專(zhuān)利名稱：用于改善的陰道健康的益生菌乳桿菌屬菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)的益生菌細(xì)菌菌株，或者其變種，其能夠在人陰道中建群。更具體地，益生菌細(xì)菌菌株屬于選自植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus)和加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)的物種。本發(fā)明還涉及其作為藥物，包含所述菌株的組合物，該組合物例如是食品或者藥物組合物，衛(wèi)生產(chǎn)品，所述菌株的生物純的培養(yǎng)物和新的食物的用途。
背景技術(shù)：
通過(guò)陰道上皮與微生物菌群的相互作用維持健康的陰道，其中乳桿菌起了關(guān)鍵作用。乳桿菌屬物種通過(guò)葡萄糖代謝在陰道保持pH酸性；此外，與過(guò)氧化氫和細(xì)菌素樣產(chǎn)生一起，它們抑制病原體和其他不希望的微生物的生長(zhǎng)。這有助于對(duì)導(dǎo)致泌尿道感染(UTI)的尿路病原體、細(xì)菌性陰道病和白色假絲酵母(Candida albicans)引起的酵母性陰道炎的成功保護(hù)(Reid G，Bruce AW.Urogenital infections in womencan probiotics help？Postgrad Med J 2003；79428-432.)。
長(zhǎng)期以來(lái)公認(rèn)在陰道占優(yōu)勢(shì)的乳桿菌屬物種是嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，但是基因型鑒定方法的使用已經(jīng)證明健康陰道中最常見(jiàn)的乳桿菌物種實(shí)際上是卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、Lactobacillus iners和詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)。然而，單獨(dú)的研究證明從陰道回收的乳桿菌之間的差異表明諸如鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌的物種是占優(yōu)勢(shì)的乳桿菌，這可能是由于樣品處理、陰道狀態(tài)或者分離的優(yōu)選方法中的差異(Vásquez A，Jakobsson T，AhrnéS，F(xiàn)orsum U，Molin G.Vaginal Lactobacillus flora of healthy Swedish women.J.Clin.Mirobiol.2002；402746-9)。
世界衛(wèi)生組織(World Health Organization)將益生菌定義為“當(dāng)以足夠量施用時(shí)對(duì)宿主賦予健康益處的活的微生物”?？股乜剐缘陌l(fā)展和陰道感染治療中的失敗已經(jīng)引起了對(duì)益生菌作為備選工具的漸增的興趣。就陰道感染復(fù)發(fā)的高發(fā)病率而言，對(duì)于陰道益生菌的需求是顯然的(Reid G，Bruce AW，F(xiàn)raser N，Heinemann C，Owen J，Henning B.Oral probiotics can resolve urogenital infections.FEMSImmunol Med Microbiol 2001；3049-52；Famularo G，Pieluigi M，Coccia R，Mastroiacovo P，De Simone C.Microecology，bacterial va-ginosis and probioticsperspectives for bacteriotherapy.MedHypotheses 2001；56421-30.)。特征是乳桿菌減少的陰道菌群的改變似乎是導(dǎo)致細(xì)菌性陰道炎綜合征的主要因素。規(guī)則地施用能夠在陰道建群的乳桿菌屬菌株可以是該問(wèn)題的備選解決方案。
作為家庭治療法的酸乳酪治療多年來(lái)已用于預(yù)防或者減輕陰道病癥。然而，在酸乳酪中發(fā)現(xiàn)的乳桿菌德氏乳桿菌保加利亞變種(Lactobacillus delbreukii var.bulgaricus)不是通過(guò)益生菌進(jìn)行陰道恢復(fù)的最佳候選物，因?yàn)樗ǔ２辉谠摥h(huán)境中發(fā)現(xiàn)并且不良好地附著到陰道上皮細(xì)胞來(lái)進(jìn)行成功的建群(Famularo G，Pieluigi M，Coccia R，Mastroiacovo P，De Simone C.Microecology，bacterial vaginosis andprobioticsperspectives for bacteriotherapy.Med Hypotheses 2001；56421-430)。這種陰道益生菌的最佳候選物是通常在陰道中發(fā)現(xiàn)并且具有抑制病原體的性質(zhì)的物種。
正常的陰道菌群從直腸粘膜上升(Reid G，Bruce AW.Urogenitalinfections in womencan probiotics help？Postgrad Med J 2003；79428-432)，這意味著在穿過(guò)胃腸幸存下來(lái)的經(jīng)口施用的微生物將在一定的時(shí)間以后出現(xiàn)在陰道中。該事實(shí)產(chǎn)生了這樣的可能性，即陰道益生菌可以經(jīng)口施用于宿主，這簡(jiǎn)化了意在預(yù)防陰道問(wèn)題的長(zhǎng)期施用。
在6個(gè)月期間對(duì)婦女施用嗜酸乳桿菌引起假絲酵母建群和感染都下降(Hilton E，Isenberg HD，Alperstein P，F(xiàn)rance K，Borenstein MT.Ingestion of yogurt containing Lactobacillus acidophilus as prophylaxisfor candidal vaginitis.Ann Internal Med 1992；116353-357)。
發(fā)明概述現(xiàn)在已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)屬于乳桿菌屬，更具體地，屬于選自植物乳桿菌、卷曲乳桿菌和加氏乳桿菌的物種的特定益生菌細(xì)菌菌株能夠當(dāng)例如經(jīng)口、直腸或者陰道施用時(shí)在人陰道建群并且保持或者改善陰道健康。
本發(fā)明的一方面涉及屬于乳桿菌屬的益生菌細(xì)菌菌株或者其變種，其能夠在人陰道建群，附帶條件是該細(xì)菌菌株不是保藏號(hào)DSM15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM 15313的植物乳桿菌HEAL19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL 99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299或者保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌菌株屬于選自植物乳桿菌、卷曲乳桿菌和加氏乳桿菌的物種或者其變種，且在另一實(shí)施方案中，所述菌株具有甘露糖特異性粘附素或者其他粘附機(jī)制，其允許細(xì)菌結(jié)合到陰道、胃腸道、包括尿道的膀胱的內(nèi)表面。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，益生菌細(xì)菌菌株是保藏號(hào)DSM16735的卷曲乳桿菌VPC5，或者其變種。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，益生菌細(xì)菌菌株是保藏號(hào)DSM16736的卷曲乳桿菌VPC40，或者其變種。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，益生菌細(xì)菌菌株是保藏號(hào)DSM16738的卷曲乳桿菌VPC70，或者其變種。
在另一實(shí)施方案中，益生菌細(xì)菌菌株是保藏號(hào)DSM 16739的卷曲乳桿菌VPC71，或者其變種。
在另一實(shí)施方案中，益生菌細(xì)菌菌株是保藏號(hào)DSM 16740的卷曲乳桿菌VPC77，或者其變種。
在另一實(shí)施方案中，益生菌細(xì)菌菌株是保藏號(hào)DSM 16741的卷曲乳桿菌VPC111，或者其變種。
在另一實(shí)施方案中，益生菌細(xì)菌菌株是保藏號(hào)DSM 16742的卷曲乳桿菌VPC130，或者其變種。
在另一實(shí)施方案中，益生菌細(xì)菌菌株是保藏號(hào)DSM 16743的卷曲乳桿菌VPC177，或者其變種。
在另一實(shí)施方案中，益生菌細(xì)菌菌株是保藏號(hào)DSM 16737的加氏乳桿菌VPG44，或者其變種。
在另一實(shí)施方案中，上述細(xì)菌菌株用作藥物。
本發(fā)明的第二方面涉及上述細(xì)菌菌株用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防細(xì)菌性陰道病、病毒性陰道病、酵母性陰道炎、陰道中的感染、諸如HIV和衣原體感染的性傳播疾病、危及孕婦中胎兒的感染、早產(chǎn)和泌尿道感染的藥物的用途。
本發(fā)明的第三方面涉及選自保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM 15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM15316的植物乳桿菌HEAL 99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299或者保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v的細(xì)菌菌株或者其變種的用途，其用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防細(xì)菌性陰道病、病毒性陰道病、酵母性陰道炎、陰道中的感染、諸如HIV和衣原體感染的性傳播疾病、危及孕婦中胎兒的感染、早產(chǎn)和泌尿道感染的藥物，附帶條件是保藏號(hào)DSM9843的植物乳桿菌299v用于泌尿道感染。
本發(fā)明的第四方面涉及組合物，其包含如上述的至少一種益生菌細(xì)菌菌株，和/或保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299或者保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v，或者其變種，和/或其片段或者級(jí)分。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含載體材料。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是食品，優(yōu)選包含選自燕麥片粥、乳酸發(fā)酵食物、抗性淀粉、飲食纖維、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)的載體材料。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述食品選自面包、干酪、酸乳酪、汁、健康條(health bar)、涂抹料(spreads)、餅干和谷類(lèi)，且在另一實(shí)施方案中，所述至少一種益生菌細(xì)菌菌株經(jīng)被囊化或者包衣，并且優(yōu)選以一定量存在，當(dāng)被消費(fèi)時(shí)，所述量提供107到1012CFU，優(yōu)選109到1010CFU的有效日劑量。
在另一實(shí)施方案中，組合物是食物補(bǔ)充劑，優(yōu)選包含選自燕麥片粥、乳酸發(fā)酵食物、抗性淀粉、飲食纖維、安茴酰牛扁堿(inulines)、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)的載體材料。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，組合物是用于治療和/或預(yù)防細(xì)菌性陰道病、病毒性陰道病、酵母性陰道炎、陰道中的感染、諸如HIV和衣原體感染的性傳播疾病、危及孕婦中胎兒的感染、早產(chǎn)和泌尿道感染的藥物組合物，附帶條件是保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v用于泌尿道感染。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物經(jīng)口、陰道或者直腸施用，或者滴注到膀胱中，并且優(yōu)選所述載體材料是至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物以經(jīng)口和陰道，經(jīng)口和直腸，或者經(jīng)口、陰道和直腸的組合施用治療施用。
在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物以片劑、吮吸片劑、甜味食品、口香糖、膠囊、有腸溶衣的片劑和膠囊、栓劑、微型灌腸劑、陰道用片劑、陰道用明膠膠囊、陰道用錠劑、乳膏、凝膠、軟膏、洗劑、棉塞、尿布、墊子、熔化條(melting strip)、避孕套、陰道栓劑、噴霧劑和臨床營(yíng)養(yǎng)品的形式施用。在組合物的再一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)經(jīng)口施用時(shí)，所述至少一種益生菌細(xì)菌菌株以提供107到1012CFU，優(yōu)選109到1010CFU的有效日劑量的量存在，并且當(dāng)經(jīng)陰道或者直腸施用時(shí)，所述至少一種益生菌細(xì)菌菌株以提供103到1012CFU，優(yōu)選105到109CFU的有效日劑量的量存在。
在藥物組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種益生菌細(xì)菌菌株經(jīng)被囊化或者包衣，且在另一實(shí)施方案中，所述組合物包含選自維生素、礦物質(zhì)和益生素的添加劑。
本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及包含如上述的組合物的衛(wèi)生產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述衛(wèi)生產(chǎn)品選自棉塞、衛(wèi)生巾、月經(jīng)墊、尿布、肥皂、洗發(fā)劑、凝膠、軟膏、乳膏、噴霧劑和洗劑。
本發(fā)明的第六個(gè)方面涉及如上述的至少一種益生菌細(xì)菌菌株，和/或保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM 15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL 99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299、保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v，或者其變種，和/或其片段或者級(jí)分的生物培養(yǎng)物。
本發(fā)明的第七個(gè)方面涉及包含如上述的至少一種益生菌細(xì)菌菌株，和/或保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM 15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL 99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299、保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v，或者其變種，和/或其片段或者級(jí)分的新的食物。
本發(fā)明的第八個(gè)方面涉及包含如上述的至少一種益生菌細(xì)菌菌株，和/或保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM 15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL 99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299、保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v，或者其變種，和/或其片段或者級(jí)分的食物補(bǔ)充劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述益生菌細(xì)菌菌株是活的。在另一實(shí)施方案中，它是滅活或者受抑制的。在再一個(gè)實(shí)施方案中，它是基因修飾的，且在另一實(shí)施方案中，它是被殺死的。
本發(fā)明的第八個(gè)方面涉及如上述的益生菌細(xì)菌菌株的片段或者級(jí)分。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了基于一些最優(yōu)選的益生菌細(xì)菌菌株的RAPD分析的系統(tǒng)樹(shù)。
圖2A-I顯示了作為圖1的系統(tǒng)樹(shù)的基礎(chǔ)的一些最優(yōu)選的益生菌細(xì)菌菌株的RAPD模式。
圖3A顯示了攝入實(shí)施例3的四種不同的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品后的log cfu/g糞便。
圖3B顯示了攝入實(shí)施例3的四種不同的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品后，陰道流體中的log cfu/拭子。
圖4顯示了通過(guò)用限制酶Hind III(泳道2)、Cla I(泳道3)、Eco RI(泳道4)切割菌株卷曲乳桿菌VPC 177的染色體DNA得到的分離的DNA片段。分子量DNA標(biāo)記用作標(biāo)準(zhǔn)(泳道1和5)。
圖5顯示了通過(guò)用限制酶Hind III(泳道2)、Cla I(泳道3)、Eco RI(泳道4)切割菌株卷曲乳桿菌VPC 5的染色體DNA得到的分離的DNA片段。分子量DNA標(biāo)記用作標(biāo)準(zhǔn)(泳道1和5)。
圖6顯示了通過(guò)用限制酶Hind III(泳道2)、Cla I(泳道3)、Eco RI(泳道4)切割菌株卷曲乳桿菌VPC 40的染色體DNA得到的分離的DNA片段。分子量DNA標(biāo)記用作標(biāo)準(zhǔn)(泳道1和5)。
圖7顯示了通過(guò)用限制酶Hind III(泳道2)、Cla I(泳道3)、Eco RI(泳道4)切割菌株卷曲乳桿菌VPC 71的染色體DNA得到的分離的DNA片段。分子量DNA標(biāo)記用作標(biāo)準(zhǔn)(泳道1和5)。
圖8顯示了通過(guò)用限制酶Hind III(泳道2)、Cla I(泳道3)、Eco RI(泳道4)切割菌株卷曲乳桿菌VPC 111的染色體DNA得到的分離的DNA片段。分子量DNA標(biāo)記用作標(biāo)準(zhǔn)(泳道1和5)。
圖9顯示了通過(guò)用限制酶Hind III(泳道2)、Cla I(泳道3)、Eco RI(泳道4)切割菌株卷曲乳桿菌VPC 130的染色體DNA得到的分離的DNA片段。分子量DNA標(biāo)記用作標(biāo)準(zhǔn)(泳道1和5)。
圖10顯示了通過(guò)用限制酶Hind III(泳道2)、Cla I(泳道3)、Eco RI(泳道4)切割菌株加氏乳桿菌VPG 44的染色體DNA得到的分離的DNA片段。分子量DNA標(biāo)記用作標(biāo)準(zhǔn)(泳道1和5)。
發(fā)明描述本發(fā)明特別涉及包含植物乳桿菌或密切相關(guān)的乳桿菌屬物種的一種或多種菌株的組合物，所述菌株通過(guò)經(jīng)口施用和腸確立能夠在陰道建群。所述組合物將例如保持陰道健康，減輕陰道病、酵母性陰道炎、泌尿道感染、性傳播疾病和可能危及孕婦中胎兒的感染。
健康的尿生殖微生物菌群包含＞50種微生物物種。健康的尿生殖細(xì)胞被細(xì)菌生物膜覆蓋，其中主要是乳桿菌。通過(guò)陰道上皮和微生物菌群的相互作用維持健康的陰道。糞便菌群中的病原體是泌尿道感染和細(xì)菌性陰道病的來(lái)源。致病的一個(gè)因素是病原體能夠附著到上皮細(xì)胞。粘附素和受體位點(diǎn)參與該附著過(guò)程。例如，病原體大腸桿菌(E.coli)在上皮表面上具有甘露糖特異性附著。以前已經(jīng)表明一些乳桿菌也具有甘露糖特異性粘附。通過(guò)利用該機(jī)制，一些益生菌乳桿菌也阻止病原體粘附到粘膜表面，如陰道和尿道粘膜并且從而防止感染。其他因素是通過(guò)葡萄糖代謝維持陰道中的低pH、產(chǎn)生過(guò)氧化氫和細(xì)菌素樣產(chǎn)生來(lái)抑制病原體和其他不想要的微生物的生長(zhǎng)。
本發(fā)明特別涉及菌株保藏號(hào)DSM 16735的卷曲乳桿菌VPC5、保藏號(hào)DSM 16736的卷曲乳桿菌VPC40、保藏號(hào)DSM 16738的卷曲乳桿菌VPC70、保藏號(hào)DSM 16739的卷曲乳桿菌VPC71、保藏號(hào)DSM16740的卷曲乳桿菌VPC77、保藏號(hào)DSM 16741的卷曲乳桿菌VPC111、保藏號(hào)DSM 16742的卷曲乳桿菌VPC130、保藏號(hào)DSM 16743的卷曲乳桿菌VPC177和保藏號(hào)DSM 16737的加氏乳桿菌VPG44，它們?cè)?004年9月17日保藏在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，并且被給予上面引用的編號(hào)，或者其變種。所述菌株具有在陰道建群的能力。
本發(fā)明還涉及細(xì)菌菌株保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL9、保藏號(hào)DSM 15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL 99，它們?cè)?002年11月27日保藏在德意志微生物保藏中心，并且被給予上面引用的編號(hào)，或者其變種。
本發(fā)明還涉及1991年7月2日保藏的保藏號(hào)為DSM 6595的植物乳桿菌299和1995年3月16日保藏的保藏號(hào)為DSM 9843的植物乳桿菌299v或者其變種的用途，它們?cè)诘乱庵疚⑸锉２刂行谋２夭⒔o予上面引用的編號(hào)。
關(guān)于本發(fā)明的細(xì)菌菌株，特別是那些已經(jīng)保藏的細(xì)菌菌株使用的短語(yǔ)“其變種”定義為細(xì)菌，其-通過(guò)使用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)和利用算術(shù)平均值的未加權(quán)的配對(duì)算法(UPGMA；BioNumerics 2.5，Applied Maths，Kortrijk，比利時(shí))，屬于與所述益生菌細(xì)菌菌株具有至少80％的RAPD相似性的聚簇；和/或-通過(guò)使用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)和利用算術(shù)平均值的未加權(quán)的配對(duì)算法(UPGMA；BioNumerics 2.5，Applied Maths，Kortrijk，比利時(shí))，屬于與所述益生菌細(xì)菌菌株優(yōu)選具有至少75％的限制性內(nèi)切核酸酶分析相似性的聚簇；和/或-能夠在人陰道建群；和/或-具有甘露糖特異性粘附素或者其他粘附機(jī)制，其允許細(xì)菌結(jié)合到陰道、胃腸道、包括尿道的膀胱的內(nèi)表面。
關(guān)于本發(fā)明在此處使用的短語(yǔ)“益生菌細(xì)菌菌株”指活的微生物，其當(dāng)以足夠量施用時(shí)，對(duì)宿主賦予健康益處。此外，當(dāng)經(jīng)口服用細(xì)菌菌株時(shí)，細(xì)菌菌株必須穿過(guò)胃腸道存活并且，當(dāng)細(xì)菌菌株被經(jīng)陰道或者直腸服用時(shí)，細(xì)菌菌株必須分別在陰道和直腸建群。
關(guān)于本發(fā)明的細(xì)菌菌株在此處使用的短語(yǔ)“在人陰道建群”指與最初的總?cè)闂U菌計(jì)數(shù)，即服用任何細(xì)菌菌株之前相比，在經(jīng)口、直腸或者陰道服用所述細(xì)菌菌株后，陰道流體和/或糞便中存活的乳桿菌的計(jì)數(shù)(log cfu/拭子)至少增加。
本發(fā)明實(shí)施方案詳述通過(guò)REA進(jìn)行基因型鑒定菌株(保藏號(hào)DSM 16735的卷曲乳桿菌VPC5、保藏號(hào)DSM 16736的卷曲乳桿菌VPC40、保藏號(hào)DSM 16739的卷曲乳桿菌VPC71、保藏號(hào)DSM 16741的卷曲乳桿菌VPC111、保藏號(hào)DSM 16742的卷曲乳桿菌VPC130、保藏號(hào)DSM 16743的卷曲乳桿菌VPC177和保藏號(hào)DSM16737的加氏乳桿菌VPG44)通過(guò)根據(jù)Sthl M，Molin G，Persson A，AhrnéS & Sthl S，International Journal of Systematic Bacteriology，40189-193，1990并由Johansson，M-L等人，International Journalof Systematic Bacteriology 45670-675，1995進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的限制性內(nèi)切核酸酶分析(REA)方法檢查染色體DNA的切割模式?？梢匀缦率疽庑悦枋鯮EA制備參與研究的菌株的染色體DNA并通過(guò)限制性內(nèi)切核酸酶切割。用10單位Hind III、Cla I和EcoRI在37℃將0.75μg每種DNA單獨(dú)消化4小時(shí)；每種內(nèi)切核酸酶分開(kāi)使用。用浸沒(méi)的水平瓊脂糖板凝膠通過(guò)凝膠電泳根據(jù)大小分離切割的DNA片段。凝膠由150ml0.9％瓊脂糖(超純DNA級(jí)；低電滲；BioRad Laboratories，Richmond，美國(guó))組成并澆鑄為板凝膠(150×235mm)。0.2μg高分子量DNA標(biāo)記(High Molecular Weight DNA marker)(Bethesda ResearchLaboratories，MD，美國(guó))與0.5μg DNA分子量標(biāo)記VI(Roche，德國(guó))一起用作標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)在Ficoll加樣緩沖液(2g Ficoll，8ml水，0.25％溴酚)中應(yīng)用樣品DNA實(shí)現(xiàn)最小的帶變形和最大的銳度。
凝膠在40V的恒定電壓、在約6-8℃下電泳18小時(shí)。在電泳期間緩沖液(89mM Tris，23mM H3P04，2mM EDTA鈉，pH 8.3)再循環(huán)。之后，將凝膠用溴化乙錠(2μg/m1)染色20分鐘并用蒸餾水脫色，在302nm下用紫外透射儀(UVP Inc.，San Gabriel，美國(guó))顯色并拍照。這種進(jìn)行凝膠電泳的方法得到良好分布并且相對(duì)良好分離的帶，所述帶低至1.2×106分子量。
分析結(jié)果在圖4-10中給出。
實(shí)施例1志愿者和菌株沒(méi)有陰道感染或者任何腸疾病的不同年齡的10名健康婦女參與該研究。該研究受試者通過(guò)問(wèn)卷提供了關(guān)于她們的年齡、月經(jīng)周期和健康行為的信息。采集第一次樣品前一周，志愿者經(jīng)歷清除(washout)期，期間她們避免所有類(lèi)型的含有益生菌的配方。
用于研究的細(xì)菌菌株在表1中給出。它們依據(jù)質(zhì)量從一組23種乳桿菌中選擇，所述質(zhì)量為諸如在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后的活菌計(jì)數(shù)、燕麥片粥發(fā)酵和抵抗冷凍和解凍的能力。
12種最有抗性的菌株被選擇用來(lái)施用于志愿者；在表1中給出了細(xì)菌濃度和培養(yǎng)物的溫育時(shí)間。施用在10天期間進(jìn)行。從LCM(攜帶乳桿菌的培養(yǎng)基)中的新鮮培養(yǎng)物制備細(xì)菌菌株(Efthymiou C，HansenCA.An antigenic analysis of Lactobacillus acidophilus.J Infect Dis 1962；110258-267)。通過(guò)離心收獲總體積100ml中等價(jià)于約109個(gè)細(xì)菌濃度的每種培養(yǎng)物的細(xì)胞并用Millipore-H2O洗滌一次。然后將沉淀溶解在20ml燕麥乳(Beneviva，芬蘭)和80ml越桔湯(Ekstrms，瑞典)中，其是施用于受試者的飲料。
表1.為了施用所選的細(xì)菌乳桿菌(L.)菌株
樣品收集志愿者遞送糞便和陰道流體樣品，其在遞送到實(shí)驗(yàn)室后在瓊脂板上培養(yǎng)3小時(shí)。在處理開(kāi)始時(shí)(T0)、施用后10天(T1)和施用結(jié)束后7天(T2)采樣。
通過(guò)蓋子插入陰道拭子(Copan amies瓊脂凝膠拭子；Copaninnovation，意大利)服用陰道樣品以防止細(xì)菌污染。將陰道拭子在9ml無(wú)菌磷酸緩沖鹽水(PBS)pH 7.2中攪拌并連續(xù)稀釋。將1g糞便在9mlPBS中攪拌并連續(xù)稀釋。將陰道樣品的每種稀釋液和糞便樣品的最后三次稀釋液的等分試樣鋪平板在Rogosa瓊脂(Oxoid AB，Sollentuna，瑞典)上并在BBL Gas Pack系統(tǒng)中在37℃下厭氧溫育3天。
溫育后隨機(jī)挑取來(lái)自糞便和陰道樣品的6個(gè)菌落。此外，搜索具有典型的形態(tài)學(xué)外觀的菌落并當(dāng)發(fā)現(xiàn)時(shí)額外挑取。
菌株分型用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)以及施用的菌株一起將總共338個(gè)分離物分組。它們?cè)赗ogosa瓊脂(Oxoid)上再次培養(yǎng)以驗(yàn)證它們沒(méi)有被污染。
用于PCR擴(kuò)增的引物是具有序列3′-ACG CGC CCT-5′的9聚體(Scandinavian Gene Synthesis AB，Kping，瑞典)。如Quednau M，AhrnéS，Pettersson AC，Molin G.Identification of clinically importantspecies of Enterococcus with in 1 day with Random AmplifiedPolymorphic DNA(RAPD)Curr.Microbiol.1998；36332-6以前所述進(jìn)行下面的PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳。在含有具有1.5mM MgCl2的PCR緩沖液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國(guó))、0.2mM每種核苷酸(Roche)和2.5單位Taq DNA聚合酶(Roche)的50μl總反應(yīng)體積中使用1μl PCR模板。根據(jù)下面的溫度特征進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃45秒，30℃120秒，72℃60秒，四個(gè)循環(huán)，接著是94℃5秒，36℃30秒(每個(gè)循環(huán)延長(zhǎng)1秒)，72℃30秒，共26個(gè)循環(huán)。PCR期間(session)以72℃10分鐘結(jié)束，接著冷卻到4℃。產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳顯現(xiàn)并通過(guò)Hewlett Packard ScanJet 5300C將RAPD-凝膠的照相底片(photonegative)以300dpi的分辨率掃描到計(jì)算機(jī)中。然后通過(guò)GelCompar 4.2(Applied Maths，Kortrijk，比利時(shí))，以Pearson積矩相關(guān)系數(shù)(r)和利用算術(shù)平均值的未加權(quán)配對(duì)組方法(UPGMA)分析凝膠圖像并將其分組。
菌株鑒定REA-限制性內(nèi)切核酸酶分析從RAPD分組選擇36個(gè)分離物以及所施用的菌株并通過(guò)REA(限制性內(nèi)切核酸酶分析)進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，以便確保在受試者的糞便和陰道樣品中存在外源菌株。
如以前描述的程序(Ulrich RL，Hughes TA.A rapid procedure forisolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other gram-positive bacteria.Lett Appl Microbiol 2001；3252-56)進(jìn)行染色體DNA的制備。根據(jù)Johansson等人(Johansson ML，Quednau M，AhrnéS，Molin，G.Classification of Lactobacillus plantarum by restrictionendonuclease analysis of total chromosomal DNA using conventionalagarose gel electrophoresis.Int J Syst Bacteriol 1995；45670-5)的較早方案進(jìn)行凝膠電泳。
用10單位的HindIII和EcoRI(Roche)在37℃下單獨(dú)消化DNA(0.75μg)4小時(shí)。使用大小為150×235mm的浸沒(méi)的水平0.9％瓊脂糖(高強(qiáng)度分析級(jí)瓊脂糖(High Strength Analytical Grade Agarose)低電滲，Bio-Rad Laboratories，CA，美國(guó))板凝膠。0.2μg量的高分子量DNA標(biāo)記(Gibco，Invitrogene Corporation，瑞典)以及0.5μg DNA分子量標(biāo)記VI(Roche)用作標(biāo)準(zhǔn)。凝膠在40V恒定電壓在5℃下電泳18小時(shí)。之后，在302nm下用紫外透射儀(UVP Inc.，San Gabriel，CA，美國(guó))顯現(xiàn)帶并拍照。
結(jié)果在10天處理(T1)后和結(jié)束施用后1周(T2)，從10名受試者中的8名回收了所施用的菌株的5種。在T1再分離的菌株為卷曲乳桿菌VPC177、加氏乳桿菌VPG44和植物乳桿菌HEAL 19；而在T1和T2均回收了植物乳桿菌HEAL 99和植物乳桿菌HEAL 9(表2)。
表2.在受試者(s)的陰道和糞便樣品中發(fā)現(xiàn)的再分離的菌株。括號(hào)內(nèi)“d”指出菌株從隨機(jī)挑取的菌落再分離，即該菌株代表總的乳桿菌菌群的占優(yōu)勢(shì)部分。
RAPD-隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)還用如Johansson等人，1995 Randomly Amplified PolymorphicDNA(RAPD)for rapid typing of Lactobacillus plantarum strains.Lett.Appl.Microbiol.21155-159描述的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)的基于PCR的方法，用如下的改進(jìn)分析最引入關(guān)注的細(xì)菌菌株。從來(lái)自MRS瓊脂板的純培養(yǎng)物的3-5個(gè)菌落制備粗細(xì)胞提取物。將純培養(yǎng)物的細(xì)胞用1ml無(wú)菌Milli-Q水洗滌兩次，并在Eppendorf管中用玻璃珠(直徑2mm)，用Eppendorf混合器(5432；Eppendorf，Hamburg德國(guó))破裂10分鐘。使用的引物具有序列5′-CCGCAGCCAA-3′和15μM的濃度。來(lái)自Qiagen的Taq mastermix用于PCR反應(yīng)。通過(guò)使用BioNumerics 2.5(Applied Maths，Kortrijk，比利時(shí))，用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)(r)和利用算術(shù)平均值的未加權(quán)配對(duì)組方法(UPGMA；Romersburg，1984)分析凝膠的帶模式。RAPD模式的計(jì)算機(jī)化聚簇分析與目視比較相結(jié)合。
通過(guò)對(duì)表1的8個(gè)卷曲乳桿菌菌株和1個(gè)加氏乳桿菌菌株使用上述RAPD方法，可以鑒定含有具有80％相似性的菌株的兩個(gè)聚簇(見(jiàn)圖1的系統(tǒng)樹(shù))。在這種聚簇中的菌株被認(rèn)為是相互的變種并且預(yù)測(cè)其具有相似的性質(zhì)。聚簇之一含有菌株VPC 70、VPC 71和VPC 5，而另一個(gè)含有菌株VPC 177、VPC 40和VPC 111。例如，經(jīng)口施用后在陰道中可以發(fā)現(xiàn)菌株VPC 177，并且因此相同的RAPD聚簇內(nèi)的其他菌株也可能具有這種能力。
結(jié)論實(shí)驗(yàn)證明所選的植物乳桿菌菌株通過(guò)經(jīng)口施用和腸確立在陰道內(nèi)建群的出乎意料的能力。應(yīng)該指出的是，用相對(duì)低劑量的益生菌在短時(shí)間內(nèi)施用實(shí)現(xiàn)了該結(jié)果并且將植物乳桿菌與陰道的更典型的菌株，即更頻繁發(fā)生的物種和從陰道分離的菌株進(jìn)行了比較。
實(shí)施例2酵母凝集作用作為甘露糖附著的度量在該實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)目測(cè)確定細(xì)菌凝集酵母細(xì)胞作為酵母細(xì)胞和細(xì)菌的可見(jiàn)的沉淀的能力。將洗滌的細(xì)菌以每毫升2×1010個(gè)細(xì)胞的濃度懸浮在PBS(pH 7.2)中。在顯微鏡載玻片上，將懸浮在PBS或者含有0.125％(重量/體積)的D-甘露糖的PBS中的2.5％(重量/體積)面包酵母(啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae))的溶液加入等體積的細(xì)菌溶液中。通過(guò)溫和搖動(dòng)載玻片混合細(xì)菌和酵母溶液，并計(jì)算轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)直到出現(xiàn)凝集的酵母和細(xì)菌細(xì)胞的沉淀。比較有和沒(méi)有甘露糖的溶液之間的該轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)。如果在有或者沒(méi)有甘露糖的樣品之間，直到出現(xiàn)可見(jiàn)的沉淀時(shí)的轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)相差超過(guò)10倍，那么將酵母凝集分類(lèi)為甘露糖敏感的。
在實(shí)驗(yàn)期間，表明卷曲乳桿菌VPC 177和VPC 70能夠以甘露糖敏感的方式凝集酵母。以前已經(jīng)表明甘露糖敏感的酵母凝集與附著到人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29的細(xì)胞的能力相關(guān)(Adlerberth，I.，Ahrné，S.，Johansson，M-L.，Molin，G.，Hanson，L-.，and Wold，A.E.(1996).Amannose-specific adherence mechanism in Lactobacillus plantarumconferring binding to the human colonic cell line HT-29，Appl.Environ.Microbiol.，62，2244-2251.)，并且從而是促進(jìn)腸中研究中的細(xì)菌的建群和持久性的因素。因此，非常可能的是，細(xì)菌的該特征對(duì)于陰道和泌尿道中的建群也是重要的，并且因此是與大腸桿菌的尿路致病(uropathogenic)細(xì)菌菌株競(jìng)爭(zhēng)的機(jī)制。以前對(duì)保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299和保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v也顯示了該特征，從而甘露糖特異性附著的機(jī)制。
實(shí)施例3下面實(shí)驗(yàn)的目的是研究4種乳桿菌屬菌株在腸和陰道中的確立，這通過(guò)研究經(jīng)口攝入冷凍干燥的配方中的乳酸細(xì)菌后它在糞便和陰道流體中的存在來(lái)進(jìn)行。
重要的是強(qiáng)調(diào)該實(shí)驗(yàn)在人體內(nèi)進(jìn)行，因?yàn)轶w外研究和動(dòng)物研究都不能反映施用于人時(shí)的存活程度。這些細(xì)菌當(dāng)培養(yǎng)后直接施用時(shí)在腸中確立的能力在以前的研究中有記載(Moreno，Alejandra Vásquez2004 PhD thesisSystematics of Lactobacillus spp.of probiotic potentialFood Technology；Lund University.)。在所述研究中，使用從過(guò)夜培養(yǎng)物得到的新鮮細(xì)菌細(xì)胞。然而，更方便的是使用實(shí)際產(chǎn)品中的凍干產(chǎn)品。因此，在該實(shí)驗(yàn)中由于該原因而選擇凍干的制劑。
主要目的是研究在開(kāi)放式研究中經(jīng)口攝入菌株后，來(lái)自陰道的四種乳桿菌屬菌株在糞便和陰道流體中的存在。
因?yàn)殛幍乐械脑S多疾病，如泌尿道感染從直腸粘膜產(chǎn)生，所以有益的是看到糞便和陰道流體中健康乳桿菌的活菌計(jì)數(shù)都增加。如果本發(fā)明的健康細(xì)菌菌株除了陰道外還影響直腸，那么本發(fā)明的健康乳桿菌細(xì)菌將抑制直腸中不希望的細(xì)菌，從而避免陰道中發(fā)生來(lái)自直腸的疾病。
材料和方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)是開(kāi)放研究并且用一組受試者進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)分成八個(gè)時(shí)間段1.14天的清除時(shí)間段(第1-14天)2.在14天期間卷曲乳桿菌VPC 111的經(jīng)口攝入時(shí)間段(第15-28天)。
3.14天的清除時(shí)間段(第29-42天)4.在14天期間加氏乳桿菌VPG 44的經(jīng)口攝入時(shí)間段(第43-56天)。
5.14天的清除時(shí)間段(第57-70天)6.在14天期間卷曲乳桿菌VPC 177的經(jīng)口攝入時(shí)間段(第71-84天)。
7.14天的清除時(shí)間段(第85-98天)8.在14天期間植物乳桿菌HEAL 9的經(jīng)口攝入時(shí)間段(第99-112天)。
受試者和募集通過(guò)對(duì)Lund的Ideon and Chemical Centre(Lund University)的職員發(fā)送信息募集18-65歲的36名健康婦女。排除Probi AB，已知對(duì)該制劑中包括的任何成分不耐受或者變應(yīng)性的，當(dāng)前治療嚴(yán)重胃腸病癥和當(dāng)前治療陰道病癥的職員。
實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品分別含有凍干的卷曲乳桿菌VPC177、卷曲乳桿菌VPC111、植物乳桿菌HEAL9和加氏乳桿菌VPG44。加入蔗糖、麥芽糖糊精(maltodextrine)和水解的明膠作為冷凍保護(hù)劑。
日攝入為經(jīng)口2×1g凍干的乳桿菌(約1×109cfu/天)。在早晨和晚上服用劑量并且其與膳食結(jié)合攝入。產(chǎn)品以囊劑提供。
飲食規(guī)則從第1天到第113天，受試者不被允許攝入含有益生菌細(xì)菌的產(chǎn)品。為每個(gè)受試者提供在研究時(shí)間段期間不允許消費(fèi)的益生菌產(chǎn)品列表。這樣做是為了確保其他益生菌細(xì)菌不干擾該實(shí)驗(yàn)。
伴隨藥療法在病例報(bào)告表(CRF)和日志中指出所有伴隨藥療法。
在研究期間的排除標(biāo)準(zhǔn)是沒(méi)有連續(xù)服用＞4劑(2天)或者在研究的每個(gè)攝入時(shí)間段期間沒(méi)有服用總共＞8劑(4天)的受試者、沒(méi)有遵循飲食規(guī)則的受試者、在第1天和第112天之間對(duì)于嚴(yán)重的胃腸疾病而開(kāi)始醫(yī)學(xué)治療過(guò)程的受試者(由主要研究人員判斷)和不希望繼續(xù)該研究的受試者。
在第15、29、43、57、71、85、99和113天上交糞便和陰道樣品。在服用第一劑周期實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品之前收集第15、43、71和99天的樣品。在不超過(guò)上交用于分析前18小時(shí)收集樣品，并且在該時(shí)間段期間將樣品在冰箱中保存。分析樣品中的乳桿菌。
通過(guò)蓋子插入陰道拭子(Copan amies瓊脂凝膠拭子；Copaninnovation，Brescia，意大利)收集陰道樣品以防止細(xì)菌污染。在不超過(guò)上交用于分析前3小時(shí)收集樣品，并在該時(shí)間段期間將其保存在冰箱中。
針對(duì)乳桿菌菌群，通過(guò)(根據(jù)Johansson等人，1998)的微生物學(xué)方法分析樣品。(Rogosa瓊脂，厭氧，37℃下3天)。根據(jù)Johansson等人，Lett.Appl.Microbiol.1995；21155-159，用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析(RAPD)鑒定不同的乳桿菌。
根據(jù)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)值，見(jiàn)表1和2。
結(jié)果在36名婦女中，31名參加了1和2時(shí)間段(WO+VPC111)，34名參加了3和4時(shí)間段(WO+VPG44)，28名參加了5和6時(shí)間段(WO+VPC177)，且31名參加了7和8時(shí)間段(HEAL 9)。25名婦女參加了所有研究時(shí)間段。
表1攝入實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品2周之前和之后，在糞便樣品中的乳桿菌(平均值(最小值-最大值))。檢測(cè)水平下的值設(shè)為3.0，且超出檢測(cè)水平的值設(shè)為9.0以使得能夠計(jì)算。
表2攝入實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品2周之前和之后，在陰道樣品中的乳桿菌(平均值(最小值-最大值))。對(duì)于陰道樣品，檢測(cè)水平下的值設(shè)為2.0以使得能夠計(jì)算。
卷曲乳桿菌的兩個(gè)菌株VPC111和VPC177導(dǎo)致糞便菌群中總?cè)闂U菌顯著增加。此外，經(jīng)口攝入VPC177后，在陰道流體中觀察到總?cè)闂U菌的顯著增加。從而，非常有趣的是注意到經(jīng)口攝入益生菌細(xì)菌卷曲乳桿菌VPC111和VPC177后，觀察到糞便中乳桿菌的總的增加。經(jīng)口攝入卷曲乳桿菌VPC177后也觀察到陰道流體中總?cè)闂U菌的顯著增加。從而，不必通過(guò)以栓劑或者陰道插入物的形式服用菌株來(lái)實(shí)現(xiàn)陰道或直腸中關(guān)于健康的乳桿菌方面的有益效果?，F(xiàn)在已經(jīng)表明經(jīng)口攝入某些乳桿菌，如卷曲乳桿菌VPC111和VPC177引起糞便以及陰道流體中乳桿菌的總的增加。
植物乳桿菌HEAL9對(duì)糞便和陰道菌群缺乏效果可能是由于總?cè)闂U菌的高的初始濃度?？梢酝茰y(cè)攝入VPC177后的清除時(shí)間段不夠長(zhǎng)(圖1和2)。然而，值得一提的是在31名婦女的27名中，根據(jù)Johansson等人，Lett.Appl.Microbiol.1995；21155-159，通過(guò)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析可以回收植物乳桿菌HEAL 9。在攝入后通過(guò)RAPD測(cè)試的婦女中也回收了其他實(shí)驗(yàn)菌株。
總之，糞便和陰道流體中總的乳桿菌濃度的顯著增加表明乳桿菌是有活性的并且已經(jīng)確立。因?yàn)樵诿總€(gè)攝入時(shí)間段期間沒(méi)有提供其他益生菌材料，所以肯定是所服用的益生菌細(xì)菌菌株實(shí)現(xiàn)了所述效果。
從而，陰道乳桿菌菌株，即已經(jīng)最初從陰道分離的菌株可以通過(guò)經(jīng)口服用的凍干產(chǎn)品而穿過(guò)胃腸道存活并且能夠在陰道中再建群。卷曲乳桿菌VPC177尤其增加了陰道中乳桿菌的總濃度。這是非常令人驚奇的，因?yàn)橐阎捎诜浅８叩拿舾行?，分離的陰道乳桿菌菌株的穩(wěn)定性非常低。為了在陰道健康方面增加本發(fā)明的細(xì)菌菌株的有益效果，經(jīng)口和陰道施用細(xì)菌菌株將有助于陰道更保持健康。
權(quán)利要求
1.屬于乳桿菌屬的益生菌細(xì)菌菌株或者其變種，其能夠在人陰道建群，附帶條件是該細(xì)菌菌株不是保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM 15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM15316的植物乳桿菌HEAL 99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299或者保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的益生菌細(xì)菌菌株，其屬于選自植物乳桿菌、卷曲乳桿菌和加氏乳桿菌的物種或者其變種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的益生菌細(xì)菌菌株，其具有甘露糖特異性粘附素或者其他粘附機(jī)制，其允許細(xì)菌結(jié)合到陰道、胃腸道、包括尿道的膀胱的內(nèi)表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的益生菌細(xì)菌菌株，其選自保藏號(hào)DSM 16735的卷曲乳桿菌VPC5、保藏號(hào)DSM 16736的卷曲乳桿菌VPC40、保藏號(hào)DSM 16738的卷曲乳桿菌VPC70、保藏號(hào)DSM 16739的卷曲乳桿菌VPC71、保藏號(hào)DSM 16740的卷曲乳桿菌VPC77、保藏號(hào)DSM 16741的卷曲乳桿菌VPC111、保藏號(hào)DSM 16742的卷曲乳桿菌VPC130和保藏號(hào)DSM 16743的卷曲乳桿菌VPC177，或者其變種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的益生菌細(xì)菌菌株，其是保藏號(hào)DSM16737的加氏乳桿菌VPG44，或者其變種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的益生菌細(xì)菌菌株，其是活的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的益生菌細(xì)菌菌株，其是滅活或者受抑制的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的益生菌細(xì)菌菌株，其是基因修飾的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的益生菌細(xì)菌菌株，其是被殺死的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的益生菌細(xì)菌菌株，其用作藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的細(xì)菌菌株的用途，其用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防細(xì)菌性陰道病、病毒性陰道病、酵母性陰道炎、陰道中的感染、諸如HIV和衣原體感染的性傳播疾病、危及孕婦中胎兒的感染、早產(chǎn)和泌尿道感染的藥物。
12.選自保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299、保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v的細(xì)菌菌株或者其變種的用途，其用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防細(xì)菌性陰道病、病毒性陰道病、酵母性陰道炎、陰道中的感染、諸如HIV和衣原體感染的性傳播疾病、危及孕婦中胎兒的感染、早產(chǎn)和泌尿道感染的藥物，附帶條件是保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v用于泌尿道感染。
13.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的至少一種益生菌細(xì)菌菌株和/或保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299、保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v的細(xì)菌菌株，或者其變種，和/或根據(jù)權(quán)利要求32的其片段或者級(jí)分。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其包含載體材料。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的組合物，其是食品。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14的組合物，其是食物補(bǔ)充劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)的組合物，其中所述載體材料選自燕麥片粥、乳酸發(fā)酵食物、抗性淀粉、飲食纖維、安茴酰牛扁堿、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求15或17的組合物，其中所述食品選自面包、干酪、酸乳酪、汁、健康條、涂抹料、餅干和谷類(lèi)。
19.根據(jù)權(quán)利要求13-18任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種益生菌細(xì)菌菌株經(jīng)被囊化或者包衣。
20.根據(jù)權(quán)利要求13-18任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種益生菌細(xì)菌菌株以一定量存在，當(dāng)被消費(fèi)時(shí)，所述量提供107到1012CFU，優(yōu)選109到1010CFU的有效日劑量。
21.根據(jù)權(quán)利要求13或14的組合物，其是用于治療和/或預(yù)防細(xì)菌性陰道病、病毒性陰道病、酵母性陰道炎、陰道中的感染、諸如HIV和衣原體感染的性傳播疾病、危及孕婦中胎兒的感染、早產(chǎn)和泌尿道感染的藥物組合物，附帶條件是保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v用于泌尿道感染。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，其中所述組合物經(jīng)口、陰道或者直腸施用，或者滴注到膀胱中。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，其中所述組合物以經(jīng)口和陰道，經(jīng)口和直腸，或者經(jīng)口、陰道和直腸的組合治療施用。
24.根據(jù)權(quán)利要求21-23任一項(xiàng)的組合物，其中所述載體材料是至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
25.根據(jù)權(quán)利要求21-24任一項(xiàng)的組合物，其以片劑、吮吸片劑、甜味食品、口香糖、膠囊、有腸溶衣的片劑和膠囊、栓劑、微型灌腸劑、陰道用片劑、陰道用明膠膠囊、陰道用錠劑、乳膏、凝膠、軟膏、洗劑、棉塞、尿布、墊子、熔化條、避孕套、陰道栓劑、噴霧劑和臨床營(yíng)養(yǎng)品的形式施用。
26.根據(jù)權(quán)利要求21-25任一項(xiàng)的組合物，其經(jīng)口施用，其中所述至少一種益生菌細(xì)菌菌株以提供107到1012CFU，優(yōu)選109到1010CFU的有效日劑量的量存在。
27.根據(jù)權(quán)利要求21-25任一項(xiàng)的組合物，其經(jīng)陰道或者直腸施用，其中所述至少一種益生菌細(xì)菌菌株以提供103到1012CFU，優(yōu)選105到109CFU的有效日劑量的量存在。
28.根據(jù)權(quán)利要求21-27任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種益生菌細(xì)菌菌株經(jīng)被囊化或者包衣。
29.根據(jù)權(quán)利要求13-27的組合物，其包含選自維生素、礦物質(zhì)和益生素的添加劑。
30.衛(wèi)生產(chǎn)品，其包含根據(jù)權(quán)利要求13-14或者21-29任一項(xiàng)的組合物。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的衛(wèi)生產(chǎn)品，其選自棉塞、衛(wèi)生巾、月經(jīng)墊、尿布、肥皂、洗發(fā)劑、凝膠、軟膏、乳膏、噴霧劑和洗劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的至少一種益生菌細(xì)菌菌株和/或保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM 15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL 99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299、保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v的細(xì)菌菌株，或者其變種，和/或根據(jù)權(quán)利要求35的其片段或者級(jí)分的生物培養(yǎng)物。
33.新食物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的至少一種益生菌細(xì)菌菌株和/或保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299、保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v的細(xì)菌菌株，或者其變種，和/或根據(jù)權(quán)利要求35的其片段或者級(jí)分。
34.食物補(bǔ)充劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的至少一種益生菌細(xì)菌菌株和/或保藏號(hào)DSM 15312的植物乳桿菌HEAL 9、保藏號(hào)DSM 15313的植物乳桿菌HEAL 19、保藏號(hào)DSM 15316的植物乳桿菌HEAL 99、保藏號(hào)DSM 6595的植物乳桿菌299、保藏號(hào)DSM 9843的植物乳桿菌299v的細(xì)菌菌株，或者其變種，和/或根據(jù)權(quán)利要求35的其片段或者級(jí)分。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的益生菌細(xì)菌菌株的片段或者級(jí)分。
全文摘要
本發(fā)明涉及屬于乳桿菌屬的益生菌細(xì)菌菌株，或者其變種，所述菌株能夠在人陰道中建群。更具體地，益生菌細(xì)菌菌株屬于選自植物乳桿菌、卷曲乳桿菌和加氏乳桿菌的物種。還涉及其作為藥物，包含所述菌株的組合物，該組合物例如是食品或者藥物組合物，衛(wèi)生產(chǎn)品，所述菌株的生物純的培養(yǎng)物和新的食物的用途。
文檔編號(hào)A23C9/123GK101048168SQ200580034031
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2005年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月5日
發(fā)明者G·莫林, S·阿爾尼, B·杰普森, A·瓦斯奎茨, A·伯格倫 申請(qǐng)人:普羅比公司