物，這樣的突變或突變基因可以被分離并引入同樣或不同的植物物種。這種突變體的例子為MAP基因顯性失活突變體。
以基因表達(dá)靜默為目的的遺傳構(gòu)建體可以包括編碼MAP蛋白的核酸，例如相對于啟動子序列的有義和/或反義方向的SEQ ID NO 1所示的核酸(或其變體)。正向或反向重復(fù)的形式或發(fā)夾形式的內(nèi)源基因的至少一部分有義或反義拷貝也可以在本發(fā)明的方法中利用。植物的生長也可以通過向植物中引入編碼MAP蛋白的核苷酸序列的反義形式的至少一部分而改變。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了有助于向植物細(xì)胞導(dǎo)入和/或有助于表達(dá)和/或有助于維持能夠改變編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)和/或能夠改變MAP蛋白的水平和/或活性的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體和載體，因此根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種構(gòu)建體，包括(a)編碼植物MAP蛋白或其變異體的核酸或編碼植物MAP蛋白的核酸變體；(b)能夠驅(qū)動植物中的核酸(a)的表達(dá)的一個或多個控制序列；以及可選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
用于本發(fā)明的方法的構(gòu)建體可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)建立。該基因構(gòu)建體可以插入載體，載體可以購買得到，適合于轉(zhuǎn)化入植物并適合MAP基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的維持和表達(dá)。遺傳構(gòu)建體優(yōu)選為植物表達(dá)載體。
根據(jù)(a)的核酸可以為這里前文描述的任意核酸。優(yōu)選的核酸為SEQ ID NO 1或3所代表的核酸或其前文定義的變體，或者編碼SEQ IDNO 2或4所代表蛋白的核酸序列或其前文定義的變體。
術(shù)語“調(diào)控序列”和“控制序列”這里可互換使用，且在廣泛的情形下使用，指能夠驅(qū)動和/或調(diào)控它們所操作性連接的序列的表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸?？刂菩蛄?b)優(yōu)選為植物中可操作的，最優(yōu)選調(diào)控序列來自植物序列。術(shù)語“控制序列”包括啟動子?！皢幼印卑▉碓从诮?jīng)典的真核基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(包括精確的轉(zhuǎn)錄起始所必需的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)以及附加的調(diào)控元件(即，上游活化序列，增強子，靜默子)，該序列根據(jù)發(fā)育和/或外部刺激而改變基因的表達(dá)，或以組織特異性的方式表達(dá)。也包含在該術(shù)語范圍內(nèi)的為一種經(jīng)典的原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在該情形下，它可以包括一個-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)控序列”也包含賦予、活化或增強細(xì)胞、組織或器官中核酸分子表達(dá)的合成融合分子或衍生物，這里采用的術(shù)語“操作性連接”指在啟動子序列和目的基因之間的功能性連接，從而使啟動子序列能夠起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。目的基因優(yōu)選以有義方向(sense orientation)與啟動子操作性連接。
任意類型的啟動子可以方便地用于本發(fā)明的方法。例如一種分生組織特異性啟動子，如RNR(核苷酸還原酶)、cdc2a啟動子和cyc07啟動子；或種子特異性啟動子，如2S2白蛋白、醇溶谷蛋白、或油質(zhì)蛋白啟動子。為了提高在萌芽時期的MAP蛋白的表達(dá)可以選擇啟動子?；蛘?，可以采用僅在一種或多種種子組織，例如糊粉、胚、盾片(scutellum)或胚乳中表達(dá)的啟動子。如果需要的結(jié)果是在花器官中改變MAP基因的表達(dá)，可以采用花特異性的啟動子，例如葉啟動子。一種花粉特異性啟動子可以用于改變雄性生殖器官中MAP的表達(dá)。另外，可以采用根特異性啟動子，特別在收獲根的農(nóng)作物中；這種農(nóng)作物包括糖用甜菜、蘿卜、胡蘿卜以及馬鈴薯。可以采用脈管特異性啟動子或結(jié)節(jié)(nodule)特異性啟動子或應(yīng)激誘導(dǎo)啟動子。可以采用一種細(xì)胞壁特異性啟動子或優(yōu)先在一種或多種植物地上組織中表達(dá)的啟動子，例如綠色組織、芽、莖、葉子、果實以及早期膨脹(expanding)組織。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式
，如上所述，基因構(gòu)建體中的MAP核酸與一個組成性啟動子可操作性地連接。這里定義的術(shù)語“組成性”指在和基本上在植物的所有組織中持續(xù)地充分表達(dá)的啟動子?？捎玫慕M成性啟動子的例子選自稻GOS2啟動子、玉米GOS2啟動子、CaMV35S啟動子、泛素啟動子、烯醇化酶啟動子、肌動蛋白-2啟動子和L-41啟動子或其它具有類似表達(dá)模式的啟動子。通過在植物的不同組織中將它們與報告基因相偶聯(lián)并檢測報告基因的功能，可以找到具有類似表達(dá)模式的啟動子。一個合適的報告基因是β-葡糖醛酸酶，且在植物組織中比色GUS染色以顯示β-葡糖醛酸酶活性為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
任意地，一個或多個終止子序列也可以導(dǎo)入基因構(gòu)建體中。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄終止序列”包括在轉(zhuǎn)錄單位末端的控制序列，它給予初級轉(zhuǎn)錄本3’端處理和聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止的信號。其它調(diào)控元件如轉(zhuǎn)錄或翻譯增強子，可以包含在基因構(gòu)建體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適合用于本發(fā)明的終止子和增強子序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道并容易得到這種序列。
本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括復(fù)制源點，它是在特定細(xì)胞類型中保持和/或復(fù)制所必需的。一個例子是當(dāng)一個基因構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中作為游離體(episomal)遺傳元件(如，質(zhì)粒或粘粒分子)需要保持的時候。優(yōu)選的復(fù)制源點包括，但并不限于f1-ori和colE1 ori。
該遺傳構(gòu)建體可以任選地包括選擇標(biāo)志基因，這里采用的術(shù)語“選擇標(biāo)志基因”包括賦予它所表達(dá)的細(xì)胞表型的任意基因，以協(xié)助識別和/或選擇用本發(fā)明的遺傳異構(gòu)體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。合適的標(biāo)志物可以選自導(dǎo)致抗生素或除草劑抗性的標(biāo)志物。含有重組DNA的細(xì)胞因此將能夠在殺滅未轉(zhuǎn)化細(xì)胞濃度的抗生素和除草劑存在的情況下存活。選擇性標(biāo)志基因的例子包括，導(dǎo)致對抗生素(如編碼能夠磷酸化新霉素和卡那霉素的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的nptII，或編碼能夠磷酸化潮霉素的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的hpt)，對除草劑(例如bar，提供Basta抗性；aroA或gox，提供草甘膦抗性)產(chǎn)生抗性的基因，或提供新陳代謝特性的基因(如manA，允許植物利用甘露糖作為唯一的碳源)?？梢姷臉?biāo)志基因?qū)е骂伾男纬?例如β葡糖醛酸酶，GUS)，發(fā)光(例如螢光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白，GFP，和其衍生物)。合適的選擇標(biāo)志基因的其它例子包括，氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，四環(huán)素抗性基因(Tcr)，細(xì)菌卡那霉素抗性基因(Kanr)，膦絲菌素抗性基因，以及氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因等等。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)相對于相應(yīng)的野生型植物具有改變的生長特性的植物的方法，包括在植物中改變編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)和/或改變MAP蛋白的水平和/或活性。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，該方法包括將能夠改變編碼MAP蛋白的核酸表達(dá)和/或能夠改變MAP蛋白的水平和/或活性的核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞中。
根據(jù)本發(fā)明的另一具體實施方式
，提供了生產(chǎn)具有改變的生長特性的植物的方法，該方法包括(a)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼MAP蛋白或其變體的核酸，或?qū)刖幋aMAP蛋白的核酸的變體；且(b)在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述的植物細(xì)胞。
根據(jù)另一優(yōu)選具體實施方式
，(a)的核酸為SEQ ID NO 1或2代表的核酸或其變體，或(a)的核酸編碼SEQ ID NO 2或4代表的MAP蛋白或其變體。
在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞，可以包括或不包括將植物細(xì)胞再生為植物。在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞，可以包括或不包括生長成熟，包括例如果實產(chǎn)生、種子形成、種子成熟和種子安置(setting)。
在植物細(xì)胞中改變MAP核酸的表達(dá)和/或改變MAP蛋白的水平和/或活性的方法包括將蛋白直接導(dǎo)入所述的細(xì)胞，例如通過顯微注射或沖擊(ballistic)方式?？蛇x地，這些方法包括瞬時將編碼MAP蛋白的核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞。
優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化將MAP核酸導(dǎo)入植物。這里涉及的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”，包括將外源性多核苷酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，而不考慮用來轉(zhuǎn)移的方法。
無論通過器官形成或胚形成，均可以用本發(fā)明的基因構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化能夠繼發(fā)無性繁殖的植物組織。根據(jù)被轉(zhuǎn)化的特定植物種類而選擇組織。代表性的目標(biāo)組織包括葉片、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、愈傷組織、現(xiàn)存的分生組織(例如，頂點分生組織，葉腋芽，以及根部分生組織)，和誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)?？梢运矔r或穩(wěn)定地將核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞，并可以非整合保持，例如，作為質(zhì)粒。優(yōu)選將編碼MAP蛋白的核酸穩(wěn)定地導(dǎo)入轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的基因組?？梢赃_(dá)到植物細(xì)胞基因組的穩(wěn)定導(dǎo)入，例如，通過采用具有T-DNA邊界的植物轉(zhuǎn)化載體或植物表達(dá)載體，T-DNA側(cè)翼包圍欲被導(dǎo)入基因組的核酸。
目前植物物種的轉(zhuǎn)化是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)，可以方便的采用一些轉(zhuǎn)化方法的任意一種來將MAP核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法包括運用脂質(zhì)體、電穿孔、增加自由DNA攝入的化學(xué)物質(zhì)、向植物中直接注射DNA、粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉(zhuǎn)化，或顯微發(fā)射。方法可以選自對于原生質(zhì)體鈣/聚乙二醇法(Krens，F(xiàn).A.等人，1882，Nature296，72-74；Negrutiu I.等人，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質(zhì)體電穿孔(Shillito R.D.等人，1985 Bio/Technol3，1099-ll02)；向植物材料微注射(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen Genet202，179-185)；DNA或RNA包被粒子轟擊(Klein T.M.等人，1987，Nature327，70)；用病毒等注射(非整合)。生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。
優(yōu)選通過農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來采用任何一種已知的稻轉(zhuǎn)化方法來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因稻植物，例如下列文獻(xiàn)任一篇所描述的方法公開的歐洲專利申請EP1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)；Hiei等人(Plant J.6(2)271-282，1994)；這些公開作為參考在這里引入，如同完全列舉一樣。在玉米轉(zhuǎn)化的情形下，優(yōu)選的方法為Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996Jun；14(6)745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002May；129(1)13-22)所描述的，這些公開作為參考在這里引入，如同完全列舉一樣。
通常轉(zhuǎn)化后，篩選植物細(xì)胞或細(xì)胞組中一個或多個上述選擇標(biāo)志物的存在，該標(biāo)志物與MAP基因共轉(zhuǎn)化。
接著得到的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、細(xì)胞組或植物組織可以用于通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)再生為完整的植株。
隨后，可以測定推定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植物中目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組組成，例如運用Southern分析?？蛇x地或另外地，導(dǎo)入的核酸的表達(dá)水平可以用Northern和/或Western分析，兩種技術(shù)都為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。
再生的轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方法繁殖，如通過無性繁殖或傳統(tǒng)培育技術(shù)。例如，第一代轉(zhuǎn)化植物(T1植物)可以自花受精產(chǎn)生純合子的第二代轉(zhuǎn)化植物(T2植物)，T2植物可以進(jìn)一步通過傳統(tǒng)培育技術(shù)繁殖。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以采取多種形式，例如它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；無性轉(zhuǎn)化體(例如，所有的轉(zhuǎn)化細(xì)胞含有本發(fā)明的基因構(gòu)建體)；轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如，將轉(zhuǎn)化的根莖嫁接到未轉(zhuǎn)化的接穗上)。
本發(fā)明無疑延伸至本發(fā)明的任意方法可獲得的植物，該植物具有改變的生長特性。本發(fā)明進(jìn)一步延伸至該植物的任意植物部分和繁殖體。本發(fā)明進(jìn)一步延伸至包含了由任意的前述方法產(chǎn)生的初級轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織、器官或整株植物的子代，唯一的要求為子代表現(xiàn)出與本發(fā)明的方法產(chǎn)生的親本同樣的基因型和/或表型特征。本發(fā)明也包括具有改變的MAP基因表達(dá)和/或改變的MAP蛋白的水平和/或活性的宿主細(xì)胞。特別是本發(fā)明包括宿主細(xì)胞，其包含分離的編碼MAP蛋白的核酸。該宿主細(xì)胞優(yōu)選含有上述的基因構(gòu)建體。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞可以選自細(xì)菌、藻類、真菌、酵母、昆蟲、植物或動物宿主細(xì)胞。本發(fā)明擴展到具有改變的生長特性的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物，該植物具有改變的MAP基因表達(dá)或改變的MAP蛋白的水平和/或活性。優(yōu)選所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物含有分離的編碼MAP蛋白或其變體的核酸，更加優(yōu)選含有上述的基因構(gòu)建體。本發(fā)明還擴展本發(fā)明的植物的任何部分，優(yōu)選可收獲部分，例如但并不限于種子、葉、果實、花、莖培養(yǎng)物、莖、根莖、根、塊莖、鱗莖或棉纖維。
這里采用的術(shù)語“植物”包括整株植物、植物的原代(ancestor)和后代和植物部分，包括種子、芽、莖、根(包括塊莖)、以及植物細(xì)胞、組織和器官。術(shù)語“植物”也包括懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、配子體、孢子體、花粉、以及小孢子。本發(fā)明的方法中特別有用的植物包括屬于Viridiplantae超家族的所有植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括，飼料或草料豆類、裝飾植物、食品農(nóng)作物、樹木、或灌木，從包括下列的植物中選擇金合歡屬(Acacia spp.)、槭屬(Acer spp.)、獼猴桃屬(Actinidia spp.)、七葉樹屬(Aesculus spp.)、新西蘭貝殼杉(Agathis australls)、Albizia amara、Alsophila tricolor、須芒草屬(Andropogon spp.)、落花生屬(Arachis spp.)、檳榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、Baikiaea plurijuga、樺木屬(Betula spp.)、蕓苔屬(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkeaafricana、Butea frondosa、Cadaba farinosa、朱纓花屬(Calliandraspp、)、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬(Capsicum spp.)、決明屬(Cassia spp.)、Centroema pubescens、木瓜屬(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、繡球小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂屬(Crataegusspp.)、香瓜屬(Cucumis spp.)、柏木屬(Cupressus spp.)、Cyatheadealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅屬(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、Davallia divaricata、山螞蝗屬(Desmodium spp.)、Dicksonia squarosa、Diheteropogonamplectens、Dioclea spp、鐮扁豆屬(Dolichos spp.)、Dorycniumrectum、Echinochloa Pyramidalis、Ehrartia spp.、(Eleusinecoracana)、Eragrestis spp.、刺桐屬(Erythrina spp.)、桉屬(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、蕎麥屬(Fagopyrum spp.)、南美稔(Feijoa sellowiana)、草莓屬(Fragariaspp.)、千斤拔屬(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geraniumthunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidiaspp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺屬(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、巖黃芪屬(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、紅苞茅(Hyparrhenia rufa)、小連翹(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、Indigo incamata、鳶尾屬(Iris spp.)、Leptarrhena Pyrolifolia、胡枝子屬(Lespedizaspp.)、Lettuca spp.、銀合歡(Leucaena leucocephala)、Loudetiasimplex、Lotonus bainesii、百脈根屬(Lotus spp.)、Macrotylomaaxillare、蘋果屬(Malus spp.)、木薯(Manihot esculenta)、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、煙草屬(Nicotianum spp.)、驢食草屬(Onobrychis spp.)、Omithopus spp.、稻屬(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬(Pennisetum spp.)、Perseagratissima、碧冬茄屬(Petunia spp.)、菜豆屬(Phaseolus spp.)、Phoenix canariensis、Phormium cookianum、石楠屬(Photinia spp.)、Picea glauca、松屬(Pinus spp.)、豌豆(Pisum satiyum)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬(Populus spp.)、瓜葉牧豆樹(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬(Quercusspp.)、Rhaphiolepsis umbellata、Rhopalostylis sapida、Rhusnatalensis、歐洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子屬(Ribes spp.)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、薔薇屬(Rosa spp.)、懸鉤子屬(Rubus spp.)、柳屬(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美紅杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高粱(Sorghumbicolor)、菠菜屬(spinacia spp.)、sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶屬(Tadehagis pp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda trtandra)、車軸草屬(Trifolium spp.)、小麥屬(Triticumspp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔屬(Vaccinium spp.)、野豌豆屬(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、Watsoniapyramidata、馬蹄蓮(Zantedesc hia aethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、莧屬(amaranth)、朝鮮薊、蘆筍、莖椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、油菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)、綠葉菜、亞麻、散葉甘藍(lán)、小扁豆、含油種子油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、稻草、糖用甜菜、糖用甘蔗、向日葵、番茄、南瓜和茶、樹木和藻類等。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，植物為農(nóng)作物，例如大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯、煙草、南瓜、番木瓜、白楊、豆科植物(leguminosa)、亞麻、羽扁豆(lupinus)和高粱。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式，該植物為單子葉植物，例如甘蔗，更優(yōu)選為谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥或燕麥。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了上述的任意一種方法，或上述的轉(zhuǎn)基因植物，其中植物為單子葉植物，優(yōu)選為谷物，更為優(yōu)選該植物為稻或玉米。
有利地，本發(fā)明方法的實行導(dǎo)致具有多種改變的生長特性的植物。這里采用的術(shù)語“改變”指時間和/或地點的增加或改良、降低或改變。優(yōu)選用本發(fā)明的方法改良了植物的生長特性。這里采用的術(shù)語“生長特性”優(yōu)選指產(chǎn)量/生物量和植物高度或這里下面描述的一種或多種的生長特性，但并不僅限于此。
術(shù)語“產(chǎn)量”指可收獲物的量，通常定義為農(nóng)作物經(jīng)濟價值的可測量的農(nóng)產(chǎn)品。對農(nóng)作物，“產(chǎn)量”也表示每畝或生產(chǎn)單位的收獲物的量。產(chǎn)量可以定義為數(shù)量或質(zhì)量。根據(jù)農(nóng)作物的不同，收獲物也不同，例如，可以是種子(如為獲取種子而種植的稻、高粱或玉米)；地上生物量(如，用作飼料的玉米)、根(如甜菜、蘿卜、馬鈴薯)、果實(如番茄、番木瓜)、棉纖維，或具有經(jīng)濟價值的植物的任意其它部分?！爱a(chǎn)量”也包括植物的產(chǎn)量穩(wěn)定性。高產(chǎn)量穩(wěn)定性指一年接著一年，人們可以從植物的后代獲得同樣的產(chǎn)量?！爱a(chǎn)量”也包括產(chǎn)量潛能，是可獲得的最大的產(chǎn)量。
產(chǎn)量可能依賴一些產(chǎn)量要素，可以通過一定的參數(shù)來監(jiān)測。這些參數(shù)為本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，且不同農(nóng)作物的參數(shù)也不相同。例如，育種人員清楚的知道他們打算提高的農(nóng)作物的特定的產(chǎn)量要素以及相應(yīng)的參數(shù)。例如，玉米的關(guān)鍵產(chǎn)量參數(shù)包括每公頃或畝的植物數(shù)量，每株植物的抽穗數(shù)量，每穗的行數(shù)(種子)，每行的谷粒數(shù)，以及每千粒重量。青貯飼料玉米的常用參數(shù)為地上生物量和能量容量。稻的關(guān)鍵產(chǎn)量參數(shù)為每公頃或每畝的植物數(shù)量、每株植物的花序數(shù)目、每個花序的花(小穗)的數(shù)目、種子飽滿率(每一小穗的飽滿種子的數(shù)目)以及每千粒重量。優(yōu)選的提高稻產(chǎn)量的方法包括提高提高飽滿種子的數(shù)目。
根據(jù)一個特定的具體實施方式
，術(shù)語“產(chǎn)量”包括“種子產(chǎn)量”。本發(fā)明的植物以提高的收獲種子產(chǎn)量為特點。該植物以增加的飽滿種子的數(shù)量和增加的收獲種子的總重量為特點。本發(fā)明的植物也可具有提高的每株植物的種子總數(shù)。本發(fā)明的方法在谷類例如稻和玉米的應(yīng)用中特別有利。相應(yīng)地，本發(fā)明的一個特定實施方式涉及一種提高玉米的產(chǎn)量的方法，例如種子的產(chǎn)量，包括改變編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)。
術(shù)語“產(chǎn)量”也包括收獲指數(shù)，是收獲生物量與總生物量的比率。本發(fā)明的植物以增加的收獲指數(shù)為特點。本發(fā)明的方法可以方便地用于增加谷物的收獲指數(shù)，特別是玉米或稻的收獲指數(shù)。
術(shù)語“產(chǎn)量”也可以包括千粒重(TKW)，是單個種子生物量的參數(shù)。本發(fā)明的植物也可以表現(xiàn)出提高的TKW，提高的TKW也是增加的種子體積和/或種子密度的指示。本發(fā)明的方法可以方便地用于提高谷物的千粒重，特別是玉米或稻的千粒重。
術(shù)語“產(chǎn)量”也可以包括典型的生物量組分，例如地上面積生物質(zhì)。一般的生物質(zhì)參數(shù)包括地上面積和/或地上干重。本發(fā)明的植物以增加的地上面積為特點，因此本發(fā)明的方法在為其綠色組織而培育長和/或它們地上生物量而培育的農(nóng)作物的應(yīng)用特別有利。本發(fā)明的方法對草、草料農(nóng)作物(例如飼料玉米、苜蓿、medicago等等)、樹木、甘蔗等特別有用。
本發(fā)明的方法所獲得的產(chǎn)量的提高，可由于一種或多種上述的產(chǎn)量要素和/或參數(shù)提高或改善的結(jié)果獲得。
這里采用的術(shù)語“生長特性”也包括植物高度。本發(fā)明的植物也可以表現(xiàn)出增加的植物高度。
本發(fā)明另外涉及分離的編碼MAP蛋白的核酸或分離的MAP蛋白改變植物的生長特性的應(yīng)用。而且本發(fā)明包含將MAP基因或MAP蛋白作為生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用，例如除草劑或生長刺激劑。本發(fā)明也包括含有MAP核酸或MAP蛋白或如上所述的基因構(gòu)建體的組合物，用作植物生長特性的調(diào)節(jié)劑(生長調(diào)節(jié)劑如生長刺激劑)。另外，該組合物包括合適的載體、稀釋劑或賦形劑。
可選地，MAP基因和MAP蛋白可被考慮作為感興趣的農(nóng)用化學(xué)化合物的靶標(biāo)，例如除草劑或生長刺激劑。相應(yīng)地，本發(fā)明包括將MAP基因或MAP蛋白用作農(nóng)用化學(xué)化合物的靶標(biāo)，例如生長調(diào)節(jié)劑。
由于本發(fā)明的植物具有極好的生長特性和高產(chǎn)量，它們適合于酶、醫(yī)藥品或農(nóng)用化學(xué)品的生產(chǎn)，也適合生產(chǎn)食品或飼料產(chǎn)品。本發(fā)明無疑延伸至從這些植物中分離或制備的酶、醫(yī)藥品或農(nóng)用化學(xué)品以及食品或飼料產(chǎn)品。
而且，為了開發(fā)產(chǎn)量提高的植物，編碼MAP蛋白的核酸、MAP蛋白和/或本發(fā)明的構(gòu)建體均可用于育種計劃。而且，在特別常規(guī)的育種計劃中，例如在標(biāo)志物輔助育種中，也可以采用上述的等位基因變體。這種育種計劃有時需要通過對植物進(jìn)行突變處理向植物中引入等位基因變體。一種合適的誘導(dǎo)突變的方法為EMS誘變。接著通過例如PCR的方法來鑒定等位基因變體。之后為選擇步驟，來選擇MAP序列的更好的等位基因變體，該變體可以產(chǎn)生植物中生長特性的改變。選擇通常通過監(jiān)控含有不同MAP序列的等位基因變體的植物的生長表現(xiàn)進(jìn)行，例如，SEQ ID NO 1的MAP序列的不同的等位基因變體。監(jiān)控生長表現(xiàn)可以在溫室和/或田野中進(jìn)行，隨后選擇具有改變的生長特性的植物。這種生長特性可以為上文所述的生長特性的任意一個或多個。另外可選擇的步驟包括將其中鑒定了優(yōu)良等位基因變體的植物與另一植物雜交，例如一個具有經(jīng)濟價值基因型的植物。這些雜交方法可以用于將感興趣的表型特征或性狀結(jié)合起來。
根據(jù)另一類型的育種計劃，鑒定一種DNA標(biāo)志物，該標(biāo)志物可以與能改變植物中MAP基因的表達(dá)和/或改變MAP蛋白的水平和/或活性的基因遺傳連鎖(該基因可以為編碼MAP蛋白的基因本身或其它能夠改變MAP基因的表達(dá)或能夠改變MAP蛋白的水平和/或活性的基因)。接著，該DNA標(biāo)志物可用于育種計劃來選擇具有改變的生長特性的植物。這種生長特性可以為上文所述的生長特性的任意一個或多個。
本發(fā)明的方法也可以通過向植物中導(dǎo)入染色體的至少一部分(自然的或人工的)(例如細(xì)菌人工染色體(BAC))而實行，該染色體至少含有編碼MAP蛋白的基因，可選地，與一個或多個相關(guān)基因家族成員一起。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了通過向植物中導(dǎo)入至少含有編碼MAP蛋白的基因的染色體的至少一部分來改變植物的生長特性的方法。
本發(fā)明將參考下列附圖進(jìn)行描述


圖1為在組成性啟動子的調(diào)控下的含有MAP基因表達(dá)盒的植物表達(dá)載體圖譜。CDS0430為鼠耳芥編碼甲硫氨酸氨肽酶MAP2B的cDNA的內(nèi)在密碼子。PRO0129為稻GOS2啟動子的內(nèi)在密碼子。MAP表達(dá)盒也含有雙轉(zhuǎn)錄終止序列T-zein和T-rbcS-deltaGA。該表達(dá)盒位于胭脂堿Ti質(zhì)粒的左邊界(LB Ti C58)和右邊界(RB Ti C58)的范圍內(nèi)。在這些T邊界范圍內(nèi)也克隆了可篩查的標(biāo)記物以及選擇標(biāo)記物，每個標(biāo)記物均在組成性啟動子的控制下，其后是NOS轉(zhuǎn)錄終止序列。而且，該載體也含有用于細(xì)菌復(fù)制的復(fù)制原點(pBR322(ori+bom))和細(xì)菌選擇的選擇標(biāo)志物(Sm/SpR)，以進(jìn)行細(xì)菌選擇。
圖2列出了所有的本發(fā)明的說明書用到的序列。
圖3顯示了動物和植物MAP蛋白的多重比對，附帶對不同結(jié)構(gòu)域的注解。從N端到C端富含賴氨酸結(jié)構(gòu)域、MAP2標(biāo)簽或MAP1標(biāo)簽和肽酶_M24結(jié)構(gòu)域。這些肽酶結(jié)構(gòu)域相應(yīng)于MAP2蛋白的肽酶結(jié)構(gòu)域注解(例如參見SEQ ID NO 8)。MAP1蛋白的肽酶結(jié)構(gòu)域比該注解延伸更遠(yuǎn)(例如參見SEQ ID NO 7)。
實施例本發(fā)明將通過參考下列實施例加以描述，僅為說明目的。
DNA操作除非另外說明，重組DNA技術(shù)根據(jù)Sambrook(2001)分子克隆實驗室手冊，第三版，冷泉港實驗室出版社，CSH，紐約，或第1和2卷的Ausubel等人(1988)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols中所描述的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)的材料和方法在Plant Molecular Biology Labfase(1993)中描述，作者R.D.D.Croy，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
實施例1編碼鼠耳芥MAP2B的CD S0430的克隆從鼠耳芥籽苗的cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)通過PCR技術(shù)擴增編碼甲硫氨酸氨肽酶MAP2B的基因。從籽苗中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后，將cDNAs克隆入pCMV Sport6.0。平均插入物的大小為1.5kb，克隆的原始數(shù)目為1.59×107cfu。在第一次6×1011cfu/ml擴增后，原始滴度確定為9.6×105cfu/ml。提取質(zhì)粒后，在50μl PCR混合物中使用200ng模板。PCR擴增所用的引物為prm01642，序列為5’ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCA CAATGGCGAGCGAAAGTCC3’，由SEQ IDNO10表示，以及prm01643，序列為5’ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTAGGATCTGAATCAGTAGTCGTCTC3’，由SEQ ID NO 11表示，包括Gateway重組的attB位點(斜體字)。用Hifi Taq DNA聚合酶在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。1381bp的PCR片段被擴增并用標(biāo)準(zhǔn)方法純化。接著進(jìn)行Gateway操作程序的第一步，BP反應(yīng)，其中PCR片段在體內(nèi)與pDONR201質(zhì)粒重組以產(chǎn)生進(jìn)入克隆p1753。質(zhì)粒pDONR201從Invitrogen購買，作為Gateway技術(shù)的一部分。
實施例2表達(dá)盒CD2231(pGOS2::AtMAP2B)的構(gòu)建隨后將進(jìn)入克隆p1753用于與適合稻轉(zhuǎn)化的Gateway目的載體p0640的LR Gateway重組反應(yīng)中。載體p0640在T-DNA界限的范圍內(nèi)含有作為功能元件的植物篩選標(biāo)記，用于與目的序列LR體內(nèi)重組的Gateway盒已經(jīng)克隆入進(jìn)入克隆。目的基因組成性表達(dá)的稻GOS2啟動子(PRO0129)位于該Gateway盒的上游(De Pater等人，Plant J.2(6)837-844，1992)。重組步驟后，得到的具有表達(dá)盒CD2231(
圖1)的表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)菌株LBA4404，并隨后導(dǎo)入稻品種Nipponbare植物中。培育轉(zhuǎn)化的稻植物，然后按照實施例3描述的方法檢測不同的參數(shù)。
實施例3用pGOS2::AtMAP2B轉(zhuǎn)化的T0、T1和T2稻植物的評估大約產(chǎn)生15到20獨立的T0轉(zhuǎn)化株。將初級轉(zhuǎn)化株從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到溫室，以培育和收獲T1種子。其中保留T1后代按轉(zhuǎn)基因的存在/缺乏分離為3∶1的6種事件?！傲愫现参?null plant)”或“零合分離種”或“零合子”為用與轉(zhuǎn)基因植物同樣方式處理的植物，但是其中轉(zhuǎn)基因被分離。零合植物也可以描述為純合陰性轉(zhuǎn)化子。對每個事件，通過PCR篩選，含有轉(zhuǎn)基因(雜合子和純合子)的大約10個T1籽苗，以及缺乏轉(zhuǎn)基因(零合子)的大約10個T1籽苗。
基于T1評估的結(jié)果，選擇在T1水平表現(xiàn)出改良生長特性的三種事件，進(jìn)一步在T2代和更遠(yuǎn)后代中鑒定。對這一程度，通過檢測標(biāo)志物的表達(dá)而篩查來自T1陽性植物的一批種子(雜合子和純合子同時存在)。對每一選擇的事件，選擇雜合子種子進(jìn)行T2評估。每批種子中相等的陽性和陰性數(shù)被移植溫室中，以進(jìn)行評估(即，對每個事件的40株植物進(jìn)行栽培，其中培養(yǎng)20株轉(zhuǎn)基因陽性，20株轉(zhuǎn)基因陰性)。因此，三種事件的總數(shù)達(dá)到120株植物，以對T2代進(jìn)行評估。
T1和T2植物被轉(zhuǎn)移至溫室并評估植物生長參數(shù)以及種子的參數(shù)，如下文將要描述的。
(I)數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)的統(tǒng)計分析將經(jīng)不均衡設(shè)計矯正的雙因素ANOVA(離差分析)作為觀察的植物表型性狀數(shù)字值的評估統(tǒng)計模型。對數(shù)字值進(jìn)行t檢驗和f檢驗。p值通過比較t-分布與t值，或者比較F分布與F值而得到。P值代表零假設(shè)(零假設(shè)為“轉(zhuǎn)基因沒有任何效應(yīng)”)正確的概率。
對一種事件所有植物的所有值進(jìn)行t檢驗。每種事件和每一生長特性都重復(fù)這種t檢驗。為檢測在一種轉(zhuǎn)化事件內(nèi)的基因的效應(yīng)進(jìn)行t檢驗，這里也命名為“線性特異性”效應(yīng)。在t檢驗中，線性特異性效應(yīng)的顯著性的閥值設(shè)為10％可能性水平。因此，t檢驗的p值低于10％表示“線性特異性”效應(yīng)，意味著在該種系的轉(zhuǎn)基因植物中觀察的表型是由該基因的存在引起的。在轉(zhuǎn)化事件的一個種群內(nèi)，一些事件可能在該閥值之下或之上。這種差別可能是由于轉(zhuǎn)基因在基因組中位置的差別。基因可能只在基因組的一定位置時才具有效應(yīng)，因此，上述的“線性特異性效應(yīng)”也指“位置依賴性效應(yīng)”。
對所有事件的所有植物的所有值進(jìn)行F檢驗。對每一生長特性都重復(fù)F檢驗。進(jìn)行F檢驗來檢測所有的轉(zhuǎn)化事件的基因的效果并檢驗基因總的效果，這里也命名為“基因效果”。在F檢驗中，總的基因效果的顯著性的閥值設(shè)置為5％概率水平，因此，F(xiàn)檢驗的p值低于5％表示“基因效應(yīng)”，意味著觀察的表型不僅由該基因的存在和/或轉(zhuǎn)基因在基因組的位置所引起?！盎蛐?yīng)”表示轉(zhuǎn)基因植物中該基因的廣泛適應(yīng)性。
(II)植物生長測量選擇的植物在溫室中栽培，每株植物都接受到獨特的條形碼標(biāo)記以將表型數(shù)據(jù)和相應(yīng)植物清楚地相互連鎖。選擇的植物在10cm直徑的罐的土壤中栽培，在下列環(huán)境設(shè)置下光周期＝11.5h，光照強度＝30,000lux或更大，日間溫度＝28℃或更高，夜間溫度＝22℃，相對濕度＝60-70％。轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的零合子在隨機位置并行培育。從播種期直到成熟期(生物量沒有更大增長的時期)，植物每周通過數(shù)字成像室。每次從至少6個不同角度拍攝每株植物的點數(shù)字圖像(2048×1536像素，16百萬顏色)。下述的參數(shù)采用圖像分析軟件從數(shù)字圖像自動生成。
(a)地上面積植物地上面積通過計算從背景中區(qū)分的地上植物部分的像素總數(shù)來確定。該數(shù)值為不同角度在同一時間點拍攝的照片的平均值，并校準(zhǔn)轉(zhuǎn)化為平方mm表示的物理表面值。試驗表明用這種方式測定的與總的最大面積相應(yīng)的地上植物面積與植物地上部分的生物量相關(guān)聯(lián)。
這些最大地上面積值的結(jié)果概括于表1。平均轉(zhuǎn)基因植物的地上面積表現(xiàn)出10％的增長。在一個特定的種系中，地上面積的增加高達(dá)26％。這些結(jié)果表明MAP基因?qū)AP轉(zhuǎn)基因植物的地上生物量具有一定的效應(yīng)。
表1MAP轉(zhuǎn)基因T2植物的地上面積。每行相應(yīng)于一個事件，確定轉(zhuǎn)基因(TR)和零合植物(null)的平均最大地上面積(以mm2表示)。每一事件的轉(zhuǎn)基因植物和零合植物的差別用絕對值(dif.)以及差別的百分比(％dif)表示。P代表每個事件的t檢驗的概率。最后一行表示了從所有事件計算的平均值。這里通過F檢驗產(chǎn)生p值。
(III)種子相關(guān)參數(shù)的測量收獲將成熟的初級圓錐花序、裝袋，并用條形碼標(biāo)記，然后在烤箱中37℃干燥3天。圓錐花序接著被脫粒，并收集所有種子。用吹風(fēng)裝置將飽滿的殼與空殼分離。分離后，將種子用可商業(yè)化購買得到計數(shù)器計數(shù)。將殼丟棄，飽滿的殼在分析天平上稱重。該操作步驟導(dǎo)致下面描述的種子相關(guān)參數(shù)的設(shè)定。
(a)每株植物的飽滿種子總數(shù)通過對分離步驟后保留的飽滿殼的計數(shù)來確定飽滿種子的數(shù)目。該數(shù)目總結(jié)于表2。轉(zhuǎn)基因植物平均表現(xiàn)出飽滿種子的數(shù)目52％的增加。在一個特定的種系中，飽滿種子數(shù)目的增加高達(dá)76％。這些結(jié)果顯示MAP基因?qū)AP轉(zhuǎn)基因植物的飽滿種子的數(shù)目具有一定的效應(yīng)。
表2MAP轉(zhuǎn)基因T2植物的飽滿種子的總數(shù)。每行相應(yīng)于一個事件，確定轉(zhuǎn)基因(TR)和零合植物(null)的平均飽滿種子數(shù)目。每一事件的轉(zhuǎn)基因植物和零合植物的差別用絕對值(dif.)以及差別的百分比(％dif表示)。P代表每個事件的t檢驗的概率。最后一行表示了從所有事件計算的平均值。這里通過F檢驗產(chǎn)生p值。
(b)每株植物的總種子產(chǎn)量通過稱量從植物收獲的飽滿殼的重量來測量作為總種子重量的總種子產(chǎn)量?？偡N子重量值概括于表3。轉(zhuǎn)基因植物平均表現(xiàn)出總種子重量55％的增加。在一個特定的種系中，種子重量的增加高達(dá)79％。這些結(jié)果顯示MAP基因?qū)AP轉(zhuǎn)基因植物的總種子重量和種子產(chǎn)量具有效應(yīng)。
表3MAP轉(zhuǎn)基因T2植物的每株植物的總種子重量。每行相應(yīng)于一個事件，確定轉(zhuǎn)基因(TR)和零合植物(null)的平均總種子重量(以克表示)。每一事件的轉(zhuǎn)基因植物和零合植物的差別用絕對值(dif.)以及差別的百分比(％dif)表示。P代表每個事件的t檢驗的概率。最后一行表示了從所有事件計算的平均值。這里通過F檢驗產(chǎn)生p值。
(c)收獲指數(shù)本發(fā)明的收獲指數(shù)定義為總種子產(chǎn)量和地上面積(mm2)的比例，乘以106的數(shù)量級。收獲指數(shù)值總結(jié)于表4。轉(zhuǎn)基因植物的平均表現(xiàn)出收獲指數(shù)36％的增加。在一個特定的種系中，收獲指數(shù)的增加以及由此產(chǎn)量的增加高達(dá)50％。這些結(jié)果顯示MAP基因?qū)AP轉(zhuǎn)基因植物的收獲指數(shù)和產(chǎn)量具有效應(yīng)。
表4MAP轉(zhuǎn)基因T2植物的收獲指數(shù)。每行相應(yīng)于一個事件，確定轉(zhuǎn)基因(TR)和零合植物(null)的平均收獲指數(shù)。每一事件的轉(zhuǎn)基因植物和零合植物的差別用絕對值(dif.)以及差別的百分比(％dif)表示。P代表每個事件的t檢驗的概率。最后一行表示了從所有事件計算的平均值。這里通過F檢驗產(chǎn)生p值。
(d)千粒重TKW是從計算的飽滿種子的數(shù)目以及他們的總重量推斷的參數(shù)。一些MAP轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出千粒重的增加，這是增加的種子密度和/或增加的種子大小的指示。
(IV)植物高度測量植物的高度通過罐上部的邊緣的水平線與相應(yīng)于植物地上部分的最高像素之間的距離確定。該值為同一時間點從不同角度拍攝的照片的平均值(按照上文的描述拍攝)，并通過標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化為用mm表示的物理距離。試驗表明用這種途徑檢測的植物高度與用直尺手工測量的植物高度相關(guān)。一些MAP轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出增加的植物高度。
實施例4.MAP轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米植物的評估這里描述的本發(fā)明的方法也用于玉米(Zea mays)。為了這一目的，MAP編碼基因，例如玉米MAP直向同源物(orthologues)，在玉米中可操作的啟動子的控制下克隆入適合土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化的植物轉(zhuǎn)化載體中。該在玉米中可操作的啟動子可以是組成性啟動子，選自GOS2啟動子、泛素啟動子、L-41啟動子、肌動蛋白2啟動子和烯醇化酶啟動子。用于玉米轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述(Ishida等人，Nat Biotechnol.1996Jun；14(6)745-50；Frame等人，Plant Physiol.2002May；129(1)13-22)。
用這些方法制造的轉(zhuǎn)基因(近交(inbred))種系可以與另一非轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因(近交)種系雜交或自我/近親授粉。重要的是，轉(zhuǎn)基因(近交)種系可以用作母本或父本。轉(zhuǎn)基因的遺傳性和拷貝數(shù)通過定量實時PCR(quantitative real-time PCR)和Southern印跡分析檢測，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平由逆轉(zhuǎn)錄PCR和Northern分析確定。選擇轉(zhuǎn)基因單個拷貝插入以及具有轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平變化的轉(zhuǎn)基因事件進(jìn)行在后代中進(jìn)一步的評估。
將按照上文所述獲得的后代種子發(fā)芽并在十分適合玉米的條件下(168光周期，26-28℃日間溫度和20-24℃夜間溫度)以及在缺乏水、缺乏氮和過量NaCl的條件下在溫室中培育。用來自同樣的親本種系的零合分離種(近交系或雜交種系)，以及來自同一近交種系或雜交種系的野生型植物作為對照。對后代植物的不同生物量和發(fā)育參數(shù)進(jìn)行評估，包括，但不僅限于植物高度、莖干寬度、穗下節(jié)點(nodes belowear)、穗上節(jié)點、主根、葉子數(shù)目、葉片綠色、葉片角度、總地上面積、抽穗時間、抽絲時間、成熟時間、抽穗高度、抽穗數(shù)目、抽穗長度、穗重、行數(shù)、粒數(shù)、谷物濕度，還監(jiān)測了谷粒的特性包括但不僅限于谷粒大小、谷粒重量、淀粉含量、蛋白含量、油含量。玉米產(chǎn)量根據(jù)已知的方法計算。用MAP蛋白轉(zhuǎn)化的玉米植物表現(xiàn)出改善的生長特性。更特別地，它們在任一種或多種的上述的生物量和發(fā)育參數(shù)中都表現(xiàn)出改善。
選擇與相應(yīng)的對照種系相比提高最顯著的轉(zhuǎn)基因事件進(jìn)行進(jìn)一步的田間試驗和標(biāo)志輔助培育。目標(biāo)是將田間有效的轉(zhuǎn)基因品質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一種質(zhì)。在田間運用良好確立的操作程序?qū)τ衩咨L和產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)分型。對不同植物密度和不同環(huán)境條件的玉米植物的產(chǎn)量組分進(jìn)行特定評估，隨后也采用良好確立的操作程序包括但不僅限于MAS增加基因從一種種質(zhì)滲入到另一種質(zhì)的特定位點(例如含有轉(zhuǎn)基因的位點)。
實施例5.對鼠耳芥MAP1A轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的評估在實施例1、2、3和4中描述的方法也用鼠耳芥MAP1A重復(fù)。為達(dá)到這一目的，將由SEQ ID NO 3表示的AtMAP1A編碼基因，在稻或玉米中可行的啟動子的控制下，克隆入適合于農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的稻或玉米轉(zhuǎn)化的植物轉(zhuǎn)化載體中。一種合適的啟動子是組成性啟動子，例如GOS2啟動子。
對稻植物，分離cDNA和載體的構(gòu)建的步驟按照實施例1和2的描述進(jìn)行，除了引物是SEQ ID NO 3特異性外。植物轉(zhuǎn)化、植物生長和植物評估的步驟按照實施例3的描述進(jìn)行。用AtMAP1A轉(zhuǎn)化的稻植物具有改變的生長特性，且表現(xiàn)出實施例3中所描述的任意一種或多種改變的生長特性。
對于玉米植物，植物轉(zhuǎn)化、植物生長、植物繁殖、植物選擇和植物評估都按照實施例4描述的方法進(jìn)行，用AtMAP1A轉(zhuǎn)化的玉米植物具有改變的生長特性，且表現(xiàn)出實施例4所描述的任意一種或多種的改良的生長特性。
權(quán)利要求
1.相對于相應(yīng)野生型植物改變植物生長特性的方法，包括改變植物中編碼甲硫氨酸氨肽酶(MAP蛋白)的核酸的表達(dá)和/或改變植物中MAP蛋白的水平和/或活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的改變表達(dá)、水平和/或活性是通過向植物中導(dǎo)入能夠改變編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)和/或能夠改變MAP蛋白的水平和/或活性的核酸而實現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中導(dǎo)入的核酸編碼MAP蛋白或其變體和/或其中所述的導(dǎo)入的核酸是編碼MAP蛋白的核酸的變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任意一項的方法，其中所述的改變表達(dá)、水平和/或活性包括增加表達(dá)、水平和/或活性。
5.生產(chǎn)相對于相應(yīng)的野生型植物而言具有改變的生長特性的植物的方法，包括a)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼MAP蛋白或其變體的核酸，或?qū)刖幋aMAP蛋白的核酸的變體；且b)在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述的植物細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的核酸(a)為SEQ ID NO 1或3代表的核酸或其變體，或所述的核酸(a)編碼SEQ ID NO 2或4代表的MAP蛋白或其變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中所述的核酸編碼與SEQ ID NO2的序列或與SEQ ID NO 4的序列具有以漸增的優(yōu)選順序至少35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％或99％的序列一致性的同源物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5到7任意一項的方法，其中所述的編碼MAP蛋白的核酸來自植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8任意一項的方法，其中所述改變的生長特性為增加的產(chǎn)量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9任意一項的方法，其中所述改變的生長特性為增加的種子產(chǎn)量。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到8任意一項的方法，其中所述生長特性為增加的植物高度。
12.包括下述各項的基因構(gòu)建體a)編碼MAP蛋白或其變體的核酸，或包括編碼MAP蛋白的核酸的變體；以及b)一個或多個在植物中能夠驅(qū)動(a)項的核酸序列表達(dá)的調(diào)控序列；以及可選地c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的基因構(gòu)建體，其中核酸(a)為SEQ ID NO 1或3代表的核酸或其變體，或所述的核酸(a)編碼SEQ ID NO 2或4代表的MAP蛋白或其變體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的基因構(gòu)建體，其中所述的核酸(a)編碼與SEQ ID NO 2的序列或與SEQ ID NO 4的序列具有以漸增的優(yōu)選順序至少35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、或99％的序列一致性的同源物。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的基因構(gòu)建體，其中核酸(a)為SEQ ID NO 1或3代表的核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求12到15任意一項的基因構(gòu)建體，其中所述的調(diào)控序列(b)是組成性啟動子，例如GOS2啟動子。
17.含有權(quán)利要求12到16任意一項定義的基因構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求1到11的任意一項的方法可獲得的植物，相對于相應(yīng)的野生型植物，該植物具有改變的生長特性。
19.具有改變的生長特性的轉(zhuǎn)基因植物，相對于相應(yīng)的野生型植物而言，該植物具有改變的編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)，和/或具有改變的MAP蛋白的水平和/或活性。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因植物，含有分離的編碼MAP蛋白或其變體的核酸，或含有分離的編碼MAP蛋白的核酸的變體，或含有權(quán)利要求12到16的任意一項定義的基因構(gòu)建體。
21.根據(jù)權(quán)利要求18到20任意一項的植物，該植物是單子葉植物，優(yōu)選谷類植物，例如玉米或稻。
22.根據(jù)權(quán)利要求18到21任意一項的植物，其中所述的生長特性是增加的產(chǎn)量。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的植物，其中所述的增加的產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量。
24.根據(jù)權(quán)利要求18到21任意一項的植物，其中所述的生長特性是增加的植物高度。
25.權(quán)利要求18到24的任意一項定義的植物的植物部分，優(yōu)選可收獲的部分，例如種子，繁殖體或后代。
26.分離的編碼MAP蛋白的核酸或分離的MAP蛋白對改變植物生長特性的應(yīng)用。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中所述的生長特性為增加的產(chǎn)量。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中所述的增加的產(chǎn)量為增加的種子產(chǎn)量。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中所述的生長特性為增加的植物高度。
30.適合于調(diào)節(jié)植物生長特性的組合物，包括編碼MAP蛋白的核酸、MAP蛋白或權(quán)利要求12到16任意一項所定義的基因構(gòu)建體，以及另外包括合適的載體、稀釋劑或賦形劑。
31.編碼MAP蛋白的核酸或MAP蛋白作為植物生長調(diào)節(jié)劑的靶標(biāo)的應(yīng)用。
32.編碼MAP蛋白的核酸在以提高產(chǎn)量為目的的植物培育程序中的應(yīng)用。
33.權(quán)利要求18到24的任意一項定義的植物或權(quán)利要求25中定義的植物部分在生產(chǎn)酶、醫(yī)藥品或農(nóng)用化學(xué)品中的應(yīng)用。
34.權(quán)利要求18到24的任意一項定義的植物或權(quán)利要求25中定義的植物部分在生產(chǎn)食品或飼料產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過改變植物中編碼甲硫氨酸氨肽酶(MAP蛋白)的核酸的表達(dá)和/或改變植物中MAP蛋白的水平和/或活性來改變植物的生長特性的方法。本發(fā)明也涉及具有改變的生長特性的轉(zhuǎn)基因植物，該植物具有改變的編碼MAP蛋白的核酸的表達(dá)。本發(fā)明特別揭示了一種提高植物產(chǎn)量的方法，優(yōu)選提高谷類作物的產(chǎn)量，例如稻或玉米。
文檔編號A01H5/10GK1748033SQ200480003665
公開日2006年3月15日 申請日期2004年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月6日
發(fā)明者V·米羅諾夫 申請人:作物培植股份有限公司