專利名稱：：涉及核糖開關(guān)的基于結(jié)構(gòu)的化合物設(shè)計的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及基因表達領(lǐng)域，具體涉及基因表達調(diào)節(jié)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：活體系統(tǒng)的一個本質(zhì)特征是精確基因控制，例如細胞必須通過改變基因表達模式來對大量的生物化學(xué)信號和環(huán)境信息做出應(yīng)答。大多數(shù)已知的基因控制機制都涉及蛋白質(zhì)因子的使用，所述蛋白質(zhì)因子感受化學(xué)或物理刺激然后通過與相關(guān)DNA或信使RNA序列的選擇性相互作用來調(diào)節(jié)基因表達。蛋白質(zhì)可以采用多種復(fù)雜的形狀并帶有各種功能，這使得活體系統(tǒng)可以精確的感知它們的化學(xué)和物理環(huán)境。對代謝產(chǎn)物應(yīng)答的蛋白質(zhì)因子通常通過與DNA結(jié)合來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的啟動(例如乳糖抑制體蛋白；Matthews,K.S.，andNichols,J.C"1998，Prog.NucleicAcidsRes.Mol.Biol.J《127-164)，或者通過與RNA結(jié)合來控制轉(zhuǎn)錄終止(例如PryR蛋白；Switzer，R丄，etal.，1999,Prog.NucleicAcidsRes.Mol.Biol.化329-367)或翻譯(例如TRAP蛋白；Babitzke，P.,andGollnick，P.,2001,J.Bacteriol.7《J，5795-5802)。蛋白質(zhì)因子通過例如變構(gòu)修飾或翻譯后修飾的各種機制對環(huán)境剌激做出應(yīng)答，并且經(jīng)常利用這些機制起到高應(yīng)答性基因開關(guān)的作用(參見例如Ptashne，M.,andGann，A.(2002).GenesandSignals.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。除了蛋白質(zhì)因子廣泛參與基因控制之外，還已知RNA也在基因調(diào)節(jié)中有活躍的作用。最近的研究逐漸揭示出小的非編碼RNA在選擇性靶向和破壞mRNA方面的重要作用，這導(dǎo)致基因表達的下調(diào)(參見例如Harmon,GJ.2002，NatureW《244-251和該文章的參考文獻)。這種RNA干擾過程利用了短RM通過Watson-Crick堿基互補而選擇性識別目標mRM靼標的能力上的優(yōu)勢，在該過程之后被結(jié)合的mRNA通過蛋白質(zhì)的作用而被破壞。在這一系統(tǒng)中RM為分子識別的理想媒介物，因為通過進化過程產(chǎn)生新的耙標特異性RNA因子要比產(chǎn)生具有新的高特異性RNA結(jié)合位點的蛋白質(zhì)因子容易得多。雖然蛋白質(zhì)可以滿足生物學(xué)對于酶、受體和結(jié)構(gòu)功能的大部分需求，但是RNA也具有這些能力。例如，RNA具有足夠的結(jié)構(gòu)彈性，能形成多種具有很大的酶活力和精確的分子識別能力的核酶結(jié)構(gòu)域(Cech&Golden,BuildingacatalyticactivesiteusingonlyRNA.In:TXei似^bi7dR.F.Gesteland，T.R.Cech，J.F.Atkins,eds.，pp.321—350(1998);Breaker,Zo72'"0selectionofcatalyticpolynucleotides.97，371-390(1997))和受體結(jié)構(gòu)域(Osborne&Ellington，Nucleicacidselectionandthechallengeofcombinatorialchemistry.C力e邁.97，349-370(1997);Hermann&Pate1，Adaptiverecognitionbynucleicacidaptamers.287，820-825(2000))。此外，上述能力還可以組合產(chǎn)生被效應(yīng)物分子選擇性調(diào)節(jié)的變構(gòu)核酶(Soukup&Breaker,EngineeringprecisionRNAmolecularswitches,化〃.JcarfliW.USA96，3584-3589(1999);Seetharamanetal.，Immobilizedriboswitchesfortheanalysisofcomplexchemicalandbiologicalmixtures.組weA/"ec力"o/.19，336-341(2001))。RM的這些屬性與一些研究的結(jié)論相一致(Goldetal.，F(xiàn)romoligonucleotideshapestogenomicSELEX:novelbiologicalregulatoryloops.尸roc,組/.Jc/.USA94，59_64(1997);Goldetal.，SELEXandthsevolutionofgenomes.Cw/r.O;7/j3.Ce"./teK7，848-851(1997);Nou&Kadner，AdenosylcobalamininhibitsribosomebindingtoW""RNA./Voc.JcW.5W.USA97，7190-7195(2000);Gelfandetal.，AconservedRNAstructureelementinvolvedintheregulationofbacterialriboflavinsynthesisgenes.7!re/^yd7e/7.15,439-442(1999);Miranda-Riosetal.，AconservedRMstructureU力/box)isinvolvedinregulationofthiaminbiosyntheticgeneexpressioninbacteria.淑厶USA98，9736—9741(2001);Stormo&Ji，DomRNAsactasdirectsensorsofsmallmoleculestocontroltheirexpression淑/.5t/USA98，9465-9467UOOl)),上述研究表明某些mRM可能利用變構(gòu)機制來對存在的特異性代謝產(chǎn)物做出基因調(diào)節(jié)性應(yīng)答。雖然推測有一種硫胺素焦磷酸(TPP)依賴性的感應(yīng)物/調(diào)節(jié)性蛋白可能參與了對硫胺素生物合成基因的控制(Webb&Downs,Characterizationoff力/Z，encodingthiamin—monophosphatekinase,in5W邁o刀e"a的力/咖r/咖./.A》人C力e邁.272，15702-15707(1997))，但是還^JL現(xiàn)有這類蛋白質(zhì)因子的存在。雖然枯草芽孢桿菌(A^/6"7/"的/7^^基因的轉(zhuǎn)錄受到高濃度的賴氨酸的抑制(Kochhar,S.，andPaulus，H.1996，#/cro6/o/.142:1635-1639;Mader，U.，etal.，2002，/.勘WeWo/.184:4288—4295;Patte，J.C.1996.Biosynthesisoflysineandthreonine.In:^ycAer/cA/sco//a/7diW咖/e/7s:6W7w/ara/-5/0/0^7,F.C.Neidhardt，etal"eds.，Vol.1，pp.528-541.ASMPress,Washington,DC;Patte，J.-C，etal.，1998，,愿Ze".169:165-170)，但是還沒有識別到作為該基因調(diào)節(jié)物的蛋白質(zhì)因子(Liao，H.-H.，andHseu，T.—H.1998，^fiSJ^#/cro6/o/.ZeW.168:31-36)。/7W基因編碼天冬氨酸激酶n，該酶催化L天冬氨酸轉(zhuǎn)化為L賴氨酸的代謝途徑的第一步(Belitsky，B.R.2002.Biosynthesisofaminoacidsoftheglutamateandaspartatefamilies,alanine,andpolya邁ines.In:勘"7/:w57/6〃//"osei^We/"/i^.'尸r咖Ce/7estoA丄Sonenshein，J丄Hoch，andR.Losick,eds"ASMPress,Washington,D.C.)。
發(fā)明內(nèi)容現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，某些天然mRM可作為對代謝產(chǎn)物敏感的基因開關(guān)，其中所述RNA直接結(jié)合小有機分子。這種結(jié)合過程改變了mRNA的構(gòu)型，由此通過多種不同機制引起了基因表達的變化。這些天然"核糖開關(guān)(riboswitch)"的修飾形式(通過各種核酸工程策略而產(chǎn)生)可#_用作受特異性效應(yīng)物化合物控制的設(shè)計基因開關(guān)。這類激活核糖開關(guān)的效應(yīng)物化合物在本文中被稱為觸發(fā)分子。天然開關(guān)是抗生素和其它小分子治療劑的靶標。此外，核糖開關(guān)的建造使得天然開關(guān)的實際片段可被用于構(gòu)建新的非免疫原性基因控制元件，例如適體(aptamer)(分子識別)結(jié)構(gòu)域可與其它的非天然適體相交換(或以其他方式修飾)，這樣新的識別結(jié)構(gòu)域可導(dǎo)致由使用者定義的效應(yīng)物化合物引起的基因調(diào)節(jié)。這種改變的開關(guān)可成為治療方案的一部分一一可以打開或關(guān)閉，或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成。新構(gòu)建的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)可以應(yīng)用于一些領(lǐng)域，例如活體生物傳感器、生物的代謝工程以及基因療法的高級形式。公開了分離的和重組的核糖開關(guān)、含有這類核糖開關(guān)的重組構(gòu)建體、與這類核糖開關(guān)可操作地連接的異源序列、帶有這類核糖開關(guān)的細胞和轉(zhuǎn)基因生物、核糖開關(guān)重組構(gòu)建體以及與異源序列可操作地連接的核糖開關(guān)。異源序列可為例如編碼目的蛋白質(zhì)或肽的序列，包括報告蛋白或報告肽。優(yōu)選的核糖開關(guān)為天然存在的核糖開關(guān)或由天然存在的核糖開關(guān)^f生的核糖開關(guān)。還公開了核糖開關(guān)的晶體原子結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)可用于建模和評估核糖開關(guān)與結(jié)合配體之間的相互作用。它們還可用于識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法中。還公開了含有異源的適體結(jié)構(gòu)域和表達平臺結(jié)構(gòu)域(expressionplatformdonaim)的嵌合核糖開關(guān)。也就是說，嵌合核糖開關(guān)有來自一種來源的適體結(jié)構(gòu)域和來自另一種來源的表達平臺結(jié)構(gòu)域。異源來源可來自例如不同特異性的核糖開關(guān)或不同類別的核糖開關(guān)。異源適體也可來自非核糖開關(guān)適體。異源表達平臺結(jié)構(gòu)域也可來自非核糖開關(guān)來源。還公開了用于篩選和識別可以激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的方法和組合物。核糖開關(guān)的激活指的是結(jié)合觸發(fā)分子后核糖開關(guān)狀態(tài)的改變。核糖開關(guān)可被觸發(fā)分子以外的其他化合物激活和以結(jié)合觸發(fā)分子以外的其它方式激活。本文使用的術(shù)語觸發(fā)分子指的是可以激活核糖開關(guān)的分子和化合物。這包括核糖開關(guān)的天然或正常的觸發(fā)分子和其它可激活核糖開關(guān)的化合物。天然或正常的觸發(fā)分子是指給定的天然核糖開關(guān)的觸發(fā)分子，或者對于一些非天然核糖開關(guān)而言，是指設(shè)計該核糖開關(guān)時所針對的觸發(fā)分子或篩選該核糖開關(guān)時使用的觸發(fā)分子(篩選通過例如體外篩選或體外進化技術(shù))。非天然觸發(fā)分子可被稱為非天然觸發(fā)分子。核糖開關(guān)的失活指的是不再結(jié)合觸發(fā)分子時核糖開關(guān)的狀態(tài)改變。^以外的i它方i失活。核糖開關(guān)^阻斷指的是核糖開關(guān)的一種狀態(tài)或情況，此時存在觸發(fā)分子卻不激活核糖開關(guān)。還公開了識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法，包括利用待測化合物和核糖開關(guān)的原子結(jié)構(gòu)進行建模并確定待測化合物與核糖開關(guān)是否相互作用。這可通過測定核糖開關(guān)和待測化合物的原子接觸來進行。此外，通過分析原子接觸然后優(yōu)化類似物的原子結(jié)構(gòu)以使得相互作用最大化，可以產(chǎn)生已知與核糖開關(guān)相互作用的化合物的類似物。上述方法可以高通量篩選進行。還公開了可以激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物以及含有這類化合物的組合物。還公開了可以激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的組合物和方法。核糖開關(guān)通過結(jié)合或移除觸發(fā)分子而實現(xiàn)控制基因表達的功能?？墒褂没衔飦砑せ睢⑹Щ罨蜃钄嗪颂情_關(guān)?？梢允褂煤颂情_關(guān)的觸發(fā)分子(以及其它激活性化合物)來激活核糖開關(guān)。通?？墒褂糜|發(fā)分子以外的化合物來失活或阻斷核糖開關(guān)。還可以通過例如從核糖開關(guān)所在處移除觸發(fā)分子來失活核糖開關(guān)。核糖開關(guān)可通過例如結(jié)合不激活核糖開關(guān)的觸發(fā)分子的類似物而被阻斷。還公開了通過使化合物與RNA分子相接觸，從而改變RM分子表達或改變編碼RM分子的基因表達的方法和組合物，其中所述RNA分子包括核糖開關(guān)。核糖開關(guān)通過結(jié)合或移除觸發(fā)分子而實現(xiàn)控制基因表達的功能。因此，將包括核糖開關(guān)的目的RM分子置于可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的條件下就可用來改變RNA的表達。例如轉(zhuǎn)錄終止或核糖體與RNA的結(jié)合被阻斷可以導(dǎo)致表達被改變。根據(jù)核糖開關(guān)的性質(zhì)，與觸發(fā)分子的結(jié)合可以減少或阻止RNA分子的表達或者促進或增加RNA分子的表達。還公開了通過將核糖開關(guān)與RNA分子可^Mt地連接，來調(diào)節(jié)RNA分子或編碼NRA分子的基因的表達的方法和組合物。核糖開關(guān)可與RNA分子以任何合適的方式可操作地連接，所述方式包括例如通過將核糖開關(guān)與RM分子物理連接，或者通過將編碼RNA分子的基因用基因工程改it使其包括和編碼核糖開關(guān)，這樣由基因工程改造的核酸產(chǎn)生的RM就具有了與RM分子可操作連接的核糖開關(guān)。將與目的RNA分子可操作連接的核糖開關(guān)置于可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的條件下就可用來改變RNA的表達。還公開了通過激活、失活或阻斷核糖開關(guān)，來調(diào)節(jié)含有核糖開關(guān)的天然存在的基因或RNA的表達的方法和組合物。如果該基因?qū)性摶虻募毎蛏锏拇婊疃允种匾?，那么激活、失活或阻斷該核糖開關(guān)可導(dǎo)致細胞或生物的死亡、停滯或虛弱。例如(如果該核糖開關(guān)的激活關(guān)閉或抑制表達)，激活某個對微生物的存活而言十分重要的天然存在的基因中的天然存在的核糖開關(guān)，可能導(dǎo)致該孩史生物的死亡。這是所7>開的化合物和方法用于抗孩i生物和抗生素效果的一個理"^基礎(chǔ)。還公開了通過激活、失活或阻斷核糖開關(guān)，來調(diào)節(jié)含有核糖開關(guān)的分離的、基因工程^it的或重組的基因或RNA的表達的方法和組合物?；蚧騌M可通過任何方式進行基因工程改造或重組。例如，核糖開關(guān)和RM的編碼區(qū)域可以是異源的，核糖開關(guān)可被重組或嵌合或二者均有。如果基因編碼一種所需的表達產(chǎn)物，則激活或失活該核糖開關(guān)可被用于誘導(dǎo)該基因的表達，并由此導(dǎo)致表達產(chǎn)物的產(chǎn)生。如果該基因編碼對于基因表達或另一細胞過程的一種i秀導(dǎo)物或抑制物，則激活、失活或阻斷該核糖開關(guān)可導(dǎo)致其他被調(diào)節(jié)基因或細胞過程的誘導(dǎo)、抑制或脫抑制。已知多種這樣的次級調(diào)節(jié)效應(yīng)，它們也可適用于核糖開關(guān)。核糖開關(guān)作為這類調(diào)節(jié)的初級控制的一個優(yōu)勢是核糖開關(guān)的觸發(fā)分子可為小的非抗原性分子。還公開了通過將適體結(jié)構(gòu)域與核糖開關(guān)的表達平臺結(jié)構(gòu)域可操作地連接(為嵌^^核糖開關(guān))，來改變核糖開關(guān)的調(diào)節(jié)的方法和組合物。這樣該適體結(jié)構(gòu)域可以通過例如適體結(jié)構(gòu)域的觸發(fā)分子的作用介導(dǎo)核糖開關(guān)的調(diào)節(jié)。適體結(jié)構(gòu)域可以以任何合適的方式與核糖開關(guān)的表達平臺結(jié)構(gòu)域可操作地連接，所述方式包括例如用新的適體結(jié)構(gòu)域替換核糖開關(guān)的正常的或天然的適體結(jié)構(gòu)域。通常，可以激活、失活或阻斷該適體結(jié)構(gòu)域所來源的核糖開關(guān)的任何化合物或條件都可被用于激活、失活或阻斷該嵌合核糖開關(guān)。還公開了通過共價改變核糖開關(guān)(通過例如交聯(lián)核糖開關(guān)的部分或?qū)⒁环N化合物偶聯(lián)至核糖開關(guān))來滅活核糖開關(guān)的方法和組合物。這種方式的核糖開關(guān)的滅活可由例如一些改變來獲得，所述改變阻止了核糖開關(guān)的觸發(fā)分子的結(jié)合，阻止了核糖開關(guān)與觸發(fā)分子結(jié)合后的狀態(tài)改變，或阻止了在與觸發(fā)分子結(jié)合后核糖開關(guān)的表達平臺結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ磉_的影響。還公開了識別可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的方法。例如，可活核糖開關(guān)的化合物。如二果，核糖開關(guān)被激;舌，則^測化合物被識別為、可:活核糖開關(guān)的化合物。可以以任意合適的方式評估核糖開關(guān)的激活。例如，核糖開關(guān)可以與報告RM相連接，并可在存在和不存在待測化合物的條件下測量報告RM的表達、表達水平或表達水平的改變。作為另一個實例，核糖開關(guān)可包括構(gòu)象依賴性標簽，由該標簽產(chǎn)生的信號隨核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而改變。優(yōu)選地，這種核糖開關(guān)使用天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。由此可見，可以使用對照測定或測量或者不使用對照測定或測量來進行核糖開關(guān)激活的評估。識別可以失活核糖的開關(guān)化合物的方法可以以類似的方式進行。對阻斷核糖開關(guān)的化合物的識別可以以任何合適的方式完成。例如，;下來進行用于;估核-開關(guān)^激活或失活的分析。如果沒有觀察到如同在不存在待測化合物的情況下應(yīng)當觀察到的激活或失活情況，則該待測化合物被識別為可阻斷核糖開關(guān)的激活或失活的化合物。還公開了生物傳感器核糖開關(guān)。生物傳感器核糖開關(guān)是經(jīng)過基因工程改造的核糖開關(guān)，它們在存在它們的同種觸發(fā)分子時產(chǎn)生可檢出的信號?？捎玫纳飩鞲衅骱颂情_關(guān)可以在觸發(fā)分子達到或超過閾值水平時被觸發(fā)。生物傳感器核糖開關(guān)可被設(shè)計為體內(nèi)應(yīng)用或體外應(yīng)用。例如，報告RM編碼作為信號的蛋白質(zhì)或參與產(chǎn)生信號的蛋白質(zhì)，與該報告RNA可操作地連接的生物傳感器核糖開關(guān)可在體內(nèi)被用于通過基因工程改造細胞或生物，使其含有編碼核糖開關(guān)/報告RNA的核酸構(gòu)建體。用于體外的生物傳感器核糖開關(guān)的一個實例是包括構(gòu)象依賴性標簽的核糖開關(guān)，由該標簽產(chǎn)生的信號依賴于核糖開關(guān)的激活狀態(tài)。優(yōu)選地，這種生物傳感器核糖開關(guān)使用天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。還公開了使用生物傳感器核糖開關(guān)檢測化合物的方法。該方法可包括使待測樣本和生物傳感器核糖開關(guān)相接觸，并評估生物傳感器核糖開關(guān)的激活。生物傳感器核糖開關(guān)的激活表明在待測樣本中存在該生物傳感器核糖開關(guān)的觸發(fā)分子。還公開了由識別激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物和對識別出的化合物進行加工而制備的復(fù)合物。這可以通過例如將本文其他部分>^開的化合物識別方法與對識別出的化合物進行加工的方法結(jié)合使用而實現(xiàn)。例如，可通過下述方法制備復(fù)合物使待測化合物和核糖開關(guān)相接觸，評估核糖開關(guān)的激活，以及如果核糖開關(guān)被待測化合物激活，則制備該激活核糖開關(guān)的待測化合物作為復(fù)合物。還公開了由核實某種化合物對核糖開關(guān)的激活、失活或阻斷作用和對經(jīng)核實的化合物進行加工而制備的復(fù)合物。這可以通過例如將本文其他部分公開的化合物激活、失活或阻斷評估方法與對經(jīng)核實化合物的加工方法結(jié)合使用而實現(xiàn)。例如，可通過下述方法制備復(fù)合物^吏待測化合物和核糖開關(guān)相接觸，評估核糖開關(guān)的激活，以及如果核糖開關(guān)^皮待測化合物激活，則制備該激活核糖開關(guān)的待測化合物作為復(fù)合物。核實化合物激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的能力指的是對以前并不知道可否激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的鑒定，以及對已知可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的能力的評估。還公開了篩選、設(shè)計或產(chǎn)生可以識別新的觸發(fā)分子的新核糖開關(guān)和/或新適體的方法。這類方法可包括在核糖開關(guān)中產(chǎn)生一系列適體變異體、在目的化合物存在的條件下評估變異體核糖開關(guān)的激活、篩選被激活的變異體核糖開關(guān)(或者例如篩選激活度最高或激活選擇性最強的核糖開關(guān))和重復(fù)上述步驟，直至得到具有所需活性、特異性、活性和特異性的結(jié)合或其他性質(zhì)的結(jié)合的變異體核糖開關(guān)。還公開了由上述方法生產(chǎn)的核糖開關(guān)和適體結(jié)構(gòu)域。所公開的核糖開關(guān)(包括它們的衍生形式和重組形式)通?？蓙碜匀魏蝸碓?，包括天然存在的核糖開關(guān)和從頭設(shè)計的核糖開關(guān)。任何這類核糖開關(guān)均可被用于公開的方法中或與公開的方法一起使用。然而，還可以確定不同類型的核糖開關(guān)，一些這樣的亞類可能可用于特定的方法中或與特定的方法一起使用(通常如本文其他部分所述)。核糖開關(guān)的類型包括例如天然存在的核糖開關(guān)、天然存在的核糖開關(guān)的衍生形式和修飾形式、嵌合核糖開關(guān)和重組核糖開關(guān)。天然存在的核糖開關(guān)是這樣一種核糖開關(guān)，它具有自然界中存在的核糖開關(guān)的序列。這類天然存在的核糖開關(guān)可以是自然界中存在的天然存在的核糖開關(guān)的分離形式或重組形式。也就是說，該核糖開關(guān)還具有相同的一級結(jié)構(gòu)，但是已在新的基因背景或核酸背景中被分離或^^因工程改造。嵌合核糖開關(guān)可由例如下列的部分構(gòu)成任意或特定類別或類型的核糖開關(guān)的一部分和相同或4壬意不同類別或類型的核糖開關(guān)中不同的核糖開關(guān)的一部分；任意或特定類別或類型的核糖開關(guān)的一部分和非核糖開關(guān)序列或元件。重組核糖開關(guān)是在新的基因背景或核酸背景中被分離或#^因工程改造的核糖開關(guān)。不同類別的核糖開關(guān)指的是(預(yù)計、測得或二者結(jié)合的)具有相同或相似的觸發(fā)分子的核糖開關(guān)或具有相同或相似的總體結(jié)構(gòu)的核糖開關(guān)。同似的總體^"。核糖開關(guān)^i別包括4i酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、鳥4^應(yīng)答性核糖開關(guān)、腺噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)、賴氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、硫胺素焦磷酸應(yīng)答性核糖開關(guān)，腺苷鈷胺素應(yīng)答性核糖開關(guān)、黃素單核苷酸應(yīng)答性核糖開關(guān)和S-腺苷蛋氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)。所公開的方法和組合物的其他優(yōu)點一部分將在下文的描述中闡明，一部分可以從說明書中獲知，或者通過實施公開的方法和組合物而得知。所公開的方法和組合物的優(yōu)點將通過所附權(quán)利要求書中具體指明的要素和組合的方式實現(xiàn)和獲得。應(yīng)當理解的是，上文的一般性描述和下文的具體描述都僅僅是示例性和解釋性的，并不是對本發(fā)明要求保護范圍的限制。附圖包含于本說明書中并作為本說明書的一部分，闡述了所公開方法和組合物的一些實施方案，它與文字描述一起作為對所公開方法和組合物的原理的解釋。圖lA、lB和lC顯示的是枯草芽孢桿菌中對鳥噤呤變構(gòu)應(yīng)答的jri^-如WmRNA的G盒RM。圖1A顯示的是存在于廣泛參與噤呤代謝的基因5，UTR的G盒RM結(jié)構(gòu)域的共有序列和二級結(jié)構(gòu)模型(SEQIDNO:1)。種系發(fā)育分析的結(jié)果與三個莖結(jié)構(gòu)(three-stem)(Pl至P3)連接點的形成是一致的。以小寫字母和大寫字母顯示的核苷酸分別表示存在于90%以上和80%以上的被檢測的代表物中。圓圈內(nèi)的核苷g現(xiàn)出g互補，這也許表明假結(jié)體(pseudoknot)的形成。圖1B顯示^7卜;7&J轉(zhuǎn)錄單位的5，UTR的序列和配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)改變(SEQIDNO:2)。大方框代表推測的抗終止子相互作用。通過串聯(lián)標記(in-lineprobing)(從C開始)測定的經(jīng)過結(jié)構(gòu)改變的核苷酸用小方框標出。201a^RNA的93"f片段(大方框中)仍然保留了鳥嘌呤結(jié)合功能。星號標出了促進體外轉(zhuǎn)錄(5，端)或產(chǎn)生限制性酶切位點(3，端)的RNA序列的改變。核苷酸編號從天然轉(zhuǎn)錄起點的第一個核苷酸開始。翻譯起始密碼子從第186位開始。圖1C顯示的是鳥嘌呤和相關(guān)的嘌呤選擇性誘導(dǎo)93"^mRNA片段的結(jié)構(gòu)性調(diào)節(jié)。通過對前體RNA(Pre;5，32P標記)培養(yǎng)40小時來進行串聯(lián)標記，所述培養(yǎng)在不含有(-)或含有鳥噤呤(G)、次黃噪呤(H)、黃噪呤(X)和腺嘌呤(A)的條件下進行。標有NR、Tl和—0H的泳道分別代表未反應(yīng)的RM、經(jīng)過RNA酶Tl(G-特異性切割)部分消化的RM或經(jīng)迚減部分消化的RM。識別了選出的對應(yīng)于G-特異性切割的條帶。1至4區(qū)域識別了自發(fā)性RM切割的配體"i秀導(dǎo)調(diào)節(jié)的主要位點。圖2A、2B和2C顯示由耶卜;&ZmRNA的鳥噤呤結(jié)合適體進行的分子辨別。圖2A顯示的是鳥噤呤、次黃噪呤和黃噤^枯草芽孢桿菌中基因表達的活性天然調(diào)節(jié)物)與腺噤呤(無活性)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和表，見Ko值的比較。相對于鳥嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異用圓圏表示。圖2中顯示的Ko值是以201",RNA測定的。鳥嘌呤上的數(shù)字表示環(huán)上氮原子的位置。圖2B顯示鳥噤呤的各種類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和Kd但，表明該噤呤的所有改變都會導(dǎo)致結(jié)合親和力的喪失?？招膱A圏表示KD值很可能顯著高于示出值，這是由于在本分析中沒有檢測500jiM以上的類似物濃度。G、H、X和A的表觀K。值用三角表示以便于比較。圖2C顯示的是201"f中鳥嘌呤適體的分子識別特征的示意圖。預(yù)計在鳥嘌呤的第9位形成了氫鍵，因為鳥苷(KD〉100jiM)和肌苷(KD〉100uM)(分別為鳥噤呤和次黃嘌呤的9-核糖基f;f生物)并未表現(xiàn)出可測量的結(jié)合。圖3A、3B和3C顯示了鳥噤呤特異性和腺噤呤特異性的核糖開關(guān)。圖3A顯示了本研究中檢測的兩種鳥噤呤特異性適體結(jié)構(gòu)域(i7w^和^0和三種腺嘌呤特異性適體結(jié)構(gòu)域的序列和結(jié)構(gòu)特征BS2-purE、BS3-xpt、BS5-ydhL、CP4-add和VV1—add,它們分別示于SEQIDNO:3-7。Pl至P3示出了含有適體結(jié)構(gòu)域的二級結(jié)構(gòu)的三個^寸莖結(jié)構(gòu)。小寫字母的核苷酸表示在系統(tǒng)發(fā)育中代表物的堿基同一性保守性達到90%以上的位置。箭頭表示配體特異性決定蔟的適體的保守性核心之中的核苷酸。BS、CP和VV分別表示枯草芽孢桿菌(A犯6〃7")、產(chǎn)氣莢膜梭菌(CAWW力'咖/ei"/"/7/^e/Ly)和創(chuàng)傷子瓜菌(F/6"'ora//z//7c:Ay)。圖3B顯示的是7;7f適體和7必Z適體的序列(SEQIDNO:8)和二級結(jié)構(gòu)。圓圏內(nèi)的核苷酸表示的是,必Z適體中與^7f適體中不同的位置。圖3C中公開的序列為SEQIDNO:9。xpt中的核苷酸按照美國專利申請No.2005-0053951的實施例6中所述進行編號。其他標記如圖3A中所述。圖4A和4B顯示的是來自7必Z的腺噤呤適體的分子識別的特異性。圖4A中的上圖對80y必ZRNA表現(xiàn)出可測量的結(jié)合的腺噤呤、鳥噤呤和其他噤呤類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。用圓圈表示相對于結(jié)合最緊密的化合物2，6-DAP的化學(xué)改變。下方左圖各種噤呤的表觀Kc值圖。下方右圖作為分子識別而與7必Z接觸的腺噤呤上的化學(xué)特征的模式圖。注N7和N9的重要性未進行測定。圓圈中的箭頭表示如果在C2處附帶有氫鍵供體則會存在接觸。圖4B顯示的是不與80/必ZRM結(jié)合(KD值低于300pM)的各種噤呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖5A、5B、5C和5D顯示的是鳥嘌呤核糖開關(guān)-次黃噤呤復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。圖5A左側(cè)顯示的是枯草芽孢桿菌的鳥噤呤核糖開關(guān)的,/^-/7&/鳥噤呤結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQIDN0:213)的二級結(jié)構(gòu)。在已知的90%以上鳥噤呤核糖開關(guān)中保守的核苷酸用紅色表示；編號與全長mRNA中的編號一致。有顏色的區(qū)域?qū)?yīng)于圖6和圖7中的結(jié)構(gòu)特征。右側(cè)顯示的是次黃嘌呤結(jié)合形式的三級結(jié)構(gòu)。在環(huán)與環(huán)之間關(guān)鍵的三勤目互作用以粗虛線表示；由水連接的三聚體用帶圓圏的"w，，表示。圖5B顯示的是mRNA的5，非翻譯區(qū)內(nèi)的鳥嘌呤核糖開關(guān)的基因抑制(SEQIDNO:214)。初始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域在鳥噤呤的濃JLA夠高時主要快速地結(jié)合鳥嘌呤(G)。次黃嘌呤(HX，上右)可穩(wěn)定烏噤呤結(jié)合結(jié)構(gòu)域特別是Pl螺旋，使mRNA形成終止轉(zhuǎn)錄的終止子元件。在不存在配體時(下右)形成抗終止子促進繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。圖5C顯示的是RM-次黃嘌呤復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的帶狀代表物。紅色表示次黃噤呤配體，其表面用點表示。圖5D顯示的是復(fù)合物的俯視圖，著重顯示P2和P3螺旋的緊密堆積。圖6A、6B和6C顯示的是鳥噤呤結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Υ吸S噤呤(HX)的識別。圖6A:在三邊連接中的次黃噤呤結(jié)合袋的立體視圖。圖6B:次黃噤呤和RNA之間的氬鍵相互作用(灰色虛線)。(在棍狀圖中顯示的)最終模式與模擬的退火2Fo-Fc省略圖(橙色框)相重疊，在該省略圖中顯示的原子被排除在圖計算之外。圖6C為三種結(jié)合袋的分子表面視圖比較，左圖鳥嘌呤核糖開關(guān)與次黃嘌呤結(jié)合；中圖茶堿結(jié)合適體與茶堿結(jié)合；右圖大腸桿菌purR抑制子與次黃嘌呤結(jié)合。圖7A、7B和7C顯示的是三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化。圖7A:形成環(huán)-環(huán)接觸的核心的兩個威基四聚體中的一個。碳原子的顏色與圖5中一樣。圖7B:環(huán)-環(huán)相互作用的側(cè)視圖，著重顯示g對和四聚體的排布。圖7A中顯示的四聚體中A65和U34之間用于定向的以氬鍵結(jié)合的g被著上藍色；另一四聚體的M被著上綠色。A35A64對以及著重表示它與U34的2，羥基之間相互作用的氬鍵用黃色顯示。頂端的G62U63對用紅色表示。圖8A和8B顯示的是核糖開關(guān)對次黃嘌呤的親和力的評估。顯示了在30。C，含有10mMK+-HEPES(pH7.5)、100mMKl和5mMMgCl2的緩沖溶液中，用次黃噤呤分別對野生型鳥噤呤結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖8A)和無三^目互作用的鳥噤呤結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖8B)進行測量的等溫滴定量熱曲線。圖9A和9B顯示的是可用于高通量篩選的兩類核糖開關(guān)結(jié)合測定的示意圖。圖9A:可用的利用自切割核酶的固有作用進行的基于核酶的測定。X代表被測試的化合物，GlcN6P為葡萄糖胺-6-磷酸。F和Q分別代表熒光團和淬滅部分(例如TAMRA和CY3)。圖9B:可用于非核酶核糖開關(guān)例如鳥噤呤結(jié)合RNA的分子信標測定。標示與圖9A中相同。圖10顯示的是與鳥噤呤核糖開關(guān)結(jié)合的六氨合鈷離子。左側(cè)的RNA(灰色)與圖5B中的RNA為相同的視圖，結(jié)合的次黃噤呤為紅色，Co(NH3)fi3+為綠色和藍色。右側(cè)的RNA^1相對于左側(cè)的旋轉(zhuǎn)了180°。圖ll顯示的是GR-minimalRNA(SEQIDNO:215)的二級結(jié)構(gòu)。設(shè)計該RNA以檢測L2和L3環(huán)在配體結(jié)合后形成的三勤目互作用的效果。在該構(gòu)建體中，L2和L3環(huán)與P2和P3的一部分一起被切除，代之以極其穩(wěn)定的UUCG四元環(huán)。圖12A和12B顯示的是基于結(jié)構(gòu)設(shè)計抗核糖開關(guān)化合物。圖12A:與鳥嘌呤類似物次黃嘌呤(HX)結(jié)合的鳥噪呤核糖開關(guān)的原子分辨模型。鳥噤呤結(jié)合可包括由噤呤環(huán)的環(huán)外2位氨基和C60和U37的氧原子之間形成的兩種附加的接觸。藍色陰影表示存在的通道，它可以使得鳥噤呤環(huán)被修飾。這些通道和它們末端的附近是適體和特異性鳥噤呤衍生物之間形成新的接觸的機會。圖12B:為利用鳥嘌呤核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)中的通道而合成的代表性鳥噤呤類似物(共26種，^名為G-001至G-26)。在這一集合中的大多數(shù)化合物都可以以小于1納摩爾的解離常數(shù)與核糖開關(guān)相結(jié)合(見圖13)。這些化合物可被進一步修飾，以獲得化合物和通道附近的官能團之間的新接觸。圖13顯示的是在揭示各種類似物對鳥噤呤適體的變構(gòu)調(diào)節(jié)作用的串聯(lián)標記研究中的代表性聚丙烯酰胺皿電泳分析。NR、Tl和0H分別表示未反應(yīng)、經(jīng)核酸酶T1部分消化和經(jīng)堿部分消化。串聯(lián)標記測定進行大約l天，在J1/2、J2/3和J3/1區(qū)域的自發(fā)RM切割條帶的模糊(dampening)是配體結(jié)合的標志。這種模糊即使在加入lnM化合物的時候也會出現(xiàn)，表明解離常數(shù)等于或優(yōu)于lnM。圖14顯示的是鳥噪呤核糖開關(guān)體內(nèi)功能的GFP報告物分析。在無鳥噤呤的條件下，全長mRNA被轉(zhuǎn)錄并表達GFP。在存在高濃度的鳥嘌呤或活性鳥噤呤類似物時，形成轉(zhuǎn)錄終止子，抑制GFP的表達。建立了一個類似的系統(tǒng)，其中用核糖開關(guān)控制P-半乳糖苷酶基因。圖15顯示的是G-014的時間-殺菌測定。G-014隨著時間減少存活的枯草芽孢桿菌細胞的數(shù)量，其殺菌速度與羧爺西林相等。具體實施例方式通過參考對下文中包括的實施例和具體實施方案的具體描述，以及參考附圖及其上下文的描述，可以更容易地理解所公開的方法和組合物。某些天然mRNA可作為代謝物敏感性基因開關(guān)，其中RNA直接結(jié)合小的有機分子。這種結(jié)合過程改變了mRNA的構(gòu)象，這可通過多種不同的機制而導(dǎo)致基因表達的改變。(通過使用各種核酸工程策略產(chǎn)生的)這些天然"核糖開關(guān)"的被修飾形式可被用于設(shè)計被特異性效應(yīng)物化合物(在本文中被稱為觸發(fā)分子)控制的基因開關(guān)。天然的開關(guān)是抗體和其它小分子治療劑的靶標。此外，核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)可使得天然開關(guān)的實際片段^皮用于構(gòu)建新的非免疫原性基因控制元件，例如，適體(分子識別)結(jié)構(gòu)域可與其它的非天然適體相交換(或以其他方式^f務(wù)飾)，這樣新的識別結(jié)構(gòu)域可導(dǎo)致由使用者定義的效應(yīng)物化合物引起的基因調(diào)節(jié)。改變的開關(guān)成為治療方法的一部分一一開啟或關(guān)閉或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成。新構(gòu)建的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)可以應(yīng)用于一些領(lǐng)域，例如活體生物傳感器、生物的代謝工程以及基因療法的高級形式。信使RM通常被認為是遺傳信息的被動載體，它可在翻譯過程中被蛋白調(diào)節(jié)因子或小分子RNA調(diào)節(jié)因子和核糖體所調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn)某些mRNA帶有天然適體結(jié)構(gòu)域，并且特異性代謝物與這些RNA結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可導(dǎo)ft基因表達的調(diào)節(jié)。天然核糖開關(guān)具有天然RNA通常不具有的兩種特殊的功能。其一，mRNA元件可變?yōu)椴煌慕Y(jié)構(gòu)狀態(tài)，其中一種結(jié)構(gòu)可作為其把標代謝物的精確的結(jié)合袋。其二，由代謝物誘導(dǎo)的在結(jié)構(gòu)狀態(tài)之間的變構(gòu)互變可導(dǎo)致通過幾種不同機制之一的基因表達水平的改變。核糖開關(guān)通?？杀粍澐譃閮蓚€獨立的結(jié)構(gòu)域一個選擇性地結(jié)合耙標(適體結(jié)構(gòu)域)，另一個影響基因控制(表達平臺)。這兩個結(jié)構(gòu)域之間的動態(tài)相互作用導(dǎo)致對基因表達的依賴于代謝物的變構(gòu)控制。已識別了不同類別的核糖開關(guān)，這些不同類別的核糖開關(guān)表現(xiàn)出選擇性地識別激活化合物(在本文中被稱為觸發(fā)分子)。例如，輔酶B12、甘氨關(guān)，所述基:編碼這些化合物的代t或轉(zhuǎn)運途徑中關(guān)鍵的i。每一^核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域與高度保守的共有序列和結(jié)構(gòu)相一致。因此，可使用序列同源性檢索來識別相關(guān)的核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)域。已在細菌、太古生物和真核生物等多種生物中發(fā)現(xiàn)了核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)域。發(fā)現(xiàn)了一類可識別鳥噤呤而不識別其他大部分嘌呤類似物的核糖開關(guān)。帶有鳥嘌呤核糖開關(guān)的共有序列和結(jié)構(gòu)特征的代表性RNA位于原核生物的多種基因的5，非翻譯區(qū)(UTR)，它們控制參與嘌呤補救和生物合成的蛋白質(zhì)的表達。在這一系統(tǒng)發(fā)生學(xué)集合中有三種代表物結(jié)合腺嘌呤的表觀解離常數(shù)值(表觀KD)比結(jié)合鳥噤呤的大幾個數(shù)量級。這種對腺噤呤的優(yōu)先結(jié)合是由于在核糖開關(guān)的核心有一個核苷酸的替換，其中每種代表物最可能是通過形成Watson/Crick;aiJ^來識別其相應(yīng)的配體。此外，與枯草芽孢桿菌的7必Z基因相關(guān)的腺噤呤特異性核糖開關(guān)起"開"基因開關(guān)的作用，其中腺嘌呤的結(jié)合導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性重排，這種重糸險防止內(nèi)部轉(zhuǎn)錄終止子莖結(jié)構(gòu)的形成。鳥嘌呤感受性核糖開關(guān)是這樣一類RNA基因控制元件，它們對鳥噪呤濃度的改變做出應(yīng)答而調(diào)節(jié)基因表達。推測大腸桿菌(i^c力ei7c力/aco//)6&BmRNA的5'非翻譯序列在代謝監(jiān)控和基因控制方面有積極的作用。該mRNA通過選擇性結(jié)合輔酶B12，不需要蛋白質(zhì)就能起到代謝物敏感性基因開關(guān)的作用。該結(jié)合事件形成一種不同的RNA結(jié)構(gòu)，這種RNA結(jié)構(gòu)似乎可抑制核糖體結(jié)合和并由此降低鈷胺素轉(zhuǎn)運蛋白BtuB的合成。這一發(fā)現(xiàn)結(jié)合本文所述的觀察結(jié)果支持了以下假設(shè)通過RNA-代謝物相互作用進行的代謝物監(jiān)控是基因控制中的一種廣泛的機制。RM結(jié)構(gòu)探查數(shù)據(jù)表明硫胺素焦磷酸(TPP)核糖開關(guān)是作為其靼標化合物的變構(gòu)感受器，其中通過適體結(jié)構(gòu)域與TPP的結(jié)合穩(wěn)定了適體內(nèi)和相鄰的表達平臺內(nèi)的構(gòu)象狀態(tài)，由此阻止了翻譯。表達平臺的多樣性似乎相當廣泛。M/^/RNA使用Shine-Dalgarno(SD)-阻斷機制來控制翻譯。與之不同，"/CRNA在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上均控制基因表達，因此可能使用了更復(fù)雜一些的表達平臺，該表達平臺將TPP結(jié)合事件轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄終止事件和對完整mMA的翻譯的抑制。還已知多種其它的核糖開關(guān)，它們可一起使用或作為嵌合核糖開關(guān)的一部分與甘氨酸感受性核糖開關(guān)及其元件一起使用。這類核糖開關(guān)的實例以及它們的使用描述于美國專利申請公布No.2005-0053951中，該文獻的全部內(nèi)容特別是其中關(guān)于具體核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)和操作的描述以援引的方式納入本文。A.核糖開關(guān)RM的一般性結(jié)構(gòu)細菌核糖開關(guān)RNA是主要位于特定mRNA主編碼區(qū)域的5，非翻譯區(qū)(5'-UTR)的基因控制元件。結(jié)構(gòu)性探查研究(下文將詳述)發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)元件通常包括兩個結(jié)構(gòu)域作為配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然適體(T.Hermann,D.J.Patel，iWe"ce2000，287，820;LGold,etal.，1n腦/AeWejr0/"/oc力飾/;"71995，64，763)和與參與基因表達的RM元件相接的"表達平臺"(例如Shine-Dalgarno(SD)元件；轉(zhuǎn)錄終止莖)。上述結(jié)論是基于下述觀察結(jié)果體外合成的適體結(jié)構(gòu)域在不存在表達平臺的條件下與合適的配體相結(jié)^(見美國專利申請公布No.2005-0053951的實施例2、3和6)。此外，結(jié)構(gòu)性探查研究表明，在獨立檢測的時候大多數(shù)核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域采用一種特定的二級和三級結(jié)構(gòu)折疊，ii&本上與存在完整的5，前導(dǎo)RNA時檢測到的適體結(jié)構(gòu)相同。這表明在許多情況下，適體結(jié)構(gòu)域作為與表達平臺互相獨立折疊的一個模塊單元(見美國專利申請公布No.2005-0053951的實施例2、3和6)。適體結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合狀態(tài)或未結(jié)合狀態(tài)最終通it^達平臺來解釋，表達平臺可以對基因表達產(chǎn)生影響。核糖開關(guān)作為一個模塊元件的觀點被以下事實進一步支持適體結(jié)構(gòu)域在各種生物之間是高度保守的(例如TPP核糖開關(guān)甚至在不同生物界之間都是保守的)(N.Sudarsan,etal.，WW2003，9，644)，而表達平臺在序列、結(jié)構(gòu)和控制附帶可"^框架的表達的機制方面都有所變化。例如，配體結(jié)合到枯草芽#菌f朋JmRM的TPP核糖開關(guān)上可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止(A.S.Mironov，etal.，2002，111，747)。這種表達平臺與大腸桿菌M/#mRNA的TPP核糖開關(guān)的表達平臺在序列和結(jié)構(gòu)上均不同，大腸桿菌mRM的TPP核糖開關(guān)與TPP結(jié)合時會通過SD阻斷機制導(dǎo)致對翻譯的抑制(見美國專利申請^^布No.2005-0053951的實施例2)。這兩種轉(zhuǎn)錄單位的TPP適體結(jié)構(gòu)域4艮容易被識別，并且具有幾乎相同的功能特征，但U因控制機制和實現(xiàn)該機制的表達平臺則相當不同。核糖開關(guān)RNA的適體結(jié)構(gòu)域通常長度為~70至170個核苷酸(美國專利申請公布No.2005-0053951的附圖11)。這一結(jié)果有些出人意料，因為體外進化試驗識別了多種結(jié)合小分子的適體，它們的長度相當短，并且結(jié)構(gòu)也不復(fù)雜(T.Hermann,D.J.Patel，5t/e/ce2000，287，820;L.Gold,etal.，J/M朋/WeF/ew"/oc力郎/W/y1995，64，763;M.Famulok，Cwrez^。/7/"2'o"http://i^rz/c^/ra/"/.o/o^r1999，9，324)。雖然天然適體序列相對于人工適體在復(fù)雜性和信息含量上的顯著增加的原因還需要進一步的研究，但是相信這種復(fù)雜性是形成具有高親和力和高選擇性功能的RM報告物所需要的。配體-核糖開關(guān)復(fù)合物的表觀KD值從幾納摩爾至幾樣傳爾不等。還值得注意的是，當一些適體結(jié)構(gòu)域與附帶的表達平臺相分離時，表現(xiàn)出比完整核糖開關(guān)更高的(~10至100倍)對靶配體的親和力(見美國專利申請^^布No.2005-0053951的實施例2)。可以推測，由完整的核糖開關(guān)RM對多種不同的RNA構(gòu)象進行采樣時需要消耗能量，這一點通過配體親和力的損失而反映出來。由于適體結(jié)構(gòu)域必須作為分子開關(guān)，這可能提高了天然適體的功能性要求，這一點可能也有助于解釋它們?yōu)槭裁从懈鼜?fù)雜的結(jié)構(gòu)。B.細菌中的轉(zhuǎn)錄終止的核糖開關(guān)調(diào)節(jié)細菌主^^吏用兩種方法來終止轉(zhuǎn)錄。某些基因含有依賴于Rho蛋白的終止信號(J.P.Richardson,"2'oc力i恵'cs"W0;7力7w'c""s2002，1577，251)。而另一些基因使用不依賴于Rho的終止子(內(nèi)在終止子)來破壞轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物(I.Gusarov，E.Nudler，ce//1999，3,495;E.Nudler，M.E.Gottesman，Ge腳"ce/7s2002，7，755)。后者的飄元件包括富含GC的莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及與^目連的6-9個尿苷酸g。內(nèi)在終止子在細菌基因組中廣泛存在(F.Lillo，etal.，2002，18，971),通常位于基因或操縱子的3，端。值得注意的是，已觀察到有許多內(nèi)在終止子位于5，UTR的實例。在細菌使用的多種基因調(diào)節(jié)策略中，RM聚合酶對5，UTR中的終止信號以調(diào)節(jié)方式應(yīng)答的這類實例越來越多(T.M.Henkin，Cwre"f&///^7#/cro6/o/^j2000，3，149)。在某種條件下，RNA聚合酶復(fù)合物在外部信號的驅(qū)使下對終止信號做出應(yīng)答或不做應(yīng)答。雖然轉(zhuǎn)錄的啟動可能不需要調(diào)節(jié)，但是對mRNA合成(和基因表達)的控制最終要由內(nèi)在終止子來指導(dǎo)。據(jù)推測，至少兩種互不相容的mRM構(gòu)象中的一種會導(dǎo)致引發(fā)轉(zhuǎn)錄終止的RNA結(jié)構(gòu)的形成或破壞。通常需要一種反式作用因子來接收細胞內(nèi)的特定信號并隨后穩(wěn)定RNA的構(gòu)象之一，在有些情況下反式作用因子為RNA(F.J.Grundy，etal.戶rocee^///^o尸f力eA^〃o"a/^cacfe/zy。/*5We/7ceso"力e5Y"es2002，99，11121;T.M.Henkin，C.Yanofsky,A'0e5^a7s2002，24，700)，在另一些情況下為蛋白質(zhì)(J.Stulke，^rc力/^yo/#/cro6/oA^72002，177，433)。核糖開關(guān)在RM結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)以及M因控制系統(tǒng)解析的代謝物信號之間提供了一種直接的聯(lián)系。下面對來自枯草芽孢桿菌的mRNA的F匪核糖開關(guān)進行簡單的描述以闡明it種機制。由對鳥噤呤具有高親和力和高選擇性的核糖開關(guān)控制M卜;&Z操縱子(Christiansen,L.C.，etal.，1997，J.Bacteriol.179，2540-2550)。這類核糖開關(guān)存在于枯草芽孢桿菌中的五種轉(zhuǎn)錄單位(包括12-基因操縱子)的5，非翻譯區(qū)(5MJTR)中。mRM與鳥噤呤的直接結(jié)合是某些細菌的嘌呤代謝作用中維持代謝平衡的一個關(guān)鍵性決定因素。此外，所發(fā)現(xiàn)的這幾類對七種不同靶分子應(yīng)答的核糖開關(guān)，至少控制著在枯草芽孢桿菌的中心代謝途徑中十分重要的68個基因。還公開了已在枯草芽孢桿菌中識別出的鳥噤呤核糖開關(guān)。已經(jīng)闡明了與次黃噤呤相結(jié)合的來自枯草芽孢桿菌"^p^J操縱子的烏噤呤核糖開關(guān)嘌呤結(jié)合結(jié)構(gòu)域在1.95A分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，其中次黃嘌呤是細菌噤呤補救途徑中普遍的代謝物。這一結(jié)構(gòu)顯示，幾個系統(tǒng)發(fā)生上保守的核苦酸參與了復(fù)雜的RNA折疊而形成一個結(jié)合袋，該結(jié)合袋幾乎完全包裹了配體。次黃嘌"^到穩(wěn)定這一結(jié)構(gòu)和促進下游轉(zhuǎn)錄終止元件形成的作用，由此提供了對細胞內(nèi)代謝物濃度升高做出應(yīng)答而直,制基因表達的機制。某些參與硫胺素生物合成的mRNA不需要蛋白質(zhì)因子參與就可以結(jié)合硫胺素(維生素BJ或其生物活性的焦磷酸衍生物(TPP)。mRM-效應(yīng)物復(fù)合物采用可隔離核糖體結(jié)合位點的不同結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基因表達的減少。這種代謝物感受性mRM系統(tǒng)提供了基因"核糖開關(guān)"(在本文中^L稱為核糖開關(guān))的實例，它在進化上的起源可能在蛋白質(zhì)之前。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌基因的mRNA前導(dǎo)序列可以選擇性地結(jié)合輔酶B12，而且這種結(jié)合事件導(dǎo)致對基因控制十分重要的RNA的結(jié)構(gòu)改變(見美國專利申請公布No.2005-0053951的實施例1)。還發(fā)現(xiàn)編碼硫胺素生物合成蛋白質(zhì)的mRNA也使用了核糖開關(guān)機制(見美國專利申請公布No.2005-0053951的實施例2)。在細菌中發(fā)現(xiàn)了一類被甘氨酸選擇性觸發(fā)的核糖開關(guān)。來自枯草芽孢桿菌的這類甘氨酸感受性RNA的一個代表物對于^^r操縱子具有罕見的打開基因的開關(guān)作用，^^r操縱子編碼甘氨酸切割系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)。大多數(shù)甘氨酸核糖開關(guān)整合了兩個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它們共同作用以便更接近于雙狀態(tài)的基因開關(guān)。進化出這種高級形式的核糖開關(guān)可能是為了保證過量的甘氨酸被有效利用，從而為三羧酸循環(huán)提供碳源并保持足夠量的氨基酸用于蛋白質(zhì)合成。因此，核糖開關(guān)執(zhí)行了重要的調(diào)節(jié)功能并具有復(fù)雜的表現(xiàn)特征，這些性質(zhì)以前都只能在蛋白質(zhì)因子中觀察到。雖然本文公開的特異性天然核糖開關(guān)是首次公開的mRNA元件通過結(jié)合代謝物控制基因表達的實例，但M該料到這一基因控制策略在生物界中是廣泛存在的。已經(jīng)證明TPP、輔酶Bu和FMN在RNA世界中是作為生物輔助因子出現(xiàn)的(WhiteIE，Coenzymesasfossilsofanearliermetabolicstate./MZiVo/.7，101-104(1976);Whitem，In:The戶7rW"e加c7e^油tbe/727/zes.Acad,Press,NYpp,1-17(1982)jBenneretal.,ModernmetabolismasapalimpsestoftheRNAworld.戶ro(7.Jcadi^'86，7054-7058(1989))(Joyce,TheantiquityofRNA-basedevolution.組we418，214-221(2002))。如果這些代謝物的生物合成和使用是在蛋白質(zhì)出現(xiàn)之前，那么某些核糖開關(guān)可能是最古老的基因控制形式的現(xiàn)代實例?；蚪M序列數(shù)據(jù)庫的檢索顯示，對應(yīng)于TPP適體的序列廣泛存在于細菌、太古生物和原核生物的生物中，而且不同物種間的相應(yīng)序列并沒有太大的變化。雖然隨著進化過程似乎出現(xiàn)了新的結(jié)合代謝物的mRNA,但是已知的核糖開關(guān)很可能是RNA世界中的分子化石。應(yīng)當理解的是，除非特別指明，所公開的方法和組合物并不限于具體的合成方法、具體的分析技術(shù)或特定的試劑，同樣可以有所改變。還應(yīng)理解的是，本文中使用的術(shù)語學(xué)僅是出于描述具體實施方案的目的，而并不意在限制。物質(zhì)^^開了可用于所^Hf方法和組合物的、可與所公開方法和組合物一起使用的、可用于制備所公開組合物的和作為所公開方法和組合物的產(chǎn)品的物質(zhì)、組合物和組分。在本文中公開了這些物質(zhì)和其他物質(zhì)，應(yīng)當理解的是，在公開這些物質(zhì)的組合、子集、相互作用和群組等的時候，盡管關(guān)于這些化合物的每種不同的個體和集體的組合和排列可能并未明確地公開，但每種都在此被特別地考慮和描述。例如，如果公開和討論了一種具體的核糖開關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域，并且討論了可以制備許多包括核糖開關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的分子的許多修飾物，則除非另外特別指明，可能的核糖開關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域以及修飾物的每種和各種組合和排列均得到特別地考慮。因此，如果公開了一類分子A、B和C，并且還公開了一類分子D、E和F以及組合分子A-D的實例，則即使沒有每個逐一列舉，每個也單獨和共同得到考慮。因此，在這個實例中，A-E，A-F，B-D，B-E，B-F,C-D，C-E以及C-F的每個組合也被特別地予以考慮，并且認為上述每一個組合也因為A、B和C;D、E和F;以及組合分子A-D的公開而被公開。同樣，這些分子的任何子集或組合也#1特別地予以考慮和公開。因此，例如，A-E，B-F和C-E的子群也因為A、B和C;D、E和F;以及組合分子A-D的公開而被公開。將這一概念適用于本申請的所有方面，包括但不限于制備和應(yīng)用公開組合物的方法中的步驟。因此，如果有多個其他步驟可以實施，應(yīng)當理解的是，所述其他步驟的每一步都可以以所公開方法的任何具體實施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合來實施，并且每種這樣的組合都被特別地予以考慮和公開。A.核糖開關(guān)核糖開關(guān)為表達控制元件，它是待表達的RM分子的一部分，并且在與觸發(fā)分子結(jié)合時改變狀態(tài)。核糖開關(guān)通常可被劃分為兩個獨立的結(jié)構(gòu)域一個選擇性地結(jié)合耙標(適體結(jié)構(gòu)域)，另一個影響基因控制(表達平臺結(jié)構(gòu)域)。這兩個結(jié)構(gòu)域之間的動力學(xué)相互作用導(dǎo)致了對基因表達的依賴代謝物的變構(gòu)控制。公開了分離的和重組的核糖開關(guān)；含有這類核糖開關(guān)的重組構(gòu)建體；與這類核糖開關(guān)可^^作地連接的異源序列；以及^^有這類核糖開關(guān)、核糖開關(guān)重組構(gòu)建體和與異源序列可操作地連接的核糖開關(guān)的細胞和轉(zhuǎn)基因生物。異源序列可以是例如編碼目的蛋白或肽包括報告蛋白或肽的序列。優(yōu)選的核糖開關(guān)為天然存在的核糖開關(guān)或由天然存在的核糖開關(guān)產(chǎn)生。所公開的核糖開關(guān)，包括它們的衍生物和重組形式，通?？梢詠碜匀魏蝸碓?，包括天然存在的核糖開關(guān)和從頭設(shè)計的核糖開關(guān)。任何這類的核糖開關(guān)都可被用于公開的方法或與公開的方法一起使用。然而，可能識別出不同類型的核糖開關(guān)，某些這樣的亞類可能適用于特定的方法或與特定的方法一起使用(通常如本文中其他部分所述)。核糖開關(guān)的類型包括例如天然存在的核糖開關(guān)、天然存在的核糖開關(guān)的衍生物和經(jīng)修飾的形式、嵌合核糖開關(guān)和重組核糖開關(guān)。天然存在的核糖開關(guān)是這樣一種核糖開關(guān)，它具有自然界中存在的核糖開關(guān)的序列。這類天然存在的核糖開關(guān)可以是自然界中存在的天然存在的核糖開關(guān)的分離形式或重組形式。也就是說，該核糖開關(guān)還具有相同的一級結(jié)構(gòu)，但是已在新的基因背景或核酸背景中被分離或被基因工程改造。嵌合核糖開關(guān)可由例如下列的部分構(gòu)成任意或特定類別或類型的核糖開關(guān)的一部分和相同或任意不同類別或類型的核糖開關(guān)中的不同核糖開關(guān)的一部分；任意或特定類別或類型的核糖開關(guān)的一部分和非核糖開關(guān)序列或元件。重組核糖開關(guān)是在新的基因背景或核酸背景中被分離或^^因工程^it的核糖開關(guān)。核糖開關(guān)可有一個或多個適體結(jié)構(gòu)域。具有多個適體結(jié)構(gòu)域的核糖開關(guān)中的各適體結(jié)構(gòu)域可以表現(xiàn)出對觸發(fā)分子的協(xié)同結(jié)合，或可以不表現(xiàn)出對觸發(fā)分子的協(xié)同結(jié)合(也就是說適體不必要表現(xiàn)出協(xié)同結(jié)合)。在后一種情況中，適體結(jié)構(gòu)域可被稱為獨立結(jié)合物。含有多個適體的核糖開關(guān)可含有一個或多個表達平臺結(jié)構(gòu)域。例如，含有兩個協(xié)同結(jié)合其觸發(fā)分子的適體結(jié)構(gòu)域的核糖開關(guān)可以與被兩個適體結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)的一個表達平臺結(jié)構(gòu)域相連接。含有多個適體的核糖開關(guān)可含有一個或多個以接頭相連的適體。當適體對觸發(fā)分子表現(xiàn)出協(xié)同結(jié)合時，接頭可為協(xié)同式接頭。對于進行協(xié)同結(jié)合分析的適體結(jié)構(gòu)域而言，如果適體結(jié)構(gòu)域的數(shù)目(或者適體結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位點的數(shù)目)為x,而它們的希爾系數(shù)n在x和x-l之間，那么就稱這些適體結(jié)構(gòu)域有協(xié)同結(jié)合。因此，例如，具有兩個適體結(jié)構(gòu)域的核糖開關(guān)(例如甘氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān))如果其希爾系數(shù)在2和l之間，則稱它具有協(xié)同結(jié)合。應(yīng)當理解的是，所用的x值對應(yīng)的是參與協(xié)同結(jié)合分析的適體結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，而不一定是核糖開關(guān)中存在的適體結(jié)構(gòu)域的數(shù)目。這一點是有一定意義的，因為一個核糖開關(guān)可能含有多個適體結(jié)構(gòu)域，但只有其中幾個具有協(xié)同結(jié)合性質(zhì)。不同類別的核糖開關(guān)指的是(預(yù)計、測得或二者結(jié)合的)具有相同或相似的觸發(fā)分子的核糖開關(guān)或具有相同或相似的總體結(jié)構(gòu)的核糖開關(guān)。同似的總體』構(gòu)。核糖開關(guān)的、1別4括4i酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、鳥4^應(yīng)答性核糖開關(guān)、腺噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)、賴氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、硫胺素焦磷酸應(yīng)答性核糖開關(guān)，腺苷鈷胺素應(yīng)答性核糖開關(guān)、黃素單核苷酸應(yīng)答性核糖開關(guān)和S-腺苷蛋氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)。還公開了含有異源的適體結(jié)構(gòu)域和表達平臺結(jié)構(gòu)域的嵌合核糖開關(guān)。也就是說，嵌合核糖開關(guān)有來自一種來源的適體結(jié)構(gòu)域和來自另一種來源的表達平臺結(jié)構(gòu)域。異源來源可來自例如不同特異性的核糖開關(guān)、不同類型的核糖開關(guān)或不同類別的核糖開關(guān)。異源適體也可來自非核糖開關(guān)適體。異源表達平臺結(jié)構(gòu)域也可來自非核糖開關(guān)來源。核糖開關(guān)可以由其他已知的、開發(fā)出的或天然存在的核糖開關(guān)經(jīng)修飾而得到。例如，開關(guān)結(jié)構(gòu)域部分可進行如下^f奮飾改變一個或多個核苦酸，但是還保持該核糖開關(guān)已知或預(yù)計的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)或二級和三級結(jié)構(gòu)。例如，一個^對中的兩個核苷酸可被變?yōu)槿钥膳鋵Φ暮塑账?。使得g仍保持配對的改變在本文中被稱為^5^Jit保守性改變。可以使用體外的篩選和進化技術(shù)產(chǎn)生經(jīng)^f務(wù)飾的或衍生的核糖開關(guān)。通常，應(yīng)用于核糖開關(guān)的體外進化技術(shù)包括產(chǎn)生一系列的變異員糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)序列的一個或多個部分有所改變而核糖開關(guān)的其他部分保持不變。然后可評估這一系列變異體核糖開關(guān)的激活、失活或阻斷(或其他的功能性或結(jié)構(gòu)性標準)，符合所用標準的那些變異體核糖開關(guān)就被選擇出來備用或用于下一輪進化?？捎糜诋a(chǎn)生變異體的基礎(chǔ)核糖開關(guān)是本文公開的那些特異性和一致性的核糖開關(guān)?？墒褂靡恢滦院颂情_關(guān)來獲知核糖開關(guān)的哪些部分在體外篩選和進化中有所變化。還公開了調(diào)節(jié)作用發(fā)生改變的經(jīng)修飾的核糖開關(guān)?？梢酝ㄟ^將一個適體結(jié)構(gòu)域和核糖開關(guān)的表達平臺結(jié)構(gòu)域可操作地連接(這就是嵌合核糖開關(guān))，來改變該核糖開關(guān)的調(diào)節(jié)作用。適體結(jié)構(gòu)域可以通過例如適體結(jié)構(gòu)域的觸發(fā)分子的作用來介導(dǎo)核糖開關(guān)的調(diào)節(jié)作用?？捎萌魏魏线m的方式來將適體結(jié)構(gòu)域和核糖開關(guān)的表達平臺結(jié)構(gòu)域可IMt地連接，所述方式包括，例如用新的適體結(jié)構(gòu)域代替核糖開關(guān)的正常的或天然的適體結(jié)構(gòu)域。通常，可以激活、失活或阻斷適體結(jié)構(gòu)域所來源的核糖開關(guān)的任何化合物或條件都可以用來激活、失活或阻斷嵌合核糖開關(guān)。還公開了滅活的核糖開關(guān)。核糖開關(guān)可通過共價改變核糖開關(guān)的方式可通過以下方法導(dǎo)致4糖開關(guān)的這;方:的i活例如，阻止)^發(fā)分子與核糖開關(guān)結(jié)合的改變，阻止核糖開關(guān)與觸發(fā)分子結(jié)合后狀態(tài)改變的改變，或在核糖開關(guān)與觸發(fā)分子結(jié)合后阻止其表達平臺結(jié)構(gòu)域影響表達的改變。還公開了生物傳感器核糖開關(guān)。生物傳感器核糖開關(guān)是經(jīng)過基因工程改造的核糖開關(guān)，它們在存在它們的同種觸發(fā)分子時產(chǎn)生可檢出的信號。可用的生物傳感器核糖開關(guān)可以在觸發(fā)分子達到或超過閾值水平時被觸發(fā)。生物傳感器核糖開關(guān)可被設(shè)計為體內(nèi)應(yīng)用或體外應(yīng)用。例如，報告RM編碼作為信號的蛋白質(zhì)或參與產(chǎn)生信號的蛋白質(zhì)，與該報告RNA可^Mt地連接的生物傳感器核糖開關(guān)可在體內(nèi)被用于通過基因工程改造細胞或生物，使其含有編碼核糖開關(guān)/報告RNA的核酸構(gòu)建體。用于體外的生物傳感器核糖開關(guān)的一個實例是包括構(gòu)象依賴性標簽的核糖開關(guān)，由該標簽產(chǎn)生的信號隨核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而變化。優(yōu)選地，這種生物傳感器核糖開關(guān)使用天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。生物傳感器核糖開關(guān)可用于各種環(huán)境和平臺中。例如，生物傳感器核糖開關(guān)與例如平板、芯片、條帶和孔的固體載體一起4吏用。還公開了識別新的觸發(fā)分子的經(jīng)修飾的或衍生的核糖開關(guān)。識別新的觸發(fā)分子的新核糖開關(guān)和/或新適體可以從已知核糖開關(guān)中選擇、從已知核糖開關(guān)開始設(shè)計或來源于已知核糖開關(guān)。這可通過下述步驟實現(xiàn)例如，產(chǎn)生核糖開關(guān)中的一系列適體變異體；在存在目的化合物的條件下評估變異體核糖開關(guān)的激活；篩選被激活的變異體核糖開關(guān)(或者例如篩選激活度最高或激活選擇性最強的核糖開關(guān))和重復(fù)上述步驟，直至得到具有所需活性、特異性、活性和特異性的結(jié)合或其他性質(zhì)的結(jié)合的變異體核糖開關(guān)。特別有用的的適體結(jié)構(gòu)域可形成本文中稱為Pl莖結(jié)構(gòu)(或簡稱Pl)的莖結(jié)構(gòu)。美國專利申請^S布No.2005-0053951的附圖11中顯示了多種核糖開關(guān)的Pl莖結(jié)構(gòu)。Pl莖結(jié)構(gòu)中的雜交鏈被稱為適體鏈(也被稱為Pla鏈)和控制鏈(也被稱為Plb鏈)。控制鏈可以與適體鏈和所連接的表達平臺的序列形成一種莖結(jié)構(gòu)，所連接的表達平臺被稱為調(diào)節(jié)鏈(也被稱為Plc鏈)。因此，控制鏈(Plb)可以與適體鏈(Pla)和調(diào)節(jié)鏈(Plc)形成可互變的莖結(jié)構(gòu)。核糖開關(guān)的激活和失活會導(dǎo)致一種莖結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N(由Pla/Plb變?yōu)镻lb/Plc或與此相反)。Plb/Plc莖結(jié)構(gòu)的形成影響含有核糖開關(guān)的RM分子的表達。通過這種機制起作用的核糖開關(guān)在本文中被稱為互變莖結(jié)構(gòu)核糖開關(guān)(或稱為互變莖核糖開關(guān))。一些具有兩個適體的甘氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)使用第二適體中的Pl莖來利用上述機制。通常，通過設(shè)計或調(diào)整表達平臺結(jié)構(gòu)域中的調(diào)節(jié)鏈，使其與適體結(jié)構(gòu)域中的控制鏈互補，可以使任何適體結(jié)構(gòu)域適用于任何表達平臺結(jié)構(gòu)域?；蛘?，可以調(diào)整適體結(jié)構(gòu)域中的適體和控制鏈的序列，使得控制鏈與表達平臺中有功能意義的序列互補。例如，可調(diào)整控制鏈使其與RNA中的Shine-Dalgarno序列互補，以使得在控制鏈和SD序列之間形成莖結(jié)構(gòu)后核糖體難以接近SD序列，由此減弱或阻止翻譯的啟動。注意適體鏈在序列上也應(yīng)有相應(yīng)的改變，以使得可以在適體結(jié)構(gòu)域中形成P1莖。對于含有表現(xiàn)出協(xié)同結(jié)合的多個適體的核糖開關(guān)的情況，需要設(shè)計激活的適體(與表達平臺結(jié)構(gòu)域相互作用的適體)中的一個P1莖，使其與SD序列形成莖結(jié)構(gòu)。作為另一個實例，可以在RM分子上加上一個轉(zhuǎn)錄終止子(最方便的是在RNA的非翻譯區(qū)加入)，使得轉(zhuǎn)錄終止子序列的部分與適體結(jié)構(gòu)域的控制鏈互補(該序列可為調(diào)節(jié)鏈)。這可使得適體結(jié)構(gòu)域的控制序列與適體鏈和調(diào)節(jié)鏈形成可互變的莖結(jié)構(gòu)，由此可在核糖開關(guān)激活或失活后形成或破壞轉(zhuǎn)錄終止子。通過對互變莖結(jié)構(gòu)的類似設(shè)計方法可以將任意其它表達元件置于核糖開關(guān)的控制之下。對于由核糖開關(guān)控制的轉(zhuǎn)錄終止子而言，轉(zhuǎn)錄的速度以及核糖開關(guān)和表達平臺元件的間隔對于合適的控制會十分重要。轉(zhuǎn)_度可通過下述方式調(diào)整例如包含聚合酶停止元件(例如一系列尿嘧啶殘基)以停止轉(zhuǎn)錄并使得核糖開關(guān)形成和感受觸發(fā)分子。例如對于FMN核糖開關(guān)而言，如果FMN結(jié)合到它的適體結(jié)構(gòu)域上，則抗終止子序列就被隔離而不可能形成抗終止子結(jié)構(gòu)(美國專利申請^S布No.2005-0053951的附圖12)。然而，如果沒有FMN,—旦由聚合酶形成抗終止子的核苷酸，就能形成抗終止子。然后RNAP會脫離停止位點，并僅到達另一個U延伸區(qū)而再次停止。這樣僅僅當抗終止子不再阻礙終止子核普酸時才形成轉(zhuǎn)錄終止子。公開了可調(diào)節(jié)的基因表達構(gòu)建體，包括編碼RM的核酸分子，所述RNA包括與編碼區(qū)可操作地連接的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)調(diào)節(jié)RNA的表達，其中所述核糖開關(guān)和編碼區(qū)域為異源的。核糖開關(guān)可包括適體結(jié)構(gòu)域和表達平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和表達平臺結(jié)構(gòu)域為異源的。核糖開關(guān)可包括一個適體結(jié)構(gòu)域和一個表達平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域包括P1莖，其中所述P1莖包括適體鏈和控制鏈，其中所述表達平臺結(jié)構(gòu)域包括調(diào)節(jié)鏈，其中所述調(diào)節(jié)鏈、所述控制鏈或此二者均祐:設(shè)計為能形成莖結(jié)構(gòu)。核糖開關(guān)可包括兩個或兩個以上的適體結(jié)構(gòu)域和一個表達平臺結(jié)構(gòu)域，其中至少一個適體結(jié)構(gòu)域和所述表達平臺結(jié)構(gòu)域為異源的。核糖開關(guān)可包括兩個或兩個以上的適體結(jié)構(gòu)域和一個表達平臺結(jié)構(gòu)域，其中至少一個適體結(jié)構(gòu)域包括P1莖，其中所述P1莖包括適體鏈和控制鏈，其中所述表達平臺結(jié)構(gòu)域包括調(diào)節(jié)鏈，其中所述調(diào)節(jié)鏈、所述控制鏈或此二者均^皮設(shè)計為能形成莖結(jié)構(gòu)。公開了核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)為天然存在的核糖開關(guān)的非天然衍生物。核糖開關(guān)可包括一個適體結(jié)構(gòu)域和一個表達平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和表達平臺結(jié)構(gòu)域為異源的。核糖開關(guān)可來源于天然存在的鳥噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)、腺噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)、賴氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、硫胺素焦磷酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、腺苷鈷胺素應(yīng)答性核糖開關(guān)、黃素單核苷酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、甘氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)或S腺苷蛋氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)。核糖開關(guān)可，發(fā)分子激活，其中所述核糖開關(guān)在被觸發(fā)分子激活時產(chǎn)生信號。表5公開了各種鳥噤呤核糖開關(guān)的實例。表5中的序列比對為Stockholm格式，它是由INFERNAL軟件包的cmalign程序輸出的。表5中的最后兩項反映了由計算機算法所計算出的基序的共有序列和結(jié)構(gòu)，所迷計算機算法是Eddy，S.R.(2003)所述的INFERNAL0.55版本，由算法的作者華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳系(Dept.ofGenetics,WashingtonUniversitySchoolofMedicine.St.Louis,Missouri)贈送。美國專利申請公布No.2005-0053951的附圖41描述了共有核糖開關(guān)序列、天然核糖開關(guān)序列和核糖開關(guān)序列比對。與腺噤呤核糖開關(guān)RM結(jié)合的各種核威基的熱力學(xué)#示于表7。與鳥噤呤核糖開關(guān)RM結(jié)合的各種核威基的熱力學(xué)^t示于表8。在本文中描述和提到了多種核糖開關(guān)和核糖開關(guān)構(gòu)建體。特別考慮了可能被本發(fā)明公開內(nèi)容的一些方面排除的任何特異性核糖開關(guān)或核糖開關(guān)構(gòu)建體，或核糖開關(guān)或核糖開關(guān)構(gòu)建體的群組。例如，m卜p6z/z核糖開關(guān)與報告基因的融合體可能被與報告基因融合的核糖開關(guān)的系列所排除。作為另一個實例，表5中所列的核糖開關(guān)的任意組合可能被公開的方法和組合物的任意方面特別地包括或特別地排除。1.適體結(jié)構(gòu)域適體為可選擇性結(jié)合特定化合物和化合物類別的核酸區(qū)段和結(jié)構(gòu)。核糖開關(guān)具有適體結(jié)構(gòu)域，該適體結(jié)構(gòu)域在與觸發(fā)分子結(jié)合后導(dǎo)致核糖開關(guān)狀態(tài)或結(jié)構(gòu)的改變。在功能性核糖開關(guān)中，當觸發(fā)分子結(jié)合至適體結(jié)構(gòu)域時，與適體結(jié)構(gòu)域相連的表達平臺結(jié)構(gòu)域的狀態(tài)或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域可有任何來源衍生，所述來源包括例如核糖開關(guān)的天然適體結(jié)構(gòu)域，人工適體，基因工程改造的、選擇的、進化的或衍生的適體或適體結(jié)構(gòu)域。核糖開關(guān)中的適體通常具有至少一個可以所連接的表達平臺結(jié)構(gòu)域的部分相互作用的部分，所i^目互作用是通過例如形成莖結(jié)構(gòu)。這種莖結(jié)構(gòu)可能在結(jié)合觸發(fā)分子后形成或被破壞。美國專利申請公布No.2005-0053951的附圖11和本文其他部分中描述了多種天然核糖開關(guān)的共有適體結(jié)構(gòu)域。這些適體結(jié)構(gòu)域(包括由此包含的所有直接變異體)可被用于核糖開關(guān)中。共有序列和結(jié)構(gòu)表明了序列和結(jié)構(gòu)中的可變形式。這些可變形式中包括的適體結(jié)構(gòu)域在本文中被稱為直接變異體?？梢孕揎椷@些適體結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生經(jīng)修飾的或變異的適體結(jié)構(gòu)域。保守性修飾包括4tt對核苷酸中的任何修飾，只M—對中的核苷酸仍然互補即可。中度修飾包括對莖或環(huán)長度(對于已給出莖或環(huán)的長度或長度范圍)所作的小于或等于所給出長度范圍的20%的改變。當共有結(jié)構(gòu)顯示了特定長度的莖或環(huán)時或者當列出或說明了長度范圍時，就認為"給出了"環(huán)和莖的長度。中度修飾包括對莖或環(huán)長度(對于已給出莖或環(huán)的長度或長度范圍)所作的小于或等于所給出長度范圍的40%的改變。中度修飾還包括適體結(jié)構(gòu)域的未指明部分的功能性變異體。在美國專利申請乂^布No.2005-0053951的附圖11中用實線標出了適體結(jié)構(gòu)域的未指明部分。在和表達平臺和RNA分子一起使用的改變的適體結(jié)構(gòu)域中，Pl莖和它的組成鏈可被修飾。這類修飾廣泛存在，在本文中被稱為Pl修飾。Pl修飾包括對適體結(jié)構(gòu)域的Pl莖的序列和/或長度所作的改變。美國專利申請公布No.2005-0053951的附圖11中顯示的適體結(jié)構(gòu)域(包括任意的直接變異體)，在通過體外篩選或體外進化技術(shù)生產(chǎn)衍生適體結(jié)構(gòu)域時可以特別有用地作為初始序列。所公開的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域也可用于其他目的，以及在任何其他背景中用作適體。例如，當結(jié)構(gòu)的改變可影響RM的功能時，可j吏用適體來控制核酶、其他分子開關(guān)和任意RNA分子。2.表達平臺結(jié)構(gòu)域表達平臺結(jié)構(gòu)域是核糖開關(guān)的一部分，它可以影響含有該核糖開關(guān)的RNA分子的表達。表達平臺結(jié)構(gòu)域通常具有至少一個可以所連接的適體結(jié)構(gòu)域的部分相互作用的部分，所W目互作用是通過例如形成莖結(jié)構(gòu)。這種莖結(jié)構(gòu)可能在結(jié)合觸發(fā)分子后形成或被破壞。莖結(jié)構(gòu)通常為表達調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)或者阻止表達調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)的形成。表達調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)為這樣一種結(jié)構(gòu)，它可以允許、阻止、增強或抑制含有該結(jié)構(gòu)的RNA分子的表達。實例包括Shine-Dalgarno序列、啟動密碼子、轉(zhuǎn)錄終止子和穩(wěn)定性信號和加工信號。B.觸發(fā)分子觸發(fā)分子是可以激活核糖開關(guān)的分子和化合物。這包括核糖開關(guān)的天然的或正常的觸發(fā)分子和可以激活核糖開關(guān)的其他化合物。天然或正常的觸發(fā)分子是對于給定的天然核糖開關(guān)的觸發(fā)分子，或者對于一些非天然核糖開關(guān)而言，天然或正常的觸發(fā)分子是指該核糖開關(guān)在設(shè)計時或篩選時所針對的觸發(fā)分子(設(shè)計和篩選例如體外篩選或體外進化技術(shù))。c.化合物還公開了能夠激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物以及包括這類化合物的組合物。核糖開關(guān)通過結(jié)合或移去觸發(fā)分子而發(fā)揮控制基因表達的功能?；衔锟杀挥糜诩せ睢⑹Щ罨蜃钄嗪颂情_關(guān)。核糖開關(guān)的觸發(fā)分子(以及其它激活性化合物)可被用于激活核糖開關(guān)。通?？墒褂糜|發(fā)分子以外的化合物來失活或阻斷核糖開關(guān)。核糖開關(guān)也可以通過例如從核糖開關(guān)所在處移去觸發(fā)分子而被失活。核糖開關(guān)可通過例如結(jié)合不激活核糖開關(guān)的觸發(fā)分子的類似物而被阻斷。還公開了用于改變RNA分子表達或改變編碼RNA分子的基因表達的化合物，其中所述RNA分子包括核糖開關(guān)。這可通過使化合物與RNA分子相接觸而實現(xiàn)。核糖開關(guān)通過結(jié)合或移除觸發(fā)分子而實現(xiàn)控制基因表達的功能。因此，將包括核糖開關(guān)的目的RNA分子置于可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的條件下就可用來改變RNA的表達。例如轉(zhuǎn)錄終止或核糖體與RNA的結(jié)合被阻斷可以導(dǎo)致表達被改變。根據(jù)核糖開關(guān)的性質(zhì)，與觸發(fā)分子的結(jié)合可以減少或阻止RNA分子的表達或者促進或增加RNA分子的表達。還公開了用于調(diào)節(jié)RM分子表達或調(diào)節(jié)編碼RNA分子的基因表達的化合物。還公開了通過激活、失活或阻斷核糖開關(guān)，來調(diào)節(jié)含有核糖開關(guān)的天然存在的基因或RNA的表達的化合物。如果該基因?qū)性摶虻募毎蛏锏拇婊疃允种匾敲醇せ?、失活或阻斷該核糖開關(guān)可導(dǎo)致細胞或生物的死亡、停滯或虛弱。還公開了通過激活、失活或阻斷核糖開關(guān)，來調(diào)節(jié)含有核糖開關(guān)的分離的、基因工程^it的或重組的基因或RM的表達的化合物。如果基因編碼一種所需的表達產(chǎn)物，則激活或失活該核糖開關(guān)可被用于誘導(dǎo)該基因的表達，并由此導(dǎo)致表達產(chǎn)物的產(chǎn)生。如果該基因編碼對于基因表達或另一細胞過程的一種誘導(dǎo)物或抑制物，則激活、失活或阻斷該核糖開關(guān)可導(dǎo)致其他被調(diào)節(jié)基因或細胞過程的誘導(dǎo)、抑制或脫抑制。已經(jīng)已知多種這樣的次級調(diào)節(jié)效應(yīng)，它們也可適用于核糖開關(guān)。核糖開關(guān)作為這類調(diào)節(jié)的初級控制的一個優(yōu)勢是核糖開關(guān)的觸發(fā)分子可為小的非抗原性分子。還公開了識別可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的方法。例如，可以通過使待測化合物和核糖開關(guān)相接觸并評估核糖開關(guān)的激活來識別可激活核糖開關(guān)的化合物。如果核糖開關(guān)被激活，則待測化合物被識別為可激活核糖開關(guān)的化合物?？梢砸匀我夂线m的方式評估核糖開關(guān)的激活。例如，核糖開關(guān)可以與報告RM相連接，并可在存在和不存在待測化合物的條件下測量報告RNA的表達、表達水平或表達水平的改變。作為另一個實例，核糖開關(guān)可包括構(gòu)象依賴性標簽，由該標簽產(chǎn)生的信號隨核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而變化。優(yōu)選地，這種核糖開關(guān)使用天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。由此可見，可以使用對照測定或測量或者不使用對照測定或測量來進行核糖開關(guān)激活的評估。識別可以失活核糖開關(guān)的化合物的方法可以以類似的方式進行。對阻斷核糖開關(guān)的化合物的識別可以以任何合適的方式完成。例如，;下來進行用于;估核i開關(guān)^激活或失活的分析。如果沒^"觀察到如同在不存在待測化合物的情況下應(yīng)當觀察到的激活或失活情況，則該待測化合物被識別為可阻斷核糖開關(guān)的激活或失活的化合物。還可以使用核糖開關(guān)的原子晶體結(jié)構(gòu)來識別化合物。天然鳥嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)的這類晶體原子結(jié)構(gòu)的一個實例示于圖5。原子結(jié)構(gòu)的原子坐標列于表6。圖5中顯示的核糖開關(guān)是與次黃嘌呤結(jié)合的。在這個實例中顯示了與次黃嘌呤相結(jié)合的來自枯草芽孢桿菌;;6"Z操縱子的鳥噤呤核糖開關(guān)嘌呤結(jié)合結(jié)構(gòu)域在1.95A分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，次黃噤呤是細菌噤呤補救途徑中普遍的代謝物。這一結(jié)構(gòu)顯示，幾個系統(tǒng)發(fā)生上保守的核苦酸參與了復(fù)合物RNA的折疊而形成一個結(jié)合袋，該結(jié)合袋幾乎完全包裹了配體。次黃嘌^到穩(wěn)定這一結(jié)構(gòu)和促進下游轉(zhuǎn)錄終止元件形成的作用，由此提供了對細胞內(nèi)代謝物濃度升高做出應(yīng)答而直接抑制基因表達的機制。可以使用核糖開關(guān)的晶體結(jié)構(gòu)來識別化合物，這可通過例如利用待測化合物和核糖開關(guān)的原子結(jié)構(gòu)進行建模并確定待測化合物與核糖開關(guān)是否相互作用來實現(xiàn)。這可通過使用核糖開關(guān)模型中待測化合物的預(yù)計最小相互作用能、預(yù)計結(jié)合常數(shù)、預(yù)計解離常數(shù)或它們的組合來實現(xiàn)。還可以通過下述方法識別化合物，例如，評估核糖開關(guān)和一種已知可與核糖開關(guān)結(jié)合的化合物(例如觸發(fā)分子)的匹配程度，識別化合物上可以改變而不會對化合物的結(jié)合帶來較大或明顯不良影響的位點，以及引入這樣的一個或多個改變以產(chǎn)生新的化合物。識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法可以包括像這樣識別出的化合物的生產(chǎn)。通常，該方法首先利用了核糖開關(guān)與化合物的三維結(jié)構(gòu)，這也被稱為"已知化合物"或"已知耙標"。本文公開的任何觸發(fā)分子和化合物均可被用作這種已知化合物。核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)可使用任何已知方式測定，例如晶體學(xué)或溶液麗R光語學(xué)。可通過例如AutoDock的計算機分子模型模擬程序來獲得上述的結(jié)構(gòu)。該方法可包括測定結(jié)合量，例如測定核糖開關(guān)和針對該核糖開關(guān)的潛在化合物之間的結(jié)合能。對核糖開關(guān)具有某些活性的化合物為活性化合物，例如可抑制核糖開關(guān)的活性或增強核糖開關(guān)的活性的化合物。此外，潛在化合物可以是與針對該分子的化合物在結(jié)構(gòu)上有一定關(guān)系的類似物。任何觸發(fā)分子、已知化合物和本文公開的化合物均可用作潛在化合物的基礎(chǔ)或者衍生潛在化合物的基礎(chǔ)?？赏ㄟ^多種方式來認識已知化合物和潛在化合物在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互作用或結(jié)合M等方面的同一性或關(guān)系。例如，可使用結(jié)構(gòu)模型測量或評估的任何量度和相互作用參數(shù)以及對于已知化合物和潛在化合物獲得的這類量度和參數(shù)之間都可以進行比較?？梢杂^察總體上已知化合物和潛在化合物之間的同一性。也可以觀察潛在化合物例如類似物和已知化合物之間僅在潛在化合物與核糖開關(guān)相互作用的結(jié)構(gòu)域位置的同一性。還可以觀察潛在化合物和已知化合物之間亞結(jié)構(gòu)域水平的同一性，例如僅在7A、6A、5A、4人、3A或2A范圍內(nèi)觀察核糖開關(guān)與已知化合物接觸的原子或部分以及相應(yīng)的潛在化合物的原子或部分。通常，亞結(jié)構(gòu)域越具體，潛在化合物和已知化合物的部分之間的同一性就越高。例如，在總體上，已知化合物和潛在化合物之間的同一性可能為30%或更高、35%或更高、40%或更高、45%或更高、50%或更高、55%或更高、60%或更高、65%或更高、70%或更高、75%或更高、80/?；蚋?、85%或更高、90%或更高、95%或更高；在已知化合物和潛在化合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的同一性可能為50%或更高、55%或更高、60%或更高、65%或更高、70%或更高、75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、9W或更高；而在已知化合物和潛在化合物的相應(yīng)的與核糖開關(guān)相互作用的原子或部分的周圍5A范圍以內(nèi)，它們的同一性可為70%或更高、75°/?；蚋?、80%或更高、85°/?；蚋?、90%或更高、95%或更高。另一亞結(jié)構(gòu)域是真正與核糖開關(guān)接觸的部分或原子的亞結(jié)構(gòu)域。在這種情況下，同一性可為例如大于50%、55°/。、60°/。、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高。通常，潛在化合物是以潛在化合物家族即一系列類似物的形式存在，該家族中所有的化合物都與該核糖開關(guān)的已知化合物在結(jié)構(gòu)上有一定關(guān)系?？赡芎Y選出由任何數(shù)量的成員組成的家族。家族中成員的最大數(shù)量僅僅由計算機的數(shù)量所限制，所述計算機要具有在所需的一定時間內(nèi)能篩選出每個成員的能力。該方法可包括核糖開關(guān)的至少一種模板結(jié)構(gòu)和一種靶標，通常靶標應(yīng)為已知靶標。由于在一些情況下上述結(jié)構(gòu)可以由本文公開的方法使用標準的結(jié)構(gòu)測定技術(shù)產(chǎn)生，因此并不需要目前存在該結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，在使用該方法時存在真實的結(jié)構(gòu)。該方法還可以包括使用由已知化合物的結(jié)構(gòu)得到的信息來對潛在化合物的結(jié)構(gòu)建模。所述建模可以用本文所述的方法和任何方法進行。潛在化合物的構(gòu)象和位置可以在計算過程中保持固定；也就是說可以假定核糖開關(guān)與潛在化合物結(jié)合的方向和它與已知化合物結(jié)合的方向完全一樣。然后可以測定核糖開關(guān)與潛在化合物之間的結(jié)合能(或其他性質(zhì)或參數(shù))，如果結(jié)合能(或其他性質(zhì)或械)符合某種標準，則該潛在化合物就可被認為是現(xiàn)實化合物，即可能與核糖開關(guān)相互作用的化合物。應(yīng)當理解的是，雖然下述討論的是使用結(jié)合能的情況，但也可以使用任何涉及化合物和核糖開關(guān)模型或相互作用的任何性質(zhì)或^t。該標準可為核糖開關(guān)與潛在化合物的計算結(jié)合能相當于或優(yōu)于核糖開關(guān)與已知化合物的計算結(jié)合能。例如，現(xiàn)實化合物可以是這樣一種化合物，它按本文所述計算出的結(jié)合能是已知化合物結(jié)合能的例如至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96°/"97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%、106°/。、107%、108%、109%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900°/。、1000%或更高?，F(xiàn)實化合物也可以是這樣一種化合物，在對所有潛在化合物按其結(jié)合能強度進行排序之后，該化合物位于例如一系列潛在化合物的計算結(jié)合強度的前20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8°/、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%;所述一系列潛在化合物至少有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、500、700或1000種潛在化合物。還應(yīng)該理解的是，在如本文公開內(nèi)容所述地識別出一種潛在化合物之后，可進行常規(guī)的檢測和分析，例如使用核糖開關(guān)和現(xiàn)實化合物進行生物學(xué)分析以進一步確定現(xiàn)實化合物與核糖開關(guān)相互作用的能力和/或調(diào)節(jié)核糖開關(guān)的能力。所公開的方法可以包括分析核糖開關(guān)和化合物的活性的步驟，以及使用例如基于核糖開關(guān)的文庫進行例如組合化學(xué)研究。能量計算可以基于例如分子力學(xué)或量子力學(xué)。分子力學(xué)通過將一系列經(jīng)驗函數(shù)進行加和來模擬系統(tǒng)的能量，所述一系列經(jīng)驗函數(shù)代表了例如鍵拉力、范德華力或靜電相互作用的能量的總體組合。量子力學(xué)使用不同程度的近似度來解薛定譯方程。這些方法對電學(xué)結(jié)構(gòu)進行處理，使得可以對化學(xué)反應(yīng)進行表征?？梢宰R別核糖開關(guān)的潛在化合物。這可通過用與已知化合物的給定相似性進行篩選而實現(xiàn)。例如，與已知化合物為同一家族的化合物可被選擇。為*個核糖開關(guān)做計算準備，可以建立潛在化合物晶體結(jié)構(gòu)中未解析的或不存在的原子。這可使用下述工具來完成例如PR0DRG網(wǎng)絡(luò)J3艮務(wù)器http://www.davapcl.bioch.dundee.ac.uk./programs/prodrg,或例如InsightII、Quanta(均在www.accelrys.com網(wǎng)站)和CNS(Brimgeretal.，Crystallography&NMRsystem:anewsoftwaresuiteformacromolecularstructuredetermination.ActaCrystallogr.D54，905-921(1998))的標準分子建模程序，或者任何其它能夠作出核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)的分子建模系統(tǒng)。然后可以計算潛在化合物和核糖開關(guān)的結(jié)合能(或其他性質(zhì)或M)。有許多方法可用于進行這一計算。例如，通過使用經(jīng)驗函數(shù)可以實現(xiàn)側(cè)鏈位置的采樣和結(jié)合熱力學(xué)的計算，所述經(jīng)驗函數(shù)將潛在化合物-分子的能量建模為模型中所有原子對之間的靜電相互作用和范德華相互作用的總和。還可使用其他任何對潛在化合物和核糖開關(guān)的結(jié)合能進4亍評分的計算方法(H.Gohlke，&G.Klebe,Approachestothedescription和predictionofthebindingaffinityofsmall—moleculeligandstomacromolecularreceptors.Angew.Chem.Int.Ed.41，2644-4676(2002)).這類評分方法的實例包括但不限于下列程序中實現(xiàn)的方法，所述程序例如AutoDock(G.M.Morris"a人AutomateddockingusingaLamarckiangeneticalgorithmandanempiricalbindingfreeenergyfunction./C0邊/7W.19,1639-1662(1998))、Gold(G.Jones"a/.Molecularrecognitionofreceptorsitesusingageneticalgorithmwithadescriptionofdesolvation./245，43-53(1995))、Chem—Score(M.D.Eldridgea/./Co邁/wf—/4/fitedZtes.11，425-445(1997))和Drug-Score(H.Gohlke"a/，Knowledge-basedscoringfunctiontopredictprotein-ligandinteractions./U.A'o/,295，337-356(2000)).旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并可從包括互聯(lián)網(wǎng)的各種來源獲得。旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體為低能量側(cè)鏈構(gòu)象。使用旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫可以對結(jié)構(gòu)建模以嘗試最可能的側(cè)鏈構(gòu)象、節(jié)省時間并產(chǎn)生最可能正確的構(gòu)象。旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫的使用限于潛在化合物給定區(qū)域內(nèi)的殘基，例如在結(jié)合位點的殘基或化合物特定距離內(nèi)的殘基。所述特定距離可以設(shè)定為任何所需的長度，例如，潛在化合物與分子的任意原子的距離可為2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A或9A可以通過例如使用具有以下公式的Coulombic模型來計算每一對原子之間的靜電相互作用Eelec=332.08q命/er。其中qi和q2為部分原子電荷，r為它們之間的距離，e為介電常數(shù)?？梢允褂脼槊枋龇肿又械碾姾煞植级_發(fā)的現(xiàn)有M集來計算部分原子電荷。參數(shù)集的實例包括但不限于PARSE(D.A.SitkoffWa/.Accuratecalculationofhydrationfree—energiesusingmacroscopicsolventmodels./.戶扭Oe瓜98，1978-1988(1994))、CHA醒(MacKerellAll—atomempiricalpotentialformolecularmodelinganddynamicsstudiesofproteins./.尸力7s.C力e邁.B102，3586-3616，1998)和AMBER(W.D.CornellWa/.A2ndgenerationforce—fieldforthesimulationofproteins,nucleic—acids,和organic-分子./.j瓜Joe.117.5179-5195(1995))。部分原子電荷可通過它們與相似官能團的類比來分配，或通過例如PR0DRG服務(wù)器上實施的經(jīng)驗性分配方法來分配(D.M.F.vanAaltena/.PRODRG，aprogramforgeneratingmoleculartopologiesanduniquemoleculardescriptorsfromcoordinatesofsmallmolecules./C咖;^.—J2edM/.Ztew》/z10，255-262(1996))或通過使用標準量子力學(xué)計算方法來分酉己(例如，C.I.Baylye"/,Awell—behavedelectrostaticpotentialbasedmethodusingchargerestraintsforderivingatomiccharges-theRESPmodel.義戶A^.C力e邁.91，10269—10280,(1993))。靜電相互作用可以通過引入靜電去溶劑化效應(yīng)的更精密的方法學(xué)來計算。這可包括顯式溶劑模式和隱式溶劑模式在前一種方法中水分子直接包括在計算之中，而后一種方法中是通過介電連續(xù)介質(zhì)的方式描述水的效應(yīng)。用于計算靜電相互作用的隱式溶劑方法的具體實例包括但不限于基于Poisson-Boltz邁ann的方法和GeneralizedBorn方法(M.Feig&C.L.Brooks.Recentadvancesinthedevelopmentandapplicationofimplicitsolventmodelsinbiomoleculesimulations.Op/n.A/o/.14，217-224(2004))?？梢允褂煤唵蔚腖ennard-Jones形式和下列公式來計算原子對(兩個原子為硫原子或碳原子時)之間的范德華力和疏水相互作用Evdw=E{aatt12/r12-ciattVr6}。其中E為能量，r為兩個原子之間的距離，cj"t為相互作用能為零時的距離?？梢允褂煤唵蔚南喑饽苄g(shù)語來計算原子對(一個或兩個原子既不是辟u原子也不是碳原子時)之間的范德華力Evdff-E{orep12/r12}。其中E為能量，r為兩個原子之間的3巨離，crrep為相斥相互作用等于E時的距離。原子間的疏水相互作用還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法來計算。例如，能量分布可以按照下述方式計算在配體和受體復(fù)合物形成時會把一些溶劑可接近的表面積包埋起來，而能量分布與被包埋的溶劑可接近的表面積的量成比例。這種分布可以用原子對之間相互作用的形式表示，例如由Street和Mayo提出的方法(A.G.Street&S.L.Mayo.Pairwisecalculationofproteinsolvent—accessiblesurfaceareas.尸oA///^f"es/卵3，253-258(1998))。這種計算中可以包括用于描述疏水作用或范德華力或其他能量分布的任何形式的實施方法。可以針對每種潛在化合物-核糖開關(guān)相互作用來計算結(jié)合能。例如，可在存在或不存在核糖開關(guān)的條件下進行MonteCarlo采樣并計算每個模型的平均能量。然后可按照兩個計算出的平均能量的差別計算出核糖開關(guān)與潛在化合物的結(jié)合能?？梢詫⒂嬎愠龅臐撛诨衔锱c核糖開關(guān)的結(jié)合能和計算出的已知化合物與核糖開關(guān)的結(jié)合能相比較，來確定潛在化合物是否可能為現(xiàn)實化合物。上述結(jié)果可以用實驗數(shù)據(jù)來加以證實，實驗中可以測量核糖開關(guān)和化合物實際的相互作用。這種可用于測定核糖開關(guān)和化合物實際的相互作用的方法的實例包括但不限于平衡透析測量法(其中檢測放射形式的化合物與核糖開關(guān)的結(jié)合)、酶抑制測定(其中可在存在或不存在化合物的條件下監(jiān)測核糖開關(guān)的活性)和化學(xué)位移擾動測量(其中通過原子在畫R中的化學(xué)位移的變化來監(jiān)測核糖開關(guān)與潛在化合物的結(jié)合)。在上文公開的方法中，核糖開關(guān)可為例如鳥噤呤核糖開關(guān)。這種核糖開關(guān)可由例如表5中所列的核糖開關(guān)來篩選。在使用一種潛在化合物對核糖開關(guān)的原子晶體結(jié)構(gòu)進行建^后，可以進行進一步測試以測定核糖開關(guān)和化合物實際的相互作用。例如，可使用多種不同的手段來檢測結(jié)合的RNA，包括使用基于皿和基于芯片檢測方法的變構(gòu)核酶測定和串聯(lián)標記測定?？梢酝ㄟ^使用例如熒光檢測方法來實現(xiàn)高通量檢測。例如，可以使用通過激活RM切割核酶來控制基因表達的葡萄糖胺-6-磷酸感受性核糖開關(guān)的天然催化活性?？梢灾貥?gòu)該核酶以侵_以多種翻轉(zhuǎn)動力學(xué)切割分離的底物分子。因此，如果化合物觸發(fā)了核酶功能，則保持在淬滅基團附近的熒光基團就會解偶聯(lián)(因此變得熒光更強)?；蛘呖墒褂梅肿有艠思夹g(shù)。如果化合物可阻礙信標與核糖開關(guān)RNA的對接，則可產(chǎn)生抑制熒光的系統(tǒng)。通過使用本文公開的RNA基因工程策略，可以使上述任一種手段適用于任意類別的核糖開關(guān)。本文還公開了可與本文公開的鳥噤呤核糖開關(guān)相互作用的類似物。這類類似物的實例示于圖12B。這26種合成和檢測過的化合物中，有許多種化合物和烏噪呤核糖開關(guān)結(jié)合的常數(shù)與鳥噤呤(-5nM)相等或優(yōu)于鳥嘌呤。具有高度可變的附加物的化學(xué)組合物都具有功能，這一事實表明可以產(chǎn)生和檢測這些化學(xué)骨架的多種變種以用于體外和細胞內(nèi)的功能。特別地，可以通過與RNA結(jié)構(gòu)中其他官能團產(chǎn)生新的接觸的方式，使得經(jīng)過進一步修飾的上述化合物具有改善的與鳥噤呤核糖開關(guān)的結(jié)合力。此外，如同核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)模型顯示的在這些位點可能的多種修-飾那樣，通過在骨架的這兩個區(qū)域加以修飾，可以對生物活性、毒性和合成難度(以及其它特征)進行調(diào)節(jié)。高通量篩選還可用于發(fā)現(xiàn)也可與核糖開關(guān)RNA結(jié)合的全新的化學(xué)骨架，所述結(jié)合可以通過標準的或非標準的分子識別模式進行。由于核糖開關(guān)是首先發(fā)現(xiàn)的天然的結(jié)合代謝物的RM的主要形式，因此在以前很少有人進行建立適用于高通量篩選的結(jié)合測定方法的工作。有多種手段都可用于檢測結(jié)合代謝物的RNA，包括使用基于^和基于芯片檢測方法的變構(gòu)核酶測定和串聯(lián)標記測定。還公開了由識別激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物和對識別出的化合物進行加工而制備的復(fù)合物。這可以通過例如將本文其他部分公開的化合物識別方法與對識別出的化合物3^f亍加工的方法結(jié)合使用而實現(xiàn)。例如，可通過下述方法制備復(fù)合物使待測化合物和核糖開關(guān)相接觸，評估核糖開關(guān)的激活，以及如果核糖開關(guān)^皮待測化合物激活，則制備該激活核糖開關(guān)的待測化合物作為復(fù)合物。還公開了由核實某種化合物對核糖開關(guān)的激活、失活或阻斷作用和對經(jīng)核實的化合物進行加工而制備的復(fù)合物。這可以通過例如將本文其他部分公開的化合物激活、失活或阻斷評估方法與對經(jīng)核實化合物的加工方法結(jié)合使用而實現(xiàn)。例如，可通過下述方法制備復(fù)合物使待測化合物和核糖開關(guān)相接觸，評估核糖開關(guān)的激活，以及如果核糖開關(guān)4皮待測化合物激活，則制備該激活核糖開關(guān)待測化合物作為復(fù)合物。核實化合物激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的能力指的是對以前并不知道可否激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的鑒定，以及對已知可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的能力的評估。本文中使用的術(shù)語"取代的"意在包括有機化合物的所有允許的取代基。廣義上講，允許的取代基包括有機化合物的非環(huán)狀的和環(huán)狀的、分支的和未分支的、碳環(huán)的和雜環(huán)的以及芳香族的和非芳香族的取代基。示例性的取代基包括例如下述的那些基團。對于合適的有機化合物，可有一個或多個相同或不同的允許的取^J^。出于本發(fā)明公開的目的，例如氮原子的雜原子可以具有氬取M和/或任何本文所述的允許取^KJ^，以滿足雜原子的價位。有機化合物的允許取代基并不意在以任何方式限制本發(fā)明的公開內(nèi)容。此外，術(shù)語"取代"或"用……取代"包括下迷隱含條件這類取代應(yīng)符合取代原子和取代基的價位，并且這類取代產(chǎn)生的是穩(wěn)、定的化合物，例如不會自發(fā)地經(jīng)過例如重排、環(huán)化、消去等轉(zhuǎn)化反應(yīng)的化合物。本文中使用的"A1，，、"A2"、"A3"和"A4"是一般性標記，表示不同的具體取代基。這些標記可以是任何取代基，并不限于本文/^開的那些取代基，在一種情況中它們指代某種取代基，也可能在另一種情況中它們就指代別的取代基。本文中使用術(shù)語"烷基"指的是1至24個碳原子的分支或不分支的飽和烴基，例如曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等等。烷基可為取代的或未取代的。烷基可以被一個或多個下述基團取代，所逸基團包括但不限于下文所述的烷基、鹵化烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、■、羧酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、硫代氧基、磺酰基、砜、亞砜或疏氬基。術(shù)語"低級烷基"是具有6個或6個以下碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基等等。在本說明書通篇中，一般用"烷基"指代未取代的烷基和取代的烷基;然而取代的烷M本文中提及時也要指出烷基上具體的取代基。例如，術(shù)語"卣化烷基"專門指被一個或多個例如氟、氯、溴和碘的囟原子取代的烷基。術(shù)語"烷lL^烷基"專門指被一個或多個如下所述的烷lL^取代的烷基。術(shù)語"烷基^JJ'專門指被一個或多個如下所述的M取代的烷基等等。當在一種情況中使用"烷基"而在另一種情況中使用例如"卣化烷基"的具體術(shù)語時，并非意在暗示術(shù)語"烷基"就不包括例如"卣化烷基"等的具體術(shù)語。這一習(xí)慣也適用于本文所述的其它基團。也就是說，例如術(shù)語"環(huán)烷基"指的是未取代和取代的環(huán)烷基部分，而取代的部分可在本文中另外具體地指明；例如，具#代的環(huán)烷基可被稱為例如"烷基環(huán)坑基"。類似地，一種取代的烷氧基可^皮具體地稱為例如"卣化烷氧基"，一種具體的取代烯基可被地稱為例如"烯基醇"等等。此外，使用例如"環(huán)烷基，，的一般性術(shù)語和例如"烷基環(huán)烷基"的具體術(shù)語的習(xí)慣，并非意在暗示一般性術(shù)語不包括具體術(shù)語。本文中所使用的術(shù)語"烷氧基"是指烷基鍵合一個單獨的醚鍵；也就是說"烷M"可被定義為-0A1，其中〃為上文定義的烷基。本文中使用的術(shù)語"烯基"為有2至24個碳原子的烴基，它們的結(jié)構(gòu)式中含有至少一個碳-碳雙鍵。例如(W)C=C(A3A4)的這種不對稱結(jié)構(gòu)意在包括E型和Z型異構(gòu)體。可以^(^^:在本文的結(jié)構(gòu)通式中存在不對稱的烯，或者由鍵的標記C-C明確地表示出來。烯基可被一個或多個下述基團所取代，所述基團包括但不限于下文所述的烷基、鹵化烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、硫代^^、磺跣基、砜、亞砜或碗^^。本文中使用的術(shù)語"炔基"為有2至24個碳原子的烴基，它們的結(jié)構(gòu)式中含有至少一個碳-碳巻鍵。炔基可被一個或多個下逸基團所取代，所述基團包括但不限于下文所述的烷基、卣化烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、硫代氧基、磺?；?、砜、亞砜或石危MJ^。本文中使用的術(shù)語"芳基"為含有任意以碳為M的芳香基團的基團，包括但不限于苯、萘、苯基、聯(lián)苯、苯^苯等。術(shù)語"芳基，，還包括"雜芳基"，"雜芳基"指的是含有的芳基環(huán)上至少摻入一個雜原子的基團，雜原子的實例包括但不限于氮、氧、硫和磷。類似地，術(shù)語"非雜芳基"也包括在術(shù)語"芳基"之內(nèi)，指的是包括不含雜原子的芳基的基團。芳基可為取代的或未取代的。芳基可^皮一個或多個下述基團所取^R，所述基團包括但不限于本文所述的烷基、面化烷基、烷M、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、M、羧酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、硫代lt^、磺?；㈨?、亞砜或疏氬基。術(shù)語"聯(lián)芳基，，是芳基基團的一種具體形式，也包括在芳基的定義之內(nèi)。聯(lián)芳基指的是結(jié)合在一起的兩個芳基，它們可例如萘那樣通過稠環(huán)結(jié)構(gòu)相連接，或者例如聯(lián)苯那樣通過一個或多個碳碳鍵相連接。本文中使用的術(shù)語"環(huán)烷基"為由至少三個碳原子組成的非芳香性的以碳為基礎(chǔ)的環(huán)。環(huán)烷基基團的實例包括但不限于環(huán)丙烷基、環(huán)丁烷基、環(huán)戊烷基、環(huán)己烷基等等。術(shù)語"雜環(huán)烷基"為前面定義的環(huán)烷基的一種，但是它的環(huán)上至少有一個碳原子被雜原子取代，所述雜原子包括但不限于氮、氧、疏或磷。環(huán)烷基和雜環(huán)烷基可為取代的或未取代的。環(huán)烷基和雜環(huán)烷基可被一個或多個下述基團所取代，所述基團包括但不限于本文所述的烷基、鹵化烷基、烷IL^、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、M、羧酸、酯、醚、卣化物、鞋基、酮、硫代M、磺?；㈨?、亞砜或硫g。本文中使用的術(shù)語"環(huán)烯基"為由至少三個碳原子組成的非芳香性的以碳為基J出的環(huán)，在環(huán)上含有至少一個雙鍵即OC。環(huán)烷基基團的實例包括但不限于環(huán)丙烯基、環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)戊二烯基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基等等。術(shù)語"雜環(huán)烯基"為前面定義的環(huán)烷基的一類并且包括在術(shù)語"環(huán)烯基"的含義之內(nèi)，但是它的環(huán)上至少有一個碳原子,皮雜原子取代，所述雜原子包括但不限于氮、氧、硫或磷。環(huán)烯基和雜環(huán)烯基可為取代的或未取代的。環(huán)烯基和雜環(huán)烯基可^l一個或多個下述基團所取代，所述基團包括但不限于本文所述的烷基、鹵化烷基、烷M、烯基、、芳基、雜芳基、醛、M、羧酸、酯、醚、鹵化物、羥基、酮、硫代IL^、磺it&、砜、im^硫i^本文中使用的術(shù)語"環(huán)狀基團"指的是芳基基團和非芳基基團(即環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基)或二者皆有。環(huán)狀基團具有一個或多個可為取代或未取代的環(huán)系統(tǒng)。環(huán)狀基團可包括一個或多個芳基基團、一個或多個非芳基基團，或者一個或多個芳基基團、一個或多個非芳基基團。本文中所使用的術(shù)語"醛"用通式-C(0)H表示。在本說明書通篇中"c(o)"都是c-o的簡寫形式。本文中使用的術(shù)語"胺"或用通式MlW表示，其中A1、A2和^可以獨立地為上文所述的氫、坑基、卣化烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基。本文中所使用的術(shù)語"羧酸"用通式-C(O)OH表示。本文中所使用的"羧酸才艮"用通式-C(O)(T表示。本文中所使用的術(shù)語"酯"用通式-0C(0)^或-C(0)0^表示，其中A1可以為上文所述的烷基、囟化烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基。本文中所使用的術(shù)語"醚"用通式A^A'表示，其中V和A'可以獨立地為上文所述的烷基、卣化烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基。本文中所使用的術(shù)語"酮，，用通式At(0)V表示，其中^和尸可以獨立地為上文所述的M、卣化烷基、烯基、、芳基、雜芳基、環(huán))^&、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基。本文中所使用的術(shù)語"卣化物"指的是鹵素氟、氯、溴和碘。本文中所使用的術(shù)語"羥基"用通式-OH表示。本文中所使用的術(shù)語"硫代氧基"用下列通式表示-S(0)A1(即"磺酰基，，)、VS(0)A2(即"亞砜，，)、-S(0)2A1、"02"即"砜，，)、—0S(0)2A1或-0S(0)20A1，其中^和尸可以為上文所述的氫、烷基、鹵化烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基。在本說明書通篇中"S(0)"都是S-O的簡寫形式。本文中所使用的術(shù)語"磺酰氨基"或"磺跣胺"用通式-S(0)2冊-表示。本文中所使用的術(shù)語"硫氬基"用通式-SH表示。本文所使用的"Rn，，(其中n為整數(shù))可以獨立地具有一個或多個上述的基團。例如，如果r含有一個芳基，則該芳基上的一個或多個氫原子可以任選地被羥基、烷氧基、氨基、烷基或卣化物等基團所取代。根據(jù)所選擇的基團，第一基團可能摻入第二基團中，或者第一基團可能在第二基團的側(cè)翼(即附著于第二基團)。例如，使用短語"包括氨基的烷基"時，氨基可能摻入于烷基的主鏈上?；蛘甙被赡苁歉街谕榛麈溕稀Ｋx擇的基團的性質(zhì)將決定第一基團是包含在第二基團中還是附著在第二基團上。如果沒有明確指出，在一個通式中只是以實線表示而未用楔形線或虛線表示的化學(xué)鍵包括了每種可能的異構(gòu)體，例如對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體，以及異構(gòu)體的混合物，例如外消旋混合物或成比例的(scalemic)混合物。本文公開的某些物質(zhì)、化合物、組合物和組分可以由商購得到，或是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)容易地合成得到。例如，在制備所公開的化合物和組合物中使用的起始物質(zhì)和試劑可以從下述的供應(yīng)商處商購例如AldrichChemicalCo.，(Milwaukee,Wis.)、Acros0rganics(MorrisPlains,NJ.)、FisherScientific(Pittsburgh,Pa.)或Sigma(St.Louis,Mo.);或者使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，參考下述文獻中所述的工藝來制備FieserandFieser，sReagentsforOrganicSynthesis,Volumes1-17(JohnWiley和Sons,1991);Rodd'sChemistryofCarboncompounds,Volumes1-5andS叩plementals(ElsevierSciencePublishers,1989);OrganicReactions,Volumes1-40(JohnWileyandSons,1991);March'sAdvancedOrganicChemistry,(JohnWileyandSons,4thEdition)和Larock'sComprehensiveOrganicTransformations(VCHPublishersInc.,1989)?？捎糜邙B噪呤應(yīng)答性核糖開關(guān)(以及由鳥嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)衍生的核糖開關(guān))的化合物包括用通式I表示的化合物該化合物可結(jié)合鳥噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)或其衍生物，其中當該化合物與鳥噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)或衍生物結(jié)合時，f和R2作為氫鍵供體，W作為氬鍵受體，R'作為氬鍵供體，r作為氬鍵受體，其中每個"—--"獨立地代表單鍵或雙鍵。在一些實例中，Rs可為氳鍵受體。應(yīng)當理解的是，當某一特定部分或基團可被稱為氬鍵##或氬鍵受體時，使用這一術(shù)語僅僅是為了i更于參照而將各種取代基進行分類。這一用語并不應(yīng)被理解為某一特定部分真正參與了與核糖開關(guān)或其他化合物形成氬鍵的過程。也有這種可能，例如，在本文中被稱為氬鍵受體(或氫鍵供體)的某一部分可能是唯一地或另外地參與了與核糖開關(guān)或其他化合物形成疏水相互作用、離子鍵、范德華力或其他類型相互作用的過程。還應(yīng)理解的是，本文公開的某些基團在本文中既可以被稱為氬鍵受體，也可以被稱為氬鍵供體。例如，-0H可以通過貢獻一個氫原子而成為氬鍵供體；-OH也可以通過氧原子上的一個或多個非鍵合電子對而成為氬鍵受體。因此在本說明書通篇中，多種部分可為氬鍵皿和氫鍵受體，并且可照這樣稱謂?？纱嬖谟谒_化合物中的合適的氳鍵供體，例如R1、W和f中的一個或多個，為含有極性氬鍵的部分，所述極性氬鍵例如氫原子與電負性更強的原子例如C、N、O或S結(jié)合時形成的氳鍵。對于R1、！^和^而言合適的氫鍵供體的實例包括但不限于下述部分-NR11-、-CHRu-、-CRH-和-C(-NR11)-，其中R"為-H、-NH2、-0H、-SH、-C02H,取代或未取代的絲、烷氧基、芳基、芳基氧基或苯甲氧基，-NH烷基、-冊烷氧基、-麗C(O)烷基、-NHC02烷基、-NHC(0)NH2、-NH-NH2、-NH-NH烷基、-NH-NH烷lt^、-NH-S02烷基、-ra-S02-R12、-NHC02CH2-R12、-NH-0R12、-N+H2-R12、-NH-NH-R12和-NH-NH-CH2-R12,其中R"可為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>其中n為1至5，R"可為-H、-NH2、-0H、烷H^、-N-嗎啉代或卣化物中的一個或多個?？纱嬖谟谒_化合物中的合適的氫鍵受體，例如R3、R'和FT中的一個或多個，為含有非^合電子對的部分。通常在N、0、S和鹵原子上存在非鍵合電子對。對于W和R'而言合適的氫鍵受體的實例包括但不限于N、0、S和S02。例如，r8和R7可以一起用-CH-N-、-CH2-0-、-CH2-S-或-CH2S0廣來表示。R'可為N、0或S，這在通式I的結(jié)構(gòu)中就會分別生成-N-R2、-0-R2和-S-R'部分，其中112的定義如前所述。對于r"部分，合適的氳鍵受體可為0或S，例如0-R'或S-rs中的0或S，其中^為C。對于R"而言氬鍵受體的其他實例包括但不限于-OH、-SH、-NH2、-C02H、-烷錄、-芳基g、-苯甲|^、_卣化物、-NH烷基、-NH烷H&、-NHC(O)烷基、-NHC0z烷基、-NHC02CHz-R12、-NHC(0)NH2、-NH-NH2、-NH-NH烷基、-NH-NH烷氧基、-S02烷基、-S02芳基、-NH-S02烷基、-NH-SO廣R12、-NH-OR12、-NH-R"、-NH-NH-R12、-NH-NH-CH2-R"或-NH-CH廣R12,其中R"的定義如前所述。對于R"部分，其他合適的氬鍵受體可為NR"，例如R"^W中的NR"，其中116為C。在這些實例中，R"可為-H、-NH2、-0H、-SH、-C02H、-。02烷基、-C02芳基、-C(0)NH2，取代或未取代的烷基、烷氧基、烷氧基、芳基氧基或苯甲氧基，-NH烷基、-NH烷氧基、-NHC(0)烷基、-NHC02烷基、-NHC(0)NH2、-S02烷基、-S()2芳基、-NH-S02烷基、-NH-S02-R12、-NH-OR12、-NH-R"或-NH-CH2-R12，其中R"的定義如前所述。所公開的一些特異性的化合物可用通式n表示，其中If為N或CH:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>R"為-0、=S、=NH、-NOH、-N烷基、=N烷氧基、-N-芳基、=N芳基氧基、-N-苯甲基、1苯曱|1^、=N-NH2、-N-NHOH、-N-NH烷基、-N-NH烷氧基、=N-NH芳基、-N-NH芳基M、=N-NH苯甲基、=N-NH苯曱H^、-N-NH-(對M苯基)、-N-NH-(對曱HJL苯基)、-N-NH-(對-N-嗎啉代-苯基)；以及r2為-CR15-，其中R"為-nh2、-NHNH2、-NHOH、-NH烷基、-NH烷氡基、-NH芳基、-NH芳基氧基、-NH苯曱基、-NH苯曱氧基、-N+H2芳基、-1012-(對-N-嗎啉代-苯基)、-N+H2-(對氨基苯基)、-N+H2-(對曱氧基苯基)、-NHC02烷基、-NHC02苯曱基、-NHNH烷基、-NHNH芳基、-NHNH苯甲基或-NHC(O)烷基。其他的化合物可用通式m表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>其中R"為-H、-0H、-SH、-烷氧基、卣化物、-NH2、-NHOH、-NH烷基、-NH烷^、-NH芳基、-NH芳基M、-NH苯曱基、-NH苯甲^、-NHC(O)烷基、-NHC02烷基、麗C02苯甲基、-NHNH2、-NHNH烷基、-NH冊芳基或-NHNH苯曱基；R'和lT的定義如前所述?；衔锏钠渌唧w實例示于圖12B。可用于鳥嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)(以及由鳥嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)衍生的核糖開關(guān))的化合物還包括具有通式IV的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>該化合物可結(jié)合鳥噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)或其衍生物，其中當該化合物與鳥噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)或衍生物結(jié)合時，R7作為氬鍵受體，1。作為氳鍵供體，Ru作為氳鍵受體，Ru作為氳鍵供體，其中Ru為H、H2或者不存在，其中&、R2、R3、R4、R5、R6、Rs和R9分別獨立地為C、N、0或S，其中每個"——"獨立地4義表單鍵或雙鍵。在上述定義范圍內(nèi)的每一種化合物都意圖在并應(yīng)被認為是在本文中具體地公開。此外，在上述定義范圍內(nèi)可識別的每個亞群都意圖在并應(yīng)被認為是在本文中具體地公開。因此，特別考慮了化合物的列表中可具體包括或排除的或者在用途中可具體包括或排除的任意化合物或化合物的亞群。例如，作為一種選擇，如果有某組化合物，其中每種化合物都符合上述定義但不是鳥嘌呤、次黃噤呤、黃噤呤或N2-甲基鳥噤呤，那么該組也是被考慮到的。作為另一種實例，如果有某一組化合物，其中每種化合物都符合上述定義而且能激活烏嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)，那么該組也是被考慮到的。應(yīng)該理解的是，對于化合物與核糖開關(guān)的相互作用，本文所述的特定接觸和相互作用方式(例如氫鍵供給或接受)對于化合物與核糖開關(guān)的相互作用來說是優(yōu)選的而非必需的。例如，化合物與核糖開關(guān)的相互作用與本文公開的化合物與核糖開關(guān)的接觸和相互作用相比，可能親和力和/或特異性要低一些。此外，化合物上不同的或其他的官能團可能會帶來與核糖開關(guān)的新的、不同的和/或補償性的接觸。例如，對于鳥噤呤核糖開關(guān)而言，在例如R1。和R2位置可使用大的官能團。這類官能團可以或被設(shè)計為可以與核糖開關(guān)的其他部分有接觸和相互作用。這種接觸和相互作用可以補償觸發(fā)分子和核心結(jié)構(gòu)的接觸和相互作用?？捎糜谙汆溥蕬?yīng)答性核糖開關(guān)(以及由腺嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)衍生的核糖開關(guān))的化合物包括具有以下通式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula>該化合物可結(jié)合腺噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)或其衍生物，其中當該化合物與腺噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)或衍生物結(jié)合時，Ri、113和R7作為氬鍵受體，Rw和Ru作為氬鍵脊沐，其中Ru為H、H2或者不存在，其中R!、R2、R3、R4、R5、R6、tU和Rs分別獨立地為C、N、0或S,其中每個"——"獨立地代表單鍵或雙鍵。在上述定義范圍內(nèi)的每一種化合物都意圖在并應(yīng)被認為是在本文中具體地公開。此外，在上述定義范圍內(nèi)可識別的每個亞群都意圖在并應(yīng)被認為是在本文中具體地公開。因此，特別考慮了化合物的列表中可具體包括或排除的或者在用途中可具體包括或排除的任意化合物或化合物的亞群。例如，作為一種選擇，如果有某一組化合物，其中每種化合物都符合上述定義但并不M嘌呤、2,6-二氨基嘌呤或2-氨基嘌呤，那么該組也是被考慮到的。作為另一種實例，如果有某一組化合物，其中每種化合物都符合上述定義而且能激活腺嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)，那么該組也是被考慮到的。可用于賴氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)(以及由賴氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)衍生的核糖開關(guān))的化合物包括具有以下通式的化合物該化合物可結(jié)合賴氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)或其衍生物，其中R2和R3每一個均帶正電，Ri帶負電，R4為C、N、0或S，并且其中每個"——，，獨立地代表單鍵或雙鍵。還考慮了在按上述定義的化合物中其中R2和R3均為NH3+并且l為0—的情況。在上述定義范圍內(nèi)的每一種化合物都意圖在并應(yīng)被i人為是在本文中具體地公開。此外，在上述定義范圍內(nèi)可識別的每個亞群都意圖在并應(yīng)被認為是在本文中具體地公開。因此，特別考慮了化合物的列表中可具體包括或排除的或者在用途中可具體包括或排除的任意化合物或化合物的亞群。例如，作為一種選擇，如果有某一組化合物，其中每種化合物都符合上述定義但都不是賴氨酸，那么該組也是被考慮到的。作為另一種實例，如果有某一組化合物，其中每種化合物都符合上述定義而且能激活賴氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)，那么該組也是被考慮到的?？捎糜赥PP應(yīng)答性核糖開關(guān)(以及由賴氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)衍生的核糖開關(guān))的化合物包括具有以下通式的化合物該化合物可結(jié)合TPP應(yīng)答性核糖開關(guān)或其f汴生物，其中Ri帶正電，R2和R3每一個均獨立地為C、0或S，114為CH3、NH2、0H、SH、H或不存在，Rs為CH3、NH2、0H、SH或H，IU為C或N,并且其中每個"——"獨立地代表單鍵或雙鍵。還考慮了在按上述定義的化合物中其中l(wèi)為磷酸才艮、二磷酸根或三磷酸根的情況。在上述定義范圍內(nèi)的每一種化合物都意圖在并應(yīng)被認為是在本文中具體地公開。此外，在上述定義范圍內(nèi)可識別的每個亞群都意圖在并應(yīng)被認為是在本文中具體地公開。因此，特別考慮了化合物的列表中可具體包括或排除的或者在用途中可具體包括或排除的任意化合物或化合物的亞群。例如，作為一種選擇，如果有某一組化合物，其中每種化合物都符合上述定義但并不是TPP、TP或硫胺素，那么該組也是被考慮到的。作為另一種實例，如果有某一組化合物，其中每種化合物都符合上述定義而且能激活TPP應(yīng)答性核糖開關(guān)，那么該組也^1被考慮到的。D.構(gòu)建體、栽體和表達系統(tǒng)所公開的核糖開關(guān)可在任何合適的表達系統(tǒng)中使用。重組表達可以使用例如質(zhì)粒等載體來實現(xiàn)。載體可包括與核糖開關(guān)編碼序列可^^作地連接的啟動子和待表達的RNA(例如，編碼一種蛋白的RM)。載體還可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的其它元件。本文所述的栽體指的是包含外源DNA的任何載體。因此，載體是可將外源核酸不降解地轉(zhuǎn)移至細胞中的媒介，它包括啟動子，可在它轉(zhuǎn)入的細胞中獲得核酸的表達。載體包括但不限于質(zhì)粒、病毒核酸、病毒、噬菌體核酸、噬菌體、粘粒和人工染色體?？梢陨a(chǎn)多種適于攜帶核糖開關(guān)-調(diào)節(jié)構(gòu)建體的原核和真核的表達栽體。這類表達載體包括例如pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC和酵母載體。栽體可在例如各種體內(nèi)和體外環(huán)境中使用。病毒栽體包括腺病毒、腺伴隨病毒、皰滲病毒、牛痘病毒、脊1^炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)營養(yǎng)病毒(neuronaltrophicvirus)、辛德畢斯病毒(Sindbis)和其他RM病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。還可使用與上述病毒具有共同性質(zhì)從而適于用作載體的任意病毒家族。由Verma(1985)描述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括鼠類馬羅尼白血病病毒MMLV和表現(xiàn)MMLV作為載體所需性質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。通常，病毒栽體包括非結(jié)構(gòu)性早期基因、結(jié)構(gòu)性晚期基因、RNA聚合酶m轉(zhuǎn)錄物、復(fù)制和殼體化必需的反向末端重復(fù)序列以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動子。當故基因工程改造用作載體時，通常要移除病毒的一個或多個早期基因，并將一種基因或基因/啟動子盒插入到病毒基因組中代替被移除的病毒DNA。"啟動子"通常為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點相對固定的位置時可以發(fā)揮功能的一個或多個DNA序列。"啟動子"包括與RM聚合酶發(fā)生基;M目互作用所需的核心元件和轉(zhuǎn)錄因子，還可包括上游元件和應(yīng)答元件。"增強子"通常指的是為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點相對不固定的位置時就可以發(fā)揮功能的DNA序列，它可以在轉(zhuǎn)錄單位的5，(Laimins，1981)或3，(Luskyetal.，1983)。此外，增強子可以在內(nèi)含子中(Banerjietal.，1983),也可以在編碼序列本身之中(Osborneetal.，1984)。它們的長度通常為10bp至300bp之間，并且以順式方式發(fā)揮作用。增強子的功能是增加鄰近的啟動子的轉(zhuǎn)錄。增強子與啟動子類似，也經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強子經(jīng)常對表達的調(diào)節(jié)有決定性作用。用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或有核細胞)中的表達載體還可包括可以影響mRM表達的轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列。這些區(qū)域在編碼組織因子蛋白的mRM的非翻"^分中以多腺苷酸化區(qū)段的形式被轉(zhuǎn)錄。3，非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位還包括多腺苷酸化區(qū)域。這一區(qū)域的一個優(yōu)點是它增加了被轉(zhuǎn)錄的單位像mRNA一樣被加工和轉(zhuǎn)運的可能性。多腺苷酸化信號在表達構(gòu)建體中的鑒定和用途已經(jīng)廣為人知。優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源的多腺苷酸化信號。載體可包括編碼標記物產(chǎn)物的核酸序列。^使用這種標記物產(chǎn)物來確定基因是否被送遞至細胞以及在送遞后是否M達。優(yōu)選的標記物基因為編碼p-半乳糖苷酶的大腸桿菌lacZ基因和綠色熒光蛋白。在一些實施方案中，標記物可為可選擇的標記物。當這類可選擇的標記物被成功地轉(zhuǎn)移至宿主細胞中時，如果將宿主細胞置于篩選壓力下，則被轉(zhuǎn)化的宿主細胞可以存活。目前廣泛使用的有兩類不同的篩選策略。第一類是基于細胞代謝的，使用離開添加培養(yǎng)基就不能生長的突變細胞系。第二類為顯性選擇，它指的是在任何細胞類型中都可使用而不必使用突變細胞系的篩選方案。這些方案通常^^用抑制宿主細胞生長的藥物。含有新基因的那些細胞可以表達使細胞具有藥物抗性的蛋白質(zhì)，從而可以在篩選中存活。這類顯性篩選的實例中使用的藥物有新霉素(SouthernandBerg，1982)、霉酚酸(MulliganandBerg，1980)或潮霉素(Sugdenetal.，1985)。可以使用遺傳物質(zhì)的直接轉(zhuǎn)移來獲得基因轉(zhuǎn)移，所述遺傳物質(zhì)包括但不限于質(zhì)粒、病毒栽體、病毒核酸、噬菌體核酸、噬菌體、粘粒和人工染色體，或者通過細胞或栽體例如陽離子脂質(zhì)體中的遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移來獲得基因轉(zhuǎn)移。這類方法為本領(lǐng)域所熟知，并且可以很容易的使^Jt用于本文所述的方法。轉(zhuǎn)移載體可為任何可將基因送遞至細胞內(nèi)的核苷酸構(gòu)建體(例如質(zhì)粒)，或者作為送遞基因的總體策略的一部分，例如作為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或重組腺病毒的一部分(Rametal.CancerRes.53:83-88，(1993))。用于轉(zhuǎn)染的合適手段包括病毒載體、化學(xué)轉(zhuǎn)染子或物理-機械方法例如電穿孔和DM的直接擴散，這些手段描述于例如，Wolff，J.A.，etal.,Science,247，1465-1468，(1990);和Wolff,J.A.Nature,352，815-818,(1991)。1.病毒載體優(yōu)選的病毒栽體為腺病毒、腺伴隨病毒、皰滲病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)營養(yǎng)病毒、辛德畢斯病毒和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。還優(yōu)選的是與上述病毒具有共同性質(zhì)從而適于用作載體的任意病毒家族。優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括鼠類馬羅尼白血病病毒醒LV和表現(xiàn)MMLV作為載體所需性質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以比其他載體病毒攜帶更大的基因載量，即攜帶更大的轉(zhuǎn)基因或標記物基因，因此是常用的載體。但是它們不能用于非增殖細胞。腺病毒栽體相對穩(wěn)定并易于操作、具有高滴度、可在氣溶膠制劑中送遞并可以轉(zhuǎn)染非分裂細胞。Pox病毒載M大并具有多個可插入基因的位點，它們對熱穩(wěn)定，可在室溫下儲存。優(yōu)選的實施方案為經(jīng)迚基因工程改造的病毒載體，這樣可以抑制宿主生物由病毒抗原引起的免M應(yīng)。優(yōu)選的這種類型的栽體應(yīng)攜帶白細胞介素8或10的編碼區(qū)域。病毒載體與大多數(shù)將基因?qū)爰毎幕瘜W(xué)或物理方法相比，具有更高的處理能力(導(dǎo)4因的能力)。通常，病毒載體包括非結(jié)構(gòu)性早期基因、結(jié)構(gòu)性晚期基因、RNA聚合酶m轉(zhuǎn)錄物、復(fù)制和殼體化必需的反向末端重復(fù)序列以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動子。當拔基因工程改造用作載體時，通常要移除病毒的一個或多個早期基因，并將一種基因或基因/啟動子盒插入到病毒基因組中代替被移除的病毒DNA。這種類型的構(gòu)建體可以攜帶最多達約8kb的外部遺傳物質(zhì)。被移除的早期基因的必需功能通常由經(jīng)過基因工程改造而反式表達早期基因的基因產(chǎn)物的細胞系提供。i.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒為屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的動物病毒，包括任何類型、亞科、屬或向性。在Verma，I.M.，Retroviralvectorsforgenetransfer.InMicrobiology-1985，AmericanSocietyforMicrobiology,pp.229-232，Washington,(1985)中總體描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，上述文獻以援引的方式納入本文。將逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體用于基因療法的方法的實例描述于美國專利No.4，868，116和4，980，286;PCT申請W090/02806和W089/07136;以及Mulligan，(Science260:926-932(1993))等文獻中，以上文獻中的教導(dǎo)以援引的方式納入本文。逆轉(zhuǎn)錄病毒本質(zhì)上是一個包裝，它將核酸負載包裹在內(nèi)。核酸負載攜帶有包裝信號，這使得復(fù)制出的子代分子可以被有效地包裝在包衣中。除了包裝信號以外，還有許多復(fù)制和復(fù)制病毒的包裝所需要的順式分子。通常逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括參與蛋白質(zhì)外殼形成的gag、pol和env基因。通常使用待轉(zhuǎn)入靶細胞的外部DNA來替代gag、pol和env基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常包括摻入至包衣所需的包裝信號，起動gag轉(zhuǎn)錄單位的信號序列，逆轉(zhuǎn)錄必需的元件(包括引物結(jié)^^位點以結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄的tRM引物)，在DNA合成過程中引導(dǎo)RNA鏈轉(zhuǎn)換的末端重M列，作為DM合成中第二鏈合成起始位點的富含嘌呤的序列5，至3'LTR，以及可使DNA狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)錄病毒插入到宿主基因組中的LTR末端附近的特異性序列。gag、pol和env基因的移除可以使得約8kb的外部序列被插入到病毒基因組中、^L^轉(zhuǎn)錄以及在復(fù)制后被包裝到新的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。根據(jù)每種轉(zhuǎn)錄物的大小，上述核酸量足夠送遞一個或多個基因。優(yōu)選地，在插入物中于其他基因一起含有陽性或陰性的可選擇的標記物。由于在大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體中，復(fù)制機制和包裝蛋白(gag、pol和env)已經(jīng)被移除，通常通過將載體置于包裝細胞系中來生產(chǎn)載體。包裝細胞系為已被含有復(fù)制和包裝機制但不含任何包裝信號的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細胞系。當攜帶所選DNA的栽^M皮轉(zhuǎn)染到這些細胞系中時，包括目病毒顆粒中。而具有機制的基因組因為沒有必需的信號而不被包裝。ii.腺病毒載體復(fù)制缺陷型腺病毒的構(gòu)建前人已有所描述(Berkneretal.，J.Virology61:1213-1220(1987);Massieetal.，Mol.Cell.Biol.6:2872-2883(1986);Haj-Ahmadeta1,，J.Virology51:261-21A(1986);Davidsonetal.，LVirology61:1226-1239(1987);Zhang"Generation和identificationofrecombinantadenovirusbyliposome—medUtedtransfectionandPCRanalysis"BioTechniques15:868-872(1993))。使用這些病毒作為載體的優(yōu)點是它們散播至其他細胞類型的程度是有限的，雖然它們可以在初始感染的細胞中復(fù)制，但是它們不能形成新的感染性病毒顆粒。重組腺病毒在直M內(nèi)送遞至下列組織時已表現(xiàn)出可獲得#_高的基因轉(zhuǎn)移效率氣道上皮、肝細胞、血管內(nèi)皮、CNS實質(zhì)以及多種其他纟且織位點(Morsy，J.Clin.Invest.92:1580—1586(1993);Kirshenbaum，J.Clin.Invest.92:381—387(1993);Roessler，J.Clin.Invest.92:1085—1092(1993);Moullier,NatureGenetics4:154—159(1993);LaSalle，Science259:988-990(1993);Gomez-Foix，J.Biol.Chem.267:25129—25134(1992);Rich,HumanGeneTherapy4:461—476(1993);Zabner,NatureGenetics6:75-83(1994);Guzman,CirculationResearch73:1201-1207(1993);Bout，HumanGeneTherapy5:3-10(1994);Zabner，Cell75:207-216(1993);Caillaud，Eur.J.Neuroscience5:1287—1291(1993);以及Ragot，J.Gen.Virology74:501—507(1993))。重組腺病毒與野生型或復(fù)制缺陷型腺病毒一樣，通過結(jié)合特異性細胞表面受體而完成基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用而內(nèi)生4匕(Chardonnet和Dales,Virology40:462-477(1970);Brown和Burlingham，J".Virology12:386-396(1973);Svensson和Persson，J.Virology55:442-449(1985);Seth，etal.，J.Virol.51:650-655(1984);Seth，etal.，Mol.Cell.Biol.4:1528-1533(1984);Vargaetal.，J.Virology65:6061-6070(1991);Wickhametal.，Cell73:309-319(1993))。一種優(yōu)選的病毒載體為基于移除了El基因的腺病毒的載體，這些病毒在例如人類293細胞的細胞系中產(chǎn)生。在另一個優(yōu)選的實施方案中，El和E3基因都被^病毒基因組中移除。另一類病毒載體是基于糾目關(guān)病毒(AAV)。這種缺陷型細小病毒是一種優(yōu)選的載體，因為它可以感染許多種細胞類型，并且對人類沒有致病性。AAV型載體可以轉(zhuǎn)運4至5kb的基因，并且已知野生型AAV可以穩(wěn)定地插入到第19染色體上。具有這種特異性位點整合性質(zhì)的載體為優(yōu)選的。這種載體的一種特別優(yōu)選的實施方案是由Avigen，SanFrancisco,CA生產(chǎn)的P4.1C栽體，它可包括單純皰滲病毒胸苷激酶基因、HSV-tk和/或標記物基因，例如編碼綠色熒光蛋白GFP的基因。在病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒中插入的基因經(jīng)常含有包括啟動子和/或增強子以輔助對所需基因產(chǎn)物的表達的控制。啟動子通常為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點相對固定的位置時可以發(fā)揮功能的一個或多個DM序列。"啟動子"包括與RNA聚合酶發(fā)生基本相互作用所需的核心元件和轉(zhuǎn)錄因子，還可包括上游元件和應(yīng)答元件。2.病毒啟動子和增強子控制哺乳動物細胞中的載體轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選啟動子可由各種來源獲得，例如下列病毒的基因組多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒，最優(yōu)選巨細胞病毒；或者來源于異源哺乳動物啟動子例如P肌動蛋白啟動子。SV40病毒的早期和晚期啟動子可以方便地以包括SV40病毒復(fù)制起始位點的限制性片段的形式獲得(Fiersetal.，Nature,273:113(1978))。人類巨細胞病毒的即時早期啟動子可以方便地以HindmE限制性片段的形式獲得(Greenway,PJ.etal.，Gene18:355-360(1982))。當然，來自宿主細胞或相關(guān)物種的啟動子也在此使用。"增強子"通常指的是為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點相對不固定的位置時就可以發(fā)揮功能的DM序列，它可以在轉(zhuǎn)錄單位的5，(Laimins，L.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.78:993(1981))或3,(Lusky，M.L.，etal.，Mol.細胞Bio.3:1108(1983))。此外，增強子可以在內(nèi)含子中(Banerji，J.L.etal.，細胞33:729(1983))，也可以在編碼序列本身之中(Osborne,T.F.,etal.，MoI.細胞Bio.4:1293(1984))。它們的長度通常為10bp至300bp之間，并且以順式方式發(fā)揮作用。增強子的功能是增加鄰近的啟動子的轉(zhuǎn)錄。增強子還經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強子還經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強子經(jīng)常對表達的調(diào)節(jié)有決定性作用。雖然許多來自哺乳動物基因的增強子的序列是已知的(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰島素)，但是通常還是使用來自真核細胞病毒的增強子。優(yōu)選的實例為在復(fù)制起點下游的SV40增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、在復(fù)制起點下游的多瘤病毒增強子和腺病毒增強子。啟動子和/或增強子可以被能觸發(fā)它們功能的光或特異性化學(xué)事件特異性地激活?？梢杂美缢沫h(huán)素和地塞米爭>等試劑來調(diào)節(jié)系統(tǒng)。也有一些方法通過暴露于例如Y輻照的輻照方法或烷化化療藥物來增強病毒栽體的基因表達。優(yōu)選地，啟動子和/或增強子區(qū)域在所有真核細胞類型中都是有活性的。這種類型的一種優(yōu)選的啟動子為CMV啟動子(650個戚基)。其他優(yōu)選的啟動子為SV40啟動子、巨細胞病毒(全長啟動子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LTF。已顯示所有的特異性調(diào)節(jié)元件都可#:克隆和用于構(gòu)建在特異細胞類型例如黑素瘤細胞中選擇性表達的表達載體。膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子已被用于在M來源的細胞中選擇性表達基因。用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或有核細胞)中的表達載體還可包括可以影響mRNA表達的轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列。這些區(qū)域在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中以多腺苷酸化區(qū)段的形式被轉(zhuǎn)錄。3'非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位還包括多腺苷酸化區(qū)域。這一區(qū)域的一個優(yōu)點是它增加了被轉(zhuǎn)錄的單位像邁RNA一樣;f皮加工和轉(zhuǎn)運的可能性。多腺苦酸化信號在表達構(gòu)建體中的鑒定和用途已經(jīng)廣為人知。優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源的多腺普酸化。在轉(zhuǎn)錄單位的一個優(yōu)選實施方案中，多腺苷酸化區(qū)域來自SV40早期多腺香酸化信號，由大約400個g組成。還優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位單獨包括其他標準序列或包括其他標準序列和上述序列，改進構(gòu)建體的表達或穩(wěn)定性。3.標記物載體可包括編碼標記物產(chǎn)物的核酸序列。使用這種標記物產(chǎn)物來確定基因是否被送遞至細胞以及在送遞后是否被表達。優(yōu)選的標記物基因為編碼P-半乳糖苷酶的大腸桿菌lacZ基因和綠色熒光蛋白。在一些實施方案中，標記物可為可選擇的標記物。用于哺乳動物細胞的可選擇標記物的實例為二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素類似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。當這類可選擇的標記物^皮成功地轉(zhuǎn)移至哺乳動物宿主細胞中時，如果將宿主細胞置于篩選壓力下，則被轉(zhuǎn)4匕的哺乳動物宿主細胞可以存活。目前廣泛^:用的有兩類不同的篩選策略。第一類是基于細胞代謝的，使用離開添加培養(yǎng)基就不能生長的突變細胞系。兩個實例為CH0DHFR—細胞和小鼠LTK—細胞。這些細胞在不添加營養(yǎng)物胸苷或次黃嘌呤的情況下就不能生長。由于這些細胞缺乏完整的核苦酸合成途徑中必需的某個基因，因此除非在添加培養(yǎng)基中提供那種沒有的核苷酸，否則細胞就不能存活。另一種補充培養(yǎng)基的方式是將完整的DHFR或TK基因?qū)肴?^目應(yīng)基因的細胞中，由此改變它們的生長需求。未被DHFR或TK基因轉(zhuǎn)化的細胞將不能在非添加培養(yǎng)基上生長。第二類為顯性選擇，它指的是在任何細胞類型中都可使用而不必使用突變細胞系的篩選方案。這些方案通常使用抑制宿主細胞生長的藥物。含有新基因的那些細胞可以表達使細胞具有藥物抗性的蛋白質(zhì)，從而可以在篩選中存活。這類顯性篩選的實例中使用的藥物有新霉素(SouthernP.和Berg，P.，J.Molec.A卯l.Genet.1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan,R.C.和Berg，P.Science209:1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.etal.,Mol.細胞.Biol.5:410-413(1985))。這三個實例使用了真核控制下的細菌基因來分別賦予細胞對于合適的藥物G418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他的還有新霉素類似物G418和嘌呤霉素。E.生物傳感器核糖開關(guān)還公開了生物傳感器核糖開關(guān)。生物傳感器核糖開關(guān)是經(jīng)過基因工程改造的核糖開關(guān)，它們在存在它們的同種觸發(fā)分子時產(chǎn)生可檢出的信號?？捎玫纳飩鞲衅骱颂情_關(guān)可以在觸發(fā)分子達到或超過閾值水平時被觸發(fā)。生物傳感器核糖開關(guān)可被設(shè)計為體內(nèi)應(yīng)用或體外應(yīng)用。例如，報告RNA編碼作為信號的蛋白質(zhì)或參與產(chǎn)生信號的蛋白質(zhì)，與該報告RNA可操作地連接的生物傳感器核糖開關(guān)可在體內(nèi)被用于通過基因工程改造細胞或生物，使其含有編碼核糖開關(guān)/報告RNA的核酸構(gòu)建體。用于體外的生物傳感器核糖開關(guān)的一個實例是包括構(gòu)象依賴性標簽的核糖開關(guān)，由該標簽產(chǎn)生的信號隨核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而變化。優(yōu)選地，這種生物傳感器核糖開關(guān)使用天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。F.報告蛋白和報告肽為評估核糖開關(guān)或生物傳感器核糖開關(guān)的激活，可以使用報告蛋白或報告肽。報告蛋白或報告肽可以由核糖開關(guān)調(diào)節(jié)其表達的RM編碼。實施例中描述了一些特異性報告蛋白的使用。報告蛋白和報告肽的使用已為人所熟知，并可以方便地與核糖開關(guān)一起使用。報告蛋白可為任意可檢出的或產(chǎn)生可檢出信號的蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)或肽的存在可以用常規(guī)技術(shù)(例如放射免疫測定、放射性標記、免疫測定、酶活性測定、吸附、焚光、發(fā)光和蛋白質(zhì)印跡)檢出。更優(yōu)選地，即使在報告蛋白的水平比較低的情況下，仍然可以使用常規(guī)技術(shù)對其水平定量。可用的報告蛋白包括熒光素酶、綠色熒光蛋白以及它們的衍生物，例如北美縈火蟲(i%W//7M的螢火蟲熒光素酶(FL)和海參(ie/7/7/sr^y/anz")的海參熒光素酶(RL)。G.構(gòu)象依賴性標簽構(gòu)象依賴性標簽指的是具有下述性質(zhì)的所有標簽在標簽所連接的分子或化合物(例如核糖開關(guān))的形式或構(gòu)象發(fā)生改變的基礎(chǔ)上標簽可以產(chǎn)生熒光強度或波長的變化。以探針和引物為背景使用的構(gòu)象依賴性標簽的實例包括分子信標、Amplifluors、FRET探針、可切割的FRET探針、TaqMan探針、蝎形引物(scorpionprimer)、熒光三聚體寡核苷酸(fluorescenttriplexoligos)包括但不限于三聚體分子信標或三聚體FRET探針、熒光水溶性偶聯(lián)聚合物、PNA探針和QPNA探針。這種標簽具體而言它們的功能原理可適于與核糖開關(guān)一起使用。一些類型的構(gòu)象依賴性標簽綜述于SchweitzerandKingsmore，Curr.Opin.Biotech.12:21-27(2001)。莖淬滅標簽是構(gòu)象依賴性標簽的一種形式，它是位于核酸上的焚光標簽，這樣當莖結(jié)構(gòu)形成時淬滅部分會接近焚光標簽以使得標簽發(fā)出的熒光被淬滅。當莖結(jié)構(gòu)被破壞時(例如當含有標簽的核糖開關(guān)被激活時)，淬滅部分就不再接近熒光標簽，熒光就會增強。這種效應(yīng)的實例可見于分子信標、熒光三聚體寡核苷酸、三聚體分子信標、三聚體FRET探針和QPNA探針中，它們的操作原理也可適于與核糖開關(guān)一起使用。莖激活標簽是構(gòu)象依賴性標簽的一種形式，它是通過莖結(jié)構(gòu)的形成可以增強或改變萸光的標簽或標簽對。莖激活標簽可包括受體熒光標簽和供體部分，當受體和供體相互接近時(當包括標簽的核酸鏈形成莖結(jié)構(gòu)時)，熒光共振能量由M相受體的轉(zhuǎn)移會使受體發(fā)熒光。莖激活標簽通常為位于核酸分子(例如核糖開關(guān))上的標簽對，這樣當核酸分子中形成莖結(jié)構(gòu)時受體和供體就會相互接近。如果莖激活標簽的供體部分本身就是熒光標簽，那么當它不與受體接近時(也就是未形成莖結(jié)構(gòu)時)它就會以熒光的形式釋》文能量(通常這種熒光的波長與受體熒光的波長不同)。當莖結(jié)構(gòu)形成時，總體的效果是供體熒光減少和受體熒光增加。FRET探4十為使用莖'激活標簽的一個實例，它的操作原理也可適于與核糖開關(guān)一起使用。H.檢測標簽為了對核糖開關(guān)的激活、失活或阻斷進4亍檢測和量化，或?qū)颂情_關(guān)的激活、失活或阻斷后產(chǎn)生的核酸或蛋白質(zhì)的表達進行檢測和量化，可以在檢測探針或者檢測分子中引入檢測標簽，或者在表達的核酸或蛋白質(zhì)中引入檢測標簽。本文中所述的檢測標簽為可以與核酸或蛋白質(zhì)直接或間接地相連接、并由此產(chǎn)生可以直接或間接地測量或檢測的信號的任何分子。許多這種標簽均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。可用于所7>開方法的合適的檢測標簽的實例為放射性同位素、熒光分子、磷光分子、酶、抗體和配體。合適的熒光標簽的實例包括異硫氰酸熒光素(FITC)、5，6-羧甲基熒光素、德克薩斯紅(Texasred)、硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹酰氯、羅丹明、氨基曱^^香豆素(AMCA)、曙紅、藻紅、B0DIPY、CascadeBlue、OregonGreen、芘、麗絲胺(lissamine)、加氧雜蒽(xanthenes)、吖啶、藻紅蛋白、鑭系金屬離子的大環(huán)螯合物例如量子染料TM、熒光能量染料例如噻哇橙乙啡啶異源二聚體、以及花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。其他特異性熒光標簽的實例包括3-羥基芘5，8，10-三磺酸、5-羥色胺(5-HT)、酸性品紅、茜素*酮、茜素紅、別藻藍蛋白、^J^香豆素、蒽基硬脂酸、Astrazon亮紅4G、Astrazon橙R、Astrazon紅6B、Astrazon黃7GLL、阿的平(Auramine)、Aurophosphine、AurophosphineG、BA09(Bisaminophenyloxadiazole，雙#^苯基噁二哇)、BCECF、硫酸小檗堿、雙苯酰胺、BlancophorFFG溶液、BlancophorSV、BodipyFl、亮>#基黃素FF(BrilliantSulphoflavinFF)、CalcienBlue、CalciumGreen、CalcofluorRW溶液、CalcofluorWhite、CalcophorWhiteABT溶液、CalcophorWhite標準溶液、Carbostyryl、CascadeYellow、兒茶酚胺、奎納克林(Chinacrine)、科里膦0、香豆素-鬼筆環(huán)肽、CY3.18、CY5.18、CY7、Dans(l-二甲基絲-萘一5—磺酸)、Dansa(二絲萘基磺酸)、丹酰NH-CH3，二M苯基噁二唑(DA0)、二甲基^J^5-磺酸、二吡咯亞甲基二氟化硼、聯(lián)苯亮吖啶黃7GFF、多巴胺、藻紅ITC、吖梵橙(Euchrysin)、FIF(甲醛誘導(dǎo)熒光)、Flazo0range、Fluo3、熒光胺、Fura-2、Genacryl亮紅B、Genacryl亮黃10GF、Genacryl粉紅3G、Genacryl黃5GF、GloxalicAcid、粒狀藍(GranularBlue)、血p卜啉(Haematoporphyrin)、Indo-l、IntrawhiteCf液體、LeucophorPAF、LeucophorSF、LeucophorWS、麗絲胺羅丹明B200(RD200)、Lucifer黃CH、Lucifer黃VS、蘇丹紅(MagdalaRed)、MarinaBlue、Maxilon亮黃素10GFF、Maxilon亮黃素8GFF、MPS(MethylGreenPyronineStilbene,曱基綠焦寧均二苯乙烯)、光神霉素、NBD胺、硝基苯并噁二唑(Nitrobenzoxadidole)、去曱腎上腺素、核堅牢紅(NuclearFastRed)、核黃(NuclearYellow)、Nylosan亮黃素E8G、噁二峻、Pacific藍、堿小生副品紅(Feulgen)PhorwiteAR溶液、PhorwiteBKL、PhorwiteRev、PhorwiteRPA、膦3R、酞^Phthalocyanine)、藻紅蛋白R、PolyazaindacenePontochromeBlueBlack、吟啉、Primuline、普施安黃(ProcionYellow)、焦寧(Pyronine)、焦寧B、Pyrozal亮黃素7GF、芥奎吖因(QuinacrineMustard)、羅丹明123、羅丹明5GLD、羅丹明6G、羅丹明B、羅丹明B200、羅丹明BExtra、羅丹明BB、羅丹明BG、羅丹明WT、5-羥色胺、Sevron亮紅2B、Sevron亮紅4G、Sevron亮紅B、Sevron橙、Sevron黃L、SITS(Primuline)、SITS(均二苯乙烯異石械酸，StilbeneIsothiosulphonicacid)、均二苯乙烯、Snarf1、^t基羅丹明BCanC、碌基羅丹明GExtra、四環(huán)素、蓬溱紅R、v琉黃素S、硫黃素TCN、^琉黃素5、Thiolyte、Thiozol0range、TinopolCBS、TrueBlue、Ultralite、UranineB、UvitexSFC、XyleneOrange和XRITC?？捎玫臒晒鈽撕灋闊晒馑?5-氛基突光素-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、羅丹明(5，6-四曱基羅丹明)和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。這些熒光染料的最大吸收和發(fā)射波長分別為FITC(490nm;520nm)、Cy3(554nm;568nm)、Cy3.5(581nm;588nm)、Cy5(652mn;672nm)、Cy5.5(682nm;703n邁)、Cy7(755nm;778nm)，這使得它們可以同時被檢測。熒光素染料的其他實例包括6-羧基熒光素(6-FAM)、2，，4，，1，4，—四氯熒光素(TET)、2，，4，，5，，7，，1，4-六氯熒光素(HEX)、2，，7，-二甲錄-4，，5，-二氯-6-氛基羅丹明(J0E)、2，-氯-5，-氟-7，，8，-稠苯-l,4-二氯-6-^J^熒光素(NED)和2，-氯-7，-苯基-1，4-二氯-6-氣基熒光素(VIC)。熒光標簽可由各種來源商購獲得，包括AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ;MolecularProbes,Eugene，OR;和Research0rganics，Cleveland,Ohio。所關(guān)注的其他標簽包括那些僅當它們所連接的探針與靶分子特異性結(jié)合時產(chǎn)生信號的標簽，其中這類標簽包括Tyagi&Kramer,NatureBiotechnology(1996)14:303和EP0070685Bl中所述的"分子信標"。所關(guān)注的其他標簽包括美國專利No.5,563037、國際申請WO97/17471和W097/17076中所述的那些標簽。帶標簽的核苷酸是檢測標簽的一種可用形式，可以在合成過程中直接引入,錄達的核酸中?？梢灾苯右牒怂嶂械臋z測標簽的實例包括核苷酸類似物例如BrdUrd(5-溴脫氧尿苦，HoyandSchinike，MutationResearch290:217-230(1993))、^J^烯丙基脫氧鳥苷(Henegariuetal:，NatureBiotechnology18:345-348(2000))、5-曱基胞嘧咬(Sanoetal.，Biochim.Biophys.Acta951:157-165(1988))、溴^fe苷(Wansicketal，LCellBiology122:283-293(1993))和經(jīng)生物素修飾的核苷酸(Langeretal，Proc.Natl.Acad.Sd.USA78:6633(1981))或經(jīng)過例如地高辛抗原(digoxygenin)的半抗原修飾的核苦酸(Kerkhof，Anal.Biochem.205:359-364(1992))。合適的帶熒光標簽核苷酸有異疏氰酸熒光素-dUTP、花青-3-dUTP和花青-5-dUTP(Yuetal，NucleicAcidsRes.,22:3226-3232(1994))。對于DNA而言優(yōu)選的核苷酸類似物檢測標簽為BrdUrd(溴脫氧尿苷、BrdUrd、BrdU、B臓，Sigma-AldrichCo)。其他用于將檢測標簽引入DNA的可用的核苷酸類似物為AA-dUTP(氨基烯丙基脫氧尿苷三磷酸，Sigma-AldrichCo.)和5-甲基-dCTP(RocheMolecularBiochemicals)。一種用于將檢測標簽引入RM的可用的核苷酸類似物為生物素-16-UTP(生物素-16-尿苷-5，-三磷酸，RocheMolecularBiochemicals)?？蓪晒馑亍y3和Cy5連接至dUTP上用于直接標記。Cy3.5和Cy7可以以抗生物素蛋白或抗地高辛抗原綴合物的形式用于帶有生物素或地高辛抗原標簽的探針的次級檢測。被S1入核酸的例如生物素的檢測標簽，隨后可以使用本領(lǐng)域公知的敏感方法進行檢測。例如，使用抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物(Tropix，Inc.)可以檢測生物素，這種綴合物可以與生物素結(jié)合并隨后通過適當?shù)孜锏幕瘜W(xué)發(fā)光進行檢測(例如，化學(xué)發(fā)光底物CSPD:二鈉，3-(4-甲氧基螺-[1，2,-二環(huán)氧丙烷-3-2，-(5，-氯)三環(huán)[3.3.1.13'7]癸烷]-4-基)苯基磷酸(disodium,3-(4-methoxyspiro-[1，2，-dioxetane-3-2，一(5，一chloro)tricyclo[3.3.1.I3'7]decane]-4-yl)phenylphosphate);Tropix，Inc.)。標簽也可以是可檢測的酶，例如堿性磷酸酶、大豆過氧化物酶、辣根過氧化物酶和聚合酶，檢測例如使用化學(xué)信號放大法或使用能發(fā)光的酶的底物(例如化學(xué)發(fā)光的1，2-二環(huán)氧丙烷底物)或能產(chǎn)生熒光信號的酶的底物。結(jié)合了兩個或多個上述檢測標簽的分子也可被認為是檢測標簽。任何已知的檢測標簽都可與本發(fā)明公開的探針、標簽、分子和方法一起使用，或蛋白質(zhì)。用于檢測和測量檢測標簽產(chǎn)生的信號;方法也^^領(lǐng)域i^人員已知的。例如，可以通過閃爍計數(shù)或直接顯示法來檢測放射性同位素；可用熒光分光光度計來檢測熒光分子；可用分光光度計或直接照相的方法檢測磷光分子；可通過直接檢測或可視化SI^反應(yīng)的產(chǎn)物來檢測酶?？赏ㄟ^檢測與抗體偶聯(lián)的次級檢測標簽來檢測抗體。本文所述的檢測分子為與偶聯(lián)了一個或多個檢測標簽的待測化合物或組合物相互作用的分子。I.序列相似性應(yīng)當理解的是，本文所使用的術(shù)語同源性和同一性的含義是相同的，都是指相似性。因此，例如，如果在兩個序列(例如非天然序列)之間使用同源性這一詞語，應(yīng)當理解這并不一定是指著兩個序列之間在進化上相關(guān)，而是著眼于它們的核酸序列之間的相似性或關(guān)聯(lián)。為了測量序列的相似性，確定兩個進化上相關(guān)的分子之間相似性的很多方法都可以常規(guī)地應(yīng)用于兩個或多個核酸或蛋白質(zhì)，而無需考慮它們在進化上是否相關(guān)?？傮w而言，應(yīng)當理解的是，為了定義本文所公開的核糖開關(guān)、適體、表達平臺、基因和蛋白質(zhì)的已知變異體和衍生物或可能出現(xiàn)的種類，一種方法是通過變異體和衍生物與特定已知序列的同源性方面來定義。本文/>在本文其他部分也有所討論?？傮w而言，本文所公開的核糖開關(guān)、適體、表達平臺、基因和蛋白質(zhì)的變異體與指定序列或天然序列有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76°/、77%、78%、79%、亂81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98°/或99%的同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易明白如何測定兩種蛋白質(zhì)或例如基因的核酸之間的同源性。例如，可以在序列比對并4吏同源性達到最高水平后計算同源性。計算同源性的另一種方法可以通過公開的算法進行?？蒷吏用下列算法進4亍用于比較的序列優(yōu)4t比對Anotherwayofcalculatinghomologycanbeperformedbypublishedalgorithms.Optimalalignmentof序歹寸forcomparisoncanbeconductedbythelocalhomologyalgorithmofSmithandWatermanAdv.Appl.Math.2:482(1981)中所述的局部同源性算法;NeedlemanandWunsch，J.MoLBiol.48:443(1970)中所述的同源性比對算法；PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)中所述的相似性檢索方法；或者這些算法的計算機實現(xiàn)形式(WisconsinGenetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI);或者通過審查的方式進行。通過例如Zuker，M.Science244:48-52，1989;Jaegeretal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7706-7710，1989;Jaegeretal.MethodsEnzymol.183:281-306，1989中公開的算法，可以獲得核酸的相同類型的同源性，上述文獻中至少與核酸比對有關(guān)的資料以援引的方式納入本文。應(yīng)當理解的是，通?？梢允褂萌魏畏椒?，而在某種情況下這些不同的方法所得到的不同結(jié)果可能不同，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，如果使用上述方法中的至少一種發(fā)現(xiàn)了同一性，則該序列可被稱為具有指定的同一性。例如，如本文所使用的，所述的具有與另一序列相比的特定百分比同源性的序列，是指具有由上述任意一種或多種計算方法所計算出的所述同源性的序列。例如，如果使用Zuker計算方法，第一序列被計算為具有與第二序列相比的80%的同源性，即使按照其他任何計算方法計算出該第一序列與第二序列相比都不具有80%的同源性，那么，如本文所定義的，第一序列也仍具有與第二序列相比的80%的同源性。另一個實例，如果使用Zuker計算方法和Pearson和Lipman計算方法，第一序列被計算為具有與第二序列相比的80%的同源性，即使通過Smith和Waterman計算方法、Needleman和Wunsch計算方法、Jaeger計算方法或任意其他計算方法計算，第一序列不具有與第二序列相比的80°/。的同源性，那么，如本文所定義的，第一序列也仍具有與笫二序列相比的80°/的同源性。再一個實例，如果4吏用每一種計算方法，第一序列都-皮計算為具有與第二序列相比的80%的同源性(盡管實際上不同的計算方法常得到不同的計算的同源性百分比)，那么如本文所定義的，第一序列具有與第二序列相比的80%的同源性。J.雜交和選擇性雜交術(shù)語雜交通常意為至少兩種核酸分子例如引物或探針與核糖開關(guān)或基因間的序列驅(qū)動的相互作用。序列驅(qū)動的相互作用意為以核苷酸特異性例如:與c相互作;或者《it相互作用;i序列驅(qū)動的相互作用。通常序列驅(qū)動的相互作用發(fā)生于核苦酸的沃森-克里克面或Hoogsteen面。兩種核酸的雜交受到本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的許多條件和參數(shù)的影響。例如鹽濃度、pH和反應(yīng)溫度均會影響兩種核酸分子是否會雜交。兩種核酸分子間的選擇性雜交的*為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，在一些實施方案中選擇性雜交務(wù)降可被定義為嚴格雜交的條件。例如，雜交的嚴格性是通過雜交和/或洗滌步驟的溫度和鹽濃度共同控制的。例如實現(xiàn)選擇性雜交的雜交條件可包括在比Tm(解鏈溫度，在該溫度下一半的分子與其雜交配對的另一部分解離)低大約12-25'C的溫度下，在高離子強度溶液(6xSSC或6xSSPE)中雜交，然后在所選的溫度和鹽濃度的組合的條件下洗滌，此時洗滌溫度為比Tm低大約5'C至20'C。在預(yù)實驗中，可根據(jù)經(jīng)驗容易地確定溫度和鹽濃度條件，在該實驗中使固定在濾膜上的參照DNA的樣品與帶標記的目的核酸雜交，然后在不同嚴襠v變的^f下洗滌。對于DNA-RNA雜交和RM-RM雜交而言雜交溫度通常較高一些。可使用如上所述的或本領(lǐng)域已知的(Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989;Kunkeletal.MethodsEnzymol.1987:154:367，1987,上述文獻中至少與核酸雜交相關(guān)的資料通過援引的方式納入本文)條件以達到嚴格度。優(yōu)選的DNA:DNA雜交的嚴*件可以是在約68'C(水溶液中)，在6xSSC或6xSSPE中雜交，之后在68'C洗滌。如果需要，當所需的互補程度降低時，雜交和洗滌的嚴格性可作相應(yīng)減小，并且還4^據(jù)尋找可變性的任何區(qū)域中的G-C或A-T的豐富程度而定。同樣，如果需要，當所需的同源性增大時，雜交和洗滌的嚴格性可作相應(yīng)增加，并且還根據(jù)需要高同源性的任何區(qū)域中的G-C或A-T的豐富程度而定，所有這些均為本領(lǐng)域已知。另一種定義選擇性雜交的方法是通過著眼于一種核酸與其他核酸結(jié)合的量(百分比)。例如，在一些實施方案中選擇性雜交的條件可以為至少約60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、亂81%、82%、83%、84%、85%、86%、87°/。、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的限量核酸與非限量核酸結(jié)合時的條件。通常非限量核酸要過量例如10或100或1000倍。這類測定可在限量核酸和非限量核酸均比它們的kd低例如IO倍或100倍或1000倍時進4亍，或者只是一種核酸分子為比它的h低例如IO倍或IOO倍或IOOO倍時進行，或兩種核酸分子之一或兩者均在kd之上時的條件下進行。另一種定義選擇性雜交的方法是通過著眼于核酸的百分比，所述核酸是在需要雜交以促進所需的酶操作的條件下得到酶操作的核酸。例如，在一些實施方案中選擇性雜交條件可以是至少約60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99/、100%的核酸在促進酶操作的條件下進行酶操作時的條件，例如，如果酶操作是DM延伸，那么選擇性雜交條件可以是至少約60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99°/。、100y。的核酸分子^U^伸時的務(wù)降。優(yōu)選的條件還包括廠商所建議的或本領(lǐng)域所指出的適于酶進行操作的條件。正如同源性一樣，應(yīng)當理解本文公開的用于確定兩種核酸分子間的雜交水平的方法有許多種。應(yīng)當理解這些方法和條件可提供不同百分比的兩種核酸分子間的雜交，但是除非另外指明，否則滿足任何方法的^都是足夠的。例如，如果需要80%雜交并且只要在這些方法的任意一種中所要求的Wt內(nèi)發(fā)生雜交，就認為它在本文得到了公開。應(yīng)當理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，如果組合物或方法滿足用于單獨或聯(lián)合確定雜交的這些標準的任意一條，那么它就是本文所公開的組合物或K.核酸本文公開了基于核酸的多種分子，包括例如核糖開關(guān)、適體以及編碼核糖開關(guān)和適體的核酸。所公開的核酸由例如核苦酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物構(gòu)成。本文討論了這些分子及其他分子的非窮盡性實例。應(yīng)當理解，例如當栽體在細胞中表達時，表達的mRM通常由A、C、G和U組成。同樣，應(yīng)當理解，如果核酸分子通過例如外源性送遞被導(dǎo)入細胞或細胞環(huán)境中，那么核酸分子由核苷酸類似物構(gòu)成是有利的，這樣可減少核酸分子在細胞環(huán)境中的降解。只要保留了它們相關(guān)的功能，核糖開關(guān)、適體、表達平臺以及任何其他寡核香酸和核酸都可以由經(jīng)修飾的核苷酸(核苷酸類似物)構(gòu)成或含有經(jīng)修飾的核苷酸(核苷酸類似物)。很多經(jīng)修飾的核苷酸是已知的，并可被用于寡核苷酸和核酸之中。核苷酸類似物是含有對堿基、糖或磷酸部分的一些類型的修飾的核苷酸。對堿基部分的修飾可以包括對A、C、G和T/U的天然性或合成性修飾，以及使用不同的噤呤或嘧咬堿，例如尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌呤-9-基。經(jīng)修飾的堿基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C);5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃噤呤；2-氨基腺噤呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-曱基或其他烷基衍生物；腺噤呤和鳥噤呤的2-丙基或其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧咬和2-辟b胞嘧咬；5-囟素尿嘧啶和5-卣素胞嘧咬；5-丙炔基尿嘧咬和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶和6-偶氮基胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；腺噪呤和鳥噤呤的8-卣素、8-氨基、8-疏代、8-硫代烷基、8-羥基以及其他8-取代物；尿嘧啶和胞嘧啶的5-鹵素特別是5-溴、5-三氟曱基和其他的5-取代物；7-甲基鳥嘌呤和7-曱基腺噤呤；8-氮雜鳥噤呤和8-氮雜腺噪呤；7-脫氮鳥噤呤(7-deazaguanine)和7-脫氮腺噪呤和3-脫氮鳥噤呤和3-脫氮腺噤呤。其他的堿基修飾物可見于例如美國專利No.3，687，808、Englischetal.，AngewandteChemie，InternationalEdition,1991，30，613、Sanghvi，Y.S.，Chapter15，AntisenseResearchandApplications,pages289-302、Crooke，S.T.andLebleu，B.ed.，CRCPress,1993。某些核苷酸類似物例如5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧咬；和N-2、N-6和0-6取代的噤呤包括2-氨基丙基腺嘌呤；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧咬。5-曱基胞嘧啶可以增加雙鏈體形成的穩(wěn)定性。其他經(jīng)修飾的g是那些有通用堿基功能的堿基。通用堿基包括3-賄基吡咯和5-硝基吲哚。通用戚基可取代正常的堿基，但在威基配對上沒有偏好性。也就是說通用威基可以與其他任何堿基進行威基配對。g修飾經(jīng)?？膳c例如糖修飾結(jié)合使用，例如2，-0-曱氡基乙基，以獲得獨特的屬性例如提高的雙鏈體穩(wěn)定性。有多個美國專利具體描述了;f艮多堿基修飾，例如4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5，367，066、5,432,272、5，457，187、5，459，255、5,484,908、5，502，177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5，596，091、5,614,617和5,681,941。以上各專利文獻的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻中關(guān)于M修飾及其合成、用途和將其導(dǎo)入寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。核苷酸類似物還可包括糖部分的修飾。對糖部分的修飾可包括核糖和脫氧核糖的天然性修飾及合成性修飾。糖修飾包括但不限于在2，位置的下列修飾OH;F;O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或0-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的Cl至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。2，糖修飾還包括但不限于-0[(CH2)n0]fflCH3、-0(CH2)nOCH3、-0(CH2)nNH2、-0(CH2)nCH3、-0線)n-0仰2和-0(CH2)nON[(CH2)nCH3)〗2,其中n和m在1至大約10之間。在2，位置的其他修飾包括但不限于C1至C10低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、0CN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、M烷基M、聚烷基M、取代的曱硅烷基、RNA切割基團、報告基團、插入劑、可提高寡核苷酸藥物動力學(xué)性質(zhì)的基團或可提高寡核香酸藥物動力學(xué)性質(zhì)的基團和其他具有類似性質(zhì)的基團。還可以在糖的其他位置進行類似的修飾，特別是在3，端核苷酸上的糖3的3，位置，或者在5，核苷酸的2，-5，連接的寡核苷酸和5，位置。經(jīng)修飾的糖可含有那些在環(huán)氧橋位置用例如CH2和S進行的修飾。核苷酸糖類似物還可具有糖模擬物，例如用環(huán)丁基部分代替五碳呋喃糖。有許多美國專利都教導(dǎo)了這類經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)的制備，例如4，981，957、5，118，800、5，319，080、5，359，044、5，393，878、5，446，137、5,466,786、5,514,785、5，519，134、5，567，811、5,576,427、5，591，722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5，658，873、5，670,633和5，700，920，以上各專利文獻的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻中關(guān)于經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)及其合成、用途和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。核苷酸類似物可以在磷酸部分加以修飾。經(jīng)修飾的磷酸部分包括但不限于經(jīng)過修飾而使得在兩個核苷酸之間的連接部分含有下列結(jié)構(gòu)的磷酸部分，所述結(jié)構(gòu)包括磷硫酰；手性磷疏酰；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨烷基磷酸三酯；磷酸甲酯和磷酸與其他烷基醇形成的酯，包括磷酸3，-乙烯酯和手性磷酸酯；磷化氫；磷酸酯，包括3，-氨基M磷酸酯(3，-aminophosphoramidate)和氨烷基^^礴酸酉旨(aminoalkylphosphoramidate)、疏代氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、石危代烷基磷酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫代烷基磷酸三酉旨(thionoalkylphosphotriesters)和硼烷褲酸酉旨(boranophosphates)。應(yīng)當理解的是，在兩個核苷酸之間的這些磷酸連接或經(jīng)修飾的鱗酸連接可以通過3，-5，連接或2，-5，連接，連接可以包括極性的倒轉(zhuǎn)，例如3，-5，至5，-3，或者2，-5，至5，-2'。還包括各種鹽形式、混合鹽形式和游離酸形式。許多美國專利教導(dǎo)了如何制備和使用含有經(jīng)修飾磷酸的核苷酸，包括但不限于3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5，264，423、5,276,019、5,278,302、5，286，717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050,以上各專利文獻的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻中關(guān)于經(jīng)修飾的磷酸及其合成、用途和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。應(yīng)當理解的是，核苷酸類似物僅需要包括一種修飾，但是也可以在一個部分或幾個不同部分中包括多種修飾。核苷酸替代物為與核苷酸具有類似功能特性但不含有磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替4義物分子可以以Watson-Crick方式或Hoogsteen方式識別互補性核酸并與互補性核酸雜交(堿基配對)，但是它們通過不是核酸的部分連接起來。核普酸替代物在與合適的^fe酸相互作用時能夠形成雙螺旋形結(jié)構(gòu)。物。核苷酸替代物不包括標準的磷原子。磷酸的替代物可為例如短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接物、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苦間連接物、或一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接物。這些連接物可包括具有下列結(jié)構(gòu)的連接物嗎啉代連接物(形成核苷的糖部分的一部分)；硅氧烷骨架；碌u化物、亞砜和砜骨架；甲?；?formacetyl)和辟^甲?；?thioformacetyl)骨架；亞曱基曱?；褪＜柞；羌?；含烯烴骨架；M磺酸鹽骨架；亞甲基亞胺基和亞曱基肼基骨架；磺酸和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其他帶有混合的N、0、S和CH2組成部分的連接物。許多美國專利公開了如何制備和使用這些種類的磷酸替換物，包括但不限于5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5，216，141、5,235,033、5,264,562、5，264，564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5，489，677、5,541,307、5，561，225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5，608，046、5,610,289、5,618,704、5，623，070、5，663，312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，以上各專利文獻的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻中關(guān)于磷酸替換物及其合成、用途和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。應(yīng)當理解的是，在核苷酸替代物中糖部分和磷酸部分都可以被例如酰胺型連接物(氨基乙基甘氨酸)(PNA)所替換。美國專利5,539,082、5，714,331和5,719，262教導(dǎo)了如何制備和使用PNA分子，上述文獻的每一篇都以援引的方式納入本文。(還可參見NielsenefaA,5t/e/ce254:1497-1500(1991))。寡核苷酸和核酸可以包括核苷酸，并可以由不同類型或相同類型的核苷酸構(gòu)成。例如，在寡核苷酸中，一個或多個核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-曱基核糖核香酸或核糖核苷酸和2，-0-曱基核糖核苦酸的混合物；大約10%至約50%的核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-O-曱基核糖核苷酸或核糖核普酸和2，-O-曱基核糖核苦酸的混合物；大約50%或50%以上的核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2，-O-曱基核糖核苷酸的混合物；或者全部核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-曱基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2，-0-甲基核糖核苷酸的混合物。這類寡核苷酸和核酸可被稱為嵌合核苷酸和嵌合核酸。L.固體支持物固體支持物為固態(tài)基質(zhì)或支持物，分子(例如觸發(fā)分子)和核糖開關(guān)(或其他由所公開的方法產(chǎn)生的或在所公開的方法中使用的組件)可以與支持物相連接。核糖開關(guān)和其他分子可以直接或間接地與支持物相連接。例如，分析物(例如觸發(fā)分子，待測化合物)可以結(jié)合到固體支持物表面或與固定在固體支持物上的捕獲試劑(例如結(jié)合分析物的化合物或分子)相連接。作為另一個實例，核糖開關(guān)可以結(jié)合到固體支持物表面或與固定在固體支持物上的探針相連接。多個核糖開關(guān)、探針或其他分子以陣列、網(wǎng)格或其他組織形式連接到固體支持物上就構(gòu)成了陣列?？捎糜诠腆w支持物的固態(tài)基質(zhì)可以包括可以與組件直接或間接連接的任何固體材料。這包括下述材料，例如丙烯酰胺、瓊脂糖、纖維素、硝酸纖維素、玻璃、金、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧化乙烯、聚硅酸鹽、聚碳酸酯、特氟隆(聚四氟乙烯樹脂)，碳氟化合物、尼龍、硅橡膠、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、官能化硅烷、聚丙基延胡索酸鹽(polypropylfumerate)、膠原、糖胺聚糖和聚氨基酸。固態(tài)基質(zhì)可為任何可用的形式，包括薄膜、膜、瓶、盤、纖維、編織纖維、成型聚合物、顆粒、微球、微顆?；蛩鼈兊慕M合。固態(tài)基質(zhì)和固體支持物可為有孔的和無孔的。芯片是一小片長方形或正方形的材料。優(yōu)選的固態(tài)基質(zhì)的形式為薄膜、孩史球或芯片。一種可用于固態(tài)基質(zhì)的形式是微量滴定板。在一些實施方案中，可以使用多孔玻璃板。陣列可包括多個固定于固體支持物的確定位置或預(yù)定位置的核糖開關(guān)、觸發(fā)分子、其他分子、化合物或探針。固體支持物上的每個預(yù)定位置通常具有一種類型的組件(即在該位置的所有組件都是相同的)?；蛘?，在固體支持物上的同一預(yù)定位置可以固定化多種類型的組件。每一位置可以具有給定組件的多個拷貝。在固體支持物上的不同組件的空間隔離使得可以進4亍分別的檢測和識別。固體支持物為一個單獨的單位或結(jié)構(gòu)雖然是有用的，但不是必需的。一系列的核糖開關(guān)、觸發(fā)分子、其他分子、化合物和/或探針可以分布于4壬意數(shù)目的固體支持物上。例如，一種極端的情況是每一個組件可被固定于分離的反應(yīng)管或容器中，或在分離的微球或微顆粒上。將寡核苷酸固定化于固態(tài)基質(zhì)的方法已廣為人知。可使用已知的偶聯(lián)方法將包括定位探針(addressprobe)和檢測探針的寡核苷酸偶聯(lián)至基質(zhì)上。例如，合適的固定方法描述于Peaseetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(11):5022-5026(1994)和Khrapkoetal.，MolBiol(Mosk)(USSR)25:718-730(1991)。一種將3，-胺寡核苷酸固定于酪蛋白包被的玻片上的方法描述于Stimpsonetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6379-6383(1995)。一種將寡核苷酸附著于固態(tài)基質(zhì)上的可用的方法描述于Guoeta1，NucleicAcidsRes.22:5456-5465(1994)。固定于固體支持物上的每一組件(例如，核糖開關(guān)、觸發(fā)分子或其他分子)可以位于固體支持物的不同預(yù)定區(qū)域。不同的位置可以是不同的反應(yīng)室。每一不同的預(yù)定區(qū)域可以與其他不同的預(yù)定區(qū)域在物理上彼此分離。固體支持物上的不同預(yù)定區(qū)域之間的距離可以是固定的，也可以是可變的。例如，在陣列中每一組件可以彼此之間以固定距離排列，而與微斜目連接的組件就不會有固定的空間關(guān)系。特別地，多個固體支持物單位(例如多個微球)的使用方式會導(dǎo)致不同的距離。組件可以以任何密度連接于或固定于固體支持物上。組件固定于固體支持物上的密度可以超過每立方厘米400個不同組件。組件的陣列可以有任何數(shù)目的組件。例如，陣列可以具有至少l，OOO個固定于固體支持物的不同組件、至少10，000個固定于固體支持物的不同組件、至少100,000個固定于固體支持物的不同組件或至少1，000，000個固定于固體支持物的不同組件.M.試劑盒上文所述的材料和其他材料可以以任意合適的組合被包裝在一起，作為用于進行或輔助進行所公開方法的試劑盒。如果給定試劑M設(shè)計和調(diào)整為在所公開的方法中一起使用將是有用的。例如公開了用于檢測化合物的試劑盒，該試劑盒包括一種或多種生物傳感器核糖開關(guān)。該試劑盒還可包括檢測核糖開關(guān)的激活的試劑和標簽。N.混合物公開了通過實行或準備實行所公開方法而形成的混合物。例如，公開了包括核糖開關(guān)和觸發(fā)分子的混合物。不論何時，只要方法包括使組合物或組件或試劑混合或相接觸，實行該方法就會產(chǎn)生多種不同的混合物。例如，如果方法包括3個混合步驟，如果各步驟分別進行，則在上述步驟的每一步之后都會形成一種特有的混合物。此外，不論各步驟如何進行，在所有步驟完成之后也會形成一種混合物。本發(fā)明的公開內(nèi)容考慮了由實行所/>開方法所獲得的這些混合物，以及含有例如本文所公開的試劑、組合物或組件的混合物。0.系統(tǒng)公開了用于實行或輔助實行所公開方法的系統(tǒng)。系統(tǒng)通常包括制造的物體的組合例如結(jié)構(gòu)、機械、裝置等，以及組合物、化合物、材料等。這些組合為已公開的或從公開考慮的內(nèi)容可以顯而易見的。例如，公開了和考慮了包括生物傳感器核糖開關(guān)、固體支持物和信號讀取裝置的系統(tǒng)。p.數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和計算機控制公開了所公開方法中使用的、由所公開方法產(chǎn)生的或從所公開方法中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)通?？蔀樵诮M合物或介質(zhì)中采集、編組、儲存和/或體現(xiàn)的任何形式的數(shù)據(jù)、信息和/或?qū)ο?。以例如RAM或存儲磁盤的電子形式儲存的核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)和激活測量結(jié)果就是一種類型的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。所公開的方法或其任意部分或由該方法制備的制品，都可以通過計算機控制來進行控制、管理或輔助。這類計算機控制可以通過計算機控制過程或方法來實現(xiàn)，可以使用和/或產(chǎn)生數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，并可以使用計算機程序。這類計算機控制、計算機控制的過程、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和計算枳4呈序都被考慮到并應(yīng)理解為在本文中被/>開。方法公開了用于激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的方法。這類方法可包括例如使核糖開關(guān)和可激活、失活或阻斷該核糖開關(guān)的化合物或觸發(fā)分子相接觸。核糖開關(guān)通過觸發(fā)分子的結(jié)合或移除來發(fā)揮控制基因表達的功能?；衔锟捎糜诩せ睢⑹Щ罨蜃钄嗪颂情_關(guān)。核糖開關(guān)的觸發(fā)分子(以及其他的、激活化合物)可被用于激活核糖開關(guān)。通?？墒褂糜|發(fā)分子以外的化合物來失活或阻斷核糖開關(guān)。還可以通過例如從核糖開關(guān)所在處移除觸發(fā)分子來失活核糖開關(guān)。因此，所>^開的失活核糖開關(guān)的方法可以包括例如從核糖開關(guān)所在的位置或與核糖開關(guān)接觸的位置移除觸發(fā)分子(或其他激活化合物)。可以通過不激活核糖開關(guān)的觸發(fā)分子類似物的結(jié)合來阻斷核糖開關(guān)。還公開了通過使化合物與RNA分子相接觸，從而改變RNA分子表達或改變編碼RNA分子的基因表達的方法，其中所述RNA分子包括核糖開關(guān)。核糖開關(guān)通過結(jié)合或移除觸發(fā)分子而實現(xiàn)控制基因表達的功能。因此，將包括核糖開關(guān)的目的RNA分子置于可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的條件下就可用來改變RNA的表達。例如轉(zhuǎn)錄終止或核糖體與RNA的結(jié)合被阻斷可以導(dǎo)致表達被改變。根據(jù)核糖開關(guān)的性質(zhì)，與觸發(fā)分子的結(jié)還公開了通過將核糖開關(guān)與RNA分子可操作地連接，來調(diào)節(jié)RNA分子或編碼NRA分子的基因的表達的方法。核糖開關(guān)可與RNA分子以任何合適的方式可操作地連接，所述方式包括例如通過將核糖開關(guān)與RNA分子物理連接，或者通過將編碼RNA分子的基因用基因工程改造使其包括和編碼核糖開關(guān)，這樣由基因工程改造的核酸產(chǎn)生的RNA就具有了與RNA分子可操作連接的核糖開關(guān)。將與目的RM分子可操作連接的核糖開關(guān)置于可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的條件下就可用來改變RNA的表達。還公開了通過激活、失活或阻斷核糖開關(guān)，來調(diào)節(jié)含有核糖開關(guān)的天然存在的基因或RNA的表達的方法。如果該基因?qū)性摶虻募毎蛏锏拇婊疃允种匾敲醇せ?、失活或阻斷該核糖開關(guān)可導(dǎo)致細胞或生物的死亡、停滯或虛弱。例如(如果該核糖開關(guān)的激活關(guān)閉或抑制表達)，激活某個對微生物的存活而言十分重要的天然存在的基因中的天然存在的核糖開關(guān)，可能導(dǎo)致該微生物的死亡。這是所公開的化合物和方法用于抗微生物和抗生素效果的一個理論基礎(chǔ)。還公開了通過激活、失活或阻斷核糖開關(guān)，來調(diào)節(jié)含有核糖開關(guān)的分離的、基因工程改造的或重組的基因或RNA的表達的方法?；蚧騌NA可通過任何方式進行基因工程改造或重組。例如，核糖開關(guān)和RNA的編碼區(qū)域可以是異源的，核糖開關(guān)可被重組或嵌合或二者均有。如果基因編碼一種所需的表達產(chǎn)物，則激活或失活該核糖開關(guān)可被用于誘導(dǎo)該基因的表達，并由此導(dǎo)致表達產(chǎn)物的產(chǎn)生。如果該基因編碼對于基因表達或另一細胞過程的一種i秀導(dǎo)物或抑制物，則激活、失活或阻斷該核糖開關(guān)可導(dǎo)致其他被調(diào)節(jié)基因或細胞過程的誘導(dǎo)、抑制或脫抑制。已知多種這樣的次級調(diào)節(jié)效應(yīng)，它們也可適用于核糖開關(guān)。核糖開關(guān)作為這類調(diào)節(jié)的初級控制的一個優(yōu)勢是核糖開關(guān)的觸發(fā)分子可為小的非抗原性分子。還公開了通過將適體結(jié)構(gòu)域與核糖開關(guān)的表達平臺結(jié)構(gòu)域可操作地連接(為嵌合核糖開關(guān))，來改變核糖開關(guān)的調(diào)節(jié)的方法。這樣該適體結(jié)構(gòu)域可以通過例如適體結(jié)構(gòu)域的觸發(fā)分子的作用介導(dǎo)核糖開關(guān)的調(diào)節(jié)。適體結(jié)構(gòu)域可以以任何合適的方式與核糖開關(guān)的表達平臺結(jié)構(gòu)域可操作地連接，結(jié)構(gòu)域。通常，可以激活、失活或阻斷該適體結(jié)構(gòu)域所來源的核糖開關(guān)的任何化合物或條件都可被用于激活、失活或阻斷該嵌合核糖開關(guān)。還公開了通過共價改變核糖開關(guān)(通過例如交聯(lián)核糖開關(guān)的部分或?qū)⒁环N化合物偶聯(lián)至核糖開關(guān))來滅活核糖開關(guān)的方法和組合物。這種方式的核糖開關(guān)的滅活可由例如一些改變來獲得，所述改變阻止了核糖開關(guān)的觸發(fā)分子的結(jié)合，阻止了核糖開關(guān)與觸發(fā)分子結(jié)合后的狀態(tài)改變，或阻止了在與觸發(fā)分子結(jié)合后核糖開關(guān)的表達平臺結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ磉_的影響。還公開了篩選、設(shè)計或產(chǎn)生可以識別新的觸發(fā)分子的新核糖開關(guān)和/或新適體的方法。這類方法可包括在核糖開關(guān)中產(chǎn)生一系列適體變異體、在目的化合物存在的條件下評估變異體核糖開關(guān)的激活、篩選被激活的變異體核糖開關(guān)(或者例如篩選激活度最高或激活選擇性最強的核糖開關(guān))和重復(fù)上述步驟，直至得到具有所需活性、特異性、活性和特異性的結(jié)合或其他性質(zhì)的結(jié)合的變異體核糖開關(guān)。還公開了由上述方法生產(chǎn)的核糖開關(guān)和適體結(jié)構(gòu)域。功能性核酸分子的體外篩選和體外進化技術(shù)是已知的，并且可以適于與核糖開關(guān)及其組件一起使用?？捎玫募夹g(shù)描述于例如下列文獻中A.RothandR.R.Breaker(2003)Selectioninvitroofallostericribozymes.In:MethodsinMolecularBiologySeries-CatalyticNucleicacidProtocols(Sioud，M.，ed.)，Humana，Totowa，NJ;R.R.Breaker(2002)EngineeredAllostericRibozymesasBiosensorComponents.Curr.Opin.Biotechnol.13:31-39;G.M.EmilssonandR.R.Breaker(2002)Deoxyribozymes:NewActivitiesandNewApplications.Cell.Mol.LifeSci.59:596-607;Y.Li,R.R.Breaker(2001)InvitroSelectionofKinaseandLigaseDeoxyribozymes.Methods23:179-190;G.A.Soukup，R.R.Breaker(2000)AllostericRibozymes.In:Ribozymes:BiologyandBiotechnology.R.K.GaurandG.Kr卿eds.EatonPublishing;A.Souk叩，R,R-Breaker(2000)AllostericNucleicAcidCatalysts.Curr.Opin.Struct.Biol.10:318-325;G.A.Soukup，R.R.Breaker(1999)NucleicAcidMolecularSwitches.TrendsBiotechnol.17:469—476;R.R.Breaker(1999)InvitroSelectionofSelf-cleavingRibozymesandDeoxyribozymes.In:IntracellularRibozymeApplications:PrinciplesandProtocols.L.Couture,J.Rossieds.HorizonScientificPress,Norfolk,England;R.R.Breaker(1997)InvitroSelectionofCatalyticPolynucleotides.Chem.Rev.97:371-390;以及它們的參考文獻，上述出版物的每一篇基于它們對于體外篩選和進化技術(shù)的描述而被特別地以援引的方式納入本文。還公開了用于篩選和識別可以激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的方法。核糖開關(guān)的激活指的是結(jié)合觸發(fā)分子后核糖開關(guān)狀態(tài)的改變。^它方式i活。本文使用的術(shù)語觸發(fā)分子指的是可以激活核糖開關(guān)的分子和化合物。這包括核糖開關(guān)的天然或正常的觸發(fā)分子和其它可激活核糖開關(guān)的化合物。天然或正常的觸發(fā)分子是指給定的天然核糖開關(guān)的觸發(fā)分子，或者對于一些非天然核糖開關(guān)而言，是指設(shè)計該核糖開關(guān)時f斤針對的觸發(fā)分子或篩選該核糖開關(guān)時使用的觸發(fā)分子(篩選通過例如體外篩選或體外進化技術(shù))。非天然觸發(fā)分子可被稱為非天然觸發(fā)分子。還公開了識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法，包括利用待測化合物和核糖開關(guān)的原子結(jié)構(gòu)進行建模并確定待測化合物與核糖開關(guān)是否相互作用。確定待測化合物與核糖開關(guān)是否相互作用可通過例如本文其他部分所述的確定核糖開關(guān)模型中待測化合物的預(yù)計最小相互作用能、預(yù)計結(jié)合常數(shù)、預(yù)計解離常數(shù)或它們的組合來實現(xiàn)。確定待測化合型中的一個或多個預(yù)計的鍵、一種或多種預(yù)計的相互作用或它們的組合來實現(xiàn)。預(yù)計的相互作用可以選自例如前文所述的范德華相互作用、氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用或它們的組合。在一個實例中，核糖開關(guān)是鳥嘌呤核糖開關(guān)。在測定與核糖開關(guān)的相互作用時可以測定原子接觸，由此測定待測化合物與核糖開關(guān)的相互作用?？梢宰R別待測化合物的類似物，并可以確定待測化合物的類似物是否與核糖開關(guān)相互作用。還公開了殺死或抑制細菌的方法，包括將細菌與本文公開的化合物或由本文公開方法識別的化合物相接觸。還公開了識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法，包括識別核糖開關(guān)的晶體結(jié)構(gòu)、用核糖開關(guān)與待測化合物建模和確定待測化合物是否與核糖開關(guān)相互作用。核糖開關(guān)的失活指的是觸發(fā)分子不再結(jié)合時核糖開關(guān)的狀態(tài)的改變。核糖開關(guān)可通過與觸發(fā)分子以外的其他化合物結(jié)合失活和以移除觸發(fā)分子以外的其它方式失活。核糖開關(guān)的阻斷指的是核糖開關(guān)的一種狀態(tài)或情況，此時存在觸發(fā)分子卻不激活核糖開關(guān)。還公開了識別可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的方法。例如，可活核糖開關(guān)的化合物。如;果核糖開關(guān)被激活:則待測化合物被識別為可i活核糖開關(guān)的化合物?？梢砸匀我夂线m的方式評估核糖開關(guān)的激活。例如，核糖開關(guān)可以與報告RNA相連接，并可在存在和不存在待測化合物的條件下測量報告RNA的表達、表達水平或表達水平的改變。作為另一個實例，核糖開關(guān)可包括構(gòu)象依賴性標簽，由該標簽產(chǎn)生的信號依賴于核糖開關(guān)的激活狀態(tài)。優(yōu)選地，這種核糖開關(guān)使用天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。由此可見，可以使用對照測定或測量或者不使用對照測定或測量來進行核糖開關(guān)激活的評估。識別可以失活核糖的開關(guān)化合物的方法可以以類似的方式進行。除了本文其他部分公開的方法之外，對阻斷核糖開關(guān)的化合物的識別可以以任何合適的方式完成。例如，可以在存在已知可激活或失活核糖開或失活的分析。如果沒有觀察到如同在不存在待測化合物的情況下應(yīng)當賴L察到的激活或失活情況，則該待測化合物被識別為可阻斷核糖開關(guān)的激活或失活的化合物。還公開了使用生物傳感器核糖開關(guān)檢測化合物的方法。該方法可包括使待測樣本和生物傳感器核糖開關(guān)相接觸，并評估生物傳感器核糖開關(guān)的激活。生物傳感器核糖開關(guān)的激活表明在待測樣本中存在該生物傳感器核糖開關(guān)的觸發(fā)分子。生物傳感器核糖開關(guān)是經(jīng)過基因工程改造的核糖開關(guān)，它們在存在它們的同種觸發(fā)分子時產(chǎn)生可檢出的信號?？捎玫纳飩鞲衅骱颂情_關(guān)可以在觸發(fā)分子達到或超過閾值水平時被觸發(fā)。生物傳感器核糖開關(guān)可被設(shè)計為體內(nèi)應(yīng)用或體外應(yīng)用。例如，報告RNA編碼作為信號的蛋白質(zhì)或參與產(chǎn)生信號的蛋白質(zhì)，與該報告RNA可操作地連接的生物傳感器核糖開關(guān)可在體內(nèi)被用于通過基因工程改造細胞或生物，使其含有編碼核糖開關(guān)/才艮告RNA的核酸構(gòu)建體。用于體外的生物傳感器核糖開關(guān)的一個實例是包括構(gòu)象依賴性標簽的核糖開關(guān)，由該標簽產(chǎn)生的信號依賴于核糖開關(guān)的激活狀態(tài)。優(yōu)選地，這種生物傳感器核糖開關(guān)使用天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。生物傳感器核糖開關(guān)可被用于監(jiān)測變化的條件，因為當觸發(fā)分子的濃度降低時核糖開關(guān)的激活是可逆的，所以信號會隨著觸發(fā)分子濃度的變化而變化。可以通過基因工程^tit出對觸發(fā)分子有不同解離常數(shù)的核糖開關(guān)，從而得到不同的可檢測的觸發(fā)分子濃度范圍。這可以容易地通過例如"降解"對觸發(fā)分子具有高親和力的核糖開關(guān)的敏感度來實現(xiàn)。通過在同一感受器或測定中使用不同敏感度的多個生物傳感器核糖開關(guān)可以監(jiān)測濃度的范圍。還公開了由識別激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物和對識別出的化合物進行加工而制備的復(fù)合物。這可以通過例如將本文其他部分公開的化合物識別方法與對識別出的化合物進行加工的方法結(jié)合使用而實現(xiàn)。例如，可通過下述方法制備復(fù)合物使待測化合物和核糖開關(guān)相接觸，評估核糖開關(guān)的激活，以及如果核糖開關(guān)被待測化合物激活，則制備該激活核糖開關(guān)待測化合物作為復(fù)合物。還公開了由核實某種化合物對核糖開關(guān)的激活、失活或阻斷作用和對經(jīng)核實的化合物進行加工而制備的復(fù)合物。這可以通過例如將本文其他部分公開的化合物激活、失活或阻斷評估方法與對經(jīng)核實化合物的加工方法結(jié)合使用而實現(xiàn)。例如，可通過下述方法制備復(fù)合物使待測化合物和核糖開關(guān)相接觸，評估核糖開關(guān)的激活，以及如果核糖開關(guān)被待測化合物'激活，則制備該激活核糖開關(guān)待測化合物作為復(fù)合物。核實化合物激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的能力指的^1對以前并不知道可否激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的鑒定，以及對已知可激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的化合物激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的能力的評估。公開了一種檢測目的化合物的方法，所述方法包括將樣本與核糖開關(guān)相接觸，其中核糖開關(guān)被目的化合物激活，其中核糖開關(guān)在被目的化合物激活時產(chǎn)生信號，其中當樣本中含有目的化合物時核糖開關(guān)產(chǎn)生信號。核糖開關(guān)可在凈皮目的化合物激活時改變構(gòu)象，其中構(gòu)象的改變會通過構(gòu)象依賴性標簽產(chǎn)生信號。核糖開關(guān)可在^L目的化合物激活時改變構(gòu)象，其中構(gòu)象的改變導(dǎo)致與核糖開關(guān)相連的RM的表達的改變，其中表達的改變產(chǎn)生信號。信號可以由與核糖開關(guān)相連的RNA表達的報告蛋白產(chǎn)生。公開了一種方法，包括(a)檢測可以抑制編碼包括核糖開關(guān)的RM的基因的基因表達的化合物，其中所述的抑制是通過核糖開關(guān)實現(xiàn)，以及(b)通過使細胞與步驟(a)中可以抑制基因表達的化合物相接觸來抑制基因表達，其中所述細胞包括編碼包括核糖開關(guān)的RNA的基因，其中所述化合物通過與核糖開關(guān)結(jié)合而抑制基因的表達。還公開了一種識別核糖開關(guān)的方法，所述方法包括在存在和不存在4匕合物的條件下評估RNA分子的內(nèi)嵌(in-line)自主切割，其中RM分子由,皮化合物調(diào)節(jié)的基因所編碼，其中RNA分子的內(nèi)嵌自主切割模式的改變表明存在核糖開關(guān)。A.抗微生物化合物的識別核糖開關(guān)是為了結(jié)合小有機分子而進化出的新一類結(jié)構(gòu)性RNA。核糖開關(guān)的天然結(jié)合袋可被代謝物類似物或被模擬天然代謝物形狀-空間的化合物所靶向。核糖開關(guān)(l)存在于許多革蘭氏陽性細菌和包括炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)的革蘭氏陰性細菌中，(2)是這些細菌中基因表達的基本調(diào)節(jié)物，(3)存在多個拷貝，不太可能同時出現(xiàn)抗性，以及(4)還未證實存在于人體中。這種特征的組^f吏得核糖開關(guān)很有希望成為新型抗微生物化合物的靶標。而且，核糖開關(guān)的小分子配體提供了用于衍生生產(chǎn)藥物候選物的有用位點。一些核糖開關(guān)的分布示于美國專利申請公布No.2005-0053951的表1中。當識別了一類核糖開關(guān)而且(通過例如測定在耙標生物中有多少基因被這一類核糖開關(guān)所調(diào)節(jié))評估了它作為藥物靶標的潛力之后，就可以識別候選物分子。有兩種化合物在多年以前就已知它們可以殺死細菌，現(xiàn)已確定它們是通過結(jié)合核糖開關(guān)而起作用。具體而言，化合物氨乙基半胱氨酸(賴氨酸的類似物)結(jié)合細菌的賴氨酸核糖開關(guān)，并阻止賴氨酸生物合成中所需的基因的表達。類似地，化合物吡咬石危胺素(硫胺素的類似物)被細菌細胞二磷酸化而生成吡啶硫胺素焦磷酸。吡啶硫胺素焦磷酸是石危胺素焦磷酸(TPP)的模擬物，它由于結(jié)合TPP核糖開關(guān)而對細菌有毒性。因此，通過應(yīng)用現(xiàn)代藥物開發(fā)策略靶向核糖開關(guān)可以使得發(fā)現(xiàn)一類新的抗生素4匕合物。可以入本文公開的那樣使用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計方法以產(chǎn)生可以結(jié)合核糖開關(guān)并觸發(fā)其變構(gòu)作用的代謝物。細菌的藥物抗性林的出現(xiàn)加強了對識別新型抗生素的需要。抗核糖開關(guān)藥物代表了抗菌作用的一種模式，它由于下述理由而引起了人們的極大興趣。核糖開關(guān)控制了基礎(chǔ)代謝過程的關(guān)鍵基因的表達。因此用藥物對這些基因控制元件進行處理可得到新的抗生素。核糖開關(guān)還帶有進化為選擇性結(jié)合代謝物的RNA結(jié)構(gòu)，因此這些RM受體像蛋白質(zhì)酶類和受體一樣成為了良好的藥物靶標。此外，已顯示上述的兩種抗微生物化合物通過失活抗生素抗性而殺死細菌，該抗生素抗性是通過RNA靶標的突變而出現(xiàn)的。至少有11類高度保守的核糖開關(guān)存在于多種細菌中，提供了許多藥物靶標。許多來源于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性譜系的生物具有多種類型的核糖開關(guān)(參見美國專利申請公布No.2005-0053951)。大部分致病性生物例如葡萄球菌以及大部分與生物恐怖主義相關(guān)的生物例如炭疽芽孢桿菌都富含核糖開關(guān)。如本文所公開的那樣，已經(jīng)詳盡解析了鳥噤呤核糖開關(guān)的原子分辨結(jié)構(gòu)模型，這使得可以使用基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計方法來產(chǎn)生結(jié)合核糖開關(guān)的化合物。具體而言，鳥噤呤核糖開關(guān)結(jié)合位點的模型顯示存在著兩條能夠進行配體修飾的通道(圖12A)。通過對鳥噤呤的N2位置或06位置進行化學(xué)修飾，產(chǎn)生了26種鳥噤呤類似物，幾乎所有測試過的類似物都能以低納摩爾級的解離常數(shù)結(jié)合該核糖開關(guān)。圖12B顯示了在N2位置和06位置進行修飾而合成的鳥噤呤類似物的結(jié)構(gòu)。這些化合物中的大多數(shù)都利用了枯草芽孢桿菌鳥嘌呤核糖開關(guān)適體結(jié)構(gòu)域或結(jié)合位點模型中的分子識別"盲點"。成功的化合物可用作骨架，在該骨架上可以進一步引入化學(xué)變異體以產(chǎn)生無毒性、可生物利用的、高親和性抗核糖開關(guān)化合物。下面利用SAM核糖開關(guān)(參見美國專利申請公布No.2005-0053951的實施例7)對上述內(nèi)容進行一些說明。SAM類似物是用穩(wěn)定的基于硫的連接(YBD-2和YBD-3)替換了反應(yīng)活性的甲基和锍離子中心，它可被核糖開關(guān)以足夠的親和力(低至中納摩爾級)識別，從而作為其他SAM類似物合成的平臺。另夕卜，可以合成和測試各種的連接類似物(基于N和C的連接)，以提供制備#^酸和核苷矛汴生物的最佳平臺。用于產(chǎn)生類似物。例如可4吏用RonaldT.BorchardtandYihShiongWu，PotentialinhibitorofS—adenosylmethionine-dependentmethyltransferase.1.ModificationoftheaminoacidportionofS-adenosylhomocysteine.J.Med.Chem.17，862-868，1974中所述的已驗汪的合成方法。這些和其它類似物的合成和結(jié)合測試可以連續(xù)地進行或按小組進行?？梢栽诨衔镒R別過程中，基于每一輪驗證的識別決定簇來設(shè)計其他的SAM類似物。可以如本文其他部分所述的那樣對枯草芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌的核糖開關(guān)RM進行筒單的結(jié)合測試。也可以進行更高級的測試。最有希望的SAM類似物前藥化合物必須在保持代謝惰性的前提下能進入細菌細胞并結(jié)合核糖開關(guān)。此外，可用的SAM類似物必須緊密地結(jié)合核糖開關(guān)，但在對蛋白質(zhì)酶類的活性位點的結(jié)合上又必須不如SAM，否則就會有在患者細胞中產(chǎn)生不期望的毒性作用的危險。作為對這一方面的預(yù)先評估，可以測試具有阻礙枯草芽孢桿菌生長的能力但又不影響大腸桿菌培養(yǎng)物(大腸桿菌利用SAM但不具有SAM核糖開關(guān))的化合物。為了篩選前藥化合物候選物，可以按下列方式平行培養(yǎng)細菌培養(yǎng)物1.可在最低葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，并且不添加外源的SAM類似物。2.可在最低葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，并且添加外源的SAM類似物(可選擇高劑量，然后設(shè)計重復(fù)試驗來測試推斷的藥物化合物的濃度范圍)。3.可在最低葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌，并且添加外源的SAM類似物(可選擇高劑量，然后設(shè)計重復(fù)試驗來測試推斷的藥物化合物的濃度范圍)。可以通過測量細胞倍增時間來比較各種培養(yǎng)物的適應(yīng)程度?？梢允褂迷谖⒘康味ò迳L的培養(yǎng)物來測試藥物化合物的濃度范圍，并使用來自另一實驗室的微量滴定板讀數(shù)儀來進行分析。預(yù)計培養(yǎng)物1生長較好。抑制培養(yǎng)物2的藥物可能抑制或不抑制培養(yǎng)物3?？梢砸暂^寬濃度范圍類似地抑制培養(yǎng)物2和培養(yǎng)物3的藥物可以反映出外源化合物誘導(dǎo)的普遍毒性(即與核糖開關(guān)抑制一起或者代替核糖開關(guān)抑制而對多種不同的細胞過程進行抑制)。這種篩選中識別的成功的藥物候選物應(yīng)不抑制大腸桿菌或僅在很高劑量時抑制大腸桿菌，而能在低得多的濃度(相差超過10倍)時抑制枯草芽孢桿菌。由于識別了SAM上的衍生位點，要有效地識別前藥化合物就需要對合適的SAM類似物或者類屬化學(xué)文庫進行大規(guī)模篩選?？梢允褂煤怂峄蚬こ痰脑硗ㄟ^一種或兩種不同的方法進行高通量篩選。將下列的兩種應(yīng)光感受器設(shè)計調(diào)整為便于進行高通量篩選的模式可以適于使用固定化方法或基于溶液的方法。一種產(chǎn)生報告物的方式是通過附加一個在SAM結(jié)合核糖開關(guān)后能催化熒光標簽釋放的結(jié)構(gòu)域，從而賦予核糖開關(guān)第三種功能。在最后的報告物構(gòu)建體中，上述的催化結(jié)構(gòu)域可以通過一個通信區(qū)(commimicationmodule)連接到核糖開關(guān)上，所述通信區(qū)通過使催化結(jié)構(gòu)域正確折疊而產(chǎn)生熒光新號，從而傳播配體結(jié)合事件。這可通過下述方式實現(xiàn)。SAM核糖報告物混合設(shè)計使用合適的DNA模板和引物序列，通過PCR擴增構(gòu)建用于體外轉(zhuǎn)錄為RM的DM模板。在該構(gòu)建體中，隨機化構(gòu)建錘頭結(jié)構(gòu)(SAM適體的PI莖)的莖n以代表2.5億種以上的可能的序列組合。其中有一些將不可避免地僅在適體結(jié)合SAM或相關(guān)高親和力類似物時具有核酶的功能。這該構(gòu)建體群中的每種分子在除隨機結(jié)構(gòu)域之外的序列上都是相同的，而在隨機結(jié)構(gòu)域中，構(gòu)建體群的每種可能的序列組合都有多個拷貝作為代表。SAM核糖報告物篩選體外篩選步驟可為下列步驟的重復(fù)過程1.用標準方法體外轉(zhuǎn)錄RNA。加入[oc-32P]UTP以〗吏得整個RM分子都具有放射性。2.用標準方法在變性PAGE上純化全長RM。3.在含有催化活性所需的足量的鎂(20mM)、但不含有SAM的陰性篩選緩沖液中孵育全長RNA(約lOOpmol)。在室溫下(約23X:)孵育4小時，需要時使用熱循環(huán)或堿性變性劑以防止自在分子(selfishmolecule)的出現(xiàn)。4.在變性PAGE上純化全長RM,并棄去不存在SAM的條件下發(fā)生反應(yīng)的RNA。5.在含有20mMMg"和SAM(在23'C時pH7.5)的陽性篩選緩沖液中孵育。室溫下孵育20分鐘。6.在變性PAGE上純化被切割的RNA，以回收結(jié)合了SAM并允許RNA自切割的核糖開關(guān)。7.將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA。8.使用可將RNA的被切割部分重新引入的引物，對DNA進行PCR擴增。步驟4中的SAM的濃度在最開始可為100iaM，并隨著篩選過程逐漸降低?；厥粘晒Φ耐ㄐ艆^(qū)的步驟可以通過在步驟6的純化膠上觀察到的切割物的數(shù)量來評估。當構(gòu)建體群在10nM的SAM條件(親本核酶和核糖開關(guān)活性最大的條件)下達到100%切割時，或者當構(gòu)建體群的活性達到平臺期即在多輪篩選后都不再增加時，就可以結(jié)束篩選。然后可對最后的群測序?？梢詼y定個別的通信區(qū)克隆，以便在存在SAM的條件下篩選構(gòu)建體的過程中產(chǎn)生熒光信號。還可以通過核糖開關(guān)介導(dǎo)的分子信標的觸發(fā)來產(chǎn)生熒光信號。在這種設(shè)計中，核糖開關(guān)的構(gòu)象改變導(dǎo)致了原先折疊狀態(tài)的帶有熒光劑和淬滅劑的分子信標打開折疊，并通過與核糖開關(guān)形成螺旋而使熒光劑遠離淬滅劑。由于這一方法可以利用配體介導(dǎo)的參與轉(zhuǎn)錄控制的終止子和抗終止子莖的形成，因此這一機制可以容易的應(yīng)用于現(xiàn)有的核糖開關(guān)。為了使用核糖開關(guān)通過結(jié)合分子信標來報告配體的結(jié)合，必須經(jīng)驗性地確定合適的構(gòu)建體。可以系統(tǒng)性地測試分子信標的最佳長度和核苷酸組成以及它在核糖開關(guān)上的結(jié)合位點，以便獲得最高的信噪比。可以通過將不同SAM類似物與分子信標偶聯(lián)核糖開關(guān)的表觀結(jié)合親和力(通過熒光4言號產(chǎn)生的水平測定)與由標準串聯(lián)標記測定的結(jié)合常數(shù)進行比較，從而確定該測定的有效性。具體實施方案公開了天然鳥嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)的原子結(jié)構(gòu)，包括圖6所示的原子結(jié)構(gòu)。原子結(jié)構(gòu)的原子坐標可包括圖6中所示的原子的表6中所列的原子坐標。原子結(jié)構(gòu)的原子坐標可包括表6中所列的原子坐標。還公開了識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法，包括(a)利用權(quán)利要求1的原子結(jié)構(gòu)和待測化合物進行建模；(b)確定待測化合物與核糖開關(guān)是否相互作用。還公開了識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法，包括將核糖開關(guān)與待測化合物相接觸，其中當核糖開關(guān)與待測化合物相互作用時會產(chǎn)生熒光信號。還公開了殺死細菌的方法，包括將細菌和與核糖開關(guān)相互作用的化合物的類似物相接觸。還公開了殺死細菌的方法，包括將細菌和與核糖開關(guān)相互作用的化合物相接觸。還公開了識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法，包括(a)識別核糖開關(guān)的晶體結(jié)構(gòu)；(b)利用核糖開關(guān)和待測化合物進行建模；和(c)確定待測化合物與核糖開關(guān)是否相互作用。還公開了可調(diào)節(jié)的基因表達構(gòu)建體，包括編碼一種RNA的核酸分子，所述RM含有與編碼區(qū)可操作地連接的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)為表5中所列的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)調(diào)節(jié)RNA的表達，其中所述核糖開關(guān)和編碼區(qū)為異源的。還公開了檢測目的化合物的方法，所述方法包括使樣本與核糖開關(guān)相接觸，其中所述核糖開關(guān)為表5中所列的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)初L目的化合物激活，其中所述核糖開關(guān)在被目的化合物激活時產(chǎn)生熒光信號，其中所述核糖開關(guān)在樣本中含有目的化合物時產(chǎn)生信號。還公開了一種方法，包括(a)檢測可以抑制編碼包括核糖開關(guān)的RNA的基因的基因表達的化合物，其中所述核糖開關(guān)為表5中所列的核糖開關(guān)，其中所述的抑制是通過核糖開關(guān)實現(xiàn)，以及(b)通過使細胞與步驟(a)中可以抑制基因表達的化合物相接觸來抑制基因表達，其中所述細胞包括編碼包括核糖開關(guān)的RNA的基因，其中所述化合物通過與核糖開關(guān)結(jié)合而抑制基因的表達。確定待測化合物是否與核糖開關(guān)相互作用，可以包括確定核糖開關(guān)模型中待測化合物的預(yù)計最小相互作用能、預(yù)計結(jié)合常數(shù)、預(yù)計解離常數(shù)或它們的組合。確定待測化合物與核糖開關(guān)是否相互作用可以包括測定待測化合物和核糖開關(guān)模型中的一個或多個預(yù)計的鍵、一種或多種預(yù)計的相互作用或它們的組合。核糖開關(guān)可為鳥噤呤核糖開關(guān)。鳥噤呤核糖開關(guān)可為表5中的核糖開關(guān)?？梢酝ㄟ^對核糖開關(guān)和待測化合物建模來確定原子接觸，并由此確定待測化合物與核糖開關(guān)的相互作用上述方法還可包括下述步驟(c)識別待測化合物的類似物；(d)確定待測化合物的類似物是否與核糖開關(guān)相互作用。所述化合物可為次黃嘌呤。可以使用基于凝膠的分析來確定待測化合物是否與核糖開關(guān)相互作用?？梢允褂没谛酒姆治鰜泶_定待測化合物是否與核糖開關(guān)相互作用。待測化合物的相互作用可以為范德華相互作用、氬鍵、靜電相互作用、疏7jc相互作用或者它們的組合。核糖開關(guān)可以包括RNA切割性核酶。當含有淬滅部分的核酸被切割時可以產(chǎn)生熒光信號。可以使用分子信標技術(shù)來產(chǎn)生熒光信號?？梢允褂酶咄亢Y選來實行該方法。核糖開關(guān)可為鳥嘌呤核糖開關(guān)。鳥嘌呤核糖開關(guān)可為表5中的核糖開關(guān)。核糖開關(guān)可被觸發(fā)分子激活，其中所述核糖開關(guān)在被觸發(fā)分子激活時產(chǎn)生信號。核糖開關(guān)在被目的化合物激活時可改變構(gòu)象，其中構(gòu)象的改變通過構(gòu)象依賴性標簽產(chǎn)生信號。核糖開關(guān)在被目的化合物激活時可改變構(gòu)象，其中構(gòu)象的改變導(dǎo)致與核糖開關(guān)相連的RNA的表達改變，其中所M達改變產(chǎn)生信號。信號可由與核糖開關(guān)相連的RNA表達的報告蛋白產(chǎn)生。實施例A.實施例1:天然鳥嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)與代謝物次黃嘌呤形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)為了理解天然生物傳感器如何發(fā)揮功能，通過X射線晶體學(xué)解析了與鳥嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)的生物學(xué)相關(guān)配體一一次黃噤呤結(jié)合的鳥噤呤結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)(表2和圖12A)。在結(jié)合次黃噤呤的狀態(tài)下，該RNA采用了下述三維折疊形式其中末端環(huán)(L2和L3)形成一系列互相連接的氫鍵(見圖5中的對比圖)，以使得P2和P3螺4t彼此平行(圖5C)。由于核糖-磷酸骨架區(qū)域的并列排布導(dǎo)致的不希望的靜電相互作用通過兩個骨架間一些正離子的結(jié)合而被中和(圖10)。RNA的球面螺旋排布的定位通過三向^^(three-wayjunction)周圍的i午多三級接觸完成，所述三級^接觸主要有J2/3環(huán)(圖5C)與結(jié)合的次黃噤呤相互作用、Pl螺旋、以及J1/2環(huán)與J3/1環(huán)。通過三向接合元件中的和元件周圍的保守核苷酸形成嘌呤結(jié)合袋。這些核苷酸通過形成上述和下述的兩個系列的威基三聚體輔助限制了噤呤結(jié)合袋(圖5A)。該袋的3，側(cè)側(cè)翼帶有水介導(dǎo)的U22-A52A73堿基三聚體和A23G"-C53三聚體；這兩種情況下腺苷的Watson-Crick面都與Watson-Crick對的小溝相互作用(圖6A)。通過螺旋P1(U20-A76和A21-U75)頂部的保守Watson-Crick對分別和U49和C50的Watson-Crick面之間的連續(xù)堿基三聚體形成另一側(cè)，這使得J2/3環(huán)緊貼Pl螺旋。這種g三聚RNA適體，示例性的結(jié)構(gòu)例如茶堿結(jié)合物(Zimmermann,G攀R.，Jenison，R.D.,Wick，C.L.，Sirnmorre，J.一P.&Pardi，A.Interlockingstructuralmotifsmediatemoleculardiscriminationbyatheophyl1ine—bindingRNA.NatureStruct.Biol.4，644—649(1997))、FMN結(jié)合物(Fan,P.，Suri，A.K.，F(xiàn)iala,R.，Live,D.&Patel，D.J.Molecularrecognitioninthe麗-RNAaptamercomplex.J.Mol.Biol.258，480-500(1996))和孔雀綠結(jié)合物(Baugh，C，Grate,D.&Wilson,C.2.8Acrystalstructureofthemalachitegreenaptamer.J.Mol.Biol.301，117-128(2000))。因此，人工篩選的RNA應(yīng)用的形成小分子配體結(jié)合位點的原理與它們天然存在的對應(yīng)物相同。核苷酸U22、U47、U51和C74形成直接堆積在PI螺旋上的堿基四聚體，次黃嘌呤通過與上述四個核苷酸形成廣泛的氳鍵系列而結(jié)合(圖6B)。該結(jié)構(gòu)清楚地顯示mRNA接觸到了配體的所有官能團，這樣就能解釋在生物化學(xué)研究中觀察到的次黃嘌呤的特異性(Mandal,M.&Breaker,R.R.Generegulationbyriboswithces.NatureRev.Mol.Cell.Biol.5，451-463(2004))。此外，由于在該結(jié)構(gòu)中有一個空間可以容納結(jié)合的噤呤2-位上的環(huán)外M，因此也很容易解釋鳥嘌呤的結(jié)合。這一附加的官能團可以與C74和U51的2-位上的氛基的氧原子形成氫鍵，這一點與這種核糖開關(guān)對鳥嘌呤的親和力比對次黃嘌呤的親和力高10倍的事實相一致。最顯著的特征之一是配體幾乎完全凈皮RNA所包裹(圖6C):在復(fù)合物中次黃嘌呤的97.8%的表面都不能被大量溶劑所接近。雖然在結(jié)構(gòu)已祐束征的適體中還從未有過被識別的配體被RNA如此幾乎完全利用的情況，但是不包括將配體固定于固體支持物上的篩選策略(Koizumi，M.，Souk叩，G.A"Kerr,J.N.&Breaker,R.R.AllostericselectionofribozymesthatrespondtothesecondmessengerscGMPandcAMP.NatureStruct.Biol.6，1062-1071(1999))使得還有希望開發(fā)出能具有相似配體包埋度的RNA。這一發(fā)現(xiàn)還表明，由于次黃嘌呤不可能〗象許多RNA-配體相互作用中的那樣接近已形成的結(jié)合位點(Leulliot,N.&Varani,G.CurrenttopicsinRNA-proteinrecognition:controlofspecificityandbiologicalfunctionthroughinducedfitandconformationalcapture.Biochemistry40，7947-7956(2001);Williamson,J.R.InducedfitinRNA-proteinrecognition.NatureStruct.Biol.7，834—837(2000",因此，局部結(jié)合位點在與配體結(jié)合后一定經(jīng)過了相當大的構(gòu)象改變。最后，這種噤呤識別的模式也可以容易地解釋下述事實通過將74位核苷酸的胞嘧啶突變?yōu)槟蜞奏?，這個單點突變就可以將它的鳥噤呤特異性變?yōu)橄汆溥侍禺愋?Mandal,M.&Breaker,R.R.Adenineriboswitchesandgeneactivationbydisruptionofatrancriptionterminator.NatureStruct.Mol.Biol.11，29-35(2004))。雖然Watson-Crick的配對優(yōu)先性由鳥噤呤變?yōu)榱讼汆溥剩青溥屎蚏NA之間的其他的相互作用并沒有變化。通過獨特的環(huán)-環(huán)相互作用而穩(wěn)定了三級結(jié)構(gòu)，所述環(huán)-環(huán)相互作用蓋住了P2和P3螺旋，該P2和P3螺旋被以前沒有見到過的兩類堿基四聚體所限制。每一四聚體包括一個Watson-Crick配對和一個位于其小溝中的非典型配對(G38-C60和G37-C61與A33A66和U34A65對分別相互作用;圖7A)。這種排布與腺苷在常見的I/n型A-minor三聚體基序中的A型螺旋中的堆積方式有4艮大的相似性(Doherty，E.A.，Batey，R.T.，Masquida，B.&Doudna，J.A.AuniversalmodeofhelixpackinginRNA.NatureStruct.Biol.8，339-343(2001);Nissen，P.，Ippolito,J.A.，Ban,N"Moore，P.B.&Steitz，T.A.RNAtertiaryinteractionsinthelargeribosomalsubunit:theA—minormotif.Proc.NatlAcad.SciUSA98，4899-4903(2001))。這八個核苷酸中任何一個的突變都會使固定環(huán)-環(huán)相互作用的核心的復(fù)雜氬鍵網(wǎng)絡(luò)被破壞，這就解釋了它們嚴格的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)保守性。在這些四聚體上堆積了兩個非典型配對，包括G62和U63之間的并列相互作用，這類似于A-平臺基序(Gate,J.H.etal.RNAtertiarystructuremediationbyadenosineplatforms.Science273，1696-1699(1996))和突起-G基序(Correll，C.C，Beneken，J.,Plantinga，M.J"Lubbers,M.&Chan,Y.Thecommonandthedistinctivefeaturesofthebulged-Gmotifbasedona1.04AresolutionRNAstructure.NucleicAcidsRes.31，6806-6818(2003))(圖7B)。G62U63對通過和與其相對的環(huán)骨架之間形成氬鍵而更加穩(wěn)定。兩個末端環(huán)之間的相互作用對于鳥噤呤核糖開關(guān)的配體結(jié)合至關(guān)重要。使用串聯(lián)標記試驗測定出的存在和不存在鳥噤呤的情況下RNA的穩(wěn)定性的差異表明RNA三級結(jié)構(gòu)的這一元件的形成并不依賴于鳥噤呤或次黃噤呤。將野生型的環(huán)替換為穩(wěn)定的UUCG四元環(huán)(Molinaro，M.&Tinoco，I.JrUseofultrastableUNCGtetraloophairpinstofoldRNAstructures:thermodynamicandspectroscopicapplications.NucleicAcidsRes.23，3056-3063(1995);圖11)，這一替換消除了三勤目互作用，使得核糖開關(guān)失去了識別次黃嘌呤的能力；這表明它對于促進高親和力相互作用至關(guān)重要(圖8)。因此，雖然這種三^M目互作用并不直M觸配體，但是它對于識別噤呤的核糖開關(guān)的整體組織還是有意義的。類似地，具有環(huán)-環(huán)相互作用的錘頭核酶的天然序列顯著地提高了它們在生理條件下的切割速度(DelaPena，M.，Gago，S.&Flores，R.Peripheralregionsofnatrualhammerheadribozymesgreatlyincreasetheirself—cleavageactivity.EMB0J.22，5561-5570(2003);Khvorova，A.，Lescoute，A.,Westhof，E.&Jayasena，S.D.Sequenceelementsoutsidethehammerheadribozymecatalyticcoreenableintracellularactivity.NatureStruct.Biol.10,708-712(2003))。每種情況下，三級結(jié)構(gòu)都使RNA局限于某一種方式，該方式使得含有功能性位點的三向M能夠?qū)ι頋舛鹊呐潴w或Mg"離子產(chǎn)生應(yīng)答。在Mg'+離子濃度很高(20mMMgCl2)的情況下，鳥噪呤核糖開關(guān)對鳥噪呤和次黃嘌呤有相當高的親和力(表觀解離常數(shù)(Kd)分別為5nM和50nM)。然而在大腸桿菌中，在噤呤濃度為1-10時出現(xiàn)purR抑制子對^7卜/6i/Z操縱子的轉(zhuǎn)錄的抑制應(yīng)答。為確定核糖開關(guān)是否對可能反映生理水平的相似濃度的嘌呤有應(yīng)答，通過等溫滴定量熱法在不同離子條件下(表1)測定了對于次黃噤呤的親和力。在更接近生理條件的離子強度條件下(0.25-1mMMg2+),RNA表現(xiàn)出的對次黃噤呤的親和力(表觀Kd=3-4pM)與purR抑制子蛋白(對于大腸桿菌變異體，表觀Kd-9juM)的相近(Choi,K.Y.&Zalkin，H.StructuralcharacterizationandcorepressorbindingoftheEscherichiacolipurinerepressor.J.Bacteriol.174，6207—6214(1992))。因此，基于RNA和基于蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)機制看起來都被調(diào)節(jié)為對相近的細胞內(nèi)代謝物濃度有應(yīng)答。表1在30'C測定次黃噤呤結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>*報告誤差表示與數(shù)據(jù)整合的非線性最小平方值的s.e.m,ND表示沒有可檢出的結(jié)合。卞該反應(yīng)中含有2mMNa廠EDTA。該結(jié)構(gòu)進一步表明了RNA是如何通過一種推斷不依賴于Rho的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制而將細胞內(nèi)代謝物濃度轉(zhuǎn)換為基因表達的變化的(Mandal，M.，Boese，B.，Barrick,J.E.，Winkler,W.C.&Breaker,R.R.riboswitchescontrolfundamentalbiochemicalpathwaysinBacillussubtilisandotherbacteria.Cell113，577-586(2003);Johansen，L.E.，Nygaard，P.，Lassen，C，Agerso,Y.&Saxild,H.H.DefinitionofasecondBacillussubtilispurreguloncomprisingthepurandxpt-pbuXoperonspluspbuG，nupG(yxjA)，andpbuE(ydhU-J-Bacteriol.185，5200-5209(2003))。起始的90個核苷酸的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致了鳥噤呤結(jié)合結(jié)構(gòu)域的形成，與L2和L3環(huán)的相互作用使得開始形成RNA的三級結(jié)構(gòu)(圖5B)。這使得三向接合基序部分形成以便有效地結(jié)合配體，但是結(jié)合部分也必須在一定程度上解構(gòu)以使得噪呤可以進入結(jié)合袋。在鳥噤呤或次黃噤呤的濃度足夠高時，核堿基(nucleobase)與袋相結(jié)合，通過堆積相互作用和與J2/3形成堿基三聚體使PI螺旋穩(wěn)定化，并防止PI核苷酸^:引入抗終止子元件中。然后mRNA可形成一種典型的不依賴于Rho的終止子莖-環(huán)和轉(zhuǎn)錄終點。與^M目反，在細胞內(nèi)鳥噤呤或次黃噤呤的濃度較低時，分離的PI螺旋的3，側(cè)會很容易地被轉(zhuǎn)錄而形成穩(wěn)定的抗終止子元件，促進繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。因此，次黃嘌呤對核糖開關(guān)十分重要，它通過它穩(wěn)定一種或另一種構(gòu)象的能力使得核糖開關(guān)能指導(dǎo)mRNA按著兩條不同的途徑折疊，生成細胞內(nèi)鳥噤呤、次黃噤呤和黃噤呤濃度的有效的生物傳感器。結(jié)晶合成RM并通過天然親和標簽純化方法純化RNA(Kieft，J，S.&Batey，R.T.AgeneralmethodforrapidandnondenaturingpurificationofRNAs.RNA10，988—995(2004)),并在含有10mMK+-HEPES(pH7.5)和1mM次黃噤呤的緩沖液進行交換。將上述溶液按1:1的比例與母液(含25%PEG3000(w/v)、200mM乙酸銨和10mM六氨合鈷)混合，并在室溫下培養(yǎng)2-3周以生長晶體。數(shù)據(jù)采集和處理在母液中加入25%的2-曱基-2，4-戊二醇，在冷凍保護的條件下對晶體以CuKoc的波長進行單波長異常衍射；在至少1.8A的分辨率下可觀察到清楚的衍射。使用D4REK對數(shù)據(jù)進行索引、整合和比例化(Pflugrath，J.W.ThefinerthingsinX—raydiffractiondatacollection.ActaCrystallogr.D55，1718—1725(1999)),用SOLVE識別重原子位點(Terwilliger，T.SOLVEandRESOLVE:automatedstructuresolution,densitymodificationandmodelbuilding.J.SynchrotronRadiat.11，49-52(2004))，并用CNS進行細化(Brunger，A.T.etal.Crystallography&NMRsystem:anewsoftwaresuiteformacromolecularstructuredetermination.ActaCrystallogr.D54，905-921(1998))，以獲得最終的Atal值為17.8。/。和Wfree值為22.8%的模型。該模型包括除A82以外的所有RNA原子和次黃噤呤配體，對于A82未觀察到電子密度。RNA合成和純化使用重疊DM寡核苷酸(IntegratedDNATechnologies)和標準方法構(gòu)建了一個68個核苷酸的構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括枯草芽孢桿菌的pbuX-xpt操縱子的鳥噤呤核糖開關(guān)序列。所得的DNA片段在5，端和3，端分別含有EcoRI和NgoMDS限制性酶切位點，將該片段連接到pRAV12質(zhì)粒栽體上(Kieft，J.S.&Batey，R.T.AgeneralmethodforrapidandnondenaturingpurificationofRNAs.10，988-995(2004))，該質(zhì)粒栽體是為了RNA的天然純化而設(shè)計的；對所得的栽體進行測序驗證。用PCR從該所得載體產(chǎn)生用于體外轉(zhuǎn)錄的DM模板，所述PCR使用的5，引物是針對T7RM聚合酶啟動子的引物，3，引物是帶有純化親和標簽的引物(5，GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAG(SEQIDNO:10);3，GGATCCTGCCCAGGGCTG(SEQIDNO:ll))。RNA轉(zhuǎn)錄的條件如下反應(yīng)體系為12.5mL，包括30mMTris-HCl(pH8.0)、10mMDTT、0.1%TritonX-100、0.1mM亞精胺-HCl、8mM的每種NTP、40mMMgCl2、50jig/mLT7RNA聚合酶和1mL的~0.5juM模板(Doudna，J.A.PreparationofhomogeneousribozymeRNAforcrystallization.#o/74，365-70(1997)),還添加了1單位/mL的無機焦磷酸酶以抑制不可溶的焦磷酸鎂的形成。反應(yīng)體系在37*€培養(yǎng)1.5小時。如前所述地進行RNA的天然純化。在從親和柱上洗脫下RNA之后，立即用10,000匿C0離心過濾裝置(Amicon，Ultra-15)進行濃縮。在所有的RNA被濃縮至~500jiL后，使用離心濃縮機將RNA對含有10mMK+-HEPES和lmM次黃噤呤，pH7.5的15mL溶液交換三次，每次更換新液體。將最后的RNA濃縮至450jliM，用根據(jù)它的堿基組成計算出的消光系數(shù)和260nm處的光吸收來判定其濃度。RNA結(jié)晶使用懸滴法獲得鳥噤呤核糖開關(guān)的結(jié)晶，其中RNA溶液按1:1的比例與儲液混合，所述儲液中含有10mM六氨合鈷、200mM乙酸銨和25%的PEG2K。將結(jié)晶盤在室溫下(231C)培養(yǎng)，在7-14天后晶體可達到它們的最大體積(0.05x0.05x0.2mm)。加入30yL含有25%(v/v)2-曱基-2，4戊二醇(MPD)的母液5分鐘并在液氮中快速冷凍以進行晶體的冷凍保護。使用CuKoc射線在內(nèi)部X射線源(RigakuMSC)上采集衍射數(shù)據(jù)；用逆射線(inverse-beam)實驗采集異常數(shù)據(jù)。使用CrystalClear(RigakuMSC)和D*TREK對數(shù)據(jù)進4亍索引、整合和比例化(Pflugrath，J.W.ThefinerthingsinX-raydiffractiondatacollection.Ciy"a//o^r"Ciy""/o^r55，1718—1725(1999))。該晶體屬于C2空間群(spacegroup)(a=132.30A，b=35.25A，c=42.23A,d=90.95。)，每個不對稱單位含有一個分子(所有的結(jié)晶學(xué)統(tǒng)計值參見表2)。在后續(xù)的定相和細化中使用的所有數(shù)據(jù)都釆集于一個個體晶體。定相和結(jié)構(gòu)測定。使用單波長異常衍射(SAD)實驗來確定相位(Dauter，Z.，Dauter,M.&Dodson，E.JollySAD.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr58，494-506(2002);Rice，L.M.，Earnest,T.N.&Brunger，A.T.Single—wavelengthanomalousdiffractionphasingrevisited.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr56(Ptll)，1413-20(2000))，衍射數(shù)據(jù)延長至1.95A分辨率。在該實驗中，鈷被當作重原子衍生物處理，它在CuKot波長時產(chǎn)生微弱的異常信號(f，=-2.464，f，，=3.608)。使用SOLVE(Terwilliger，T.SOLVEandRESOLVE:automatedstructuresolution,densitymodificationandmodelbuilding./加cAr"ro"a力."11，49-52(2004))，發(fā)現(xiàn)了一個含IO個重原子的解析圖，優(yōu)值(figureofmerit)為0.38，評分為40.9。使用這種重原子模型和其鏡像并使用CNS來確定相位(Brunger，A.T.etal.Crystallography&NMRsystem:Anewsoftwaresuiteformacromolecularstructuredetermination.Cr7"a//o^r"/o/C/Ti^a/A^r54(Pt5)，905-21(1998)),并用密度f奢飾進4亍改進。僅有一種重原子模型產(chǎn)生了電子密度圖謙，圖i普中顯示了清晰的骨架連接和堿基堆積；這一圖i普可以足夠清晰地辨析RNA的主要部分。進行在O中的重復(fù)建模輪次(Jones，T.A.，Zou，J.Y.，Cowan，S.W.&Kjeldgaard.Improvedmethodsforbuildingproteinmodelsinelectrondensitymapsandthelocationoferrorsinthesemodels.v4c^CiyWW/o^rJ47(Pt2)，110-9(1991))和CNS中的細化，同時監(jiān)測Rfree值以保證該值在每一輪之后都有所改進。在RNA除了3，端的A82以外的所有核普酸都被建立起來之后，進行兩輪水分選(waterpicking)以將總共332個水分子置于模型中，使用的限制因素是每個溶劑與另一原子的距離必須在氫鍵距離之內(nèi)，而且B因子要小于80。這建模的這一過程中，基于它們具有清晰的八面體配位構(gòu)型的內(nèi)層原子以及由異常差異圖鐠驗證的它們的位置，識別了12個六氨合鈷離子；基于這一點還在模型中定位了一個亞精胺和乙酸根離子。糖折疊被限制為C3，內(nèi)式，但是殘基22、34、35、47、49和62上的糖折疊被限制為C2，內(nèi)式。等溫滴定量熱法。用于等溫滴定量熱法(ITC)(Leavitt,S.&Freire，E.Directmeasurementofproteinbindingenergeticsbyisothermaltitrationcalorimetry.CurrOpinStructBiol11，560-6(2001);Pierce,M.，Raman,C.S.&Nail,B.T.Isothermaltitrationcalorimetryofprotein—proteininteractions.Methods19，213—21(1999))的RNA按上文所述地轉(zhuǎn)錄和純化，并使用含有10mMK+-HEPES、pH7.5、100mMKC1和不同濃度的MgCh的緩沖液在4C完全透析24-48小時。在透析后，將緩沖液用于制備次黃噤呤溶液，次黃噪呤濃度應(yīng)近似為RM濃度的10倍(通常分別為約120和12jaM)。所有實驗均使用MicrocalMCSITC裝置在30'C下進行。在對RNA和次黃噤呤溶液除氣之后，將29次注射、每次10pL的次黃噤呤滴定到RNA樣品中，以^吏得最終得到的次黃噤呤與RNA的摩爾比為2:1至3:l之間(Recht，M.I.&Williamson,J.R.Centraldomainassembly:thermodynamicsandkineticsofS6andS18bindingtoanS15-RNAcomplex./#0/A/o/313，35-48(2001))。使用OriginITC軟件(MicrocalSoftwareInc.)分析滴定數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)符合單位點結(jié)合模型。表2:晶體學(xué)統(tǒng)計值數(shù)據(jù)采集空間群C2a，b，c132.30，35.25,42.23AP90.95°分辨率a20-1.95A(2.02-1.95A)波長1.5418完整百分率92.9%(85.3%)測量的反射76,950獨特反射25，789平均冗余度2.9(2.45)I/cj21.5(6.3)Rsymb3.7%(13.5%)定相定相力eRcullis優(yōu)值SOLVE密度修飾之后的CNS細化分辨率反射數(shù)目工作系列1.62(0.95)0.670.380.8620-1.95A(2.02-1.95A)23,356(84.1%)測試系列2,430(8.8%)17.8(24.8)22.8(31.8)0.0095A1.70。0.25A交叉iHLSigma-a協(xié)同誤差平均B因子值0.23A22.4A:a.括號內(nèi)的數(shù)字對應(yīng)最高分辨率的骨架。b.Rmerge=i:II-<1>|/￡1,其中I為觀察到的強度，<1>為對稱相關(guān)反射的多個測量值的平均強度。c.定相力=所有反射中報告的〈|FH|>/〈IIFp+Fh卜IFphII〉。d.Rcums=所有反射中報告的EIIFpH士Fp卜lFH(calc)|/E|FpH|。e.Rxtai=E|F0-|FCII|F0|,Rxtal來自工作系列，Rfree來自測試系列。B.實施例2:核糖開關(guān)類似物作為抗孩i生物劑的用途對鳥嘌呤核糖開關(guān)適體和腺嘌呤的相應(yīng)適體均建立了原子分辨模型(SerganovA，YuanYR，Pikovskaya0，PolonskaiaA，MalininaL，PhanAT,HobartnerC，MicuraR，BreakerRR，PatelDJ.(2004)Structuralbasisfordiscriminativeregulationofgeneexpressionbyadenine-andguanine-sensingmRNAs.Chem.Biol.11:1729-1741)。這些模型實質(zhì)上都與Batey等人推斷的相同(Batey，R.T.，Gilbert,S.D.,Montange，R.K.(2004)Structureofanatrualguanine-responsiveriboswitchcomplexedwiththemetabolitehypoxanthine.18:432:411—415.),由此證明用于設(shè)計圖12B中所示的化合物的結(jié)構(gòu)模型是正確的。此外，鳥噤呤和腺噤呤核糖開關(guān)適體之間的相似性使我們清楚地認識到，與設(shè)計鳥噤測試了圖12B中所示的鳥噤呤類似物體外結(jié)合鳥噤呤核糖開關(guān)的能力，還測試了它們對枯草芽孢桿菌的抗菌活性。在這些類似物中，有六種開關(guān)。類似物可以抑制枯草芽孢桿菌在缺乏鳥噤呤的培養(yǎng)基上的生長(表3)。測試了其中一種化合物G-014在豐富培養(yǎng)基上對于枯草芽孢桿菌和一些臨床上相關(guān)的病原體的抑制作用(表4)。重要的是，G-014抑制大多數(shù)上述病原體，包括炭疽芽孢桿菌和和抗曱氧西林金黃色葡萄球菌，其抗菌效力與萬古霉素相當。為進一步探明這些鳥嘌呤類似物的抗菌機制，開發(fā)了兩種基因報告系統(tǒng)。在一個系統(tǒng)中，鳥噤呤核糖開關(guān)與綠色熒光蛋白(GFP)相融合，以使得高濃度的鳥嘌呤或結(jié)合核糖開關(guān)的鳥噤呤類似物可以抑制GFP的表達(圖14)。因此，GFP熒光水平的降低就表明了鳥嘌呤核糖開關(guān)在細菌中被結(jié)合和調(diào)節(jié)。還用P-半乳糖苷酶的鳥嘌呤核糖開關(guān)上游序列構(gòu)建了另一個類似的系統(tǒng)。這樣，P-半乳糖苷酶水平的降低就表明了化合物在體內(nèi)抑制鳥噤呤核糖開關(guān)。表3概括了對每種鳥噤呤類似物的這些分析的結(jié)果。還證實了化合物殺死細胞和它們控制基因表達之間的相關(guān)關(guān)系?？墒褂煤腥魏魏线m的報告基因的類似系統(tǒng)，所述基因例如編碼合適的報告蛋白或合適的報告RM(例如核酶)的基因。還測定了G-014是針對枯草芽孢桿菌的殺菌劑。在直接的比較中，G-014減少存活的集落形成單位("CFU")的數(shù)目的速度與羧千西林相等(圖15)。表3.每種鳥噤呤類似物的活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>ND表示該值尚未測定。用粗體表示的化合物抑制細菌生長。2相對的P-gal報告物活性表示用有化合物時的Miller單位值除以無化合物時的Miller單位值。1.O為無抑制作用，O為完全抑制。表4.G-014對臨床上相關(guān)病原體的抗菌活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>SA，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);MRSA，抗曱氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresistantStaphylococcusaureus);EF，糞腸球菌(Enterococcusfaecalis);SP,肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae);HI,流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza);MS,恥塘分枝軒菌(Mycobacteriumsmegmatis)。2這些病原體沒有鳥噤呤核糖開關(guān)。表5.噤呤核糖開關(guān)#STOCKHOLM1.0#=gs#-gs#-GS#=gs#=gs#=gs弁-gs#=gs#-gs#gs#=gs#=<3s#=GS#-GS#=gs#-GS#(3s#=gs#=3s#-gs#-<3s#=gs#=gs#=<3s#=gs#<3s#=GS#-GS#gsNC_JD03869nc::002570:002570NC_:0009S4NC一陽0033S6NC_:000964NC_:002570NC_006270:006322二0041s3nc二:003909nc::003397NC一:005945NC*"'005957NC二二00S2740075302/1593074-1592972organism2/676475-S7S577organism2/4004541-4004643organism1/513088-512986organism2/693775-693877organism2/650309-S50411organism2/2294931-2294831organism1/2295788-2295688organism1/1103943-1104045organism8/1S50407-1650509organism3/1497571-1497S73organism1/1497S4S-1497747organism1/1521880-1521982organism1/1532482-1532584organism2/1497594-1497796organismNZ-AAAC02000001.1/1985987-1986089organismNZ二AABK01000008.1/9S4"-9S3S4organismNZ二AAJSN01000011,1/67143-67245organismNZ二AAEO01000025.l/6S855-669S7organismNZ二AAEP01000035,1/693SS-694S7organismN2一AAEQ01000029,1/70848-709SOorganismN2二AAER01000023,1/5B182-58284organismN2二AAES010000341/。121-69223organismNC二004722.1/1515239-1515341organ丄smNC二000964,2/697711-697813organismNC二002976.3/54816-54319organismNC二004461,1/2433047-24329"organismNC二003030,1/2824953-2824855organismNC二003909.8/296465-296567organismNC二003997.3/2S2601-262703organism1TC二004722.1/261558-2G1"0organismNC二005945*1/262614-262716organismNC一005957.1/268537-268S39organismThermoanaerobactertengcongensisMB4BacillushaloduransC-125BacillushaloduiraiisC-125Bacillussubtilissubsp.subtilisstr.168Clostridiumperfringensatr.13Bacillussubtilissubsp.subtilisstir.168BacillushalodinransOl25BacilluslicheniformisATCC14580BacilluslicheniformisATCC14580OccanobacillusiheyensisHTE831BacilluscereusATCC10987anthracisstr,Amesanthracisstrthuringiensisserovarkonkukianstr.97-27cereus2KanthracisstranthracisstrcereusanthracisstranthracisstranthracisstranthrscisstranthracisstranthracisstircereusATCC14579subtilissubsp.subtilisstrStaphylococcusepidermidisStaphylococcusepidermidisATCC12228Clostridiumacetobutylic咖ATCC824Bacilluscei:eusATCC10987Bacillusanthracisstr.AmesBacilluscereusATCC14579Bacillusanthracisstt.SterneBacillusthuringiensisserovar3conkukianstr.97-27BacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBac丄llusSterneserovarkcmkukianstr.，AmesAncestor'A2012A1055VollumKrugerBWesternNorthAustralia94America#=GSNC—006274,1/267835-2S7337organism#GSNC二007530.2/2S2S01-2S2703organism#-GSNZ二AAAC02000001.1/795036-796138organism#-GSNZ二AAEK01000017,1/88397-88499organism#GSN2:AAEN01000023.1/15980-17082organism#-GSN(AAEO01000030-1/17030-17132organiBtn#=GSNZ:AABP01000043,1/12962-130"organism#=GSNZ—AAEQ01000040,l/49-48S0organism#=GSNZ二AAER010000301/4374-4272organism井sC3SNZ一AAES01000040.1/14760-14862organism#-GSNC:006270.2/693198-693300organism#-GSNC二00S322.1/692981-693083organism#-GSNC二004722.1/259601-259703organism#=GSNC:000964,2/231941Q-2319310organism#GSNC—003030,1/2905050-2904948organism#=GSNC二003210,1/611113-611017organism#GSN2二AAPQ01000001.1/2431-2533organism#GSNC二003212，1/6101SS-S100S4organism#=GSNC二003366，1/422820-422922organism#<3SNC:002973.5/61784S-S17744organism#=GSNZ:AADR01000111-1/1S98-1496organism#GSNC二003309,8/294503-234611organism#GSNC:0059S7.1/2"S77-26"79organism#-GSNC:00S274.1/265875-265977organism#=GSNC二0033S6,1/2618421-2618323organism#GSNC二002"3.5/1940027-193992Sorganism#=GSNC二003212.1/2013345-2013244organism#GSN2:AADQ01000095,1/1690-1791organism#■(38NZ:i^PR01000082,1/3415-3516organism#GSNC二003366,1/2871201-2871101organism弁豕GSNC二002745,2/430797-430900organism#GSNC二0027S8,2/43075"430857organism祐s(3SNC二002951.2/4600S9-460162organism#GSNC:002站2.2/441050-441153organism#GSNC二0029S3.3/409191-409294organism#=GSNC二003923,1/4105"-410"9organism#-GSNC二006582,1/1115665-1115767organism#-GSDTcTo05510.1/274257-274355organismBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacillusBacilluscereusZKanthraciBstr,anthracisstr.cereus.G$241anthracisstr.anthracisanthoracisanthracisanthracisanthracis'AmssAncestor'A2012A1055VolluitlKrugerBWesternNorthAmericaUSA6153Australia94168strstrstrstrstirlicheniformisATCC14580licheniformisATCC14580cereusATCC14579subtilissubsp,subtilisstr,Clostridiumacetobutylic咖ATCC824XiisteriamonocytogenesEGD-eListeriaTKonocytogenesstr,l/2aF6854IiisteriairmocuaClipl1262Clostridiumperfringensstr,13Listeriamonocytogenesstr,4bF2365Listeriamonocytogenesstr.4bH7858BacilluscereusATCC10987Bacillusthuringiensisserovar)conkukianstrBacilluscereusZKClostridiumperfringensstrListeriamonocytogenesstr.IjisteriainnocuaClipl1262Listerianupnocytogeriesstr,Listeriamonocytogenesstr.ClostridiumperfzringensstrStaphylococcusaureussui>spStaphylococcusaureussubspStaphylococcusaureussubspStaphylococcusaureussubspStaphylococcusaureussubspStaphylococcusaureussubspBacillusclausiiKSM-K1S37—27,134bl/2aF68544bH785813aureus議315,aureusMu50aureusCOIiaureusMRSA252aureusMSSA476aureusMW2200580046277.7勢s步被93/162M#=GSNC一003210,1/19S8922-1958821organism#=GSNC:O0S270.2/697054-69715SorganismJNGSNC:006322,1〉696B3B-S%340organism#-GSNC二00S510.:i/282580-282S82organism#*=GSUC=003337organism#=GSNC:005945-1/260654-2S0756organism#-GSNC二007530.2/260641-260743organism#=GS議Z:AABK01000017.l/8S437-86539organism#-GSNZ二AAEN010000231/15020-15122organism弁-G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llus7johnsoniitaxonomyBacteria,'Firmicutes/Lactobacillalesf.Lactobacillaceae/LactobacillusgasseritaxonomyBacteria,*FirmicutesLactobacillales;Lactobacillaceae,'Ijactobacillus,johnsoniitsoconomyBacteria,*Paroteobacteria,-Deltaproteobacteria,-Bdellovibrionales,'BdellovibrionaceaeBdellovibrio/bacteriovorustaxonomyBacteriaFirmicutesClostridia,'Thermoanaerobacteriales;Thermoanaerobacteriaceae〖MoorellagroupMooirella,'thermoaceticataxonomyBacteria,'Firmicutes/Ijactobacillales'.Leuconostoc;mesenteroidestaxonomyBacteria,'Firmicutes,'EntomoplasmataceaeMesoplasma;taxonomyBacteriaFirmicutesmesenteroidestaxonomyBacteria,'Firmicutes;taxonomyBacteria;Firmicutes;mesenteroidestaxonomyBacteria,'Firmicutes'*EntomoplasmataceaeMesoplasma,'Mollicutes/加tomopla柳atales,'florumIjactobacillales-Leuconostoc,*LactobacillalesOenococcusoeniLactobacillalesIjeuccmostoc,-Mollicute曰,-Entomoplasmatales/florumIDNO:12AU,AUGGCUCGGGA.IDNO:13AU.AGGGCCCGCAA.IDNO:14A17.AUGGCCCAAAA.IDNO:15AU.AUGGUCUGAUU.IDNO:16AU,AUGGUCCGAAA,IDNCC17GUCUCUACCGAACAACCC5UUUCUACCAGGCUGCC.GUUUCUACCUGCUGACCGUUUCUACCUAGUAACC.GUUUCUACCUGCUAACC..GUAAAUUGUUC.GACUAUGAGUGAAAGUOTACCUAGGG,GUAAACAGCCU,G,ACUACGAGUGAUACU,UUGACAUAGA.GlTAflAU03GCQ.G.ACUAUGGGGAAAGAU,UUUGGAUCUU■OTAAAAAACUA'G,ACUACAAGAMGUDUGAAUAAAUUUGUAAAAUAGCA<3.AOJACGAGGAGUUGUACUAUAAAUU200580046277.7勢溫1被107/162^;AGAAAUCAMUAAGA,UG.AAUUCGUAUAMJCGCGGGANC_002570.2/65030S-S50411SEQAa5aAAUCGAAAACA.UC.AUUUCGOAUAAUGGCAGGA.NC一O0S270.2/2234931-2294831SEQAa50UGAUACAUUAU.AU.CACUCAUAUAAUCGCGUGG.NC一00S322.1/2295788-2295688SEQAa5uUGAOACAUUAU.au.cacucadauaaucgcgugg.WC一004193.1/1103943-1104045SEQAa5cCUUAUAUAUAG.UU.UUUUCAUAUAAUCGCGGGG,NC—003909.8/1650407-1650509SEQAa5to^AUAGUUAGC.UA.cacucauauaaucgcgggg.NC-003997.3/1497571-1497S73SEQAAibAAMJAGUUAGC.XJA.CACUCAUAUAAUCGCGGGG.NC一005945.1/1497S45-1497747SEQAA^UAAAUAGUOAGC,UA.CACUCAUAUAAUCGCGGGG.NC一005S57.1/1521B80-1521982SEQAa5uAAAUAGUUAGC.ua.CACUCAUAUAAUCGC咖cj.NC一00S274.1/1532482-1532S84SEQAa5uAAAUA(3UUAGC.uacacucauauaaucgcgggg,NC一007530,2/1497694-1497796SEQAaZuAAAUAGUUAGC.UA.CACUCAUAUAAUCaCGGGQ,UA.CACUCAUAUAAUCGC(3GGG1/964S6-9S3S4SEQUA.CACUCAUAUAAUCGCGGGG1/67143-67245SEQUA.CAOTCAUAUAAUCGCGGGG1/66855-S6357SEQUA.CACUCADAUAAUCGCGGGG1/S93S5-S94S7SEQUA>CAOTCAUAUAA口CGCGGGG1/7084S-70950SEQUA.CACUCA咖AAaCQCGOGG1/58182-5B284SEQUA.CACUCAUAnAAUCGCGGCSG1/69121-69223SEQUA.CACUCAUA0ftAXJCGCOG3GM2_AAAC02000001N2一AABK01000008aaKuaaauaguuagcNZ一AAENOlOOOOlln2一aab001000025kt2一aaep01000035啦一AAEQ01000023N2一AABR01000023AA^X7MAUAGU0AGCNZ—AABS01000034aaXuaaauaguuagcNC一004722,1/1515239-1515341SEQAU.AUGGCUCGCAA,工DNO:18AU.AGGC3CCUGCGA.IDNO:19AU.AUGGCACGCAA.IDNO:20AU.AUGGCACGCAA.IDNO:21AU.AUGGCCUGCAA,ID110:22AU.AUGGCCUGCAA,工DNO:23AXJ.AUGGCCUGCAA.IDNO:24AU,AUGGCCiraCAA,IDNO:25AU.AUQQCCUGCAA,IDNO:26,AXJ.AUGGCCUGCAAIDHO:27,AU.AOGGCCUGCAAIDNO:28,AU.AUGGCCUGCAAIDNO:29,AU.AUGGCCUGCAAIDNO:30,AU.AUGGCCTOCAAIDNO:31.AU.AUGGCOTGCAAIDNO:32,AU.AUGC3CCUGCAAIDNO:33,AU.AUGGCCUC3CAAIDNO:34,A口.AUGGCCUGCAAIDNO:35,AXJ.AUGGCOTGCAAIDN0:3S,即CUCUACCAAGCUACC,,GUUUCUACCAAGCUACC,GUUUCUACCGGGCA-CC..GUUUCUACCGGGCA-CC.,GUUUCUACCGGUUUACC..GUUUCUACCGAAGUACC.GUUUCUACCGAAGUACC.GUUUCUACCGAAGUACC..GUUUOJACCGAAGUACC..GUUUCUACCGAAGUACC..GUUUCUACCGAAGUACC■GUUUCUACCGAAGUACC..GUUUCUACCGAAGUACC..GUUUCUACCGAAGDACC..GUUUCUACCGAAGUACC.GUUUCUACCGAAGUACC..GUUUCUACCGAAGUACC,.GUUUCUACCGAAGUACC.,GUUUCUACCGAAOUACC..GUAAAUGGCUU.G.ACUACGUAAACAUUU.CUUUCGUUUG.GUAAAUAGCUU.G.ACUACGAAAAUAAUG.GGUUUUUUAC.GUAAA-tJGUCC.G.ACUAUGAOTGGGCGA.UAAGAAAACG.GUAAA-UGUCC.G.ACUAUGAGUGGGCGA.UAAGAAAACG.GUAAAUGAACC.G.ACUAUGGAAAAGCGG.AAAAUUCGAU■GUAAAUACDUU■C3■ACUAUGAGUGAGGAC■GAADAUAUUUGUMAUACUUU.G.ACUAUGAGUGAGGAC.QAAUAUAUUU.GUASAUACUUU.G.ACUAUGAGUGAGGACGAAUAUAUUU.GUAAAUACUUU,G.ACUAUGAGUGAGGAC.GAAUAUAUUU.GUAAAUACUUU.Q.ACUAUGAGUGAGGACGAAUAUAUOT.GUAAAUACUUU.G.ACUAUGAGUGAGGACGAAUAUAUUU■GUAAAUACUUU.(3.ACUAUGAGUGAGGAC■GAAUAUAUUU.GUAAAUACUUU.G.ACUAUGAGUGAGGAC.GAAUAUAUUU*GUAAAUACUUU*(3■ACUAUGAGUGAGGAC,GAAUAUAUOTT■GUAAAUACDUU■(3.ACUAUGAGUGAGGAC■GAAUAUAUUU.GUAAAUACUOU.G.ACUAUGAGUGAGGAC.(3AAUAUAUUU*GUAAAUACUUUG,ACUAUGAGUGAGGACGAAUAUAUUUGUAAAUACUUU.G.ACUAUGAGUGAGGAC.GAMJAUAOUU■GUAAAUACUUU.(3■ACUAUGAGUGAGGAC.QAAUAUAUUU<formula>formulaseeoriginaldocumentpage115</formula>GAAAAGUGAAUAUUA.UG.CCGUCGUAUAAUAUCGGGG.NC一00S270.2/S93198-693300SEQAG石AAUUUAAAAAAG.AC.UUGUCGUAUAAUCAUGGGG.NC—006322.1/632981-6930B3SEQAg5aAU0UAAAAAAG，AC.UU即CGUAUAAXJCAUGI3GG.HC—004722.1/259601-259703SEQAGSUAAUAUAAAACG.AUCCUUCAUAUAUCCUCAAUG.NCJ500964.2/2319410-2319310SEQUU!KCAAUAUAAUAQG■AA參CACUCAUAUAAUCGCGUGG■NC_003030.1/2905050-2904S48SEQGftiiAAGUAAUAACAUAU.UACCCGUAUAUGCUUAGAANC—003210,1/S11119-S11017SEQAa5cCGCDACAAUAA，UA.uagucguauaaguocggua.NZ—AADQ01000001.1/2431-2533SEQAA^CCGCUACAAnRAUA.UAGaCGUAUAAGUUCGGUA.NC_003212.1/S1015S-S10054SEQAA5CGUCUACAADAA.UA.AAQUCGUAUAAGUUCGGUANCJ)03366,l/422B20-422922SEQUA5(30ACUUAUAT3AA.OT.AtmUCGUAUAUOOTCGACG.NC—002973*5/617846-617744SEQAa5cCGCUACAAXIAA.DA.AAQUCQUAUAAGUUCGGUANZ一AADR01000111,1/1598-149SSEQAA5ccaCUACAAUAA.UA.AAC3UCGUAUAAGUUCQGUA.NC—00390S.8/234509-294611SEQAGi0AAUAUAAAACa.AtJ.CCUUCAUAUAUCCUCAAAG.NC一0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UAU-C叨CGAA.AU.AAGGUCGACA-.GUUUCUACAAGGXJG-CC..GG-AA-CACCU.AGUUUCUACCUAGUUCCCaaUGAAAGAACUG.GGUCCCUAC-GGUUAACC.AUAAAUUAACC.AGUCUCUACCGGAUCGCC..GU-AACGAUCC..GUCUCUACCGGGUCACC..UUAAACGACOT..GUUUCUACCGAGCCACC..GUAAAUGGCUU..GUOJCUACAAGACA-CC..UU-AA-UGUCU..GUCUOJACAAGACA-CC..uu-aa-ug17ot.OTCUCUACAAGACA-CC..UU-AA-UGUCU..GUOJCUACAAGACA-CC..UU-AA-UGUCU..GUCUCUACAAGACA-CC..UU-AA-UGUOJ,GUCUCUACAAGACA-CC..UU-AA-UGUCU,.GUCUCUACCAGUUC-CC..GCAAA-GUGCU,.SUCUCUACCAACUA-CC..GUARA-UAGUU,.OUUUCUACCCAGUG-CC..GUAAA-CACUG,.GUUUCUACCCAACG-CC..GUAAA-UGUUG.,G口CUCUAC-AGGUA-CC..OTAAA-UACCU..gucucuaccaggaa-cc..aauaa-cuccu,.GUUUCUACCCACUA-CC..GUAAA-UGGUG,ACAAUAAGUAAGUCA.GCAGUGAGATJACUACGGGUUAAAGU.AUUCGGUCGCGCUACGAAAAAUGUU.UUACUGUGUUACUACGGGUGGUGAG.UUACUGCUCUACtmUGAAGGAGCAG.ACCCUUCGUAACUACGGCAUGAUAA.AUGGAGCGCAACAAUAAGUAAGCUU.UUAGGCUUGCACAAUAAGUAAGCUU.UUAGGCUUGCACAAUAAGUAAGCUUUUAGGCUUGCACAAUAAGUAAGCUU.UUAGGCUUGCACAAUAAGUAAGCUU.UUAGGCUUGCACAAUAAGUAAGCUU.UUAGGCUUGC.AUUACGAAGAGUUGA.GAUCACUGUGG.AUUAUAAAAAUUUCG.aacggamjgaG.ACUAUAAGCGAAUUG.AGUCGACGGGQACUAUAGGAAAACUA.ACUCUUAUGUA.GCUACGAAftAGAAUG.CAGDUAMJOTGACUACAAAAOGCGUA.UUAUAGCGUUG.ACUAU-AGGUAAACG.AAAOUAAGAA200580046277.7勢溢也被116/162:a;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage123</formula>NC一005055.1/484139-484044SEQIDNO:207UAUAAAAUUAAUAUG.AA,■AACUUGUAUAAUCCUUC-匿AUAUCGGGAAGGANZ—AABH02000272.1/211-308SEQIDNO:208CA^CUAAAGAAGUUA.UU,UGCAGAUAUAU-CGUUG說.AA.ACGGCCAACA-NZ—AABJ03000003.1/47905-47810SEQIDN0:209Aa5aUAAAUAGCAACca.agcagguauaxj-cqucqga,uaauggotgaca-NZ—AABH02000038,1/17559-17463SEQIDNO:210UA^JCUAUGUGAAATJUU.AGCUGAQAQAGUAUCGA-—,AXJaAUGG-UCGAUUNC—006055.1/397027-337123SEQIDN0:211AaUaMJUAAAUAUAAaaAACUUAUACAU-GACAACAuAU-UGGGUUGUC-#GCRFSEQIDNO:212aAAauuaaAaAAAaA.au.aacUCgXIAUAAucucgggA.AU.AUGC3cccgagaGTCUOTACCUAACA-CC,.---AA-加UUA.G.AUUAUGAGUUUUAUGGUUUUCGCUAGUUUOJACCACGCC-CC…-AAAA-GUCGU.G.ACUAUCCGCAAAUGU.UUCUGACGAUGIKJUCUACCCAACA-CC,—-AA-UGUUG，G，ACUAUCUGUGGAUGU.OKJUUUGGCGGUUUCUAGCCAGCA-CC一—CA-UGCUG.GaACUAUCAUAAACAUGUUAUUUAAUUGAC-CUGCCUCUGGACC,.-U—AUCCUUA.G.AOTAUAAGCGUGAGG.UUUUUUUACAGUUUCUACCaggcaaCC-.GUAAAuugccu.G.ACUAcGAguaAauuu,uauuUaUuuu#-GCSScons'.......r,<<<<<<<,'<<<<<<<>>>>>>.〃表6.鳥嘌呤核糖開關(guān)的原子坐標HEADERRIBONUCIjEICacid05-AUG-041U8Dtitleguanineriboswitchboundtohypoxanthinecompndmol一工d:1;compnd2molecule:xpt-pbuxmrna;compndchain:COMPND4ENGINEERED:YES'.5OTHER—DETAILSG-BOXMRWAsourcemol工d:1;SOURCE2SYNTHETIC-YES,'SOURCE3OTHER—DETAILS:RNAWASPREPAREDBYINVITROTRANSCRIPTION,SOURCE4THESEQUENCEOFTHISRNACANBEFOUNDNATURALLYINSOURCESbacillusSUBT工LIS(BACTERIA)keywpsRNA-Ij工GANDcomplex,doublehelix,basetriples,baseKEYWDS2QUADRUPLES,MRNAEXPDTAX-RAYDIFFRACTIONAUTHORR.T.BATEY,S.i>GILBERT,RK.MONTMTGEREVDAT123-NOV-041U8D0JRNLAUTHR.T.BATEY,SD.GILBERT,RKMONTANGEJKNIiTITLSTRUCTUREOFANATURALGUANINE-RESPONSIVEJRNLTITL2RIBOSWITCHCOMPLEXEDWITHTHEMETABOLITEJRNIiJRNLREFNATUREV.4324112004JRNLREFNASTMNATUASUKISSN0028-0836REMARK1REMARKREMARK2RESOLUTION.1.95ANGSTROMS.remark3REMARK3REFINEMENT.remark3programjcms1.1REMARKAUTHORS:BRUNGER,ADAMS,CLORE,DELANO,GROS,GROSSE-REMARK3:KUNSTLEVE,JIANG,k0s2ewski,M工:LGES,PANNU,REMARK3:READ,RICE,SIMONSON,WARRENremark3REMARK3REFINEMBOTTARGET-.咖GH&HOBERREMARK3REMARK3DATAUSEDINRKPINEMBNT.REMARK3RESOIiOTICWRANGEHIGH(ANGSTROMS)1.95REMARK3RESOLUTIONRANGELOW(ANGSTRC^S>REMARKDATACUTOFF(SIGMA(F))0.000REMARK3DATACUTOFFHIGH(ABS(F))1344227.320REMARK3DATACUTOFFLOW(ABS(F))CKO0OOREMARKCOMPIiETENESS(WORK工NG+TEST)(%):92-8REMARK3NUMBEROFREFIiECTIONS25786REMARK3REMARK3FITTODATAUSED工NREFINEMENT.REMARKCROSS-VALIDATIONMETHODTHROTJGHOOTREMARK3FREERVALUETESTSETSEIiECTIONRAKDOMREMARKRVALUE(WORKINGSET)0.178REMARK3FREERVALUE0，228REMARK3FREERVALUETESTSETSIZE(%)9-400REMARK3FREERVALUETESTSETCOUNT2430REMARK3ESTIMATEDERROROFFREERVALUE0.005REMARK3REMARK3FITINTHEHIGHESTRESOLUTIONBIN.REMARK3TOTALNUMBEROPBIHSUSEDs10REMARK3BINRESOLUTIONRANGEHIGH(A)sUSREMARK3BINRESOLUTIONRANGELOW(A):2.02200580046277.7說明書第120/162頁REMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKHEMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARK3333333333333BINCOMPLETENESS(WORKING+TEST)("REFLECTIONSINBIN(WORKINGSET)BINRVALUE<WORKINGSET)BINFREERVALUEBINFREERVALUETESTSETSIZEBINFREERVALUETESTSETCOUNTESTIMATEDERROROFBINFREERVALUE85.2021050-24800.318010.402450.020NUMBEROFNON-HYDROGEKTATOMSTOEDINREFINEMENT.PROTEINATOMSNUCLEICACIDATOMSHETEROG孤ATOMSSOLVENTATOMS01426108333BVALUKS*FROMWILSONPLOT(A**2)MEANBVALUE(OVERALIj,A"2)OVERALLANISOTROPICBVALUE.22.60Bll(A**2)B22(A**2)B33(A**2)B12(A**2)B13(A**2)B23(A**2》0.26000-0.880000.620000.00000-CK48000O，OOOOOESTIMATEDCOORDINATEERROR.ESDFROMIjUZZATIPLOTESDFROMSIGMAALOWRESOLUTIONCUTOFF(A〉(A)(A)0.190.145，00CROSS-VAL工DATEDESTIMATEDCOORDINATEERROR.ESDFROMC-VLUZZAT工PLOT(A):0.25ESDFROMC-VSIGMAA(A):0，23RMSDEVIATIONSBONDIiEKGTHSBONDANGLESDIHEDRALANGLESIMPROPERANGLESFROMIDEALVALUES，(A)(DEGREES)(DEGREES)(DEGREES)0，009l，SO19*101，83ISOTROPICTHERMALMODEL:RESTRAINEDISOTROPICTHERMALMAIN-CHA工KTBONDMAIN"-CHAINANGLESIDE-CHAINBONDSIDE-CHAINANGLEBULKSOLVENTMODELING.FACTORRESTRAINTS.RMSSIGMA(A**2):0.810;1(A"2):0，0002.0001.5202.000(A"2):1*370;2.500METHODUSEDKSOliBSOIiPLATMODEL0.3648，443NCSMODEIisNULL3NCSRESTRAINTS,3GROUP1POSITIONAL3GROUP1B-FACTORRMS(A):NULIi(A"2》NULL〖NULL〖NULL126REMARKREMARKREMARKRKMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKRKMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARKREMARK44100100100100105105105105105200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200PARAMETERFILE1DNA-RNA一REP,PARAMPARAMETERFILE2ION-PAR^MPARAMETERFILE3HPA4.PARAMPARAMETERFILE4COHEX—REP*PARAMPARAMETERFILE5WATER:PARAMPARAMETERF工IiENULLTOPOLOGYFIIjE1DNA-RNA,TOPTOPOLOGYFIIjE2ION.TOPTOPOIiOGYF工IjE3TOPTOPOLOGYFILE4COHEX一REP.TOPTOPOLOGYFIIiE5WATER-TOPTOPOIiOGYFIIiE6NULLOTHERREFINEMENTREMARKS:NULIi1XJ8DCOMPLIESWITHFORMATV.2.3,09-JULY-1398THISENTRYHASBEENPROCESSEDBYTHENUCLEICACIDDATABASEON13-AUG-2004.THENDB工DCODE工SUR0039.THEPROTEINDATABANKHASADOPTEDTHESACCHARIDECHEMISTSNOMENCLATUREFORATOMSOFTHEDEOXYRIBOSE/RIBOSEMOIETYRATHERTHANTHATOFTHENUCLEOSIDECHEMISTS.THERI議GOXYGENATOMISIiABELLED04*INSTEADOFOl*.EXPERIMENTALDETAILSEXPERIMENTTYPEDATEOFDATACOIiLECTIONTTEMPERATURE(KELVIN)PHNUMBEROFCRYSTALSUSEDSYNCHROTRONRADIATIONSOURCEBEAMLINEX-RAYGENERATORMODEIiMONOCHROMATICORIAUEWAVEIiENGTHORRANGEMONOCHROMATOROPTICS(Y/N》(M/L)(A)DETECTORTYPEDETECTORMANUFACTURERINTENSITY-INTEGRATIONSOFTWAREDATASCALINGSOFTWARENUMBEROFUNIQUEREFLECTIONSRESOLUTIONRANGEHIGH(A)RESOLUTIONRANGELOW(A)REJECTIONCRITERIA(SIGMA(I)〉OVERALL.COMPIiETENESSFORRANGE(%)DATARBDUNDANCYRMERGE(I)RSYM(I)<I/SIGMA(I)>FORTHEDATASETX-RAYDIFFRACTICftJNULL100.07.50NROTATINGANCM>ENULLRIGAKUM1.5418NIFILTERNULIiNULLR-AXISR-AXIS280131，80020，0003，000NULL2，9000，055000*0370021，5000200580046277.7說明書第122/162頁REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK200REMARK280REMARK280REMARK280REMARK280REMARK280REMARK280REMARK280REMARK280REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290REMARK290工NTHEHIGHESTRESOLUTIONSHELL.HIGHESTRESOLUTIONSHELL,HIGHESTRESOLUTIONSHEIiIi,COMPLETENESSFORSHELLDATAREDUNDANCYINSHELLRMERGEFORSHEIiIjRSYMFORSHEKL<I/S:EGMA(I)>FORSHEJDliRANGEHIGH(A)RANGELOW(A)(%):100-0(I):NULL(工)NULIi.,BO"86DIFFRACTIONPROTOCOL:SINGLEWAVELBNGTHMETHODUSEDTODETERMINETHESTRUCTURE:SADSOFTWAREUSED:SOLVESTARTINGMODEL:NUIiLREMARK:NULLCRYSTALSOLVENTCONTENT,VS(%):4S.00MATTHEWSCOEFFICIENT,VM(ANGSTROMS**3/DA)-2.29CRYSTALIiIZATIONCONDITIONS:10MMCOBALTHEXAMMINE,200順AMMONIUMACETATE,25%PEG2K,PH7.5,VAPORDIFFUSION,HANGINGDROP,TEMPERATURE23KCRYSTALLOGEAPH工CSYMMETRYSYMMETRYOPERATORSFORSPACEGROUP:C121SYMOPSYMMETRYNNNMMMOPERATOR1555X,Y,Z2555-X,Y,-Z3555l/2+X,l/2+Y,Z45551/2墨X,l/2+Y,WHERENWN->OPERATORNUMBERMMM->TRANSLATIONVECTORCRYSTALLOGRAPHICSYMMETRYTRANSFORMATIONSTHEFOLLOWINGTRANSFORMATIONSOPERATEONTHEATOM/HETATMRECORDSINTHISENTRYTOPRODUCERELATEDMOLECULES.CRYSTALLOGRAPHICALIjY290SMTRY111.0000000*0000000.0000000，00000290SMTRY210-0000001，0000000.0000000，00000290SMTRY310，0000000，0000001.0000000.00000290SMTRYl2-l,0000000-0000000.0000000*00000290SMTRY220，0000001，0000000，0000000.00000290SMTRY320,0000000*000000-l，0000000，ooooo290SMTRY131.0000000-0000000.000000S6-14900290SMTRY230.0000001-0000000.00000017.62500290SMTRY330，0000000-0000001,000000(K00000290SMTRY140000000.0000000.00000066.14900290SMTRY240000001-0000000.00000017.62500290SMTRY34000000000000—1.000000(K00000230REMARK230REMARK300REMARK300REMARK300REMARK300REMARK:NULLBIOMOLECULE:1THISENTRYCONTAINSTHECRYSTALLOGRAPHICASYMMETRICWHICHCONSISTSOF1CHAIN(S)*SEEREMARK350FORUNIT128REMARK300REMARK350REMARK350REMARK350REMARK350REMARK350REMARK350REMARK350REMARK350REMARK350REMARK350REMARK350REMARK350REMARK350REMARK465REMARK465REMARK465REMARK465REMARK465REMARK46SREMARK465REMARK46SREMARK500REMARK500REMARK500REMARK500REMARK500REMARKS00REMARK500REMARK500REMARK500REMARK500REMARK500REMARK500REMARK500REMARK500REMARK500REMARK500REMARK500SEQRES1SEQRBSSEQRESSEQRBSSEQRESSEQRESHETHETACTHETNCOHETNCOHETNCO肪TNCOHETNCOHETNCOHETNCOHETNCOHETNCOHETNCOHETNTCOHETNCO2345SPDINFORMATIONONGENERATINGTHEBIOLOGICALMOLECULE(S).GENERATINGTHEB工OMOLECULECOORDINATESFORACOMPLETEMULTI旭RREPRESENTINGTHEKNOWNB工OIiOG工CALIjYSIGNIFICANTOIiIGOMER工ZATIONSTATEOFTHEMOLECUL邁CANBEGENERATEDBYAPPLYINGBIOMTTRANSFORMATIONSGIVENBELOW.BOTHNON-CRYST;AIjIiOORAPHICANDCRYSTALLOGRAPHICOPERATIONSAREGIVEN.BIOMOLECULE:1APPLYTHEFOLLOWINGTOCHAINS:AB工OMTl11.0000000.0000000.0000000.00000BIOMT210.0000001.0000000-0000000.00000BIC^IT310.0000000.0000001.0000000.00000OCHAINCODE.)MISSINGRESIDUESTHEFOLLOWINGRESIDUESWERENOTLOCATEDINTHEEXPERIMENT,(M=MOrfflLNUMBER;RES=RESIDUENAME;IDENTIFIER,-SSSEQ-SEQUENCENUMBER,-I-IKSERTIONMRESCSSSEQIAA82GEOMETRYANDSTEREOCHEMISTRYSUBTOP工C:CLOSECCITACTSTHEFOLLOWINGATOMSTHATARERELATEDBYCRYSTALLOGRAPHICSYMMETRYAREINCLOSECONTACT.ANATOMLOCATEDWITHIN0.15ANGSTROMSOFASYMMETRYRELATEDATOMISASSUMEDTOBEONASPECIALPOSITIONANDIS,THEREFORE,LISTEDINREMARK375INSTEADOFREMARK500.ATOMSWITHNCr-BIiANKALTERNATELOCATIONINDICATORSARENOTINCLUDEDINTHECALCULATIONS.DISTANCECUTOFP:2,2ANGSTROMSFORCONTACTSNOTINVOLVINGHYDROGENATOMS1.5ANGSTROMSFORCONTACTSINVOLVINGHYBROG孤ATCOTSATM1OIPA68A68A68A68A9596101102103104105106107108109110111112RESCGSSEQ工A15GGACGUCGCCGGXTGtJCCAATM2RESCSSSQISSYMOP01PGAIS25S6CAUAUAAGGAUAUGAAGUUUCGCACCGUCCGACUADISTANCE1.81UCGGCTJAAAUG10477HETHET議AMHETNAMHETSYNFORMULFORMULHPASO10SPDSPERMIDINEACTACETATEIONNCOCOBALTHEXAMM工NBIONHPAHYPOXANTH工NESPDN-(2-AMINO-PROPYL)-1,"DIAMINOBUTANE'-2SPDC7HIS3actc2h302l-4NCO12(H18N6COl3+)16HPAC5H4Ol17HOH*333(H201》132.29835.25042.22590*0030，00cOR工GXl1-0000000.oooooo0,000000ck()0000io，oooooo1.0000000，000000O.()0000iORIGX30.00010000.0000001，000000o-()ooooiscale10*0075590.0000000,000125o,()OOOOiCKO00O0O0(k0000000")0000iSCALE30000000.0000000.023686(K()ooooATOM103PGA152.25723.,1381,.0073.41atom2pga152.0025,,93721..7151、.0079..84atom3oipga150.5305.,84821..3171.,0079,.33atom402pga152.5977..31721,.4581.0079.,53ATOM505*GA152』094,■90S20..7391,,oo77..83atom6c5*ga154.1714,■54121.0291.,0075,,63atom7c4*ga154.2383,.11921.5431-0073,,85atom804*ga152.9482,74s22,,0991.0073..98atom9c3*ga154，55s2,.02420,5381,0072.,87atom1003*ga15,9452.,03820.1581.0070.52atom11c2*ga153.9330.,79121.2001.0073.,00atom1202*ga154.6500.,23122.2851.0073.25atom13ci*ga152.6481..39721.7661-0072,,98atom14n9ga151.5811.,433so-7671-0072,■54atom15c8ga150，9502■5s0so.2841.0072.23atom16n7ga150.0452.■23619.3821_0071..52atom17c5Ga150.0720,91219.2611,0071..53atom18c6ga15_00..05118-4331,0071.10atom19osga15-1，s790.35517.s201.0071.,14atom20bt1Gais-o339-1,28418，6191.0070.53atom21c2ga150，626-1.734is.4931.0070.46atom22n2ga150829-(>5919.5171.0069.8satom23n3ga151341--0.,94120,2791，0070.84atom24c4a151.0150.3s120.1111_0071."atom25ga16.9840.35s20.7481.00sb.atom26oipga16.8450.90322，2311.0068.62atom2702pga168.3061.28220-1551-00s8.38atom28os*ga16531-0-4482(k1411，0066.18atom29c5*ga167070-.1.64620,6841*00s2.29atom30c4*a16.512-2,86619.9930059.49atom3104*ga165，058-2.82420.0370058.98atom32c3*ga16.820-'2,98118-5131-00s7.81ATOM3303*GA168.106-3,5412S71.00S6.43atom34c2*ga165709-3-902is-0251，00s7.51atom3502*ga16.944-5-2573321,0056.72atom36ci*ga164530-3*42018，8631.0057.12atom37ga16712-2,44818,1551-0055，8satom38c8gais3719-1,08018,2891.0055.10atom33a162851-0.48817，5141.0055.02ATOM40C5GA162.233-1,52Sl右.8251*0054.19atom41ga161,20s-1.51215,8511，0053.76opoooccocococncNCCONCNNCPOOoccococ0cCNccATOM4206GA160-597-0.S4015.3831-0052-60OATOM43NlGA160.894-2，79615.4161.0053*12ATOM44C2GA161.494-3.94515-8591.,0053-54CATOM45GA161.070-5.08915.3071,,0053-43ATOM46GAIS-3，S7516.7751,0053,95NATOM47GA162.767-2-74217.2081.,0054-84CATOM4BPAA178.823-3*35416.8701.0055-82PATOM43OIPAA1710.149-4』1716.9091.0055.720ATOM5002PAA178.728-1.91416.50S1,0055.260ATOM5105*AA177*903-4-18515.8801,0053.030ATOM52C5*AA177.817-5-53415-9911.0051，32cATOM53C4*AA177*075-6-14014.8091.0049-43cATOM5404*AA175.666-5-81814.&281.0048-16oATOM55C3*AA177.434-5-50213*5051.0048.31cATOM5603*AA178.659-6.13413.0121.0048.66oATOM57C2*AA17-5.722IS-6341.0047*38cATOM5802*AA176*231-7,032IS.1061,0045,760ATOM53C"AA175.138-5-51213.S531.00cATOM60AA174-655-4*13413*7161-0045-43ATOM61C8AA175.12614.5131.0045，03cATOM62N7AA174，471-1-38814*37蘭1.0045*06NATOM63C5AA173.505-2-27813.4191.0044-35cATOM64AA172*480-1.50712.8371.0043，36cATOM65恥AA172-232-0.23013-1461.0043.22NATOM66AA17-2-10511-9151.0043.31ATOM67C2AA171.930-3.39011，6071.0043，50cATOM68N3AA172.852-4，21812.08S1.0044.12NATOMC4AA17-3.59612*3981,0044.78CATOM70PCA189.428-5.43411.7631，0048，10PATOM71OIPCA1810*761-6-12411*5331.0048*55oATOM7202PCA189.319-4-01S11-8B61-0047.97oATOM7305*,cA188.513-5-91810*5411.0047，08oATOM74C5*cA188.413-5.0S43-4381.0044.02cATOM75C4*cA187.134-5.2858-6951.0042-22cATOM7604*cA185.989-5，0559.5511.0041.33oATOM77C3*cA18-4.2947,5741*0040*44cATCM47803*cA187，752-4*7376-4891，0038,62oATOM79C2*cA185.468-4-2777.3681.0040.56cATOM8002*cA185*0176.6051,000ATOM81CI*cA184*986-4.3"8-8191*0040.1&cATOM82NlcA184.886-3』323-4271，0039，2SATOM83C2cA183.854-2-1799，0531.0039*01cATOM8402cA183-040-2*5568，1SS1.003^820ATOM85N3cA183.7SS-0.9609-6351-0038*83ATOM8SC4cA184，660-0-58S10*5471.0037.75cATOM87cA184.5240，62111.0921.00ATOM88C5cA185，730-1*43110,9391,0037*85cATOM89C6cA185.804-2，63S103601，0039.12cATOM90PAA198.667-3，6885*725:u0036*72pATOM91OIPA193*480-4*4274，7353L，0037*50oATOM9202PAA199.331-2，8526,7461，0036，38oATOM93OS*AA197.574-2』174，9731,0035-32oATOM94C5*AA19-3-4554.1461，0032,02cATOM95C4*A195，S10-2.4593*6611,0030*54cATOM9604*A194.737-2-0664，7551.0030，35oATOM97AA196.211-1*1483-1841.00cATOM9803*AA196*700-1*2561，8531-0028,920ATOM99C2*AA135*026-0*2083，3071.0029,76cATCI10002*AA194.113-(K4272-2541,0030，88o131200580046277.7說明書第126/162頁ATOM101CI*AA1943844,60SoHCATOM102AA194.8400，0465，7831.0027-74ATOM103C8AA195』02-0.2996.7001*0026.96cATOM104N7AA195.9550.5837.6661*0026*99ATOM105C5AA1951.5777.3581』026*41cATOM106AA1946842.7808.000i，oo25，24cATOM107AA195.2093.1959,1531*0025-00ATOM108NlAA193.7333.5477.4151,0025，67ATOM103C2AA1931763，1166.2841*0024，91CATOM110N3AA193*4015,602i，oo25.13ATOM111C4AA194-3531-2651.0026.86cATOM112PUA207.901-(K3071.370i，oo27-68pATOM113OIPUA208.299-0，7220,0061.002S，660ATOM11402PUA208.908-0，2462,4441-0027*220ATOM11505*UA2072301，1221，256l，OO25*69oATOM116C5*UA2062451.3730.2831.0022-92cATOM117C4*uA205.7192.7800.4231.0021.41cATOM11804*uA205.0422.9071.7101.0020*040ATOMinsC3*uA206.7773-8740.487i，oo19.50cATOM12003*uA207，2594.26S-(K783i，oo20，050ATOM121C2*uA20-0275.0001.1731.0018-58cATOM12202*uA205，1035-6170.3011.0017,800ATOM123uA2052204.2312*2121.0019.20cATOM124UluA205.9004-1913.5171.0018-08ATOM125C2uA205.6685,2534.365cATOM12602uA204.9516-2054.0591.0015.17oATOM127N3uA206.3035-1745.5801.001"8NATOM128C4uA207，1274，1676.028:uoo18*60CATOM12904uA2076154，2487.1671.0015.59oATOM130C5uA207-3333.1015-0871.0017-76ATOM131uA2067253*1543.8881,0017*60cATOM132PAA2184，707-0.950i，oo21，07pATOM133OIPAA218.9585.041-2-388i，oooATOM13402PAA21.7263.742-0.3391.0017.87oATOM13505*AA218.914-0，1041.0018-44oATOM136C5*AA218.3117.240-0*587l"9cATOM137C4*AA218，4588.3980.3841.0015-52cATOM13804*AA2177818.0971，6351.0016*13oATOM139C3*AA219.8858，6601.0016*12cATOM14003*AA21105789.4151.001S.84oATCM141C2*AA219，6709.4622.1231.0014，81cATOM14202*AA21.39010-8241.853i，oo16,32oATOM143CI*AA218.4208*7941*0016.03cATOM144AA2187457，8983，8051.0014.49ATOM145C8AA2192003.807i，oo14*35cATOM146N7AA2195006-1615-0021.0014*14AT咖147C5AA219.1927-2275，846i，oo13*55cATOM148C6AA2192887*4007.255i，oo13.46cATOM149N6AA217606.4678』831*0013,17ATOM150NlAA218*8818，5887.7781-0014，41ATOM1S1C2AA218.4199.5326.9351.0014-69c152N3AA2182943*4835,6001,0016-23ATOM153C4AA218,702B*2885，122i，oo13*95cATOM154PUA22118338，778-0.8601.0017*13pATOM15501PUA2212143-1.9301.00oATOM15602PuA2211.5727-360-1.2231.00l"loATOM15705*uA22129558*7350*2741.0017*340ATOM158C5*uA22140867，8790，2601.0015*80cATOM159C4*uA22146687，7611.6541.0013*76cATOM160UA2214.9809.1042.130l，OO13,53OATOM161uA22135757.2292，579LOO14.34CATOM162uA22140S9"4003-6351.0016*58OATOM163uA2212.9508.4793.2041.00H31cATOM16402*uA2212..4193.3014，510l，OO12-30oATOM165CI*uA2214,■1409*4443.2071-0013，55cATOM166WluA2213■83210.8763.147l.OO14.29ATOM167C2uA2214.05511.6194.286l，OO13.16cATOM16802uA2214,53411.1535.327l，OO15.12oATOM169N3XJA2213■.70612.9254*1861.0013*49NATOM170CMuA2213,,17213-5693.099l，OO13,63CATOM17104uA2212..78314*7283.2281-0012*03oATOM172C5uA2212.99012.7471*9481*00cATC^173csuA2213.,32011.4532,0091*0013*42cATOM174pAA2314.,5024.8693-3971.0016.90pATOM175AA2313..7732.214l力O17*04oATOM17602PAA2314.,3514.224:uoo16，03oATOM17705*AA2316..0574.9493，0521.00oATOM178C5*AA23IS..9375.6843-9401.0016.50cATOM17&C4*AA2318.,2205,9703,200l，OO1"03cATOM18004*AA2317.,896S.559U141.0015-15oATOM181C3*AA2319.1237.0003*8651.0015.88cATOM18203*AA2320.007。3504,77分1.00oATOM183C2*AA2319.9327-5352.689LOO14*37cATOM18402*AA2321.0386.6892.4371.0014.07oATOM185CI*AA2318.9247.4471.539l，OO15.13cATOM186N3AA2318.3138.7171.1571.0014.71NATOM187C8AA2318,0279.134-0.1131.0014.38cATOM188N7AA2317.51310.334-0，1711.0015，S2NATOM189C5AA2317.44010.7271-1591.0014，12CATOM190AA2316-98411.8321-762l，OO13，27CATOM■191AA2316.51712.9441.0741.0013-02ITATOM192AA2317.02911.3623,103l，OO13，36ATOM193C2AA2317-52210.9213.7911*0012-32CATOM134N3AA2317.9963.3281.0012*80ATOM195C4AA2317.9249.7371.3881.0013*37CATOM1%PAA2419*7926，5216.3671.0016-08ATOM197OIPAA2420.7405.5387-026l，OO18-75OATOM19802PAA2418.3706.689l，OO17.24oATOM19905*AA2420-280B.006€，656l，OO14*02oATOM200C5*AA2419-4379，1236，288l，OO12*57cATOM201C4*AA2419*3IS10，0417，4751.0013，24cATOM20204*AA2418-3699.4268.4021.0014.03o203A242(K5548,339l，OO12.分BcATOM20403*AA2421.36911*3517.8011.0013*11oATOM205C2*AA2413.90710.750"471.0013*47cATOM20602*AA2419.45312.0S99，6221*0011*36oATOM207CI*"AA2418，6679.8513.7201.0013，92cATOM208HT9AA2418.8068.67110*5841.0014-61NATOM203C8AA2418*8417.34210*2301.0014，46cATOM210N7AA2418.8856.52611，2501,0015.41NATOM211C5AA2418，9057.37212.3481.0013，99CATOM212C6AA2418.9397.12913-7221.0013-84CATOM213抓AA2418.92814*2671.0013，33NATOM214AA2418，9698.201H5431.0011.61ATOM215C2A24is-9459.42914.0081.0011，99CATOM216AA249049.78412*7401,0014-75ATOM217C4AiV2418.8858*63411，949l，OO12，94cATOM218PUA2522.33111-1177.4331.0014，31pATOM219OIPUA2523.3849*7747,.9671-0013.12OATOM22002PA2523^8012*3307.9331-0015-11OATOM221OS*trA2522.9"11.1825..9041-0012-37O222C5*uA2522，8899,9875,.1171*0015*75CATcavi223C4*uA2522.39410.3143,.7151.00:u，54CATOM22404*XJA2521.01910,7863..7861.0014*76OATOM225C3*uA2523，14411，4443■0311-0015.39CATOM22603*uA2524，3312,4031.0015-75oATOM227C2*TJA2522.11411，3592.0271.0015.07cATOM22802*XJA2522，01611，1230.8891.0014-04oATOM229CI*UA2520*81711，8192.8311.0014*18cATOM230uA2520.41213.0423.5491.0010，89NATOM231C2uA2519.97214，0342.7971.0012.S8CATOM23202uA2519.9171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,1213731.0028.510ATOM1339N3uA7725536.0058.36010028.43N如果各步驟分別進行，則在上述步驟的每一步之后都會形成一種特有的混合物。此外，不論各步驟如何進行，在所有步驟完成之后也會形成一種混合物。本發(fā)明的公開內(nèi)容考慮了由實行所/>開方法所獲得的這些混合物，以及含有例如本文所公開的試劑、組合物或組件的混合物。0.系統(tǒng)公開了用于實行或輔助實行所公開方法的系統(tǒng)。系統(tǒng)通常包括制造的物體的組合例如結(jié)構(gòu)、機械、裝置等，以及組合物、化合物、材料等。這些組合為已公開的或從公開考慮的內(nèi)容可以顯而易見的。例如，公開了和考慮了包括生物傳感器核糖開關(guān)、固體支持物和信號讀取裝置的系統(tǒng)。p.數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和計算機控制公開了所公開方法中使用的、由所公開方法產(chǎn)生的或從所公開方法中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)通?？蔀樵诮M合物或介質(zhì)中采集、編組、儲存和/或體現(xiàn)的任何形式的數(shù)據(jù)、信息和/或?qū)ο?。以例如RAM或存儲磁盤的電子形式儲存的核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)和激活測量結(jié)果就是一種類型的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。所公開的方法或其任意部分或由該方法制備的制品，都可以通過計算機控制來進行控制、管理或輔助。這類計算機控制可以通過計算機控制過程或方法來實現(xiàn)，可以使用和/或產(chǎn)生數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，并可以使用計算機程序。這類計算機控制、計算機控制的過程、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和計算枳4呈序都被考慮到并應(yīng)理解為在本文中被/>開。方法公開了用于激活、失活或阻斷核糖開關(guān)的方法。這類方法可包括例如使核糖開關(guān)和可激活、失活或阻斷該核糖開關(guān)的化合物或觸發(fā)分子相接觸。核糖開關(guān)通過觸發(fā)分子的結(jié)合或移除來發(fā)揮控制基因表達的功能?；衔锟捎糜诩せ?、失活或阻斷核糖開關(guān)。核糖開關(guān)的觸發(fā)分子(以及其他的、激活化合物)可被用于激活核糖開關(guān)。通?？墒褂糜|發(fā)分子以外的化合物來失活或阻斷核糖開關(guān)。還可以通過例如從核糖開關(guān)所在處移除觸發(fā)分子來失活核糖開關(guān)。因此，所>^開的失活核糖開關(guān)的方法可以包括例如從核ATOM1399NlCA80-2.483-4."21201910056-16ATOM1400C2CA80_1.428-4.330129231,0055-40CATOM140102cA80-O.739-S-33213.1601005SsoOATOM1402N3cA80-l,184_3-14013.51610054.79ATOM1403C4cA80-l*948-2.08513.2361.00S4.67CATOM1404N4cA80_1.659_0*9311383010054.49NATOM1405C5cA80_3■038_2.1S712-32910055.04CATOM1406C6cA80_3268-3.3481174810055.31CATOM1407PcA81-6.4S2-7.2751410110067.04PATOM1408OIPcA81-7,534-8，28814.1351，0067,S6oATOM140902PcA81-6.793-5.83214.228100".oATOM141005*cA81-5.356-7-63715.2001.0067■52oATOM1411C5*cA81-4.468_8-7291499510068.78cATOM1412C4*cA81_3.176-B,5041S.7"1-0070,00cATOM141304*cA81-2.545_729515,.23910070,.26oATOM1414C3*cA81_3,315-8.24617,.236100'70,,40cATOM141503*cA81_3.607-9.40518,.0441-0071..08oATOM1416C2*cA81-2.027-7-49317,.5571,0070.66cATOM141702*cA81-0891-8.33117,■6911.0070..460ATOM1418CI*cA81-l.8"-616..29S1.0070.42cATOM1419NlcA81_2.395_52671S.42S1,.0070.,24ATOM1420C2cA81-l.749-4■38317..3011,0069..97cATOM142102cA81-0■778-4.73217.,1.0069,,96oATOM1422N3cA81-2,.199-3.11S17.,4061,.0069-86NATOM1423C4cA81-3.253-2,>71916,,6871,.0069,98cATOM14241ST4cA81-3,.655-1,-45116..8121,,0070.37NATOM"25C5cA81-3..940-3,,G0315,8051,.0069.65CATOM1426C6cA81-3..483-4.-85715,7081,,0070.02cTER1427cA81HETATM1428NlSPD9530.63515..3486-7B61,,0032.95HETATM1429C2SPD9529'.60115..1377.6381..00S4,77cHETATM1430C3SPD9528.■16014.,7947.1501,0032.97cHETATM1431C4SPD9S27.1S415.9126.7371,.0035.47cHETATM1432csSPD9527.,89617.2066，2161,.0034.05cHETATM1433SPD9528,,35618..2807■1541.,003S.93HETATM1434C7SPD9528..12918.'2168.6961,.0037.54cHETATM1435C8SPD9526,,69918.3589.2851,0036.82cHKTATM1436C9SPD9525,,56318.,9638.3581,.0033.41cHETATM1437N10SPD9524,■96318.,1"7."21■0038.63NHETATM1438CACT9635.,75218..87210.8591.,0011,75CHETATM1439oACT9635,,66618.-44712.0331,,0012,77oHETATM1440OXTACT963S.8S520.11410-4381,0013.73oHETATM1441CH3ACT9635.,72517.8229.7621,0010-3ScHETATM1442COuco10133.77917.,8110，5200012，16HETATM1443NlNCO10135.62818.02003S00HETATM1444N2NCO10131.91217'6050.0161,0011-81HETATM1445N3NCO10134.2481G.1B9-o,5281.0012.00HETATM1446N4NCO10133.306IS-4171.S651,0012.05NHETATM1447N5UCO10133,488IS.6822.1341.0011-77HETATM1448NSNCO10134.07918.927-l.0"1-0010.05NHETATM1449CONCO10230.972IS-53821.0400018.89HETATM1450NlNCO10232.077IS.97820.S400018.01HETATM1451N2NCO10223.8S117.07921.5"1，0020.34HETATM14S2N3NCO10229,40814,67420.2811，0018-HETATM1453uco10232.54016.40721.7931，0019.16NHETATM1454N5NCO10230.62214.70022*8021,0021.31HETATM1455恥NCO10231.34816.35719-2881.0018.20HETATM1456CONCO10330..07910.,96313.083,009,.34COHETATM1457NlUCO10331.1439.,31812..9371..0010,,62HETATM1458N2NCO10329.01612..607IS-.2311,,0010..47HETATM1459N3NCO10328..6239..958IS,9S31..009,,30HETATM1460N4NOD10331,53011.39412,,2281..0011..47HETATM14611033088711..31214.,B481..0010,,33NHETATM1"2恥nco10329,.29310.59111,,3351,,008,HETATM1463CONCO10435,73825..3396..924,0010,,52HETATM1464NlHCO10437,19223.9916.1,.009.,12HETATM1465N2NCO10434'.29226,,6,.9171..009.,97N"HETATM1466uco10435.29024..B035,.0791,,0010..32NHETATM1467N4NCO10436,.20025.,8508..7821'.0010..04NHETATM14S8N5NCO10434.46223..9827.,6101.,0010.,02NHETATM1469NCO10436.98926.,6736..2551.,009,,93HETATM1470CONCO10538.,319S.,18118',3540017.,ISHETATM1471NlNCO10538..5657.21218.2S31,,00IS.,21NTHETATM1472N2NCO10538,,06311■13118..4551..0016..52HETATM1473NCO10537..1669.11816..7561.0015-37NHETATM1474恥NCO10539.,472S.23119.9431.001S,.14NHETATM1475NCO10536..7478.92719-4881.0013,,92麗TATM147SN6NCO10539.8349-42817.,2211.,00IS,,03N"HETATM1477CONCO10629..79711.Gil-O.,6830029.10HKTATM1478NlWCO10S30.,1333*MS0'4121.0026.22HETATMN2NCO10629.45913.224-l.7861-0027.55NHETATM14&0NCO10627-■94710.996-0.9791.0027.31NHETATM1481N4WCO10631.64712,200-0.3881-0026.94NHETATM1482NCO10629.21312.5980-9261.0078HETATM1483恥NCO10S30.38210-638-2.3071.0027.86NHETATM14B4CONCO10721.,06421.82413.8590074HETATM1485NCO10719.81720*30913，9"1.00G5."NHETATMI486N2NCO10722.31623-35013.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19..43oHETATM16020HOH36827-008IS-37113742i.0016.03oHETATM1603oHOH37040.117IS*54124.855i.0017.75oHETATM1604oHOH37142.20424.72215.562i,0020.80oHETATM1605oHOH37233.33427-0S44.009i，0014.27oHETATM1606oHOH37334.36922.7S4-O-160:u0016,.16oHETATM1607oHOH37426.150分-9138■539:u0017,96oHETATM1608oHOH37540.78311.1036:u0014,.78oHETATM1609oHOH37635.92821*0121.4660026,.24oHETATM1610oHOH37716.64610-599-2,"11-0019,.58oHETATM1611oHOH37825.56213-304■3130018,69oHETATM1612oHOH37920.343-l.5898.7280018,.33oHETATM16130HOH3B017.4784.52180S3i-0017.,20oHETATM16140HOH38137.63327-81910,,864:u0019,,8SoHETATM1615oHOH38250*063835417,.181i，0025.,S5oHETATMoHOH38322*21519-277_1,.4140021.,60oHETATM1617oHOH38426.83912,73323,,127i,0021,,66oHETATM161BoHOH38527.31020.2845,282i-0023..43oHETATM1619oHOH38635.47714*5211,■83200IS.09oHETATM16200HOH38736.4215-3745,.731:u0018.■50oHETATM16210HOH38835.65713.08921,.646i-0027.,43oHETATM1S220HOH38331.262—0*02815,,535i,0026,,71o157HETATM16220HOH39012,,25813.37614.3331--0023.,39OHETATM1624OHOH39141.,54724.2609.,7811..0018.,53OHETATM16250HOH39245.,07423.30112..0581.,0034,.28OHETATM1625OHOH39326.,07411.,51813..04S1.,0013.39OHETATM1627OHOH3955,5878.Gil15.,0391,,0030..OSO1628OHOH39S16..781-2-19117,,1481,002S.,65OHETATM1629OHOH39839'000-l.72512,.8411-,0027..22OHETATM1630OHOH39945,53S20.,80713..713L0022.,64OHETATM1631oHOH40033..0245,,3516.,7181.0027,45o1632oHOH40119,,1286.10317..1721.0023.,23oheta1633oho狂402-2..41415.,769-5.■9771.■0028,,56oHETATM1634oHOH40435,,8631.,06610,,0341.0021,,22oHETATM1S3SoHOH405在5..7816.08810..8311.,0032.,51ohetatmohoh40620,,s8025.71618..2051.■0023,■14ohetatm1637ohoh40726..44923..755一4,,0771,,0019,.44oHETATM1638oHOH40813..4046.7126.4441.■0020.,71oHETATM1639oHOH40933..91222,1714.S581,■0018..92oHETATM16400hoh41039,,62915.71513.>2111.,0093,.76oHETATM1641oHOH41135.,29711..65618.,3521,.0021..88oHETATMoHOH41210■,9544,,1822..0081,.0023.,12oHETATM1643oHOH41328..94721.11311.,"21,,0022,,81oHETATMoHOH4145..1707.27312.■6331,,0027..36ohetatm1645oHOH41528，,47116-58318..0951,,0022,.56ohetatmohoh4164,654494523.,8801.,0052.,S7oHETATM1€47oHOH41338■,8604*45816-7401,,0033,,74ohetatm1648oHOH420-2.5497,590-3.638jl,0024.47oHETATM1649oHOH42145■37714.32421.S731.0021.22oHETATM1650oHOH42221.19623*1268.0941,0024.30oHETATM1651oHOH42324.7203(K7893.2381.0017.59oHETATM16520HOH42425.,5643.1386.6221.0021.50oHETATM1653oHOH425-34-23523*18616.7861,0020.56oHETATM1654oHOH42626-55515*84820.7971.0034.81oHETATMoHOH42716.13710.31416.9751.0035.39oHETATMoHOH428H5.2375,3419,7201.002S.74oHETATMoHOH4295.843IS.50413.4791*0020.66oHETATM1658oHOH43034.26735*2582.8091.0018.39oHETATMoHOH43134，4788*94616.7061.003*7.42oHETATMoHOH43223.0526*5634.2671，0023-73oHETATMoHOH43324,461SI-8318.0011.00:i9.72oHETATMoHOH434IS.811S'911-0.9911.0039-78oHETATMoHOH43518-336B，75S17.26S1,0016.77ohetatm1664ohoh43617-0s132*4519.2141,0032，73oHETATMohoh43725.18515-72710,1551*0023.94oHETATMoHOH43836.81934*9706*0441,0023.13oHETATM1667oHOH43936-3712*9567*5851,0022-07oHETATM1668oHOH4407.68S18,108-(K70S1*0031，oHETATM1663oHOH44228.1545-986S，62S1.0034,"oHETATM16700HOH44343-7S57*9313.7101,0023.75oHETATM1671oHOH44434-13311.97915,6971,0019，26oHETATM1672oHOH44516.1542-8766.3171，0024，75oHETATM1673oHOH4463，13815.74015.47S1,0047.5Soheta:em1674oHOH"716-35921.3204.3201，0027*58ohetatm1675ohoh44843.253885is-5671，0016.32oHETATMoHOH44935,6976.3172911,0034.21oHETATM1677oHOH45026*1187，9521-4241.0047'42oHETATM1678oHOH451Il-78219,7-2781.0031.23oHETATM1679oHOH452ls'18012,084-5.2281,0027.14oHETATM16800HOH45437.28510.8363-4171，0029.24oHETATM1681oHOH.45649.05414*72018.8701，0034*45o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage159</formula>HETATM17410HOH51912.,974HETATM17420HOH52041,,002HETATM17430HOH52128,,471HETATM17440HOHS221,.319HETATM17450HOH52447,380HETATM1746oHOH5252-015HETATM17470HOH52634.,792HETATM17480HOH527_4,,125HETATM17490HOH52814.,446HETATM17500HOH52913,,539HETATM17510HOH53015.285HETATM17520HOH53135..293HETATM17530HOH53231,,338HETATM17540HOH53310,.807HETATM1755oHOH53423■.897HETATM1756oHOH5354..746HETATM17570HOH53624..434HETATM17580HOH53743..950HETATM1759oHOH53823,,116HETATM17600HOH5399..978HETATM1761oHOH5402001HETATM17620HOH5413..1"HETATM17630HOH5429.889HETATM1764oHOH54347.,304HETATM17650HOH5444,■895HETATM17660HOH54S3S..433HETATM17670HOHS4730.,374HETATM17680HOH54846.,023HETATM17690HOH54940.,466HETATM17700HOH55024.■133HETATM1771oHOH5513446HETATM1772oHOH55219.319HETATM17730HOH55331.891HETATM1774oHOH55418.491HETATM1775oHOH5551■314HETATM177S0HOH55628,146HETATM17770HOH55730.223HETATM1778oHOH55817.905HETATM1779oHOH55929.909HETATM1780oHOH56031.631HETATM17810HOH56224.042HETATM17820HOH56337.392HETATM1783oHOH564-1.9"HETATM17840HOH56547.315HETATM1785oHOH56625.748HETATM1786oHOH56721.IISHETATM17870HOH56823.715HETATM17880HOH56933.531HETATM17890HOH57020.908HETATM1790oHOH57139.015HETATM17910HOH57241.0S1HETATM1792oHOH57330.S9BHETATM17330HOH574S.853HETATM17940HOH57539.059HETATM17950HOH57638.160HETATM1736oHOH57720*383HETATM1737oHOH57841.1S7HETATM17980HOH57927*327HETATM17930HOH58034-592160-s.9959..9S81,,0055,96O30.19016,.0571,0046,34O5.0801,.5981,.0038..47OIS.1188,-8871,,0040,.7502412..7031,.0059,46o17-05812..0741..0047.■46o8,33223.■0141,■0017,,7203.13911,■1201.,0035,8S021-6538,,9041,.0029.07o2411,■7281,.0032,0702.359124001.0045,20o32.87716.4271-004171011-70322,,6241.,0030.3803，8995-5331..0031.89023*200-28321.0031,97o239-2,472I..0030.20o2S.832-2,,0171,,0031,20o0.54413.4471,.0041.3308.5550,.6681,0035,.22o15.06814,.401■0030.790*28412,,9601,■0043,,0303,59212,,7021,00S7,,9609-611_3,;091,,0031,.84017*6486..3121.,0033.■07o-3.53610,.。S1,,00S3,,30o25.7038.,0861..0018,.28o-4*05814..167i..0015.■55015.72924■■092i..0025.■930-1.03517.,221i.,0030.,0800.72719.,713i.0026,,39o427-2,,135i.0031.76o13■000-2.,575i.0041.76o31.5B018.610i.0024.,77o2,3344.6S0i.0022.10o11.2790.038i.0026.52o13.25610,333i-0021.95o20.8045.B27i.0036.8201332815.220i，0020.710-o03518-733:l，0021,34o17,,6649.008i.0019.67o20,,35419，484i.0031.11oIS,.228_0.497i.002S.68o8.648-0,i.0039-ISo9.27922.936l.0035.60o7.2€64.529i.0028.B2o14..888_2109i，0036,75o20..1265.S45l.0040.350_0.77113.511i,0045.31018.74915.637i，0034.23o32..5294.S01l-0054.73o0..455713000S4.62o17,,7405.1060035.84o5..06317*712i*0037.5508.,S573*005i-0053.67o32,.27616，708i.0037，88021.,318-4，691i.0039.17o6,.77717.217i*0035.75o21..2578，150i*0042.39024..S8S1,886l*0030.170<table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table>HETATM1859OHOH6404.000HETATMI860OHOH64116-678HETATM1861OHOHS428358HETATM18S2OHOH64341.S1518S3OHOH64429.021HETATM1864OHOH64544197HETATM1865OHOH"622.571HETATM1866OHOH6471-473HETATM1867OHOHS4846，3591868OHOH64924330CONECT14281429CONECT142314281430CONECT143014291431CONECT143114301432CONECT143214311433CONECT143314321434CONECT143414331435CONECT143514341436CONECT143614351437CONECT14371436CONECT1438143914401441CONEOT14391438CONECT14401438CONECT14411438CONECT14421443144414451446CONECT144214471448CONECT14431442CONECT14441442CONECT14451442CONECT14461442CONECT14471442CONECT14481442CONECT14491450145114521453CONECT144914541455CONECT14501449CONECT14511449CONECT14521449CONECT14531449CONECT14541449CONECT14551449CO孤CT14561457145814591460CONECT145614611462CONECT14571456CONECT14581456CONECT145914S6CONECT14601456CONECT14611456CONECT14621456CONECT146314"146514S7CONECT1463146814G9CONECT14"1463COKECT146514S3CONECT14S3CONECT1463CONECT14681463CONECT14691463CONECT14701471147214731474CONECT147014751476CO肌CT14711470-2.10S-0*0401*0057-30023.79911*3631.0065.1900.7109*3041*0043-7002，90817*8761-0052-32013.1522.6111*0026.91015.5802.16776-220S，260-1*0001.7533-4691*0040-9307*0343U0037.66017-91517.1091*0053*900CONECT14721470CONECT14731470CO犯CT14741470CONECT14751470CONECT147S1470CONECT14771478147914801481CONECT147714821483CONECT14781477CONECT14791477CONECT14801477CONECT14811477CONECT14821477COTECT14831477CONECT14841485148614871488CONECT148414891490COTECT14851484CONECTI4861484CONECT14871484CONECT14881484CONECT14891484CONECT14901484CONECT14911492149314941495CONECT149114961497CONECT14321491CONECT14931491CONECT14941491CONECT14951491CC^IECT14%1491CONECT14971491CONECT14981499150015011502CONECT149815031504CONECT14391498CONECT15001498CONECT15011498CONECT15021498CONECT15031498CONECT15041498CONECT1S051506150715081509CONECT150515101511CONECT15061S05CCWECT1&071505CONECT15081505CONECT15091505CONECT15101S0SCONECT15111505CONECT151215131514151S151SCONECT151215171518CONECT15131512CONECT15141512CONECT15151512CONECT15161512CmECT15171512CCftiTECT15181512CONECT15191520152115221523CONECT151915241525CONECT15201519CONECT15211519CONECT15221519CONECT15231519<formula>formulaseeoriginaldocumentpage164</formula>表7.與各種核堿基結(jié)合的腺噤呤核糖開關(guān)RNA(AR)相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table>所有試驗均在50mMK+HEPES,pH7.5，100mMKC1，10mMMgCh溶液中，在30n條件下進行。n.d.表示在反應(yīng)中沒有顯示出可檢測的結(jié)合。*在298K和323K之間測量的這一反應(yīng)的熱容量(ACp)為-1.10kcal表8.與各種核堿基結(jié)合的鳥噤呤核糖開關(guān)RNA(GR)相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table>所有試驗均在50mMK+HEPES，lOOmMKCl，10mMMgCh溶液中，在30'C條件下進行。n.d.表示在反應(yīng)中沒有顯示出可檢測的結(jié)合。*除非11保持為1，否則軟件不能調(diào)整數(shù)據(jù)并報告參數(shù)。應(yīng)當理解的是，所公開的方法和組合物并不限于本文所述的具體方法學(xué)、實驗方法和試劑，也可以有所變化。還應(yīng)理解的是，本文所用術(shù)語只是出于描述特定實施方案的目的，而非意在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅僅由后附的權(quán)利要求書限定。必須注意的是，除非上下文中另外明確指出，在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式的"一"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)指代對象。因此，例如，提及"一種核糖開關(guān)"包括多個這樣的核糖開關(guān)，提及"該核糖開關(guān)，，是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個或多個核糖開關(guān)及其等價物，等等。"任選的"或"任選地"意為后面描述的事件、情況或物質(zhì)可能出現(xiàn)或存在，也可能不出現(xiàn)或不存在，這樣的描述包括所述事件、情況或物質(zhì)出現(xiàn)或存在的情況和所述事件、情況或物質(zhì)不出現(xiàn)或不存在的情況。本文中范圍可以表示為從"大約"一個具體的數(shù)值，和/或至"大約"另一個具體的數(shù)值。當表示為這種范圍時，除非上下文中特別指明，還特別考慮和認為公開了從一個具體數(shù)值和/或至另一個具體數(shù)值的范圍。類似地，當通過在前面使用"大約"將數(shù)值表示為近似值時，除非上下文中特別指明，應(yīng)當理解的是，該具體的數(shù)值構(gòu)成另一個被特別考慮和認為被公開的實施方案。應(yīng)當進一步理解的是，除非上下文中特別指明，每個范圍的端點在與另一個端點相關(guān)和獨立于另一個端點時都是有意義的。最后，應(yīng)當理解的是，除非上下文中特別指明，在明確公開的范圍中所包括的所有個別的數(shù)值和子范圍也被特別考慮和認為被公開。不論在具體的情況下這些實施方案的全部或部分是否被明確地公開，上述的原則都適用。除非另有定義，否則本文中使用的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語的含義都與雖,然在頭應(yīng)孰松觀'J冬反明萬'沃和纟且兮物町^]。同的任何方法和材料，但是具體可用的方法、裝置和材料仍然如本文所文。但是本文不應(yīng)被理解為承認本發(fā)明不能在先前的發(fā)明之前i出。并未承認任何參考文獻構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)。參考文獻的討論說明了它們的作者的論斷，但是本申請人保留懷疑所引用文獻的正確性和相關(guān)性的權(quán)利。可以清楚地理解，雖然本文中提及了許多出版物，但是并未承認這些參考文獻構(gòu)成本領(lǐng)域的公知常識的任意部分。在本申請的說明書部分和權(quán)利要求部分的通篇中，詞語"包括"及其同義詞"包含"和"含有"的含義為"包括但不限于"，并不意在排除其它的添加物、組分、整數(shù)或步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用常規(guī)試驗范圍內(nèi)的手段就可以認知或確認本文所述方法和組合物的具體實施方案的許多等價物。下述的權(quán)利要求書意在涵蓋這些等價物。權(quán)利要求1.天然鳥嘌呤應(yīng)答性核糖開關(guān)的原子結(jié)構(gòu)，包括圖6中所示的原子結(jié)構(gòu)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的原子結(jié)構(gòu)，其中所述原子結(jié)構(gòu)的原子坐標包括圖6中所示原子的表6中所列的原子坐標。3.根據(jù)權(quán)利要求1的原子結(jié)構(gòu)，其中所述原子結(jié)構(gòu)的原子坐標包括表6中所列的原子坐標。4.一種識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法，包括(a)使用權(quán)利要求l的原子結(jié)構(gòu)與待測化合物進行建;f莫；和(b)測定待測化合物是否與核糖開關(guān)相互作用。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述測定待測化合物是否與核糖開關(guān)相互作用的步驟包括測定核糖開關(guān)模型中的待測化合物的預(yù)計最小相互作用能、預(yù)計結(jié)合常數(shù)、預(yù)計解離常數(shù)或它們的組合。6.4艮據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述測定待測化合物是否與核糖開關(guān)相互作用的步驟包括測定待測化合物和核糖開關(guān)模型中的一個或多個預(yù)計的鍵、一種或多種預(yù)計的相互作用或它們的組合。7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述核糖開關(guān)為鳥噤呤核糖開關(guān)。8.4艮據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述鳥噪呤核糖開關(guān)為表5中的核糖開關(guān)。9.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中在(b)步驟中測定原子接觸，由此測定待測化合物與核糖開關(guān)的相互作用。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，還包括下述步驟(c)識別待測化合物的類似物；(d)測定待測化合物的類似物是否與核糖開關(guān)相互作用。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述化合物為次黃噤呤。12.—種殺菌方法，包括將細菌與權(quán)利要求10的方法所識別的類似物相13.—種殺菌方法，包括將細菌與權(quán)利要求4的方法所識別的化合物相接14.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中使用基于凝膠的分析來測定待測化合物是否與核糖開關(guān)相互作用。15.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中使用基于芯片的分析來測定待測化合物是否與核糖開關(guān)相互作用。16.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所迷待測化合物的相互作用是通過范德華相互作用、氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用或它們的組合。17.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述核糖開關(guān)含有RM切割核酶。18.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中當含有淬滅部分的核酸被切割時產(chǎn)生熒光信號。19.4艮據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中使用分子信標技術(shù)來產(chǎn)生熒光信號。20.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中使用高通量篩選來實行所述方法。21.—種識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法，包括將核糖開關(guān)與待測化合物相接觸，其中在核糖開關(guān)與待測化合物相互作用時產(chǎn)生熒光信號。22.—種識別與核糖開關(guān)相互作用的化合物的方法，包括(a)識別核糖開關(guān)的晶體結(jié)構(gòu)；(b)對核糖開關(guān)和待測化合物進行建模；和(c)測定待測化合物是否與核糖開關(guān)相互作用。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述核糖開關(guān)為鳥噤呤核糖開關(guān)。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述鳥噤呤核糖開關(guān)為表5中的核糖開關(guān)。25.—種可調(diào)節(jié)的基因表達構(gòu)建體，包括編碼RNA的核酸分子，所述RNA包括與編碼區(qū)域可操作地連接的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)為表5中的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)調(diào)節(jié)RNA的表達，其中所述核糖開關(guān)和編碼區(qū)域為異源的。26.根據(jù)權(quán)利要求25的基因表#建體，其中所述核糖開關(guān)被觸發(fā)分子所激活，其中所述核糖開關(guān)在被觸發(fā)分子激活時產(chǎn)生信號。27.—種檢測目的化合物的方法，所述方法包括使樣本與核糖開關(guān)相接觸，其中所述核糖開關(guān)為表5中的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)被目的化合物所激活，其中所述核糖開關(guān)在被目的化合物激活時產(chǎn)生信號，其中所述核糖開關(guān)在樣本中含有目的化合物時產(chǎn)生信號。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述核糖開關(guān)在被目的化合物激活時改變構(gòu)象，其中所述的構(gòu)象的改變通過構(gòu)象依賴性標簽產(chǎn)生信號。29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述核糖開關(guān)在被目的化合物激活時改變構(gòu)象，其中所述的構(gòu)象的改變導(dǎo)致與核糖開關(guān)相連的RNA的表達改變，其中所述表達的改變產(chǎn)生信號。30.才艮據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中通過與所述核糖開關(guān)相連接的RM所表達的報告蛋白產(chǎn)生信號。31.—種抑制基因表達的方法，所述方法包括(a)使細胞與一種化合物相接觸，(b)其中所述化合物具有式I的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中當所述化合物與鳥噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)相結(jié)合時，f和R2作為氫鍵供體，W作為氬鍵受體，R9作為氫鍵供體，R18作為氫鍵受體，其中每個"——"獨立地代表單鍵或雙鍵，其中所述化合物不是鳥噤呤、次黃噤呤或黃嘌呤，其中所述細胞含有編碼RNA的基因，所述RNA含有鳥噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)，其中所述化合物通過結(jié)合鳥噤呤應(yīng)答性核糖開關(guān)來抑制所述基因的表達。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中R'為氫鍵受體。33.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中R1、R2、f或它們的組合分別獨立地為-NR11-、-CHR"-、-CW^^-C—NR11)-,其中R"為-H、-NH2、-0H、-SH、-C02H，取代或未取代的烷基、烷氧基、芳基、芳基氧基或苯曱氧基，-NH烷基、-NH烷氧基、-NHC(0)烷基、-NHC02烷基、-NHC(0)NH2、-NH-NH2、-NH-NH烷基、-NH-NH烷氧基、-NH-S02烷基、-NH-SO廣R12、-NHC02CH2-R12、-NH-OR12、-N+H2-R12、-NH-NH-R12—-NH-NH-CH2-R12，其中R"為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中n為l至5，R"為一個或多個-H、-NH2、-OH、烷氧基、-N-嗎啉代或面化物。34.才艮據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中R8和R7—起代表-CH-N-、-CH廣0-、-CH廣S-或-CH2S02-。35.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中R"為-0H、-SH、-NH2、-C02H、_烷氧基、-芳基氧基、-苯甲氧基、-鹵化物、-NH烷基、-NH烷氧基、-NHC(0)烷基、-冊0)2烷基、-NHC02CH2-R12、-NHC(0)NH2、-NH-NH2、-NH-NH烷基、-NH-NH烷氧基、-302烷基、-S02芳基、-NH-S02烷基、-NH-SO廣R12、-NH-OR12、-NH-R12、-NH-NH-R12、-NH-NH-CH2-R12或-冊-CH廣R12，其中其中n為l至5，R"為一個或多個-H、-NH2、-OH、烷氧基、-N-嗎啉代或囟化物。36.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中R"為NR",其中R"為-H、-NH2、-0H、-SH、-C02H、-(:02烷基、-C02芳基、-C(0)NH2，取代或未取代的烷基、烷氧基、烷氧基、芳基氧基或苯甲氧基,-NH烷基、-NH烷氧基、-NHC(0)烷基、-NHC02烷基、-NHC(0)NH2、-S02烷基、-S02芳基、-NH-S02烷基、-NH-SO廣R12、-NH-OR12、-NH-R"或-NH-CH廣R12，其中R"為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中n為l至5，R"為一個或多個-H、-NH2、-OH、烷氧基、-N-嗎啉代或卣化物。1112的定義如上所述。37.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述化合物具有式n的結(jié)構(gòu)其中W為N或CH;其中R"為-0、-S、=NH、=N0H、-N烷基、-N烷氧基、-N-芳基、=N芳基氧基、-N-苯曱基、-N苯曱氧基、-N-NH2、-N-NHOH、-N-冊烷基、-N-NH烷氧基、-N-NH芳基、^-NH芳基氧基、-N-NH苯甲基、苯甲IL^、-N-NH-(對M苯基)、-N-NH-(對甲氧基苯基)、-N-NH-(對-N-嗎啉代-苯基)；以及其中R'為-CR15-，其中R"為-冊2、-NHNH2、-NHOH、-NH烷基、-NH烷氧基、-NH芳基、-NH芳基氧基、-NH苯甲基、-NH苯曱氧基、-N+H2芳基、-N+H2-(對-N-嗎啉代-苯基)、-N+H2-(對氨基苯基)、-N+H廣(對甲氧基苯基)、-NHC02烷基、-NHC02苯甲基、-NHNH烷基、-NHNH芳基、-NHNH苯甲基或-NHC(0)烷基。38.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述化合物具有式IH的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中l(wèi)T為N或CH;其中R"為-H、-OH、-SH、-烷氧基、自化物、-NH2、-NHOH、-NH烷基、-NH烷氧基、-NH芳基、-冊芳基氧基、-NH苯甲基、-NH苯甲氧基、-冊C(O)烷基、-NHC02烷基、麗C02苯甲基、-NHNH2、-NHNH烷基、-NHNH芳基或-NHNH苯曱基；以及其中R2為-CR"-,其中R"為-NH2、-NHNH2、-NHOH、-NH烷基、-NH烷氧基、-NH芳基、-NH芳基氧基、-NH苯甲基、-NH苯甲氧基、-N+H2芳基、-1012-(對-^-嗎啉代-苯基)、-N+H2-(對氨基苯基)、-NH廣(對甲氧基苯基)、-NHC02烷基、-NHC02苯甲基、-NHNH烷基、-NHNH芳基、-NHNH苯甲基或-NHC(0)芳基。39.一種方法，包括(a)檢測一種化合物對于編碼包括核糖開關(guān)的RM的基因的基因表達的抑制作用，其中所述核糖開關(guān)為表5中的核糖開關(guān)，其中所述的抑制作用是通過核糖開關(guān)進行的，(b)通過使細胞與步驟(a)中抑制基因表達的化合物相接觸，從而抑制基因表達，其中所述細胞含有編碼包括核糖開關(guān)的RM的基因，其中所述化合物通過結(jié)合所述核糖開關(guān)來抑制基因的表達。全文摘要核糖開關(guān)和修飾形式的核糖開關(guān)可被用作受特異性效應(yīng)化合物控制的設(shè)計基因開關(guān)。這類可激活核糖開關(guān)的效應(yīng)化合物在本文中被稱為觸發(fā)分子。天然開關(guān)是抗生素和其它小分子治療劑的靶標。此外，核糖開關(guān)的建造使得天然開關(guān)的實際片段可被用于構(gòu)建新的非免疫原性基因控制元件，例如適體(分子識別)結(jié)構(gòu)域可與其它的非適體(或修飾的)結(jié)構(gòu)域相交換，這樣新的識別結(jié)構(gòu)域可導(dǎo)致由使用者定義的效應(yīng)物化合物引起的基因調(diào)節(jié)。這種改變的開關(guān)可成為治療方案的一部分——可以打開或關(guān)閉，或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成。新構(gòu)建的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)可以應(yīng)用于一些領(lǐng)域，例如活體生物傳感器、生物的代謝工程以及基因療法的高級形式?？墒褂没衔飦泶碳?、激活、抑制和/或失活核糖開關(guān)?？梢岳煤颂情_關(guān)的原子結(jié)構(gòu)來設(shè)計可刺激、激活、抑制和/或失活核糖開關(guān)的新化合物。文檔編號C12Q1/18GK101111847SQ200580046277公開日2008年1月23日申請日期2005年11月8日優(yōu)先權(quán)日2004年11月8日發(fā)明者I·普斯卡茲,J·利姆,K·F·布朗特,R·R·布雷克,R·貝蒂申請人:耶魯大學(xué);科羅拉多大學(xué)評議會