專利名稱：人促造血細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞因子，尤其是一種人促造血細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
后基因組時代是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究時期。隨著生命科學(xué)理論的的不斷完善，實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的結(jié)構(gòu)性蛋白被發(fā)現(xiàn)在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著舉足輕重的生理功能。pNH是結(jié)構(gòu)蛋白糖蛋白4(PRG4，又稱SZP，關(guān)節(jié)滑膜蛋白)的一個不同剪接體形式，由PRG4的部分第2外顯子、完整的第3外顯子和部分第6外顯子組成；cDNA序列5’端兩個外顯子分別編碼兩個促細(xì)胞生成素B(SMB)結(jié)構(gòu)域，3’端外顯子編碼PTT/XP黏液素樣重復(fù)序列。其中第一個SMB結(jié)構(gòu)域N端缺失15個氨基酸，此序列內(nèi)包含一對二硫鍵。1972年一個依賴于生長激素發(fā)揮功能的血清生長因子被命名為促細(xì)胞生成素B(Somatomedin B，SMB)。它能夠刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞DNA的合成。在人血漿和hemofiltrate中都能檢測到游離的可溶性SMB蛋白。其后，不同的研究小組發(fā)現(xiàn)不少蛋白中含有與SMB同源的序列，稱為人促細(xì)胞生成素B樣結(jié)構(gòu)域(SMB like domain)，含有39到51個氨基酸殘基不等。
1999年Flannery從培養(yǎng)的牛軟骨單層細(xì)胞，2001年Gregory等從人關(guān)節(jié)滑液成纖維細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中RT-PCR SZP序列時得到SZP第4、第5外顯子缺失的全長產(chǎn)物，作為鑒定用，但是沒有進(jìn)行進(jìn)一步的表達(dá)活性鑒定等工作。
SZP/MSF的SMB結(jié)構(gòu)域Cys位點(diǎn)與玻連蛋白(Vitronectin，Vn)SBM結(jié)構(gòu)域有同源性，但是Cys的旁側(cè)序列完全不同。兩者的這一結(jié)構(gòu)域在功能上有很大的差異，后者能結(jié)合PAI-1，而MSF則不能；顯示了兩者在功能上的差別。為研究二硫鍵拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，2002年Kamikubo曾表達(dá)了人Vn的SMB結(jié)構(gòu)域。
目前造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)尚未完全成熟。培養(yǎng)過程中干細(xì)胞數(shù)量不足，易分化等問題有待解決。在培養(yǎng)體系中加入一定的細(xì)胞因子成為手段之一。比如能刺激定向分化的祖細(xì)胞的擴(kuò)增的IL-3，對巨噬祖細(xì)胞有刺激作用的GM-CSF，TPO作用于巨核祖細(xì)胞，SCF促進(jìn)造血干細(xì)胞擴(kuò)增。在血液病治療藥物研究過程中，紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)，粒細(xì)胞克隆形成刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)和粒細(xì)胞-巨核細(xì)胞刺激因子(granulocyte-macrophage stimulatingfactor，GM-CSF)是三個已被批準(zhǔn)用于腫瘤治療的細(xì)胞因子，在治療化療后的貧血和嗜中性白細(xì)胞減少癥狀中功效顯著。人白介素3受體高親合的配體類似物，(Synthokine)，人白介素3和G-CSF受體激活劑(myelopoietin MPO)，和刺激人IL-3、c-mpl受體的promegapoietin(PMP)能刺激多分化潛能的造血祖細(xì)胞的增殖，正在接受臨床實(shí)驗(yàn)。其中，EPO是首個利用克隆技術(shù)基因重組表達(dá)的造血相關(guān)的生長因子，用于調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的貧血。發(fā)現(xiàn)并研究新的細(xì)胞生長因子應(yīng)用于血液細(xì)胞培養(yǎng)體系是當(dāng)前的研究重點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種人促造血細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子及其制備方法和用途，即pNH。包括pNH cDNA的克隆及在原核中的表達(dá)，重組蛋白的制備純化，物理化學(xué)特性和生物學(xué)功能的鑒定。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種人促造血細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，所述人促造血細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子pNH由SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的蛋白質(zhì)組成。
編碼pNH的cDNA分子，由SEQ ID NO.1所列核苷酸序列的全部或片段。
一種編碼pNH的cDNA的克隆方法，包括以下步驟1)根據(jù)SEQ ID NO.2所列氨基酸序列，用已知的遺傳密碼推測出與這些氨基酸相應(yīng)的核苷酸序列；2)設(shè)計(jì)特異性引物，以pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述特異性引物為擴(kuò)增pNH的片段的上游引物為5’-GCCATGGATGCCACCTGCAACTGTGAT-3’，下游引物為5’-gCCTCgAgAGTTGTGACCTTGAAGTCACCAT-3’。
3)用特異性cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針，從人cDNA文庫中篩選出pNH的cDNA，所述特異性cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物為編碼1)所述的pNH氨基酸序列的核苷酸。
所述人cDNA文庫為人胚胎肝細(xì)胞cDNA文庫。
一種表達(dá)pNH的質(zhì)粒，含上述方法所得到的cDNA。
所述質(zhì)粒以pET32c(+)或pET22b(+)構(gòu)成。
一種SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH的純化方法，包括以Ni2+螯合層析柱純化融合蛋白，腸激酶酶切融合蛋白，ResourceQ陰離子交換層析純化，或以Ni2+螯合層析柱純化分泌型蛋白，Superdex75凝膠過濾純化。
一種藥物組合物，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
一種用于研究造血細(xì)胞增殖pNH的試劑，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
用于制備抗pNH的單克隆或多克隆抗體的抗原，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
本發(fā)明的有益效果是1、利用本發(fā)明克隆的pNH片段，構(gòu)建工程菌表達(dá)體系，表達(dá)純化目的蛋白，為研究SMB結(jié)構(gòu)域功能提供技術(shù)支持。
2、pNH蛋白可作為造血細(xì)胞增殖的生長因子，可以用于造血細(xì)胞增殖分化中細(xì)胞與因子相互作用的機(jī)理性研究，亦可作為實(shí)驗(yàn)試劑大規(guī)模生產(chǎn)。
3、pNH及其各個結(jié)構(gòu)域多肽片段可以作為低分子量生物制劑應(yīng)用于臨床造血功能障礙的疾病，具有分子量低免疫原性弱的優(yōu)點(diǎn)。
4、pNH序列片段長度適中，可用于構(gòu)建各類基因治療載體，治療造血功能障礙類疾病。
5、SMB結(jié)構(gòu)域3D結(jié)構(gòu)解析結(jié)果在各研究小組之間存在頗多爭議。pNH蛋白為SMB結(jié)構(gòu)域空間結(jié)構(gòu)的解析提供了基礎(chǔ)，通過蛋白晶體生長，X-Ray衍射獲取空間結(jié)構(gòu)信息和二硫鍵拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。
6、pNH及其多肽可用于制備多克隆抗體和單克隆抗體，用于ELISA實(shí)驗(yàn)。


圖1A是pET32c(+)-重組pNH蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建。
圖1B是pET22b(+)-重組pNH蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建。
圖2A是SDS-PAGE分析pNH的誘導(dǎo)表達(dá)pNH融合蛋白表達(dá)帶，其中1.未誘導(dǎo)pET32c(+)-pNH-BL21，2.誘導(dǎo)后pET32c(+)-pNH-BL21，3.超聲破菌后的上清，4.鎳柱洗滌，5.鎳柱洗脫融合蛋白，M.Marker(單位kD)。
圖2B是SDS-PAGE分析pNH的還原-非還原電泳純化后的pNH蛋白，其中1.還原狀態(tài)，2.非還原狀態(tài)，M.Marker(單位kD)。
圖3A是重組人pNH蛋白的Western Blot鑒定。
圖3B是等電聚焦測定pNH等電點(diǎn)和純度，其中1.pNH蛋白，M.pI標(biāo)準(zhǔn)Marker。
圖4A與PBS對照，pNH對處于對數(shù)生長期的U937細(xì)胞生長增殖的影響。
圖4B與PBS對照，pNH對PMA刺激3天的已分化貼壁的U937細(xì)胞生長增殖的影響。
圖5A與PBS對照，pNH對處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞生長增殖的影響。
圖5B與PBS對照，pNH對PMA刺激3天的K562細(xì)胞生長增殖的影響。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明但是本發(fā)明并不僅僅局限以下實(shí)施例。
實(shí)施例1人pNH基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建1.1人pNH基因的克隆取5個月大流產(chǎn)胎兒肝組織100mg，將組織置于研缽內(nèi)，并加入少量液氮，磨成粉末，然后加入1ml Trizol(購自Invitrogen公司)，將此研缽中的混懸液轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管，然后加入0.2ml的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；取上層液體于一新的離心管，加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置20分鐘，12000g離心15分鐘；棄去上清液，加入1ml的80％乙醇，4℃下7500g離心5分鐘；小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥10-15分鐘，然后將RNA溶于水中，用分光光度計(jì)測定A260/A280，計(jì)算RNA含量，并經(jīng)12g/L瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)RNA完整。20μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含2μg總RNA，4μl RT緩沖液，50pmol/L oligo(dT)16，1μmol/L dNTPs，0.1μmol/L DTT，15U RNA酶抑制劑(Takara)，200U M-MLV(購自Invitrogen公司)，于65℃水浴5min，冰浴5min，37℃水浴60min，70℃15min終止反應(yīng)，所得cDNA-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)人PRG4基因序列(NM_005807)利用gene runner軟件設(shè)計(jì)引物，分別于正義鏈5′端加NcoI反義鏈5′端加Xho I酶切位點(diǎn)，pNH正義鏈引物5’-GCCATGGATGGCATGGAAAACACTTCCCA-3’；反義鏈引物5’-GGCTCGAGCTAAGGACAGTTGTACCAGACTTTGG-3’，PCR產(chǎn)物全長3937bp，預(yù)計(jì)PCR片段長度3952bp。應(yīng)用Pyrobest DNA聚合酶(購自Takala公司)擴(kuò)增人pNH基因，PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min，94℃45s，68℃5min，32個循環(huán)，72℃15min。回收純化后的PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體(購自Takala公司)中，命名為pMD18-PRG4Δ。
1.2 pNH改構(gòu)體原核表達(dá)載體的構(gòu)建上述細(xì)胞因子可以通過多種方法制備。其中包括將cDNA序列裝入pET32c(+)和pET22b(+)原核表達(dá)載體中構(gòu)建成原核表達(dá)系統(tǒng)。
pMD18-PRG4Δ經(jīng)測序鑒定正確，以其為模板，用上游引物5’-GCCATGGATGCCACCTGCAACTGTGAT-3’和下游引物5’-gCCTCgAgAGTTGTGACCTTGAAGTCACCAT-3’上下游酶切位點(diǎn)分別為Nco I和Xho I。以pfu DNA聚合酶(購自上海生工)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 50s，25個循環(huán)后72℃延伸15min，循環(huán)完畢72℃延伸2min后，加入1U Taq DNA聚合酶繼續(xù)延伸13min。擴(kuò)增的片段讀碼框長度為336bp(SEQ ID NO.1)。將PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收后，連接入pMD18-T載體中，命名為pMD18-pNH。轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株，在LB平皿中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒用Nco I和Xho I雙酶切，跑1％的瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(購自博大泰克公司)回收目的片段。與經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切原核融合蛋白表達(dá)載體pET32c連接后，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株，通過酶切鑒定得到含目的片段的重組克隆，并命名為pET32c-pNH，見圖1A。將Nco I和Xho I酶切好的pNH-1與經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切原核分泌型蛋白表達(dá)載體pET22b連接后，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株，通過酶切鑒定得到含目的片段的重組克隆，并命名為pET22b-pNH，見圖1B。
實(shí)施例2重組人pNH蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化(方法一)2.1 pNH融合蛋白的制備將實(shí)施例1.2中獲得的pET32c-pNH轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)(購自Novagen公司)原核表達(dá)菌株，在氨卞青霉素和氯霉素雙抗性LB培養(yǎng)基瓊脂平板上篩選陽性克隆。挑取單個克隆接種于含有氨卞青霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8。以1∶100比例接種于含有相同濃度抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8后，加入IPTG至終濃度為1mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。4小時后，4℃離心收集菌體。重懸于適量的1×SDS上樣緩沖液中，置沸水浴3～5min，取50μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
2.2 pNH-1融合蛋白的裂解和純化3ml LB Amp+培養(yǎng)基接種陽性單克隆菌落，37℃搖床培養(yǎng)過夜。以1∶100(v/v)倒管入新鮮培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)至OD600＝0.6，加入IPTG至終濃度1mM。25℃誘導(dǎo)表達(dá)7.5h后，8000rpm離心30min收集菌體沉淀。1/10菌液體積的50mM Tris pH8.0混懸菌體，超聲破碎菌體.12000rpm離心30min收集上清，內(nèi)含融合蛋白。
Ni2+螯合層析柱純化融合蛋白50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，2mM咪唑平衡鎳柱后上樣。
50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，80mM咪唑洗滌，50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，160mM咪唑洗脫融合蛋白。
以50mM Tris pH8.0緩沖液充分透析融合蛋白，脫鹽。超濾濃縮讀取280nm紫外吸光度，利用xPASy-ProtParam(http://kr.expasy.org/tools/protparam.html)軟件預(yù)測的消光系數(shù)換算，進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE檢測融合蛋白，見圖2A。
以1mg蛋白3U腸激酶(Invitrogen公司)4℃酶切16h。向酶切體系中加入1M NaCl至終濃度為0.5M.以Resource Q陰離子交換柱、20mM TrispH8.0 0.5M-0M NaCl濃度梯度洗脫分離載體蛋白和目的蛋白及腸激酶。目的蛋白過Superdex200凝膠過濾，進(jìn)一步純化并換緩沖液至PBS。SDS-PAGE檢測純品蛋白，見圖2B。pNH蛋白含有112個氨基酸殘基(SEQ ID NO.2)，包括N末端兩個載體氨基酸和C末端的6個組氨酸構(gòu)成的分離純化標(biāo)簽，蛋白理論分子量為12.9kD，因N端SMB結(jié)構(gòu)域?yàn)榘腚装彼嶝S富序列，而電泳遷移率偏慢。
純品超濾濃縮后，Bio-Rad’s DC Protein Assay試劑盒進(jìn)行蛋白定量，分裝，-80℃凍存。
實(shí)施例3重組人pNH蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化(方法二)3.1 pNH-1分泌型蛋白的制備將實(shí)施例1.2中獲得的pET22b-pNH-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)原核表達(dá)菌株，在氨卞青霉素和氯霉素雙抗性LB培養(yǎng)基瓊脂平板上篩選陽性克隆。挑取單個克隆接種于含有氨卞青霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8。以1∶100比例接種于含有相同濃度抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8后，降溫到28℃后加入IPTG至終濃度為1mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。8小時后，4℃離心收集菌體。重懸于適量的1×SDS上樣緩沖液中，置沸水浴3～5min，取50μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
3.2pNH分泌型蛋白的純化將高密度發(fā)酵(方法參考分子克隆)得到的發(fā)酵液離心得到濕菌稱重，按重量體積比1∶20加入純水，將菌體充分懸浮，4℃放置30分鐘，12500轉(zhuǎn)離心30分鐘，取上清，過鎳柱制備出pNH-1粗品。
50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，2mM咪唑平衡鎳柱后上樣，50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，40mM咪唑洗滌，50mM Tris·HCl pH8.0，0.5M NaCl，160mM咪唑洗脫目的蛋白。Vivaspin3000MWCO超濾濃縮離心濃縮樣品后過1×PBS緩沖液平衡的Superdex 75凝膠過濾柱，進(jìn)一步純化蛋白。根據(jù)保留時間收集目的蛋白峰，純品蛋白超濾濃縮后，以Lowry法進(jìn)行蛋白定量，分裝，-80℃凍存。
實(shí)施例4重組人pNH蛋白的鑒定4.2 Western Blotting純化的目的蛋白濃縮后定量調(diào)整濃度為1mg/ml，Western Blot法鑒定目的蛋白。
1)SDS-PAGE電泳參考《分子克隆》所述方法進(jìn)行。分離膠與濃縮膠濃度分別為15％和5％。


60ul目的蛋白溶液加入10ul6×上樣緩沖液，100℃煮沸3min。濃縮膠電泳時電壓80V，分離膠電泳時電壓為120V。電泳結(jié)束，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡數(shù)分鐘。
2)蛋白印跡反應(yīng)PVDF膜剪SDS-PAGE膠大小，純甲醇浸泡1min，DDW沖洗SDS-PAGE膠、Whatman濾紙、PVDF膜，與襯絨一起在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5min。按順序安裝轉(zhuǎn)移裝置正極板、襯絨、Whatman濾紙、硝酸纖維素膜、SDS-PAGE膠、Whatman濾紙、襯絨、負(fù)極板，夾緊夾子。
電泳槽內(nèi)倒1×電泳緩沖液，放預(yù)凍的冰盒。轉(zhuǎn)移裝置垂直置入電泳槽，有膠的一面通陰極。
120V電壓200mA電流(8mM/cm2)恒壓轉(zhuǎn)移1h轉(zhuǎn)移結(jié)束，去除濾紙，SDS-PAGE膠用考馬斯亮藍(lán)染液染色檢測蛋白轉(zhuǎn)移質(zhì)量20ml封閉液封閉PVDF膜1h1∶1000加入一抗，孵育1h20mlPBS-T洗膜三次，每次10min10mlPBS-T，1∶1000加入二抗，孵育1h20mlPBS-T洗膜三次，每次10min顯色液10ml加50ulH2O2，放膜顯色，大約2-5min。
待蛋白帶顯色清晰，水洗膜，晾干，避光保存，見圖3A。
4.2等電聚焦電泳xPASy-ProtParam(http://kr.expasy.org/tools/protparam.html)用于預(yù)測蛋白的理論等電點(diǎn)為6.47。
等電聚焦實(shí)驗(yàn)鑒定目的蛋白實(shí)際等電點(diǎn)。
按照實(shí)驗(yàn)手冊Instruction 1818-A操作(LKB-Produkter AB公司)0.55mm聚丙烯酰氨薄層膠，pH3.5-9.5載體兩性電解質(zhì)，Marker為寬范圍等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(pI 3.5-9.3)(Amersham Biosciences公司)。
樣品脫鹽到水，調(diào)整濃度為1mg/ml。
制膠上平板洗凈后，DDW沖洗晾干；均勻涂硅烷于玻板，晾干；DDW沖洗，晾干。下平板鋪疏水膜。兩板疏水面相對。
配堿性膠(T＝5％C＝3％)AB 2.5mlLKB0.9mlDDW11.5mlTEMED 8ul抽氣10min 加AP 75ul灌膠。40℃烘箱促凝。
剝膠，0.5cm寬厚濾紙條，長度略短于膠長；加電極緩沖液，陰極NaOH陽極H3PO4；濾紙略吸干，置于膠兩極。
煤油均勻鋪于電泳板上，放膠，放點(diǎn)樣濾紙。
點(diǎn)樣20ul，1500V，50mA，20W預(yù)聚焦30min后，去除點(diǎn)樣濾紙。
電泳至電流趨于0mA。
固定，考馬斯亮藍(lán)染液顯色，見圖3B。
根據(jù)電泳條帶的位置和等電點(diǎn)數(shù)據(jù)畫出pH梯度曲線，測算目的蛋白pI實(shí)施例5促細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)5.1體外促U937細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937以IMDM，10％FCS，1％為培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，至生長狀態(tài)最佳時接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種5×103個細(xì)胞，培養(yǎng)體系采用IMDM，1％FCS，1％青、鏈霉素。5h后加入不同濃度的pNH，培養(yǎng)72h后每孔加5mg/mlMTT20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，1000rpm離心10min，小心棄去上清，每孔加DMSO150ul，震蕩10min，490nM測定光吸收值A(chǔ)。
計(jì)算細(xì)胞增殖率(％)細(xì)胞增殖率(％)＝[(實(shí)驗(yàn)組A值-PBS組A值)/(PBS組A值-不含細(xì)胞的對照組A值)]×100％。
A值的高低可以反映活細(xì)胞的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞增殖百分率表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明pNH對U937細(xì)胞具有增殖促進(jìn)作用，細(xì)胞生長增加26％-31％，見圖4A。
人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937以IMDM，10％FCS，1％青、鏈霉素為培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，至生長狀態(tài)最佳時接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)體系采用IMDM，15％FCS，1％青、鏈霉素，每孔接種1×106個細(xì)胞/5ml培養(yǎng)基。佛波酯(PMA，Sigma公司)以DMSO溶解成終濃度為162mM，加入K5626孔板培養(yǎng)體系成終濃度為50nM。培養(yǎng)3d時，棄上清，PBS清洗已貼壁分化的細(xì)胞后，以終濃度為0.25％的胰酶消化，收集細(xì)胞接種于96孔板，以每孔接種5×103個細(xì)胞，培養(yǎng)體系采用IMDM，1％FCS，1％青、鏈霉素。5h后加入不同濃度的pNH，培養(yǎng)72h后MTT檢測活細(xì)胞數(shù)量。
計(jì)算細(xì)胞增殖率(％)細(xì)胞增殖率(％)＝{1-[(PBS組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/(PBS組A值-不含細(xì)胞的對照組A值)]}×100％。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明pNH對已分化的U937細(xì)胞略有增殖抑制但差異不明顯，見圖4B。
5.2體外促K562細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)人紅白血病細(xì)胞系K562以IMDM，10％FCS，1％青、鏈霉素為培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，至生長狀態(tài)最佳時接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種5×103個細(xì)胞，培養(yǎng)體系采用IMDM，1％FCS，1％青、鏈霉素。5h后加入不同濃度的pNH，培養(yǎng)72h后每孔加5mg/mlMTT20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，1000rpm離心10min，小心棄去上清，每孔加DMSO150ul，震蕩10min，490nM測定光吸收值A(chǔ)。
計(jì)算細(xì)胞增殖率(％)細(xì)胞增殖率(％)＝[(實(shí)驗(yàn)組A值-PBS組A值)/(PBS組A值-不含細(xì)胞的對照組A值)]×100％。
A值的高低可以反映活細(xì)胞的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞增殖百分率表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明pNH對K562細(xì)胞具有增殖促進(jìn)作用，細(xì)胞生長增加10％-26％，見圖5A。
人紅白血病細(xì)胞系K562以IMDM，10％FCS，1％青、鏈霉素為培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，至生長狀態(tài)最佳時接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)體系采用IMDM，15％FCS，1％青、鏈霉素，每孔接種1×106個細(xì)胞/5ml培養(yǎng)基。佛波酯(PMA，Sigma公司)以DMSO溶解成終濃度為162mM，加入K5626孔板培養(yǎng)體系成終濃度為50nM。培養(yǎng)3d、5d后分別收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞后接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種5×103個細(xì)胞，培養(yǎng)體系采用IMDM，1％FCS，1％青、鏈霉素。5h后加入不同濃度的PNH，培養(yǎng)72h后每孔加5mg/mlMTT20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，1000rpm離心10min，小心棄去上清，每孔加DMSO150ul，震蕩10min，490nM測定光吸收值A(chǔ)。
計(jì)算細(xì)胞增殖率(％)細(xì)胞增殖率(％)＝{1-[(PBS組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/(PBS組A值-不含細(xì)胞的對照組A值)]}×100％。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明pNH對已分化的K562細(xì)胞略有增殖抑制但差異不明顯，見圖5B。
實(shí)施例6重組人pNH多克隆抗體的制備選擇優(yōu)質(zhì)的2周大新西蘭大耳白兔子4-6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)、觀察無病一個星期。常規(guī)用卡介苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫兔子。一定量的抗原SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色(或250Mm KCl染色)，將目的帶切下，用液氮在研缽中將膠磨碎，與佐劑(1∶1)混合，繼續(xù)研磨成糊狀，免疫家兔。時間為基礎(chǔ)免疫一星期后，1-2mg抗原/只。制備的膠為1mg抗原/1g膠。
兩周(或三周后)后加強(qiáng)免疫1-2mg抗原/只。
一周后加強(qiáng)免疫1-2mg抗原/只。可用雙擴(kuò)法監(jiān)測有無抗體產(chǎn)生。
一周后進(jìn)行第三次加強(qiáng)免疫1-2mg抗原/只。
2周后，取家兔耳緣靜脈血，用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測抗HAPO抗體。用ELISA法測定抗體效價(jià)。血清中目的抗體為陽性后，大量抽取兔血，收集的血液37℃放置1-2小時，4℃過夜，在無菌的條件下，離心收集血清，分裝(0.2ml)，儲存于-70℃。
上述實(shí)施例證明，本發(fā)明所得到的pNH對于幼稚的血細(xì)胞的生長有刺激作用，而且不影響已分化的細(xì)胞的生長。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)含有促細(xì)胞生成素B樣結(jié)構(gòu)域和少量黏液素樣重復(fù)序列的pNH蛋白對于幼稚的早期血液細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的功能，并且不影響已分化細(xì)胞的生長，顯示其功能發(fā)揮的特異性。臨床存在有造血或血管功能性障礙疾病，本發(fā)明為pNH因子成為治療此類疾病的輔助藥物提供平臺。
SEQUENCE LISTING
<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所泰達(dá)塵命科學(xué)技術(shù)研究中心<120>人促造血細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子及其制備方法和用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>336<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<400>1gccatggatg ccacctgcaa ctgtgattat aactgtcaac actacatgga gtgctgccct 60gatttcaaga gagtctgcac tgcggagctt tcctgtaaag gccgctgctt tgagtccttc 120gagagaggga gggagtgtga ctgcgacgcc caatgtaaga agtatgacaa gtgctgtccc 180gattatgaga gtttctgtgc agaagtaaaa gataacaaga agaacagaac taaaaagaaa 240cctaccccca aaccaccagt tgtagatgaa gctggaagtg gattggacaa tggtgacttc 300aaggtcacaa ctctcgagca ccaccaccac caccac336<210>2<211>112<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)
<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..(112)<400>2Ala Met Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr Asn Cys Gln His Tyr Met1 5 10 15Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys Thr Ala Glu Leu Ser Cys20 25 30Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg Gly Arg Glu Cys Asp Cys35 40 45Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys Cys Pro Asp Tyr Glu Ser50 55 60Phe Cys Ala Glu Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr Lys Lys Lys65 70 75 80Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser Gly Leu Asp85 90 95Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Leu Glu His His His His His His100 105 110
權(quán)利要求
1.一種人促造血細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，其特征在于，所述人促造血細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子pNH由SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的蛋白質(zhì)組成。
2.編碼pNH的cDNA分子，其特征在于，由SEQ ID NO.1所列核苷酸序列的全部或片段。
3.一種權(quán)利要求2所述編碼pNH的cDNA的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟1)根據(jù)SEQ ID NO.2所列氨基酸序列，用已知的遺傳密碼推測出與這些氨基酸相應(yīng)的核苷酸序列；2)設(shè)計(jì)特異性引物，以pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述特異性引物為擴(kuò)增pNH的片段的上游引物為5’-GCCATGGATGCCACCTGCAACTGTGAT-3’，下游引物為5’-gCCTCgAgAGTTGTGACCTTGAAGTCACCAT-3’。3)用特異性cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針，從人cDNA文庫中篩選出pNH的cDNA，所述特異性cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物為編碼1)所述的pNH氨基酸序列的核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述人cDNA文庫為人胚胎肝細(xì)胞cDNA文庫。
5.一種表達(dá)pNH的質(zhì)粒，其特征在于，含權(quán)利要求3方法所得到的cDNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述表達(dá)pNH的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒從pET32c(+)或pET22b(+)構(gòu)成。
7.一種SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH的純化方法，其特征在于，包括以Ni2+螯合層析柱純化融合蛋白，腸激酶酶切融合蛋白，ResourceQ陰離子交換層析純化目的蛋白，或以Ni2+螯合層析柱純化分泌型蛋白，Superdex75凝膠過濾純化目的蛋白。
8.一種藥物組合物，其特征在于，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
9.一種用于研究造血細(xì)胞增殖pNH的試劑，其特征在于，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
10.用于制備抗pNH的單克隆或多克隆抗體的抗原，其特征在于，包含SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的pNH蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人促造血細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子及其制備方法和用途，所述細(xì)胞因子由SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的蛋白質(zhì)組成，編碼pNH的cDNA分子，由SEQ ID NO.1所列核苷酸序列的全部或片段。以pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增pNH的片段的上游引物為5’－GCCATGGATGCCACCTGCAACTGTGAT－3’，下游引物為5’－gCCTCgAgAGTTGTGACCTTGAAGTCACCAT－3’。通過Nco I和Xho I雙酶切位點(diǎn)，克隆到原核表達(dá)載體上，在工程菌中高效表達(dá)，表達(dá)純化目的蛋白，為研究SMB結(jié)構(gòu)域功能提供技術(shù)支持。亦可作為實(shí)驗(yàn)試劑大規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)用于臨床造血功能障礙的疾病，具有分子量低免疫原性弱的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/63GK101077887SQ200610013828
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月23日
發(fā)明者韓忠朝, 王黎芳, 韓之波 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所泰達(dá)生命科學(xué)技術(shù)研究中心