專利名稱：細(xì)胞組織微芯片及細(xì)胞組織的形成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保持細(xì)胞的微芯片，特別是涉及細(xì)胞組織的形成。
背景技術(shù)：
目前，利用了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的醫(yī)療技術(shù)開發(fā)及藥品開發(fā)等正在盛行。即，例如，培養(yǎng)在生物組織和器官中表達(dá)特有功能的細(xì)胞的技術(shù)是利用該細(xì)胞作為該組織和器官的生物體外模型，并逐漸應(yīng)用于藥物的毒性試驗(yàn)、內(nèi)分泌紊亂作用的評(píng)價(jià)、新藥的篩選等中。
在這種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，通常在涂布有膠原等細(xì)胞粘著性物質(zhì)的平面基材上使細(xì)胞粘著為單層狀(即二維)后進(jìn)行培養(yǎng)。此時(shí)，例如對(duì)于從生物肝臟中取出的原代肝細(xì)胞等而言，如果以這種單層狀態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)，則在極短時(shí)間內(nèi)會(huì)使肝臟特有的功能消失或者死亡。
與此相對(duì)，近年來，通過將該原代肝細(xì)胞作為細(xì)胞之間相互三維地結(jié)合而成的集合體即細(xì)胞組織進(jìn)行培養(yǎng)來代替將其培養(yǎng)為單層狀，可以更長(zhǎng)時(shí)間地維持其生存狀態(tài)和肝臟特有的功能。
作為形成這種肝細(xì)胞組織的方法，以前例如在專利文獻(xiàn)1中公開了通過在培養(yǎng)液中加入特定的增殖因子而在聚氨酯泡沫的孔內(nèi)形成球狀的肝細(xì)胞組織。
另外，在專利文獻(xiàn)2中公開了在涂布有由具有苯基硼酸的單體、具有氨基的單體和甲基丙烯酸2-羥乙酯共聚物構(gòu)成的高分子物質(zhì)的平面上形成肝細(xì)胞組織的方法。
專利文獻(xiàn)1日本特開平10-29951號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本專利第3020930號(hào)公報(bào)但是，在上述以往的方法中，所形成的細(xì)胞組織的形狀和大小不均勻。因此，當(dāng)在評(píng)價(jià)例如利用細(xì)胞的特定藥物的代謝功能時(shí)，由于每個(gè)細(xì)胞組織中與該藥物相接觸的細(xì)胞(特別是細(xì)胞組織表面附近的細(xì)胞)的數(shù)量不同等，因此難以得到正確的評(píng)價(jià)結(jié)果。
另外，在上述以往的方法中，使用細(xì)胞粘著比較弱(即細(xì)胞粘著性比較低)的培養(yǎng)基材表面，所形成的細(xì)胞組織成為從該培養(yǎng)基材表面上脫離而懸浮在培養(yǎng)液中的狀態(tài)。因此，例如在培養(yǎng)的過程中，在進(jìn)行除去營(yíng)養(yǎng)成分被消耗的培養(yǎng)液并重新加入新鮮培養(yǎng)液的操作等時(shí)，細(xì)胞和細(xì)胞組織與培養(yǎng)液一起被除去，不能繼續(xù)進(jìn)行之后的培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明鑒于上述問題而完成，其目的之一在于提供在形成均勻形狀和大小的細(xì)胞組織的同時(shí)、可以長(zhǎng)時(shí)間地培養(yǎng)所形成的細(xì)胞組織的微芯片以及使用了該微芯片的細(xì)胞組織的形成方法。
為了解決上述以往的課題，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的細(xì)胞組織微芯片的特征在于，具有多個(gè)用于保持細(xì)胞的細(xì)胞保持內(nèi)腔，上述細(xì)胞保持內(nèi)腔的底面包括顯示細(xì)胞粘著性的1個(gè)粘著性區(qū)域和包圍該粘著性區(qū)域并顯示細(xì)胞非粘著性的非粘著性區(qū)域。
另外，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的細(xì)胞組織形成方法的特征在于，在上述細(xì)胞組織微芯片的上述細(xì)胞保持內(nèi)腔內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，從而在上述粘著性區(qū)域上形成細(xì)胞組織。
根據(jù)本發(fā)明，可以提供在形成均勻形狀和大小的細(xì)胞組織的同時(shí)、可以長(zhǎng)時(shí)間地培養(yǎng)所形成的細(xì)胞組織的微芯片以及使用了該微芯片的細(xì)胞組織的形成方法。


圖1為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的細(xì)胞組織微芯片的說明圖。
圖2為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的細(xì)胞保持內(nèi)腔的電子顯微鏡照片。
圖3為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的細(xì)胞保持內(nèi)腔的底面的說明圖。
圖4為在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的細(xì)胞組織微芯片中形成的肝細(xì)胞組織的相位差顯微鏡照片。
圖5為表示在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的細(xì)胞組織微芯片中形成的肝細(xì)胞組織的粒徑分布的直方圖。
圖6為表示對(duì)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的細(xì)胞組織微芯片中形成的肝細(xì)胞組織的肝功能進(jìn)行評(píng)價(jià)的結(jié)果的圖表。
具體實(shí)施例方式
以下，一邊參照附圖一邊說明本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的細(xì)胞組織微芯片。另外，本發(fā)明的細(xì)胞組織微芯片并不限定于以下的實(shí)施方式。
圖1為本實(shí)施方式的細(xì)胞組織微芯片(以下稱為本微芯片1)的說明圖。如圖1所示，本微芯片1在基板10上具有多個(gè)用于保持細(xì)胞且形成為具有規(guī)定深度的有底孔的細(xì)胞保持內(nèi)腔12。
在本微芯片1中，在該細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)加入分散有細(xì)胞的培養(yǎng)液，通過將該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20(參照?qǐng)D2和圖3)用作該細(xì)胞的培養(yǎng)基材表面，從而由該細(xì)胞形成細(xì)胞組織。
這里，作為形成該細(xì)胞組織的細(xì)胞，只要是在細(xì)胞之間相互形成結(jié)合，則可以不論來源的動(dòng)物種類或器官、組織的種類等進(jìn)行使用。具體地說，作為該細(xì)胞，例如可以使用從來自于人或豬、狗、大鼠、小鼠等動(dòng)物的肝臟、胰臟、腎臟、神經(jīng)、皮膚等中采集的原代細(xì)胞、ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)、建立的細(xì)胞株或者對(duì)它們實(shí)施了基因操作等而得到的細(xì)胞等。另外，作為該細(xì)胞，可以單獨(dú)使用一種細(xì)胞，還可以以任意比例混合使用兩種以上的細(xì)胞。
另外，作為培養(yǎng)液，只要是以適當(dāng)?shù)臐舛群斜匦璧柠}類或營(yíng)養(yǎng)成分等的水溶液，即可使用任意組成的培養(yǎng)液，以使得能夠維持所用細(xì)胞的生存狀態(tài)或功能等。具體地說，例如可以使用在DMEM(Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基)等基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有抗生素等的培養(yǎng)液、所謂的生理鹽水等作為該培養(yǎng)液。
另外，本微芯片1的基板10例如由聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚縮醛、聚酯(聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯等)、聚氨酯、聚砜、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、硅等合成樹脂，EPDM(三元乙丙橡膠)等合成橡膠，天然橡膠，玻璃，陶瓷，不銹鋼等金屬材料等構(gòu)成。另外，該基板10例如成形為板狀體。
細(xì)胞保持內(nèi)腔12可以使用根據(jù)基板10的材質(zhì)等選擇的任意加工方法形成在該基板10上。具體地說，例如該細(xì)胞保持內(nèi)腔12可以通過使用了加工中心等的穿孔加工、使用了激光等的光微細(xì)加工、蝕刻加工、壓花加工等形成在該基板10上，或者可以在通過注射模塑成形、加壓成形、立體光刻法等成形該基板10時(shí)形成。
通過這種加工方法，細(xì)胞保持內(nèi)腔12例如可以在規(guī)定厚度的基板10表面上形成為具有小于該基板厚度的深度的有底孔。另外，該細(xì)胞保持內(nèi)腔12例如可以在形成了貫通基板10的孔之后，將其它部件粘貼在該基板10的單面上作為底面而形成。另外，作為用于形成該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面的部件，例如可以使用與形成有該貫通孔的基板10相同或不同材質(zhì)的基板或薄膜等。
該細(xì)胞保持內(nèi)腔12如圖1所示，以規(guī)定的間隔規(guī)則地配置在基板10上。該規(guī)則配置的多個(gè)細(xì)胞保持內(nèi)腔12例如可以通過使用加工中心等形成，該加工中心通過CAD(計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì))程序來精密地控制加工位置。
圖2為一部分本微芯片1的掃描型電子顯微鏡照片。如圖2所示，形成在基板10上的細(xì)胞保持內(nèi)腔12具有形成其孔結(jié)構(gòu)的底面20和側(cè)面22。另外，如圖2所示，該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20和側(cè)面22具有基本上平滑的表面而形成。
該底面20的形狀沒有特別限定，例如，如圖2所示，可以是圓形，除此之外，還可以是橢圓形、多邊形等。該底面20的直徑優(yōu)選為所用細(xì)胞直徑的2～50倍左右的范圍，特別優(yōu)選為4倍～30倍左右的范圍。即，該底面20的面積由于細(xì)胞的大小隨著其種類和狀態(tài)等的不同而不同，因此不能一概而論，例如優(yōu)選為100～1×106μm2的范圍，特別優(yōu)選為300～3×105μm2的范圍。
其原因?yàn)?，接種在該底面20上的細(xì)胞(即，接種在細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)的細(xì)胞)在該底面20上形成細(xì)胞組織，因此該底面20的尺寸規(guī)定形成于該底面20上的細(xì)胞組織中所含細(xì)胞的數(shù)量。即，當(dāng)該底面20的尺寸小于上述下限值時(shí)，則不能保持用于在該底面20上形成細(xì)胞組織所必需數(shù)量的細(xì)胞。當(dāng)該底面20大于上述上限值時(shí)，由于能夠保持在該底面20上的細(xì)胞的數(shù)目過多，因此形成了巨大的細(xì)胞組織。此時(shí)，位于細(xì)胞組織內(nèi)部的細(xì)胞不能從該細(xì)胞組織外的培養(yǎng)液中充分地接受營(yíng)養(yǎng)和氧，往往會(huì)死亡。
該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的深度優(yōu)選為所用細(xì)胞直徑的1～50倍左右的范圍，特別優(yōu)選為2倍～30倍左右的范圍。其原因?yàn)椋?dāng)該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的深度小于上述下限值時(shí)，難以在該細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)可靠地保持細(xì)胞。當(dāng)該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的深度大于上述上限值時(shí)，對(duì)該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20上的細(xì)胞的氧和營(yíng)養(yǎng)成分的供給往往變得不充分。
圖3為本微芯片1所具有的多個(gè)細(xì)胞保持內(nèi)腔12中的一個(gè)內(nèi)腔的說明圖。如圖3所示，該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20包括顯示細(xì)胞粘著性的1個(gè)粘著性區(qū)域30和包圍該粘著性區(qū)域30并顯示細(xì)胞非粘著性的非粘著性區(qū)域32。
該粘著性區(qū)域30例如在培養(yǎng)液等溶液中具有在細(xì)胞粘著的基礎(chǔ)上帶有適宜的荷電狀態(tài)或親水性、疏水性的細(xì)胞粘著性的表面。這里，所謂的細(xì)胞粘著性表面是指例如在培養(yǎng)液中，細(xì)胞沉降在該表面上時(shí)，細(xì)胞能夠以從球形變形為比較扁平形狀的程度進(jìn)行粘著的表面。
具體地說，該粘著性區(qū)域30的表面例如可以作為基板10的材料表面本身而形成，所述基板10的材料表面在形成細(xì)胞保持內(nèi)腔12時(shí)作為該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20而露出。另外，該粘著性區(qū)域30的表面例如可以形成為在該露出的基板10的表面上固定有從生物體獲得的或者合成的細(xì)胞粘著性物質(zhì)或它們的衍生物的表面。
作為固定在該粘著性區(qū)域30上的細(xì)胞粘著性物質(zhì)，例如可以使用能夠?qū)Υ嬖谟谒眉?xì)胞的細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)等細(xì)胞表面分子(例如整聯(lián)素或糖鏈?zhǔn)荏w等)中的特定分子進(jìn)行結(jié)合的物質(zhì)。
具體地說，例如作為從生物體中獲得的細(xì)胞粘著性物質(zhì)，可以使用膠原、纖維連接蛋白、昆布氨酸等。作為它們的衍生物，例如可以使用在該細(xì)胞粘著性物質(zhì)上鍵合有任意官能團(tuán)或高分子鏈等(例如使用縮合反應(yīng)等使其共價(jià)鍵合)的物質(zhì)。
另外，作為合成的細(xì)胞粘著性物質(zhì)，可以使用顯示細(xì)胞粘著性的具有特定氨基酸序列(例如精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸(所謂的RGD)序列等)、特定的糖鏈序列(例如半乳糖側(cè)鏈等)的化合物等。另外，作為它們的衍生物，可以使用在該細(xì)胞粘著性物質(zhì)上鍵合有任意官能團(tuán)和高分子等的物質(zhì)。
這些從生物體中獲得的或者合成的細(xì)胞粘著性物質(zhì)或者它們的衍生物例如可以通過在底面20上干燥該細(xì)胞粘著性物質(zhì)等的水溶液，從而固定在該底面20上。另外，該細(xì)胞粘著性物質(zhì)等例如可以通過在該細(xì)胞粘著性物質(zhì)等的水溶液中在該細(xì)胞粘著性物質(zhì)所具有的官能團(tuán)和底面20上的官能團(tuán)之間引起化學(xué)反應(yīng)(例如羧基和氨基等之間的縮合反應(yīng)等)而形成共價(jià)鍵等，從而固定在該底面20上。
另一方面，非粘著性區(qū)域32例如在培養(yǎng)液中具有細(xì)胞基本上不能粘著的、對(duì)于細(xì)胞粘著不適合的荷電狀態(tài)或親水性、疏水性的細(xì)胞非粘著性的表面。這里，所謂顯示該細(xì)胞非粘著性的表面是指例如在培養(yǎng)液中細(xì)胞沉降在該表面上時(shí)維持下述狀態(tài)的表面，所述狀態(tài)為以其細(xì)胞形狀基本不會(huì)從球狀發(fā)生改變的程度極弱地粘著，且該粘著由于培養(yǎng)液的流動(dòng)等容易脫離或者該細(xì)胞完全不能粘著，以球形的狀態(tài)懸浮在培養(yǎng)液中。
具體地說，該非粘著性區(qū)域32的表面例如可以作為基板10的材料表面本身而形成，所述基板10的材料表面在形成細(xì)胞保持內(nèi)腔12時(shí)作為該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20而露出。該非粘著性區(qū)域32的表面例如可以形成為在該露出的基板10的表面上固定有從生物體獲得的或者合成的細(xì)胞非粘著性物質(zhì)或它們的衍生物的表面。
作為固定在該非粘著性區(qū)域32上的細(xì)胞非粘著性物質(zhì)，例如可以使用對(duì)于存在于所用細(xì)胞的細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)或糖鏈等細(xì)胞表面分子不進(jìn)行結(jié)合的生物體來源或合成的細(xì)胞非粘著性物質(zhì)。
具體地說，例如作為生物體來源的細(xì)胞非粘著性物質(zhì)，可以使用白蛋白等顯示高親水性的蛋白質(zhì)等。作為它們的衍生物，例如可以使用在該細(xì)胞非粘著性物質(zhì)上鍵合有任意官能團(tuán)或高分子鏈等的物質(zhì)。
另外，例如作為合成的細(xì)胞非粘著性物質(zhì)，可以使用聚乙二醇等顯示極高親水性的高分子、MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿)、poly-HEMA(聚甲基丙烯酸羥乙酯)、SPC(嵌段化聚氨酯)等。作為它們的衍生物，可以使用在該細(xì)胞非粘著性物質(zhì)上鍵合有任意官能團(tuán)和高分子等的物質(zhì)。
這些由生物體獲得的或者合成的細(xì)胞非粘著性物質(zhì)或者它們的衍生物例如可以通過在底面20上干燥該細(xì)胞非粘著性物質(zhì)等的水溶液而固定在該底面20上。另外，該細(xì)胞非粘著性物質(zhì)等例如可以通過在該細(xì)胞非粘著性物質(zhì)等的水溶液中在該細(xì)胞非粘著性物質(zhì)等所具有的官能團(tuán)和底面20上的官能團(tuán)之間引起化學(xué)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵等，從而固定在該底面20上。
另外，粘著性區(qū)域30可以形成在細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20的中央附近。此時(shí)，例如如圖1所示，如果在本微芯片1上規(guī)則地配置細(xì)胞保持內(nèi)腔12，則可以將形成在該細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20中的粘著性區(qū)域30上的細(xì)胞組織也規(guī)則地配置在本微芯片1上，同時(shí)可以使所形成的細(xì)胞組織的形狀均勻。
因此，例如當(dāng)對(duì)各細(xì)胞組織實(shí)施使用了熒光色素等的染色處理等，并根據(jù)其染色程度等評(píng)價(jià)該各細(xì)胞組織的功能時(shí)，由于可以通過設(shè)定在本微芯片1上的坐標(biāo)值等正確地確定均勻形狀的細(xì)胞組織的各位置，因此可以使用自動(dòng)解析裝置等簡(jiǎn)單、迅速且可靠地解析該染色的程度。
另外，如圖3所示，包括這些粘著性區(qū)域30和非粘著性區(qū)域32的底面20可以按照其整體成為平面的方式而形成，也可以是按照在至少一個(gè)區(qū)域的一部分或者在粘著性區(qū)域30與非粘著性區(qū)域32之間具有高度差等的方式而形成。
接著，概略地說明使用本微芯片1形成細(xì)胞組織的方法。首先，按照達(dá)到規(guī)定密度的方式將所用細(xì)胞分散在培養(yǎng)液中。然后，通過將各個(gè)規(guī)定量的該細(xì)胞分散液加入在各細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的接種。這樣，使該細(xì)胞沉降在細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20上。
這里，接種在1個(gè)細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)的細(xì)胞的數(shù)量?jī)?yōu)選如下決定在沉降在底面20上的細(xì)胞之間相互形成結(jié)合的基礎(chǔ)上可以必要程度地接觸，且該細(xì)胞集合形成的細(xì)胞組織的大小控制在規(guī)定范圍內(nèi)。
具體地說，例如該接種細(xì)胞數(shù)優(yōu)選平均每個(gè)細(xì)胞保持內(nèi)腔12為2～1.5×105個(gè)的范圍，特別優(yōu)選為50～3.0×104個(gè)的范圍。另外，細(xì)胞保持內(nèi)腔底面20的每單位面積的接種細(xì)胞數(shù)優(yōu)選為30～1.5×104個(gè)/mm2的范圍。
其原因在于，為了形成細(xì)胞組織，每個(gè)細(xì)胞保持內(nèi)腔12至少要保持2個(gè)細(xì)胞。如果接種細(xì)胞的數(shù)量過多，則由該細(xì)胞形成的細(xì)胞組織變得巨大，其內(nèi)部細(xì)胞由于營(yíng)養(yǎng)或氧的不足而發(fā)生壞死。
接著，在將如此接種有細(xì)胞的本微芯片1保持在水平的同時(shí)，通過在靜置狀態(tài)下維持規(guī)定時(shí)間，進(jìn)行該細(xì)胞的培養(yǎng)。在該靜置培養(yǎng)期間，在沉降于各細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20上的細(xì)胞中，使沉降在粘者性區(qū)域30上的細(xì)胞粘著在該粘著性區(qū)域30的表面上。另外，沉降在非粘著性區(qū)域32上的細(xì)胞不會(huì)粘著在該非粘著性區(qū)域32的表面上，而是維持懸浮狀態(tài)或者極弱地粘著。
之后，繼續(xù)該靜置培養(yǎng)，或者一邊在水平面上以畫圓弧的方式振搖本微芯片1一邊繼續(xù)培養(yǎng)。由此，隨著培養(yǎng)時(shí)間的經(jīng)過，沉降在各細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20上的細(xì)胞相互結(jié)合。結(jié)果，細(xì)胞在該底面20中按照集中于粘著性區(qū)域30的方式而緩慢地移動(dòng)，在該粘著性區(qū)域30上形成該細(xì)胞之間三維地結(jié)合而成的細(xì)胞組織。該細(xì)胞組織不會(huì)在培養(yǎng)液中懸浮，可以在粘著于粘著性區(qū)域30上的狀態(tài)下穩(wěn)定地保持在細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)，并長(zhǎng)時(shí)間地培養(yǎng)。
另外，在本微芯片1中，通過進(jìn)一步在各細(xì)胞保持內(nèi)腔12的側(cè)面22的一部分上形成用于使培養(yǎng)液流入到該細(xì)胞保持內(nèi)腔12中的流入口、和用于使該培養(yǎng)液從該細(xì)胞保持內(nèi)腔12中流出的流出口，從而可以在粘著性區(qū)域30上形成細(xì)胞組織后，一邊使培養(yǎng)液在該細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)流通，一邊進(jìn)行培養(yǎng)。
實(shí)施例下面，對(duì)使用本微芯片1形成細(xì)胞組織的實(shí)施例進(jìn)行說明。
在本實(shí)施例中，作為本微芯片1的基板10，使用聚甲基丙烯酸甲酯制的平板(24mm×24mm、厚度為200μm)。即，在該聚甲基丙烯酸甲酯平板表面的一部分的10mm見方的矩形范圍內(nèi)，通過實(shí)施使用了加工中心(臺(tái)式NC微細(xì)加工機(jī)、株式會(huì)社ピ一エムテイ一生產(chǎn))的穿孔加工處理，從而形成約1000個(gè)直徑為300μm的圓形貫通孔。該圓形貫通孔相互之間按照其中心間距離達(dá)到400μm的方式而規(guī)則地配置。
另外，作為本微芯片1的細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20，使用玻璃制的平板(22mm×22mm、厚度為400μm)。即，在該玻璃平板表面的一部分的12mm見方的矩形范圍內(nèi)，通過實(shí)施使用了濺射裝置(E-1030、日立株式會(huì)社生產(chǎn))的濺射處理，形成鉑(Pt)的薄膜(厚度為9nm)。然后，使該玻璃平板的鉑表面部分與上述聚甲基丙烯酸甲酯平板上形成有貫通孔的部分相吻合，使用硅類粘合劑(TSE389、GE東芝硅株式會(huì)社生產(chǎn))，粘著該玻璃平板和該聚甲基丙烯酸酯平板。如此形成圖2所示的具有直徑為300μm的圓形底面20且深度為200μm的細(xì)胞保持內(nèi)腔12。
另一方面，通過模塑成形制作具有多個(gè)直徑為100μm、長(zhǎng)度為200μm的圓筒狀突起的PDMS(聚二甲基硅氧烷)制的印模。按照該印模的各圓筒狀突起的位置對(duì)應(yīng)于本微芯片1上各細(xì)胞保持內(nèi)腔12的位置的方式，將該突起前端的圓形剖面的中心間距離設(shè)定為400um。之后，通過使用了該印模的微接觸印刷，在細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20上如下形成粘著性區(qū)域30。
即，作為固定在粘著性區(qū)域30的表面上的細(xì)胞粘著性物質(zhì)，準(zhǔn)備細(xì)胞粘著性的具有RGD序列的肽(氨基酸序列RGDSAAAAAC、Thermo Electron Corporation生產(chǎn))。然后，通過將上述制作的印模的各圓筒狀突起的前端浸漬在以1.78mg/mL的濃度含有該細(xì)胞粘著性肽的DMSO(二甲基亞砜)溶液中，從而在該各圓筒狀突起的前端面上涂布該肽溶液。
接著，一邊在相位差顯微鏡下進(jìn)行觀察，一邊使涂布有肽溶液的印模的各圓筒狀突起的位置與蒸鍍有上述鉑的本微芯片1的各細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面中央附近的位置相吻合。然后，將該各圓筒狀突起的前端按壓在該底面20上，從而將涂布在該各圓筒狀突起前端的肽溶涂布在該各細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20的中央附近，并在氮氛圍下使其干燥。由此，在細(xì)胞粘著性肽分子末端具有半胱氨酸的硫代基和底面20的鉑表面之間形成化學(xué)鍵，從而將該細(xì)胞粘著性肽固定在該鉑表面上。
這樣，在直徑為300μm的細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20的中央附近形成1個(gè)固定有細(xì)胞粘著性肽的直徑約為100μm的粘著性區(qū)域30。
接著，在包括該粘著性區(qū)域30的底面20上如下形成非粘著性區(qū)域32。即，作為固定在非粘著性區(qū)域32的表面上的細(xì)胞非粘著性物質(zhì)，準(zhǔn)備具有分子量為5000的聚乙二醇(PEG)鏈的細(xì)胞非粘著性的合成高分子(化學(xué)式CH3(CH2CH2)nSH、Nektar Therapeutics公司生產(chǎn))。
然后，在形成有上述粘著性區(qū)域30的各細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)加入過量的以25mg/Ml的濃度含有該細(xì)胞非粘著性高分子的乙醇溶液。然后，在氮氛圍下在該細(xì)胞非粘著性高分子所具有的硫代基和底面20的鉑表面之間形成化學(xué)鍵，從而在該鉑表面(即，底面20中除去粘著性區(qū)域30的區(qū)域)上固定該細(xì)胞非粘著性高分子。之后，通過乙醇溶液充分地洗滌整個(gè)本微芯片1，將多余的細(xì)胞非粘著性高分子除去，同時(shí)在乙醇中浸漬約2小時(shí)以進(jìn)行滅菌處理。
如此操作，在各細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20的中央附近形成粘著性區(qū)域30，并在該粘著性區(qū)域30之外的區(qū)域上形成非粘著性區(qū)域32，由此制作本微芯片1，并用于以下的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
在本實(shí)施例中，作為細(xì)胞，使用通過公知的膠原酶灌流法從大鼠的肝臟中制備的原代肝細(xì)胞。這里，簡(jiǎn)單地說明該肝細(xì)胞的制備方法。即，首先在7周齡的Wistar系大鼠(體重為250g)的門靜脈(與肝臟相連的血管之一)中插入插管，由該插管向肝臟中導(dǎo)入規(guī)定組成的脫血溶液后，將以0.5mg/mL的濃度溶解有膠原酶(和光純藥公司生產(chǎn))的消化液灌流，進(jìn)行切斷肝臟內(nèi)的肝細(xì)胞之間的結(jié)合等的消化處理。之后，取出經(jīng)過該消化處理的肝臟，通過使用了手術(shù)刀和吸管等的分散處理以及使用了培養(yǎng)液等的洗滌處理，得到各個(gè)細(xì)胞分散的單個(gè)狀態(tài)的肝細(xì)胞。
另外，作為培養(yǎng)液，使用在13.5g/L的Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM、ギブユ公司生產(chǎn))中加入有60mg/L的脯氨酸(シグマ公司生產(chǎn))、50mg/mL的上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF、フナユシ公司生產(chǎn))、7.5mg/L的皮質(zhì)醇(和光純藥公司生產(chǎn))、0.1μM的硫酸銅五水合物(和光純藥公司生產(chǎn))、3μg/L的硒酸(和光純藥公司生產(chǎn))、50pM的硫酸鋅七水合物(和光純藥公司生產(chǎn))、50μg/L的亞油酸(シグマ公司生產(chǎn))、58.8mg/L的青霉素(明治制果公司生產(chǎn))、100mg/L的鏈霉素(明治制果公司生產(chǎn))、1.05g/L的碳酸氫鈉(和光純藥公司生產(chǎn))、1.19g/L的2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES、同人堂公司生產(chǎn))的無(wú)血清培養(yǎng)液。
將如此得到的肝細(xì)胞分散在培養(yǎng)液中，使得密度達(dá)到5.0×105個(gè)/mL。另外，在聚苯乙烯制的培養(yǎng)容器(直徑為35mm、フアルユン公司生產(chǎn))的底部上放置上述滅菌處理后的本微芯片1。然后，在該本微芯片1上加入2.0mL該細(xì)胞分散液的一部分，在5％二氧化碳、95％空氣的氛圍中，在37℃下靜置培養(yǎng)。
另外，作為第一對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在直徑為35mm的聚苯乙烯制的培養(yǎng)容器的底部上放置與用于形成本微芯片1的細(xì)胞保持內(nèi)腔底部20相同的玻璃制平板(22mm×22mm、厚度為400μm)。然后，在該玻璃平板上加入2.0mL該細(xì)胞分散液的另外一部分，同樣地靜置培養(yǎng)。
作為第二對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在直徑為35mm的聚苯乙烯制的培養(yǎng)容器的底部上放置在與用于形成本微芯片1的細(xì)胞保持內(nèi)腔底部20相同的玻璃制平板(22mm×22mm、厚度為400μm)上涂布有膠原(Cellmatrix TypeI-C、新田ゼラチン公司生產(chǎn))的平板。然后，在該涂布有膠原的玻璃平板上加入2.0mL該細(xì)胞分散液的另外一部分，同樣地靜置培養(yǎng)。用于本微芯片1和對(duì)照實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)液在開始培養(yǎng)后，每2天更換為新鮮的培養(yǎng)液。
圖4表示形成在細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)的肝細(xì)胞組織(圖4中的T)在培養(yǎng)第3天時(shí)的相位差顯微鏡照片。如圖3所示，在各細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)形成1個(gè)肝細(xì)胞組織。各肝細(xì)胞組織的形狀均為表面平滑的球狀。另外，這種球狀的肝細(xì)胞組織在本微芯片1的各細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)在開始培養(yǎng)后的1～2天內(nèi)形成。
另外，如圖3所示，在各細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)，各肝細(xì)胞組織形成在底面20的中央附近。即，各肝細(xì)胞組織粘著在各細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20中的粘著性區(qū)域30上，不會(huì)懸浮在培養(yǎng)液中，從而穩(wěn)定地保持。另外，在非粘著性區(qū)域32上基本不存在肝細(xì)胞。
與此相對(duì)，對(duì)于第一對(duì)照實(shí)驗(yàn)而言，在整個(gè)玻璃平板上，由接種的細(xì)胞的一部分的形狀發(fā)生變形，從而各種大小的肝細(xì)胞組織以懸浮在培養(yǎng)液中的狀態(tài)而形成(未圖示)。另外，對(duì)于第二對(duì)照實(shí)驗(yàn)而言，肝細(xì)胞在涂布有膠原的玻璃平板上以伸展為扁平的單層狀態(tài)進(jìn)行粘著(未圖示)。
圖5為表示形成在本微芯片1的細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)的肝細(xì)胞組織、和在第一對(duì)照實(shí)驗(yàn)中形成的肝細(xì)胞組織的粒徑分布的直方圖。在圖5中，橫軸表示肝細(xì)胞組織的直徑(μm)?？v軸表示具有各橫軸所示直徑的肝細(xì)胞組織的個(gè)數(shù)相對(duì)于分別在本微芯片1內(nèi)或?qū)φ諏?shí)驗(yàn)中成為粒徑測(cè)定對(duì)象的肝細(xì)胞組織的總數(shù)的比例(％)。在圖5中，圓圈表示使用本微芯片1形成的肝細(xì)胞組織的結(jié)果，方塊表示在第一對(duì)照實(shí)驗(yàn)中形成的肝細(xì)胞組織的結(jié)果。
如圖5所示，在本微芯片1中形成的肝細(xì)胞組織中，86％的肝細(xì)胞組織的直徑為160～180μm的范圍。即，在本微芯片1的各細(xì)胞保持內(nèi)腔12內(nèi)形成了粒徑集中、大小極為均勻的肝細(xì)胞組織。
與此相對(duì)，在第一對(duì)照實(shí)驗(yàn)中形成的肝細(xì)胞組織包括各種粒徑的組織，作為整體，大小并不均勻。另外，該肝細(xì)胞組織的粒徑測(cè)定是通過對(duì)顯微鏡下的觀察結(jié)果進(jìn)行圖像解析進(jìn)行的。
另外，對(duì)于在本微芯片1中形成的肝細(xì)胞組織和第二對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的單層狀的肝細(xì)胞，評(píng)價(jià)作為肝臟中特有解毒功能之一的氨(生物體內(nèi)的廢棄物質(zhì)之一)除去能力。對(duì)于該氨除去能力的評(píng)價(jià)而言，首先，在開始培養(yǎng)后的第3、7、10、14天，將含有肝細(xì)胞組織或單層肝細(xì)胞的培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)液更換成添加有規(guī)定濃度的氨的培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在經(jīng)過規(guī)定時(shí)間后回收該氨添加培養(yǎng)液，使用市售的測(cè)定試劑盒(和光純藥公司生產(chǎn))測(cè)定該回收的培養(yǎng)液中的氨濃度在添加后的規(guī)定時(shí)間內(nèi)的減少量。
圖6表示氨除去能力的評(píng)價(jià)結(jié)果。在圖6中，橫軸表示培養(yǎng)時(shí)間(培養(yǎng)天數(shù))，縱軸表示每單位細(xì)胞數(shù)(106)、每單位時(shí)間(小時(shí))的氨除去量(μmol)。在圖6中，圓圈表示使用本微芯片1形成的肝細(xì)胞組織的結(jié)果，方塊表示第二對(duì)照實(shí)驗(yàn)的單層狀肝細(xì)胞的結(jié)果。
如圖6所示，在本微芯片1中形成的肝細(xì)胞組織在開始培養(yǎng)后2周持續(xù)表現(xiàn)氨除去能力。與此相對(duì)，第二對(duì)照試驗(yàn)的單層狀肝細(xì)胞的氨除去能力，如圖6所示，在培養(yǎng)1周后不停地降低，在培養(yǎng)2周時(shí)完全消失。另外，在第一對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，形成的肝細(xì)胞組織為懸浮狀態(tài)，在更換培養(yǎng)液等時(shí)肝細(xì)胞組織的多數(shù)會(huì)被除去，因此難以進(jìn)行氨除去能力的評(píng)價(jià)。
這樣，通過使用本微芯片1，可以在穩(wěn)定地固定于各細(xì)胞保持內(nèi)腔12的底面20的中央附近的狀態(tài)下，長(zhǎng)時(shí)間地培養(yǎng)以高水平持續(xù)地表現(xiàn)肝臟特有功能的肝細(xì)胞組織。
序列表<110>財(cái)團(tuán)法人北九州產(chǎn)業(yè)學(xué)術(shù)推進(jìn)機(jī)構(gòu)<120>細(xì)胞組織微芯片<130>KU-0007<150>JP 2004-315600<151>2004-10-29<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Sequence of cell adhesion peptide<400>1Arg Gly Asp Ser Ala Ala Ala Ala Ala Cys1 5 10
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞組織微芯片，其特征在于，具有多個(gè)用于保持細(xì)胞的細(xì)胞保持內(nèi)腔，所述細(xì)胞保持內(nèi)腔的底面包括顯示細(xì)胞粘著性的1個(gè)粘著性區(qū)域和包圍該粘著性區(qū)域并顯示細(xì)胞非粘著性的非粘著性區(qū)域。
2.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞組織微芯片，其特征在于，所述粘著性區(qū)域形成在所述細(xì)胞保持內(nèi)腔底面的中央附近。
3.權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞組織微芯片，其特征在于，所述細(xì)胞保持內(nèi)腔底面的直徑為所述細(xì)胞直徑的2～50倍的范圍。
4.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞組織微芯片，其特征在于，在所述粘著性區(qū)域上固定有從生物體中獲得的或者合成的細(xì)胞粘著性物質(zhì)或它們的衍生物。
5.權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的細(xì)胞組織微芯片，其特征在于，在所述非粘著性區(qū)域上固定有從生物體中獲得的或者合成的細(xì)胞非粘著性物質(zhì)或它們的衍生物。
6.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的細(xì)胞組織微芯片，其特征在于，在所述粘著性區(qū)域上粘著有由所述細(xì)胞形成的細(xì)胞組織。
7.一種細(xì)胞組織形成方法，其特征在于，在權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的細(xì)胞組織微芯片的所述細(xì)胞保持內(nèi)腔內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，從而在所述粘著性區(qū)域上形成細(xì)胞組織。
8.權(quán)利要求7所述的細(xì)胞組織形成方法，其特征在于，在所述各細(xì)胞保持內(nèi)腔平均每個(gè)為2～1.5×105個(gè)的范圍內(nèi)培養(yǎng)所述細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供在形成均勻形狀和大小的細(xì)胞組織的同時(shí)、可以長(zhǎng)時(shí)間地培養(yǎng)所形成的細(xì)胞組織的微芯片。該微芯片具有多個(gè)用于保持細(xì)胞的細(xì)胞保持內(nèi)腔(12)，所述細(xì)胞保持內(nèi)腔的底面(20)包括顯示細(xì)胞粘著性的一個(gè)粘著性區(qū)域(30)和包圍該粘著性區(qū)域(30)并顯示細(xì)胞非粘著性的非粘著性區(qū)域(32)。
文檔編號(hào)C12N11/02GK101048493SQ20058003671
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者中澤浩二, 福田淳二 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人北九州產(chǎn)業(yè)學(xué)術(shù)推進(jìn)機(jī)構(gòu)