專利名稱：通過與免疫細胞因子攝入促進劑聯(lián)合治療來增強抗體-細胞因子融合蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于靶向性免疫治療的抗體-細胞因子融合蛋白?？傊?，本發(fā)明涉及在聯(lián)合治療中免疫細胞因子攝入促進劑在增強抗體-細胞因子融合蛋白介導(dǎo)的抗預(yù)選擇靶(例如腫瘤中的細胞)的免疫反應(yīng)中的用途。具體地說，本發(fā)明涉及將抗體-細胞因子融合蛋白與化學(xué)治療劑如紫杉烷(taxane)類化學(xué)治療劑和/或烷化劑聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤細胞以及其它癌性或病變細胞。
背景技術(shù)：
像癌癥一類疾病的有效治療需要通過一種或多種如自然殺傷細胞(NK)、巨噬細胞和T淋巴細胞的效應(yīng)細胞類型參與的強烈的免疫反應(yīng)。在長有腫瘤的動物和患者體內(nèi)，免疫系統(tǒng)不能有效地對付正在生長的腫瘤，大部分是由于腫瘤自身可產(chǎn)生抑制免疫反應(yīng)的特殊機制。在許多情況下，潛在的可殺傷腫瘤的單核細胞，例如巨噬細胞遷移入正在生長的腫瘤床，但是腫瘤細胞分泌的因子，如前列腺素、TGF-β和IL-10改變了這些細胞的細胞毒活性(參見Sharma等，1999，免疫學(xué)雜志(J.IMMUNO.)，1635020-5028)。同樣，遷移入腫瘤的淋巴細胞，如NK和T細胞也可被腫瘤分泌的因子抑制以及通過與激活免疫細胞凋亡的腫瘤細胞表面表達的受體相互作用而被抑制(參見Villunger等，1997，血液(BLOOD)9012-20)。這些淋巴細胞暴露于腫瘤床內(nèi)的免疫抑制性單核細胞可進一步降低它們產(chǎn)生有效的抗腫瘤反應(yīng)的能力。
致力于克服局部腫瘤微環(huán)境的免疫抑制效應(yīng)的努力包括靶向性免疫刺激，例如使用腫瘤特異性抗體-細胞因子融合蛋白的治療。在幾種小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型中已經(jīng)證明了這種治療方法的有效性，然而隨著腫瘤體積的增大治療就不那么有效了。這可能是由于腫塊分泌的抑制因子水平升高以及由于其它因素，例如腫瘤間質(zhì)液體壓力的增加(Griffon-Etienne等，1999，癌研究(CANCER RES.)593776-3782)，形成治療劑滲入實體腫瘤的障礙。
雖然大部分癌癥患者仍用一個或多個療程的化療治療，眾所周知的事實是癌癥的細胞毒性治療也損害了免疫系統(tǒng)。免疫細胞屬于人體內(nèi)快速分裂的細胞，任何殺死分裂細胞的治療也將殺死免疫細胞。因此，包括放射療法、損傷DAN的化學(xué)品、DNA合成抑制劑和微管功能抑制劑在內(nèi)的治療都將造成免疫系統(tǒng)的損傷。癌癥治療之所以需要骨髓移植作為輔助療法，恰恰是因為免疫系統(tǒng)受到損傷并需要得到補充。氨甲蝶呤以及其它抗癌藥物也常用做免疫抑制劑。有證據(jù)表明抗癌治療可特異性地抑制T細胞功能。例如，采用全身放療治療何杰金病的患者體內(nèi)天然T細胞顯然永久喪失(Watanabe等，1997，血液903662)。
基于當前的知識，標準治療(化學(xué)療法和放射療法)和局部免疫刺激不可能成為用于有效治療癌癥的有用聯(lián)合治療方法。因此，本領(lǐng)域當前需要增強抗體-細胞因子融合蛋白介導(dǎo)的抗預(yù)先選定的細胞類型(例如腫瘤細胞)的免疫反應(yīng)的方法，以及需要在此類方法中使用的組合物。
發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，當抗體-細胞因子融合蛋白(免疫細胞因子)施用于長有腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤的哺乳動物時，如果其在使用通過促進或增強腫瘤細胞對其攝入而提高或增強治療效果的免疫細胞因子攝入促進劑處理哺物動物之前、同時或之后施用，可產(chǎn)生較強烈的抗腫瘤反應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的免疫細胞因子攝入促進劑包括烷化劑類化療劑和紫杉烷類化療劑如紫杉醇。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此類聯(lián)用在介導(dǎo)對預(yù)先選定的細胞類型如腫瘤細胞或病毒感染的細胞的免疫殺傷中是有用的。
一方面，本發(fā)明提供了用以在哺乳動物中誘導(dǎo)抗預(yù)先選定的細胞類型的殺細胞免疫反應(yīng)的方法。該方法包括向哺乳動物施用(i)包含可結(jié)合預(yù)先選定的細胞類型的抗體結(jié)合位點和可誘導(dǎo)抗預(yù)先選定細胞類型的免疫反應(yīng)的細胞因子的免疫細胞因子，和(ii)與免疫細胞因子單獨激起的免疫反應(yīng)相比，可增強免疫反應(yīng)的足夠量的免疫細胞因子攝入促進劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，預(yù)先選定的細胞類型可為存在于如實體瘤中的癌細胞，更優(yōu)選地為存在于較大的實體瘤(即大于約100mm3)中的癌細胞。另外，預(yù)先選定的細胞類型可為存在于小轉(zhuǎn)移灶中的癌細胞。
在另一優(yōu)選的實施方案中，免疫細胞因子攝入促進劑可與免疫細胞因子同時施用?；蛘?，免疫細胞因子攝入促進劑可在免疫細胞因子施用之前施用。進而，認為可將免疫細胞因子與多種不同的免疫細胞因子攝入促進劑一起施用。另外認為一種免疫細胞因子攝入促進劑可與多種不同的免疫細胞因子一起施用。
另一方面，本發(fā)明提供了用以在哺乳動物中誘導(dǎo)抗預(yù)先選定的細胞類型的殺細胞免疫反應(yīng)的組合物。組合物包括以下兩者的組合(i)包含可結(jié)合預(yù)先選定的細胞類型的抗體結(jié)合位點和可在哺乳動物中誘導(dǎo)抗預(yù)先選定的細胞類型的免疫反應(yīng)的細胞因子的免疫細胞因子，和(ii)與免疫細胞因子單獨激起的殺細胞反應(yīng)相比，可增強由本組合中使用的免疫細胞因子誘導(dǎo)的殺細胞反應(yīng)的足夠量的免疫細胞因子攝入促進劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，免疫細胞因子的抗體結(jié)合位點優(yōu)選地包含免疫球蛋白重鏈或其抗原結(jié)合片段。免疫球蛋白重鏈自氨基末端到羧基末端優(yōu)選地包含可結(jié)合預(yù)先選定抗原的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(VH)，免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域1(CH1)，免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域2(CH2)，以及任選地還可包含免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域3(CH3)。在一個更優(yōu)選的實施方案中，免疫細胞因子為包含免疫球蛋白重鏈或其抗原結(jié)合片段通過一段多肽鏈與細胞因子結(jié)合而形成的融合蛋白。因此，優(yōu)選的抗體-細胞因子結(jié)合蛋白自氨基末端到羧基末端包含(i)含有可結(jié)合預(yù)先選定的細胞類型上的細胞表面抗原的免疫球蛋白可變區(qū)、免疫球蛋白CH1結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域(任選地還含有免疫球蛋白CH3結(jié)構(gòu)域)的抗體結(jié)合位點，和(ii)細胞因子。制備和使用此類融合蛋白的方法在Gillies等(1992)美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)891428-1432；Gillies等(1998)免疫學(xué)雜志1606195-6203；和美國專利號5,650,150中有詳細描述。
免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(即CH1、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域)可為在天然存在的抗體中與可變區(qū)結(jié)構(gòu)域正常相連的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域?；蛘?，免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域中的一個或多個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可來自于與用做可變區(qū)結(jié)構(gòu)域來源的抗體所不同的抗體。換句話講，免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可能來自不同的抗體，例如來自不同物種的抗體。參見如美國專利號4,816,567。此外，免疫球蛋白可變區(qū)可包含來自一種物種(例如人)的構(gòu)架區(qū)(FR)序列和插入在FRs間的來自第二種不同物種(例如小鼠)的互補決定區(qū)(CDR)序列。制備和使用此類嵌合免疫球蛋白可變區(qū)的方法如在美國專利No.5,225,539和5,585,089中公開。
優(yōu)選地，基于抗體的免疫細胞因子還包含免疫球蛋白輕鏈，后者優(yōu)選地通過如二硫鍵與免疫球蛋白重鏈共價結(jié)合。連結(jié)在一起的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)共同決定了一個單一的和完整的用于結(jié)合預(yù)先選定抗原的結(jié)合位點。在其它實施方案中，免疫細胞因子包含兩條嵌合鏈，每一嵌合鏈均包含與細胞因子融合的至少一部分免疫球蛋白重鏈。該兩條嵌合鏈優(yōu)選地通過如一個或多個鏈間二硫鍵共價結(jié)合在一起。
因而，本發(fā)明提供了將抗體的抗原結(jié)合特異性和活性與細胞因子的強生物活性相結(jié)合的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白可用于在體內(nèi)將細胞因子選擇性地遞送至靶細胞，從而細胞因子可在靶細胞附近發(fā)揮局部生物學(xué)效應(yīng)。在一個優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白的抗體成分與癌細胞表面或內(nèi)部的抗原特異性地結(jié)合，結(jié)果融合蛋白發(fā)揮了局部抗癌活性。在另一優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白的抗體成分與病毒感染的細胞如HIV感染的細胞特異性結(jié)合，結(jié)果融合蛋白發(fā)揮了局部抗病毒活性。
可摻入本發(fā)明的免疫細胞因子中的細胞因子包括如腫瘤壞死因子、白細胞介素、集落刺激因子、淋巴因子以及本領(lǐng)域公知的其它因子。優(yōu)選的腫瘤壞死因子包括如腫瘤壞死因子α(TNFα)。優(yōu)選的白細胞介素包括如白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-7(IL-7)、白細胞介素-12(IL-12)、白細胞介素-15(IL-15)和白細胞介素-18(IL-18)。優(yōu)選的集落刺激因子包括如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)。優(yōu)選的淋巴因子包括如淋巴毒素(LT)。其它有用的細胞因子包括干擾素，有IFN-α、IFN-β和IFN-γ三種形式，均具有獨立于其抗病毒活性之外的免疫學(xué)效應(yīng)和抗血管生成效應(yīng)。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有幾種類型的化療劑是有效的免疫細胞因子攝入促進劑。特別是，有用的免疫細胞因子攝入促進劑包括紫杉烷類和烷化劑類化療劑。目前已知有幾種紫杉烷類化療劑(參見Bissery和Lavelle，1997，癌癥療法實驗和臨床藥劑(Cancer TherapeuticsExperimental and ClinicalAgents.)，第8章，B.Teicher編輯)。在一個優(yōu)選的實施方案中，紫杉烷類為紫杉酚(Taxol)，也稱為紫杉醇(Paclitaxel)。其它的實施方案包括在某些腫瘤模型和臨床適應(yīng)癥上比紫杉醇更有效的半合成紫杉烷—多烯紫杉醇(docetaxel)。進一步的實施方案包括另外的紫杉烷衍生物，如那些來自天然起始物質(zhì)10-脫乙酰漿果赤霉素III的紫杉烷衍生物，其中所述10-脫乙酰漿果赤霉素III提取自歐洲紫杉樹的針葉。此類衍生物的實例之一是可口服利用的化合物IDN5109，它是P-糖蛋白的不良底物，通常對多藥抗性腫瘤更為有效。除口服可生物利用外，IDN5109還具有較高的耐受劑量，并顯示出較小的神經(jīng)毒性副作用(Polizzi等，1999，癌研究591036-1040)。
本發(fā)明也提供了供免疫細胞因子和免疫細胞因子攝入促進劑聯(lián)用的優(yōu)選的劑量和施用方案。
附圖描述

圖1為細胞因子示意圖。
圖2顯示隨時間變化紫杉醇和免疫細胞因子對LLC/KSA腫瘤體積的影響。
圖3顯示隨時間變化紫杉醇和免疫細胞因子多次給藥對平均腫瘤體積的影響。
圖4顯示在肺轉(zhuǎn)移測定中紫杉醇和免疫細胞因子對腫瘤重量的影響。
圖5顯示隨時間變化紫杉醇和免疫細胞因子對CT26/KSA腫瘤體積的影響。
圖6顯示肝轉(zhuǎn)移測定中紫杉醇和免疫細胞因子對腫瘤重量的影響。
圖7A和7B顯示紫杉醇對腫瘤攝入免疫細胞因子的影響。
圖8顯示環(huán)磷酰胺對腫瘤攝入免疫細胞因子的影響。
圖9顯示肺轉(zhuǎn)移測定中環(huán)磷酰胺和免疫細胞因子對腫瘤重量的影響。
圖9B顯示腫瘤生長測定中環(huán)磷酰胺和免疫細胞因子對腫瘤體積的影響。
圖9C顯示腫瘤生長測定中環(huán)磷酰胺和免疫細胞因子對腫瘤體積的影響。
圖10顯示腫瘤生長測定中卡鉑和免疫細胞因子對腫瘤體積的影響。
發(fā)明詳述研究顯示，大的實體瘤通常比已播散的轉(zhuǎn)移灶對抗體介導(dǎo)的治療性干預(yù)措施和免疫治療更具抗性(Sulitzeanu等(1993)癌研究進展(Adv.CancerRes.)60247-267)。認為對基于抗體的治療的低反應(yīng)性部分是由于腫瘤產(chǎn)生的免疫抑制性因子。
盡管對腫瘤根除的機制還沒有完全了解，現(xiàn)在認為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應(yīng)可破壞癌細胞并提供免疫記憶。此外，認為在某些情況下當缺乏CTLs時自然殺傷(NK)細胞負責(zé)根除腫瘤。某些腫瘤所產(chǎn)生的不同類型或數(shù)量的下調(diào)T細胞的物質(zhì)可導(dǎo)致不同的免疫反應(yīng)。對于已經(jīng)達到危象體積的、可以產(chǎn)生和分泌足夠量的免疫抑制因子來調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)的實體瘤而不是對微小的轉(zhuǎn)移灶而言尤其如此。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，由免疫細胞因子引發(fā)的抗預(yù)先選定細胞類型的殺細胞免疫反應(yīng)可通過免疫細胞因子和免疫細胞因子攝入促進劑同時施用得到顯著增強。聯(lián)合治療在介導(dǎo)疾病組織(如已建立的腫瘤)的免疫破壞方面尤其有效。這里不受理論所束縛，認為免疫細胞因子攝入促進劑增強了免疫細胞因子向腫瘤微環(huán)境內(nèi)的滲透，使其可以克服免疫抑制效應(yīng)和更為有效地活化抗腫瘤細胞免疫反應(yīng)。與此相似，認為此方法在治療相似的免疫抑制機理阻礙了有效的細胞免疫產(chǎn)生的某些病毒性疾病時也同樣有用，例如在治療HIV感染時。認為免疫細胞因子攝入促進劑與免疫細胞因子協(xié)同作用介導(dǎo)了對疾病組織如已建立的腫瘤或病毒感染細胞的免疫破壞。本發(fā)明也描述了制備和使用有用的免疫細胞因子的方法，并描述了當與合適的免疫細胞因子攝入促進劑聯(lián)用時，用于臨床前體內(nèi)動物模型中檢測其藥物動力學(xué)活性的測定方法。
如本文中所用的，術(shù)語“免疫細胞因子攝入促進劑”是指任何可增強免疫細胞因子所誘導(dǎo)的抗預(yù)先選定的細胞類型的殺細胞免疫反應(yīng)的藥劑。更明確地，優(yōu)選的免疫細胞因子攝入促進劑是增強免疫細胞因子向腫瘤內(nèi)滲透的腫瘤攝入促進劑。免疫細胞因子攝入促進劑的實例包括但不限于化療劑如紫杉烷類、包括烷化劑類化療劑在內(nèi)的DNA損傷藥劑、放射治療藥劑和調(diào)節(jié)血壓的藥劑。優(yōu)選的紫杉烷類包括紫杉醇、多烯紫杉醇、10-脫乙酰漿果赤霉素III以及它們的衍生物。優(yōu)選的烷化劑為環(huán)磷酰胺、卡鉑、順鉑以及它們的衍生物。優(yōu)選的放射治療形式為伽瑪射線照射。優(yōu)選的血壓調(diào)節(jié)劑為血管緊張素II激動劑，例如血管緊張素II本身，其優(yōu)選地根據(jù)Netti等(癌研究555451-8)和Netti等(美國國家科學(xué)院院報963137-3142)描述的總體方案周期性施用。免疫反應(yīng)通過為本領(lǐng)域內(nèi)任何一個普通技術(shù)人員所知的方法和/或本文中所描述的方法測定。
如本文中所用的，術(shù)語“殺細胞免疫反應(yīng)”是指被免疫細胞因子激起的殺死或降低該哺乳動物體內(nèi)預(yù)先選定的細胞類型的成活力的哺乳動物體內(nèi)的任何免疫反應(yīng)，其實質(zhì)上為體液免疫反應(yīng)或細胞免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)包括T細胞、NK細胞和巨噬細胞三者中的一種或多種細胞類型。
如本文中所用的，術(shù)語“免疫細胞因子”是指這樣的融合蛋白，其(i)具有結(jié)合特異性并可結(jié)合預(yù)先選定的抗原如細胞型特異性抗原的抗體結(jié)合位點和(ii)能夠特異誘導(dǎo)或激起抗癌細胞或病毒感染細胞的殺細胞免疫反應(yīng)的細胞因子。預(yù)先選定的抗原的實例包括如癌細胞或病毒感染細胞上的細胞表面抗原和如仍可附著在細胞膜上的壞死細胞的不可溶胞內(nèi)抗原。優(yōu)選的抗原是表明腫瘤細胞特征的靶抗原，如腫瘤特異抗原。因此，免疫細胞因子能夠在體內(nèi)選擇性地將細胞因子遞送到靶位點(一般是細胞)從而使細胞因子可以介導(dǎo)抗靶細胞的局部免疫反應(yīng)。例如，如果免疫細胞因子的抗體成分選擇性地結(jié)合癌細胞(例如實體瘤內(nèi)，特別是體積比約100mm3大的實體瘤內(nèi)的癌細胞)上的抗原，免疫細胞因子即發(fā)揮局部抗癌活性。另外，如果免疫細胞因子的抗體成分選擇性地結(jié)合病毒感染的細胞(例如HIV感染的細胞)上的抗原，免疫細胞因子即發(fā)揮局部抗病毒活性。
如本文中所用的，術(shù)語“抗體結(jié)合位點”是指免疫球蛋白重鏈的至少一部分，例如可結(jié)合預(yù)先選定的抗原(如某種細胞類型)的免疫球蛋白可變區(qū)?？贵w結(jié)合位點也優(yōu)選地包含免疫球蛋白恒定區(qū)(包括如CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和任選地CH3結(jié)構(gòu)域)的至少一部分，或者至少一個CH2結(jié)構(gòu)域，或者其一個或多個部分。此外，免疫球蛋白重鏈可共價或非共價地與包含如免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和任選地輕鏈恒定區(qū)的輕鏈結(jié)合。因此，認為抗體結(jié)合位點可包括能結(jié)合預(yù)先選定抗原的完整抗體或其片段、或單鏈抗體。
關(guān)于免疫細胞因子，認為抗體片段可通過為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所周知的多種方法與細胞因子連接。例如，抗體結(jié)合位點優(yōu)選地經(jīng)多肽鍵或接頭與融合蛋白構(gòu)建體中的細胞因子相連接?；蛘?，抗體結(jié)合位點可經(jīng)抗體結(jié)合位點和細胞因子內(nèi)氨基酸側(cè)鏈中存在的反應(yīng)基如巰基與細胞因子化學(xué)偶聯(lián)。
如本文中所用的，術(shù)語“細胞因子”是指在哺乳動物中可刺激或誘導(dǎo)抗預(yù)先選定的細胞類型，如癌細胞和病毒感染細胞的殺細胞免疫反應(yīng)的任何蛋白質(zhì)或多肽、其類似物或功能片段。因此，認為多種細胞因子均可連接入本發(fā)明的免疫細胞因子中。有用的細胞因子包括如腫瘤壞死因子(TNFs)、白細胞介素(ILs)、淋巴因子(Ls)、集落刺激因子(CSFs)、干擾素(IFNs)，也包括其可刺激或誘導(dǎo)此類殺細胞免疫反應(yīng)的種內(nèi)變體、截短的類似物。有用的腫瘤壞死因子包括如TNFα。有用的淋巴因子包括如LT。有用的集落刺激因子包括如GM-CSF和M-CSF。有用的白細胞介素包括如IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。有用的干擾素包括如IFN-α、IFN-β和IFN-γ。
編碼特定的目標細胞因子的基因可從頭克隆、自可獲得源獲取或通過標準DNA合成方法按已知的核苷酸序列合成。例如，LT的DNA序列是已知的(參見如Nedwin等(1985)核酸研究(NUCLEIC ACIDS RES.)136361)，同樣已知IL-2的序列(參見如Taniguchi等(1983)自然(NATURE)302305-318)、GM-CSF的序列(參見如Gasson等(1984)科學(xué)(SCIENCE)2661339-1342)和TNFα的序列(參見Nedwin等(1985)核酸研究136361)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，免疫細胞因子為使用常規(guī)重組DNA技術(shù)，即通過形成編碼該嵌合免疫細胞因子的核酸構(gòu)建體而產(chǎn)生的重組融合蛋白。在現(xiàn)有技術(shù)中已描述了重組抗體-細胞因子融合蛋白的構(gòu)建。參見如Gillies等(1992)美國國家科學(xué)院院報891428-1432；Gillies等(1998)免疫學(xué)雜志1606195-1203和美國專利號5,650,150。優(yōu)選地，編碼本發(fā)明的免疫細胞因子的基因構(gòu)建體從5`至3`方向上包括編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的DNA片段、編碼免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的DNA片段和編碼細胞因子的DNA。將融合基因組裝進或插入表達載體以轉(zhuǎn)染融合基因在其中表達的適當受體細胞。優(yōu)選地，將雜合多肽鏈與免疫球蛋白輕鏈結(jié)合以使免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)結(jié)合產(chǎn)生單一且完整的結(jié)合預(yù)先選定的抗原的位點。在一個優(yōu)選的實施方案中，免疫球蛋白的重鏈和輕鏈如通過鏈間二硫鍵共價偶聯(lián)。此外，其中之一或兩者都與細胞因子融合的兩條免疫球蛋白重鏈可如通過一個或多個鏈間二硫鍵共價偶聯(lián)。
因此，本發(fā)明的方法用于增強在治療腫瘤的治療方法(包括W099/29732、WO99/43713、WO99/52562、WO99/53958和WO01/10912中公開的免疫細胞因子組合物和方法)中使用的免疫細胞因子和連接區(qū)氨基酸序列發(fā)生改變的基于抗體的融合蛋白的抗腫瘤活性。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法用于與Fc融合蛋白如Fc-干擾素α融合蛋白聯(lián)合應(yīng)用。
圖1顯示了代表性的免疫細胞因子1的結(jié)構(gòu)示意圖。在此實施方案中，細胞因子分子2和4為結(jié)合于抗體重鏈14和16的CH3區(qū)10和12的羧基末端6和8的肽。在典型的IgG構(gòu)型中VL區(qū)26和28與VH區(qū)18和20配對，從而在免疫細胞因子1的氨基末端提供了2個抗原結(jié)合位點30和32，并在免疫細胞因子1的羧基末端提供了2個細胞因子受體結(jié)合位點40和42。當然，在其更廣的方面，免疫細胞因子并不需要如圖所示配對，或僅兩條免疫球蛋白重鏈之一需要與細胞因子分子融合。
本發(fā)明的免疫細胞因子由于它們結(jié)構(gòu)的兩個方面可被認為是嵌合的。首先，免疫細胞因子是嵌合的，這是因為它包含有與給定細胞因子相連接的具有抗原結(jié)合特異性的免疫球蛋白重鏈。其次，本發(fā)明的免疫細胞因子從它包含來自不同抗體的免疫球蛋白可變區(qū)(V)和免疫球蛋白恒定區(qū)(C)，以至產(chǎn)生V/C嵌合體蛋白這個意義上講是嵌合的。例如，恒定區(qū)和可變區(qū)可來源于從不同物種分離的天然存在的抗體分子。參見如美國專利4,816,567。也包括免疫球蛋白可變區(qū)之一或兩者均包含來源于不同物種的構(gòu)架區(qū)(FR)序列和互補決定區(qū)(CDR)序列的構(gòu)建體。此類構(gòu)建體如在Jones等(1986)自然321522-525，Verhoyen等(1988)科學(xué)2391534-1535和美國專利號5,225,539和美國專利號5,585,089中公開。此外，認為可變區(qū)序列還可通過篩選文庫例如噬菌體展示文庫而獲得以預(yù)期的親和力結(jié)合預(yù)先選定的抗原可變區(qū)序列。制備和篩選噬菌體展示文庫的方法如在Huse等(1989)科學(xué)2461275-1281和Kang等(1991)美國國家科學(xué)院院報8811120-11123中公開。
免疫細胞因子的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可選自任一稱為IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)、IgG(Igγ)和IgM(Igμ)的5種免疫球蛋白類。但是，優(yōu)選的是來自免疫球蛋白IgG類的重鏈恒定區(qū)。此外，認為免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)可來自任一稱為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG抗體亞類。已知每一免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)包含4或5個結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域依次命名如下CH1-鉸鏈區(qū)-CH2-CH3-(-CH4)。CH4存在于沒有鉸鏈區(qū)的IgM。在免疫球蛋白的不同類中，重鏈結(jié)構(gòu)域的DNA序列具有交叉同源性，例如IgG的CH2結(jié)構(gòu)域與IgA和IgD的CH2結(jié)構(gòu)域同源，與IgM和IgE的CH3結(jié)構(gòu)域同源。免疫球蛋白輕鏈具有卡帕(κ)或拉姆達(λ)恒定鏈兩者之一。這些免疫球蛋白區(qū)域的序列和序列比較在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)眾所周知(參見如Kabat等“免疫學(xué)重要性蛋白的序列”(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”)美國健康和福利部(U.S.Department of Health and Human Services)，第三版1983，第四版1987，和Huck等(1986)核酸研究141779-1789)。
在優(yōu)選的實施方案中，可變區(qū)來源于特異性識別預(yù)先選定的細胞表面抗原(與疾病細胞例如癌細胞或病毒感染細胞相關(guān)的抗原)的抗體，且恒定區(qū)包含來自與作為可變區(qū)來源的抗體相同或不同的抗體的CH1和CH2(任選地CH3)結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的實施中，免疫細胞因子的抗體部分優(yōu)選地在預(yù)期的受體體內(nèi)沒有免疫原性或有弱免疫原性。因此，優(yōu)選地，抗體部分盡可能地來源于與預(yù)期受體相同的物種。例如，如果免疫細胞因子將施用于人，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地為人源的。參見如美國專利號4,816,567。此外，當免疫球蛋白可變區(qū)來源于與預(yù)期受體不同的物種時，例如當可變區(qū)序列為鼠源性的而預(yù)期的受體是人時，則可變區(qū)優(yōu)選地包含將鼠CDR序列插入人FR序列之間的人FR序列，以產(chǎn)生具有對預(yù)先選定抗原的結(jié)合特異性但同時在預(yù)期宿主體內(nèi)又具有最小的免疫反應(yīng)性的嵌合可變區(qū)。此類嵌合可變區(qū)的設(shè)計和合成在Jones等(1986)自然321522-525，Verhoyen等(1988)科學(xué)2391534-1535和美國專利號5,225,539和美國專利號5,585,089中公開。人源化的抗體-細胞因子融合蛋白KS-1/4抗Ep-CAM抗體-IL-12融合蛋白的克隆和表達以及其清除已建立的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的能力在Gillies等(1998)免疫學(xué)雜志1606195-6203中已經(jīng)做了描述。
將編碼細胞因子的基因直接地或者通過接頭例如通過編碼(Gly4-Ser)3接頭的DNA與編碼免疫球蛋白恒定區(qū)(如CH2或CH3外顯子)基因的3’端按正確的編碼框相連接。在某些實施方案中，接頭可包含編碼蛋白水解裂解位點的核苷酸序列。當此位點插入免疫球蛋白恒定區(qū)和細胞因子之間時，設(shè)計此位點可在靶位點通過蛋白水解釋放該細胞因子。例如，眾所周知纖溶酶和胰蛋白酶在賴氨酸和精氨酸之后蛋白酶可到達的位點處切割。其它位點特異性蛋白內(nèi)切酶和它們切割的氨基酸序列目前已經(jīng)廣為人知。優(yōu)選的蛋白水解裂解位點和識別此類裂解位點的蛋白水解酶在美國專利號5,541,087和美國專利號5,726,044中已經(jīng)公開。
任選地，核酸構(gòu)建體可包括用于可變區(qū)編碼基因的內(nèi)源性啟動子和增強子以調(diào)節(jié)嵌合免疫球蛋白鏈的表達。例如，包含前導(dǎo)肽、輕鏈的VJ基因(功能性重排的具有連接片段(J)的可變區(qū)(V))或重鏈的VDJ基因以及這些基因的內(nèi)源性啟動子和增強子的DNA片段可作為編碼可變區(qū)的基因。另外，也可獲得不含內(nèi)源性調(diào)控元件的可變區(qū)編碼基因并在提供了這些元件的表達載體中使用。
可變區(qū)基因可通過標準的DNA克隆步驟自產(chǎn)生目標抗體的細胞中獲得。使用適當?shù)腄NA探針如用包含J區(qū)DNA序列及其下游序列的DNA片段篩選基因組文庫以獲得特異的功能性重排的可變區(qū)。正確克隆的鑒定和確認可通過對已克隆的基因進行序列測定，然后將測定的序列與全長的、正確剪接的mRNA的對應(yīng)序列進行比較來進行。
靶抗原可為腫瘤細胞或癌細胞、病毒感染的細胞或其它疾病細胞的細胞表面抗原。靶抗原也可為壞死細胞的不可溶胞內(nèi)抗原(參見如美國專利號5,019,368)。編碼合適可變區(qū)的基因通?？勺援a(chǎn)生免疫球蛋白的淋巴細胞系獲得。例如，通過本領(lǐng)域廣為人知的標準體細胞雜交技術(shù)可獲得產(chǎn)生針對特異性抗腫瘤相關(guān)抗原或病毒抗原的免疫球蛋白的雜交瘤細胞系(參見美國專利號4,196,265)。這些產(chǎn)生免疫球蛋白的細胞系提供了功能性重排形式的可變區(qū)基因的來源。因為該鼠雜交瘤體系可產(chǎn)生具有預(yù)期特異性的各種各樣的免疫球蛋白，所以可變區(qū)基因一般為鼠源性的。此外，可變區(qū)序列也可來源于篩選文庫，如篩選噬菌體展示文庫用以獲得以預(yù)期的親和力結(jié)合預(yù)先選定抗原的可變區(qū)序列。制備和篩選噬菌體展示文庫的方法如在Huse等(1989)科學(xué)2461275-1281和Kang等(1991)美國國家科學(xué)院院報8811120-11123中已經(jīng)公開。
編碼功能上具有活性的可變區(qū)基因的DNA片段與包含編碼預(yù)期的恒定區(qū)(或其一部分)基因的DNA片段相連接。免疫球蛋白恒定區(qū)(重鏈和輕鏈)可通過標準的基因克隆技術(shù)自抗體產(chǎn)生細胞中獲得。兩類人抗體輕鏈(κ和λ)和五類人抗體重鏈(α、δ、ε、γ和μ)的基因已經(jīng)得到克隆，因此人源性的恒定區(qū)易于自這些克隆中獲得。
將編碼雜合免疫球蛋白重鏈的融合基因組裝或插入用以摻入受體細胞的表達載體中。通過標準的基因剪接步驟可實現(xiàn)將基因構(gòu)建體導(dǎo)入質(zhì)粒載體。嵌合免疫球蛋白重鏈可與相應(yīng)的免疫球蛋白輕鏈在相同的細胞中共表達，這樣可同時表達并組裝完整的免疫球蛋白。為此，重鏈和輕鏈構(gòu)建體可位于同一載體中或可位于分別的載體中。
受體細胞系通常為淋巴樣細胞。優(yōu)選的受體細胞是骨髓瘤(或雜交瘤)。骨髓瘤可合成、組裝和分泌轉(zhuǎn)染基因所編碼的免疫球蛋白，并且它們也可糖基化蛋白。特別優(yōu)選的受體或宿主細胞包括正常情況下不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的Sp2/0骨髓瘤和小鼠骨髓瘤NS/0細胞。在轉(zhuǎn)染后，細胞只產(chǎn)生由轉(zhuǎn)染基因構(gòu)建體所編碼的免疫球蛋白。轉(zhuǎn)染的骨髓瘤可在培養(yǎng)物中生長或在小鼠腹腔中生長，在小鼠腹腔中生長時分泌的免疫球蛋白可自腹水中收集。其它的淋巴樣細胞如B淋巴細胞可用作受體細胞。
有幾種方法用于將包含編碼嵌合免疫球蛋白鏈的核酸構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)染淋巴樣細胞。例如，載體可通過原生質(zhì)體融合(參見如Gillies等1989)生物技術(shù)(BIOTECHNOL.)7798-804)導(dǎo)入淋巴細胞。其它有用方法包括電穿孔或磷酸鈣沉淀(參見如Sambrook等編著(1989)“分子克隆實驗室手冊”(“Molecular CloningA Laboratory Manual”)冷泉港出版社)。
其它產(chǎn)生免疫細胞因子的有用方法包括制備編碼該構(gòu)建體的RNA序列，并將該RNA序列在適當?shù)捏w內(nèi)或體外表達系統(tǒng)中翻譯?？梢哉J為用以合成編碼抗體-細胞因子融合蛋白基因、用以將基因?qū)胨拗骷毎⒂靡栽谒拗髦斜磉_基因以及用以收獲所得融合蛋白的重組DNA方法學(xué)在本領(lǐng)域是公知的并且已被徹底證明了。具體的方法如在Sambrook等編著(1989)“分子克隆實驗室手冊”冷泉港出版社出版的一書中已經(jīng)描述。
已經(jīng)了解化學(xué)偶聯(lián)的免疫細胞因子可使用目前廣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的多種方法制備。如可利用抗體或抗體片段和細胞因子中化學(xué)上具反應(yīng)性的氨基酸側(cè)鏈將抗體或抗體片段與細胞因子偶聯(lián)。氨基酸側(cè)鏈可通過如二硫鍵共價連接，或通過包括如N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、間馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酸酯、間馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯和1，4-二-[3’(2`-吡啶基硫代)丙酰胺基]丁烷的同型或異型雙功能交聯(lián)劑共價連接，所有這些試劑均可從Pierce，Rockford，IL公司購得。
根據(jù)本發(fā)明的方法，免疫細胞因子與免疫細胞因子攝入促進劑的聯(lián)合用于已增強的免疫系統(tǒng)的刺激，從而在靶向的細胞類型如腫瘤細胞或其它疾病細胞的位點處產(chǎn)生細胞毒反應(yīng)。由于免疫細胞因子單獨沒有細胞毒性，可以預(yù)期免疫細胞因子與免疫細胞因子攝入促進劑的聯(lián)合在體外將沒有組合的或協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)。
這里不受理論所束縛，認為體內(nèi)組合治療的效應(yīng)可包括通過某一作用劑的作用增強了另一作用劑的攝入，從而導(dǎo)致下列之一或兩者(1)增加了化學(xué)治療的細胞毒性(如果免疫細胞因子增加了腫瘤細胞對化學(xué)治療性免疫細胞因子攝入促進劑的攝入)；和/或(2)增加了免疫刺激(如果免疫細胞因子攝入促進劑以某種方式增加了腫瘤對免疫細胞因子的攝入)。關(guān)于機理(1)，早期研究已顯示通過預(yù)先使用誘導(dǎo)局部血管滲漏的高劑量抗體-IL2免疫結(jié)合物處理可增加腫瘤對放射性標記抗體(并估計可增加對小分子藥物)的攝入(參見如Hornick等，1999，臨床癌研究(CLINCANCER RES)551-60)。如果這一特定機理在免疫細胞因子和免疫細胞因子攝入促進劑聯(lián)合治療中是起作用的，那么首先以免疫細胞因子處理荷瘤動物將是必須的。然而，如果在免疫細胞因子處理前首先施用一次免疫細胞因子攝入促進劑導(dǎo)致抗腫瘤活性上的協(xié)同效應(yīng)，則機理(1)就不起作用。相反地，更可能的解釋是用免疫細胞因子攝入促進劑的處理通過機理(2)增加了免疫細胞因子的攝入。通過證明將放射性標記免疫細胞因子與免疫細胞因子攝入促進劑共同施用增加了實體瘤對放射性標記免疫細胞因子的攝入可進一步支持這一假設(shè)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，聯(lián)合治療的優(yōu)勢在于免疫細胞因子的施用增強了起免疫細胞因子攝入促進劑作用的化學(xué)治療劑的細胞毒效應(yīng)。因此，可對患者施用較低劑量的化學(xué)治療劑。所以，經(jīng)常與化學(xué)治療藥劑相關(guān)的對患者免疫系統(tǒng)某些方面的抑制就被降低了。在本發(fā)明的一個實施方案中，在免疫細胞因子施用前施用了一次化學(xué)治療性免疫細胞因子攝入促進劑。化學(xué)治療性免疫細胞因子攝入促進劑優(yōu)選地在免疫細胞因子施用前約4天和4小時之間施用，且最優(yōu)選地是在約24-48小時間施用。在本發(fā)明的另一實施方案中，在免疫細胞因子施用前對患者施用了多次化學(xué)治療性免疫細胞因子攝入促進劑。在本發(fā)明的其它實施方案中，化學(xué)治療性免疫細胞因子攝入促進劑可在免疫細胞因子施用前施用、同時施用和/或施用后施用。
紫杉醇是可抑制或危害患者免疫系統(tǒng)的化學(xué)治療性免疫細胞因子攝入促進劑的一個例子。雖然紫杉醇的大部分免疫加強效應(yīng)是由巨噬/單核細胞介導(dǎo)的，一些關(guān)于淋巴細胞功能的研究顯示紫杉醇對這一亞群的細胞具有危害。例如，發(fā)現(xiàn)紫杉醇處理可嚴重降低正常和荷瘤小鼠淋巴細胞的增殖能力(Mullins等，1998，免疫藥理學(xué)和免疫毒理學(xué)(IMMUNOPHARMACOL IMMUNOTOXICOL)20473-492)，并且損害NK細胞的細胞毒活性和在含IL-2的細胞培養(yǎng)物中損害淋巴因子活化的細胞毒活性的產(chǎn)生(Chuang等，1993，婦科學(xué)和癌癥學(xué)(GYNECOLONCOL)49291-298)。事實上，現(xiàn)有的證據(jù)證明淋巴細胞的細胞亞群是免疫細胞因子抗腫瘤活性的主要效應(yīng)細胞群(Lode等，1998，藥理學(xué)與治療(PHARMACOL THER)80277-292)。本發(fā)明舉出的實驗證據(jù)已經(jīng)揭示出多個現(xiàn)有技術(shù)不能預(yù)見的新發(fā)現(xiàn)，尤其是關(guān)于藥物施用順序的新發(fā)現(xiàn)。
紫杉烷類可與免疫細胞因子同時一起施用，或者同時通過不同的施用途徑分別而施用。本發(fā)明的組合物可通過適用于特定分子的任何途徑施用。因此，根據(jù)需要可口服或腸胃外施用(包括靜脈內(nèi)施用和腹腔施用)。
本發(fā)明的組合物可通過任一合適的手段直接(例如局部地，通過注射、植入或局部施用至組織位點)或全身性地(例如腸胃外地或口服地)提供給動物。組合物腸胃外，例如通過靜脈、皮下、眼、腹腔、肌內(nèi)、口腔、直腸、陰道、眼窩內(nèi)、腦內(nèi)、頭蓋內(nèi)、脊髓內(nèi)、心室內(nèi)、膜鞘內(nèi)、池內(nèi)、囊內(nèi)、鼻內(nèi)施用或通過氣溶膠施用時，組合物優(yōu)選地包含含水的或生理相容的流體懸液或溶液。因此，載體是生理可接受的物質(zhì)，所以載體除將所需的組合物遞送給患者外，它不能反過來影響患者的電解質(zhì)和/或容積平衡。因此藥劑的流體介質(zhì)可包含生理鹽水(例如9.85％NaCl水溶液，0.15M，pH7-7.4)。對于許多紫杉烷類來說，由于它們通常溶解性不好，配方一般是比較復(fù)雜的。例如，紫杉醇的標準配方是10％Cremophor、10％乙醇和80％鹽水(0.9％NaCl)，而多烯紫杉醇的配方則為在施用前以5％葡萄糖溶液按1∶10進行稀釋的1∶1的乙醇∶多乙氧基醚溶液(Bissery和Lavelle，1999)。然而，其它的包含紫杉烷類和新合成的紫杉烷類似物的配方將被本領(lǐng)域的技術(shù)人員認可和/或常規(guī)性地開發(fā)出來。
每次施用免疫細胞因子的優(yōu)選劑量在0.1mg/m2-100mg/m2的范圍之間，更優(yōu)選地在1mg/m2-20mg/m2，且最優(yōu)選地在2mg/m2-6mg/m2的范圍之間。免疫細胞因子攝入促進劑的優(yōu)選劑量通常取決于使用的免疫細胞因子攝入促進劑的類型，但最適劑量可通過常規(guī)實驗來確定?？赏ㄟ^定期大丸劑注射，或通過置于外部(如靜脈袋)或內(nèi)部(如生物降解性植入物)的儲存容器連續(xù)靜脈內(nèi)或腹腔施用來進行免疫細胞因子和/或免疫細胞因子攝入促進劑的施用。此外，認為本發(fā)明的免疫細胞因子也可與多種不同的免疫細胞因子攝入促進劑一起施用于預(yù)期的受體。但是，認為免疫細胞因子和免疫細胞因子攝入促進劑的最佳組合、施用模式和劑量可通過本領(lǐng)域技術(shù)水平之內(nèi)的常規(guī)實驗確定。
可應(yīng)用多種方法評價使用抗體-細胞因子融合蛋白和免疫細胞因子攝入促進劑聯(lián)合治療對免疫反應(yīng)的功效。例如，下面實施例中描述的動物模型或其它合適的動物模型，可被熟練的技術(shù)人員用來檢測何種免疫細胞因子攝入促進劑或何種免疫細胞因子攝入促進劑的組合在與免疫細胞因子(如抗體-IL2融合蛋白)協(xié)同增強對已建立的腫瘤的免疫破壞時最為有效。免疫細胞因子攝入促進劑或免疫細胞因子攝入促進劑的組合可在免疫細胞因子治療之前施用，或在免疫細胞因子治療的同時施用，且對腫瘤的效應(yīng)可通過對腫瘤體積的測量方便地監(jiān)控。此外，當鑒定出新的免疫細胞因子攝入促進劑時，熟練的技術(shù)人員能夠使用此處描述的方法評價這些新化合物增強或改善抗體-細胞因子融合蛋白抗癌活性的潛力。
另外，在治療之后，為了評價聯(lián)合治療對免疫反應(yīng)的效應(yīng)，腫瘤可被切除、切片和經(jīng)標準的組織學(xué)方法或經(jīng)特異性的免疫組織學(xué)試劑染色。例如，簡單的蘇木素和伊紅染色可揭示實體瘤內(nèi)指示細胞免疫反應(yīng)的淋巴細胞侵潤的差異。此外，使用抗特定群的免疫細胞的抗體進行切片的免疫染色可揭示所誘導(dǎo)反應(yīng)的性質(zhì)。例如，結(jié)合CD45(通用淋巴細胞標志)、CD4和CD8(用于T細胞亞群鑒定)和NK1.1(NK細胞上的標志)的抗體可用來評價本發(fā)明的免疫細胞因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的類型。
另外，免疫細胞因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的類型可通過常規(guī)的細胞亞群耗竭研究，例如Lode等，(1998)血液911706-1715描述的研究方法來評價。耗竭性抗體的實例包括那些與T細胞標志CD4和CD8，以及那些與NK細胞標志NK1.1和脫唾液酸GM結(jié)合的抗體。簡而言之，這些抗體在開始抗體-細胞因子處理前以相當高的劑量(如劑量為約0.5mg/小鼠)注射入哺乳動物體內(nèi)，然后以周為間隔施用直到實驗結(jié)束。此技術(shù)可鑒定在哺乳動物體內(nèi)為引起觀察到的免疫反應(yīng)所必需的細胞類型。
在另一方法中，分離自經(jīng)聯(lián)合治療處理的動物的脾細胞的細胞毒活性可與那些分離自其它治療組的動物的脾細胞相比較。通過在大部分免疫學(xué)實驗室手冊中都有的標準技術(shù)將采集的無菌脾臟機械切碎后制備脾細胞培養(yǎng)物。參見Coligan等(編著)(1988)“最新免疫學(xué)方法”(“CurrentProtocols in Immunology”)，John Wiley & Sons，Inc。然后將收獲的細胞培養(yǎng)在合適的含有血清、抗生素和低濃度IL-2(～10U/mL)的細胞培養(yǎng)基中(如GIBCO的DMEM培養(yǎng)基)。例如，為比較NK細胞活性，一般培養(yǎng)3天是最適的，而為比較T細胞細胞毒活性，一般培養(yǎng)5天是最適的。細胞毒活性可通過51Cr放射性標記腫瘤靶細胞(如LLC細胞)30分鐘而測定。然后除去多余的放射性標記物，將標記細胞與不同濃度的培養(yǎng)脾細胞混合孵育4小時。孵育結(jié)束后，使用伽瑪計數(shù)儀進行細胞51Cr釋放的測定，其接下來用來定量免疫細胞誘導(dǎo)的細胞裂解程度。傳統(tǒng)的細胞毒性T淋巴細胞(或CTL)的活性就用這種方法測定。
通過下述非限制性實施例對本發(fā)明進行進一步的說明。
實施例1.動物模型已經(jīng)發(fā)展了小鼠癌癥模型用于研究免疫細胞因子和紫杉烷類聯(lián)合在介導(dǎo)有效的抗腫瘤細胞毒性反應(yīng)中的效應(yīng)。下述實施例中使用的免疫細胞因子結(jié)合EpCAM，EpCAM為在大部分上皮源性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的人腫瘤抗原(參見Perez和Walker(1989)免疫學(xué)雜志1423662-3667)。為了在免疫健全的小鼠模型中測定功效，必須在與小鼠宿主同源的小鼠腫瘤細胞表面表達人抗原。Lewis肺癌(LLC)細胞為一種廣為人知的小鼠肺癌細胞系，它是為此目的所選擇的第一個細胞系。已知LLC細胞系產(chǎn)生高水平的免疫系統(tǒng)抑制因子，并且在腫瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)免疫細胞產(chǎn)生IL-10從而導(dǎo)致局部免疫抑制(Sharma等，1999，免疫學(xué)雜志1635020-5028)。人腫瘤抗原EpCAM(也稱為KSA)表達于LLC細胞表面，從而其可用衍生自小鼠抗-EpCAM抗體KS-1/4的免疫細胞因子體內(nèi)靶向。通過利用所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Gillies，美國專利申請09/293,042)轉(zhuǎn)導(dǎo)EpCAMcDNA序列實現(xiàn)了EpCAM表達于LLC細胞表面，產(chǎn)生的細胞系命名為LLC/KSA。這些細胞在補充有10％熱滅活的胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素和Geneticin(GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基中于37℃和7％CO2的條件下培養(yǎng)。
代表不同組織來源癌癥的其它細胞系也利用類似的方式人工設(shè)計。無免疫原性的鼠乳腺癌細胞系4T1由Paul Sondel博士(威斯康星大學(xué))提供。4T1細胞系在皮下植入后緩慢但進行性地生長而且在手術(shù)切除原發(fā)腫瘤之前自然轉(zhuǎn)移至許多器官。4T1細胞通過靜脈注射也可能誘導(dǎo)實驗性肺轉(zhuǎn)移。鼠結(jié)腸癌細胞系CT26通過向BALB/c小鼠直腸內(nèi)注射N-亞硝基-N-甲基氨基甲酸乙酯獲得，由I.J.Fidler博士(MD Anderson cancer center，休斯頓，TX)提供。4T1和CT26細胞利用如(Gillies等，1998，免疫學(xué)雜志1606195-6203)描述的方法轉(zhuǎn)染Ep-CAM。4T1/KSA細胞以補充有10％熱滅活的胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素和Geneticin(GIBCO)的RPMI培養(yǎng)基中于37℃和7％CO2的條件下培養(yǎng)。CT26/KSA細胞以補充有10％熱滅活的胎牛血清、L-谷氨酰胺、維生素、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和Geneticin(GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基中于37℃和7％CO2的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基中添加Geneticin是為了給持KSA的表達。盡管所有轉(zhuǎn)染細胞系都在其細胞表面表達人Ep-CAM分子(潛在的外來抗原)，但它們都以皮膚腫瘤(皮下注射后)或轉(zhuǎn)移癌(靜脈注射后)的形式進行性地生長并殺死小鼠。
為進行腫瘤生長研究，LLC/KSA或CT26/KSA腫瘤被植入小鼠背部皮下。對于LLC/KSA研究，腫瘤取自多個通過注射懸于100μL PBS中的1×106個細胞的細胞懸液而制備的儲備腫瘤。在約2周后，無菌收集腫瘤，通過150μm直徑的篩子。細胞再通過注射器和23號針頭2-3次，洗滌2次，然后重懸于PBS中。懸于100μL PBS中的1×106個LLC/KSA細胞的單細胞懸液通過30號針頭注射入小鼠背部皮下。對于CT26/KSA的研究，在培養(yǎng)基中處于指數(shù)生長期的細胞以懸于100μL PBs中的1×106個細胞的單細胞懸液注射。在腫瘤已經(jīng)建立后，約在植入2周后開始自第0天施用藥劑。使用卡尺每周2次3維測量腫瘤。使用等式計算腫瘤體積腫瘤體積＝×3/4π(L/2×W/2×H)其中L＝腫瘤的長度，W＝腫瘤的寬度，H＝腫瘤的高度。研究過程中稱量動物體重并監(jiān)測動物總體健康狀況。當腫瘤開始壞死或動物垂死時，使用CO2窒息法對動物施行安樂死。
數(shù)據(jù)以圖解的形式表示。圖形描述了藥劑施用過程中和施用后的個體或平均腫瘤體積(+/-SEM)。數(shù)據(jù)也以治療小鼠對平均腫瘤體積的控制相對載體治療小鼠對平均腫瘤體積控制的百分比表示。對每個個體的腫瘤體積進行Student’s t檢驗以確定差異是否有顯著性。
對于實驗性肝轉(zhuǎn)移研究，小鼠以80mg/kg鹽酸氯胺酮(Ford DodgeAnimal Health，F(xiàn)ort Dodge，IA)和5mg/kg甲苯噻嗪(Bayer，ShawneeMission，KS)麻醉。在第0天，懸于100μL含有25mM HEPES(GIBCO)的DMEM中的1×105個CT26/KSA細胞的單細胞懸液使用27號針頭脾囊下于60秒的期間注射。在另一個2分鐘后脾血管以燒灼儀(Roboz，Rockville，MD)燒灼并切除脾臟。使用自動針縫合動物。接種3周后處死動物，切除動物肝臟并稱重。然后固定肝臟并在Bouin’s溶液(Sigma，St．Louis，MO)中染色。
數(shù)據(jù)以圖解的形式表示。圖形描述了動物處死時的平均腫瘤荷重(+/-SEM)。通過以實驗組動物的肝臟的重量減去正常動物肝臟重量確定腫瘤荷重。數(shù)據(jù)也以治療小鼠對平均腫瘤荷重的控制相對載體治療小鼠對平均腫瘤荷重控制的百分比表示。對每個個體的腫瘤荷重進行Student’s t檢驗以確定差異是否有顯著性。
對于實驗性肺轉(zhuǎn)移研究，在第0天，懸于100μL PBS中的2.5×105個4T1/KSA細胞的單細胞懸液使用27號針頭經(jīng)尾側(cè)靜脈緩慢注射。接種3周后處死動物，切除動物肺臟并稱重。然后固定肺臟并在Bouin’s溶液(Sigma)中染色。數(shù)據(jù)以圖解的形式表示。圖形描述了動物處死時的平均腫瘤荷重(+/-SEM)。通過以實驗組動物的肺臟的重量減去正常動物肺臟重量確定腫瘤荷重。數(shù)據(jù)也以治療小鼠對平均腫瘤荷重的控制相對載體治療小鼠的平均腫瘤荷重控制的百分比表示。對每個個體的腫瘤重量進行Student’s t檢驗以確定差異是否有顯著性。
實施例2.抗體-細胞因子融合蛋白(免疫細胞因子)的制備下述實施例中討論了幾種抗體-細胞因子融合蛋白。
huKS-huγ1-huIL2(縮寫為KS-IL2)基本如Gillies等(1998)免疫學(xué)雜志1606195-6203和美國專利No.5,650,150中所述制備和表達編碼huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的基因。簡而言之，使用Jones等(1986)自然321522-525中公開的方法，其涉及將每一KS1/4可變區(qū)的CDRs插入人可變區(qū)具有最高度同源性的共有構(gòu)架序列中，從而模建人源化的小鼠KS1/4抗體可變區(qū)(Varki等，(1984)癌癥研究44681-687)。通過使用Silicon Graphics Indigo工作站執(zhí)行BioSym軟件進行分子模建確認保持了CDRs的形狀。然后，對蛋白質(zhì)序列進行反向翻譯，通過連接重疊寡核苷酸構(gòu)建該基因。
基本如Gillies等(1992)美國國家科學(xué)院院報891428-1432中所述將獲得的可變區(qū)插入至攜帶人κ輕鏈和人Cγ1重鏈恒定區(qū)的表達載體中，所不同的是為了表達兩條鏈，將金屬硫蛋白啟動子和免疫球蛋白重鏈增強子替換為CMV啟動子/增強子。除IL-2基因的3`非翻譯區(qū)來源于SV40多聚(A)區(qū)外，通過如Gillies等(1992)美國國家科學(xué)院院報891428-1432中所描述的方法制備將IL-2成熟序列與人重鏈羧基末端融合的融合子。
通過將獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NS/0骨髓瘤細胞系并使用含有0.1μM氨甲蝶呤(MTX)的選擇培養(yǎng)基使IL-2融合蛋白獲得表達。簡而言之，為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，質(zhì)粒DNA通過電穿孔方法導(dǎo)入小鼠骨髓瘤NS/0細胞中。NS/0細胞在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長。收集約5×106個細胞，以PBS洗1次然后重懸于0.5mL的PBS中。10μg線性化的質(zhì)粒DNA與細胞一起在Gene Pulser Cuvette(0.4cm的電極間隙，BioRad)中冰浴10分鐘。使用設(shè)定為0.25V和500μF的Gene Pulser(BioRad，Hercules，CA)進行電穿孔。細胞在冰浴上恢復(fù)10分鐘，然后以生長培養(yǎng)基重懸細胞并接種于2個96孔培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染后兩天加入氨甲蝶呤，通過在100nM氨甲蝶呤存在下培養(yǎng)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。細胞每3天更換培養(yǎng)基共更換3次以上，直至2-3周后出現(xiàn)MTX-抗性克隆。
通過使用合適的抗體進行Fc或細胞因子ELISA鑒定表達克隆(參見如Gillies等(1989)生物技術(shù)(Biotechnol.)7798-804)。按照生產(chǎn)廠商的用法說明書，所得的融合蛋白通過與蛋白A瓊脂糖凝膠(Pharmacia)的結(jié)合和洗脫獲得純化。
huKS-huγ4-huIL2基本上如1999年2月24日申請的，要求1998年2月25日申請的U.S.S.N 60/075,887的專利優(yōu)先權(quán)的U.S.S.N 09/256,156中所描述的方法構(gòu)建和表達編碼huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的基因。
簡而言之，通過自huKS-huγ1-huIL2表達載體中去除免疫球蛋白恒定區(qū)Cγ1基因片段并代之以來自人Cγ4基因的相應(yīng)序列制備了huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的Igγ4變體。人重鏈恒定區(qū)Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4的序列和序列比較在Huck等(1986)核酸研究141776-1789中已經(jīng)公開。
通過以Hind III和Xho I消化原始攜帶Cγ1基因的質(zhì)粒DNA并通過瓊脂糖凝膠電泳純化7.8kb的大片段實現(xiàn)了Cγ1和Cγ4片段的交換。攜帶Cγ4基因的第二種質(zhì)粒以Hind III和Nsi I消化并純化1.75kb的片段。第三種攜帶融合于人Cγ1羧基末端的人IL-2 cDNA和SV40 polyA位點的質(zhì)粒以Xho I和Nsi I消化并純化470bp的小片段。所有的3個片段以大致上相等的摩爾量連接在一起。連接產(chǎn)物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E coli.)感受態(tài)細菌并通過在含有氨芐青霉素的平板上生長篩選菌落。通過對制備自單獨的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA進行限制性酶切分析鑒定正確組裝的重組質(zhì)粒，進而通過Fsp I消化區(qū)分Cγ1(無Fsp I位點)和Cγ4(1個Fsp I位點)基因的插入。
最終獲得的攜帶Cγ4-IL2重鏈替代的載體通過電穿孔(0.25V和500μF)方法導(dǎo)入小鼠骨髓瘤NS/0細胞中，通過在含有氨甲蝶呤(0.1μM)的培養(yǎng)基中生長篩選轉(zhuǎn)染子。鑒定、擴增表達高水平huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的細胞克隆，使用蛋白A瓊脂糖凝膠色譜層析法自培養(yǎng)上清中純化融合蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳鑒定Cγ4融合蛋白的純度和完整性。應(yīng)用T細胞增殖試驗(Gillis等(1978)免疫學(xué)雜志1202027-2032)測定IL-2的活性，發(fā)現(xiàn)其IL-2活性與γ1-構(gòu)建體的IL-2活性相同。
huKS-muγ2 a-muIL2如上所述，通過將huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的人抗體恒定區(qū)和人IL-2以相應(yīng)的鼠源性序列替代構(gòu)建了編碼huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白的基因。具體地說，人Cγ1-IL2 DNA被融合至編碼鼠IL-2的DNA的鼠Cγ2a cDNA片段所替代。簡而言之，使用下列重疊寡核苷酸引物進行重疊PCR將huKS的VH區(qū)按正確的讀碼框架與鼠γ2a cDNA連接(正義)5`CC GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC(SEQ ID NO3)；(反義)5`GG GGC TGT TGT TTT GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA CG(SEQ ID NO4)；(正義)5`C TTA AGC CAG ATC CAG TTG GTG CAG(SEQ ID NO5)；以及(反義)5`CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C(SEQ IDNO6)。
設(shè)計SEQ ID NOS3和4的寡核苷酸與huKS的VH結(jié)構(gòu)域的接點和鼠γ2a cDNA恒定區(qū)雜交(斜體)。第一輪PCR時有兩個獨立的反應(yīng)。一個反應(yīng)中，使用SEQ ID NOS4和5并以huKS DNA的VH為模板。引物SEQID NO5在編碼huKS VH成熟氨基末端的序列(黑體)上游引入AflII(CTTAAG)限制性位點。另一個反應(yīng)中，使用寡核苷酸SEQ ID NOS3和6并以鼠γ2a cDNA為模板。引物SEQ ID NO6與編碼γ2a C-末端區(qū)域周圍的cDNA雜交，且為接下來與muIL2 cDNA的連接而引入XmaI(CCCGGG)限制性位點?；旌蟽纱畏磻?yīng)的PCR產(chǎn)物并使用寡核苷酸SEQID NOS5和6進行第二輪PCR。獲得的PCR產(chǎn)物進行克隆和序列驗證，編碼huKS VH和鼠γ2a恒定區(qū)的AfIII-XmaI片段用來在AfIII位點與編碼信號肽的DNA連接以及在XmaI位點與muIL2 cDNA連接。
使用SEQ ID NOS7和8的寡核苷酸引物，自小鼠外周血單核細胞中提取mRNA并克隆鼠IL2 cDNA，其中SEQ ID NOS7和8引物為(正義)5`GGC CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AGC TCC(SEQID NO.7)；以及(反義)5`CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG(SEQ ID NO.8)。
引物SEQ ID NO7使muIL2(黑體字序列)可以與muγ2a在XmaI限制性位點(CCCGGG)相連接。引物SEQ ID NO8緊接翻譯終止密碼子(反義中的黑體字)之后引入了XhoI限制性位點(CTCGAG)。
相似地，huKS的輕鏈可變(VL)結(jié)構(gòu)域也通過重疊PCR與muκcDNA序列相連接。使用的重疊寡核苷酸引物包括(正義)5`G GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT G(SEQID NO.9)；(反義)5`GC AGC ATC AGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC(SEQID NO.10)；(正義)5`C TTA AGC GAG ATC GTG CTG ACC CAG(SEQ IDNO.11)；以及(反義)5`CTC GAG CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC(SEQ IDNO.12)。
設(shè)計寡核苷酸與huKS的VL的接點和鼠κcDNA(斜體)恒定區(qū)雜交。第一輪PCR時有兩個獨立的反應(yīng)。一個反應(yīng)中，使用SEQ ID NOS.10和11并以huKS DNA的VL為模板，SEQ ID NO.11在編碼huKS VL成熟氨基末端的序列(黑體字)上游引入AfIII(CTTAAG)限制性位點。另一個反應(yīng)中，使用寡核苷酸SEQ ID NOS.9和12并以鼠κcDNA為模板，SEQID NO.12在翻譯終止密碼子(反義引物中的黑體字)之后引入了XhoI限制性位點。
混合兩次反應(yīng)的PCR產(chǎn)物并使用寡核苷酸引物SEQ ID NOS.11和12進行第二輪PCR。獲得的PCR產(chǎn)物進行克隆和序列驗證，編碼huKS VL區(qū)和鼠κ恒定區(qū)的AflII-XhoI片段用來在AflII位點處與編碼信號肽的DNA相連接。
鼠重鏈和輕鏈序列兩者都用來替代pdHL7中的人序列。獲得的攜帶dhfr選擇性標志基因的抗體表達載體通過電穿孔(6.25V和500μF)方法導(dǎo)入鼠骨髓瘤NS/0細胞中，通過在含有氨甲蝶呤(0.1μM)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選克隆。氨甲蝶呤抗性的轉(zhuǎn)染克隆通過標準的ELISA方法檢測抗體的分泌。根據(jù)生產(chǎn)廠商的使用說明，融合蛋白經(jīng)蛋白A瓊脂糖凝膠色譜層析法純化。
huKS-muγ2a-muIL 12通過如1997年12月8日申請的U.S.S.N.08/986,997和Gillies等(1998)免疫學(xué)雜志1606195-6203中描述的方法構(gòu)建和表達編碼huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的基因。簡而言之，通過將鼠p35 IL-12亞單位cDNA與以前制備的huKS-muγ2a重鏈編碼區(qū)相融合而實現(xiàn)。獲得的載體轉(zhuǎn)染已經(jīng)使用小鼠p40 IL-12亞單位轉(zhuǎn)染并能夠表達p40 IL-12亞單位的NS/0骨髓瘤細胞系。換句話說，僅使用小鼠p40轉(zhuǎn)染細胞系，篩選獲得穩(wěn)定地高表達細胞用做轉(zhuǎn)染包含p35的融合蛋白的受體細胞(即連續(xù)轉(zhuǎn)染)。
小鼠p35和p40 IL-12亞單位通過PCR自以伴刀豆凝集素A活化的脾細胞(培養(yǎng)基中含5μg/mL刺激3天)中制備的mRNA中分離獲得。用來分離p35編碼核酸序列的PCR引物也使p35 cDNA成為具有XmaI-XhoI限制性位點的片段，引物包括5`CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG(SEQ ID NO.13)；以及5`CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC(SEQ ID NOS.14)。
用來分離p40編碼核酸序列的PCR引物包括5`TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC(SEQ ID NOS.15)；以及5`CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG(SEQ ID NOS.16)。
如(Gillies等，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)125191)中所描述構(gòu)建了攜帶有dhfr選擇性標志基因、編碼人源化KS抗體輕鏈的轉(zhuǎn)錄單位和編碼與鼠IL-12的p35亞單位融合的鼠重鏈的轉(zhuǎn)錄單位的質(zhì)粒載體(pdHL7-huKS-muγ2a-p35)。通過將改變的p35亞單位cDNA的XmaI至XhoI片段與以前制備的小鼠γ2a基因CH3外顯子末端唯一的XmaI位點相連接完成了融合。H和L鏈轉(zhuǎn)錄單位都包括5`末端的巨細胞病毒(CMV)啟動子(取代原始質(zhì)粒的金屬硫蛋白啟動子)和3`末端的多聚腺苷酸位點。
為表達游離的p40亞單位，構(gòu)建了包含選擇性標志基因(新霉素抗性基因)但仍用CMV啟動子進行轉(zhuǎn)錄的相似載體(pNC-p40)。此時該載體的編碼區(qū)包含了p40亞單位的天然前導(dǎo)序列，用于將p40亞單位正確地輸送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并與融合蛋白組裝。質(zhì)粒pNC-p40通過電穿孔法導(dǎo)入細胞，然后接種入培養(yǎng)板并以含有G418的培養(yǎng)基進行篩選。如此，通過ELISA檢測抗藥性克隆培養(yǎng)上清中p40亞單位的產(chǎn)生。
如Gillies等(1998)免疫學(xué)雜志1606195-6203中所描述的，通過電穿孔法將pdHL7-huKS-muγ2a-p35表達載體電穿孔入已經(jīng)表達鼠p40的NS/0細胞中。通過標準ELISA法檢測氨甲蝶呤抗性轉(zhuǎn)染克隆抗體決定簇和小鼠IL-12的分泌。根據(jù)生產(chǎn)廠商的使用說明，所得蛋白質(zhì)通過與蛋白A瓊脂糖凝膠柱的結(jié)合和自蛋白A瓊脂糖凝膠柱上洗脫得到純化。
實施例3.聯(lián)合治療的體外細胞毒活性在存在或缺乏包含人源化KS-1/4抗體在H鏈羧基末端與人IL2相融合、基于IL-2的免疫細胞因子(huKS-huγ1-huIL2，此后縮寫為KS-IL2)的情況下，通過細胞培養(yǎng)檢測了動物模型(實施例1)中使用的基因工程細胞系對tanane誘導(dǎo)的細胞毒性的敏感性。細胞按1000個細胞/孔接種于96孔平底培養(yǎng)板，在37℃，7％CO2的條件下培養(yǎng)24小時。紫杉醇從200ng/mL開始2倍倍比稀釋至3.125ng/mL，KS-IL2 200ng/mL和IL233.3ng/Ml(與KS-IL2中的IL2相當?shù)牧?復(fù)孔加樣加到細胞培養(yǎng)板中，在37℃，7％CO2的條件下培養(yǎng)6天。直接在96孔板上進行基于四唑鎓鹽的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化而測定細胞活力的MTS比色檢測(Promega)。在96孔板讀數(shù)和記錄后，活的粘附細胞以結(jié)晶紫(Sigma，St.Louis，MO)染色。結(jié)晶紫染色的培養(yǎng)板用以校驗MTS檢測結(jié)果。結(jié)果以表格的形式表示。IC50是產(chǎn)生對照組50％水平的細胞毒性的藥物濃度。
進行了紫杉醇(3至200ng/mL)單獨或與KS-IL2(200ng/mL)或IL-2(33.3ng/mL)聯(lián)合抗CT26/KSA、LLC/KSA和4T1/KSA細胞的細胞毒性檢測。KS-IL2或IL-2單獨對3種檢測的細胞系的細胞毒性幾乎沒有(對照的81％到101％，表1)。KS-IL2或IL-2的添加并沒有影響紫杉醇的細胞毒性。因此，由于KS-IL2和IL-2都不能影響紫杉醇的細胞毒性，聯(lián)合治療對小鼠抗腫瘤活性的任何增強一定是因為其它僅在荷瘤動物體內(nèi)發(fā)生的機理。
表1.紫杉醇與IL-2或KS-IL2聯(lián)合的細胞毒性紫杉醇的IC50(ng/mL)CT26/KSAaLLC/KSAb4T1/KSAb紫杉醇 27 6 16紫杉醇+IL-2(33ng/mL) 30 8 20紫杉醇+KS-IL2(200ng/mL)26 5 19對照的％CT26/KSAaLLC/KSAb4T1/KSAbIL-2(33ng/mL) 97 100 95KS-IL2(200ng/mL) 90 101 81a.3次實驗的平均b.2次實驗的平均實施例4.KS-IL2和紫杉烷對LLC皮膚腫瘤的聯(lián)合治療使用攻擊性生長的腫瘤LLC/KSA進行了腫瘤生長回歸檢測，其中在單次紫杉醇(80mg/kg)施用1周后，接著進行經(jīng)尾靜脈注射施用KS-IL2(20μg)5天(圖2)。紫杉醇或KS-IL2單獨施用(在第0-4天)沒有觀察到任何效應(yīng)。但是，當紫杉醇施用1周后接著施用KS-IL2時，觀察到了平均腫瘤體積大大減小(對照組的41％)和約8天的腫瘤生長延遲(TGD)，與紫杉醇單獨施用相比差異具有顯著性(p＝0.023)。在紫杉醇治療組，除＜5％的體重降低之外，沒有觀察到藥物相關(guān)的顯著毒性。
接下來，通常認為是更為有效的化學(xué)治療方案的紫杉醇多次施用的聯(lián)合KS-IL-2效應(yīng)與紫杉醇單次施用的聯(lián)合KS-IL2效應(yīng)進行了比較以確定方案是如何影響增強效應(yīng)的。KS-IL2(20μg，0-4天)單獨對LLC/KSA腫瘤生長沒有效應(yīng)，但是當多次單獨施用紫杉醇時(50mg/kg，每隔1天)降低平均腫瘤體積至對照組的63％并導(dǎo)致4天的腫瘤生長延遲(TGD)(圖3)。當KS-IL2免疫細胞因子在紫杉醇治療1周后接著施用，腫瘤體積降至對照組的27％并觀察到10天的TGD，與紫杉醇單獨治療組相比有顯著性差異(p＝0.016)。在紫杉醇治療組，除＜5％的體重降低之外，沒有觀察到藥物相關(guān)的顯著毒性。聯(lián)合治療組有更少的體重減輕?？紤]到在化學(xué)治療(和潛在的免疫損害)處理和基于刺激淋巴細胞增殖和細胞毒性的處理開始之間相對短的間隔，這些積極的聯(lián)合治療結(jié)果是另人驚訝的。
對聯(lián)合效應(yīng)的一種解釋是紫杉烷誘導(dǎo)的生長中腫瘤團塊的部分凋亡降低了腫瘤間質(zhì)的壓力，其接下來增加了腫瘤對KS-IL2的有效攝入。近期研究(Griffon-Etienne等1999，癌研究593776-3782)顯示單次施用紫杉醇的效應(yīng)有效地降低了間質(zhì)內(nèi)液體壓力，最大效應(yīng)發(fā)生在24-48小時間(Griffon-Etienne等1999，癌研究593776-3782)。盡管這可能是腫瘤攝入免疫細胞因子的最佳時間，但其也是化學(xué)治療后一段非常短的時間間隔。而且，我們在紫杉醇單次施用剛剛24小時后開始以KS-IL2連續(xù)5天治療荷LLC/KSA瘤小鼠。結(jié)果顯示，當免疫細胞因子處理比在單次紫杉醇施用后1周更早一些開始時，產(chǎn)生了對LLC/KSA癌細胞系和結(jié)腸癌CT26細胞系的更好的聯(lián)合效應(yīng)(見下文)。
實施例5.KS-IL2和紫杉烷聯(lián)合治療4T1轉(zhuǎn)移癌由于我們發(fā)現(xiàn)在施用紫杉烷和免疫細胞因子之間的處理間隔應(yīng)比預(yù)期的更短，我們檢驗了紫杉烷和免疫細胞因子在同一天施用的聯(lián)合方案，并對單次(75mg/kg)和多次(25mg/kg×3天)紫杉醇與KS-IL2(15μg/劑×3天，紫杉醇施用4小時后施用)一起施用做了比較。為了這一實驗我們使用了4T1/KSA乳腺癌細胞誘導(dǎo)的實驗性肺轉(zhuǎn)移模型。選擇比它們單獨應(yīng)用時的最適劑量稍低的藥物劑量，以便可觀察到任何潛在的相加或協(xié)同活性。
每一藥劑在單獨施用時，在相似的程度上均顯著(p＜0.02)降低了平均肺重量紫杉醇單次施用降低43％，紫杉醇多次單獨施用降低49％，KS-IL2單獨施用降低39％(圖4)。紫杉醇和KS-IL2聯(lián)合進一步稍微但不是相加地降低了肺轉(zhuǎn)移單次紫杉醇施用聯(lián)合KS-IL2降低58％，多次紫杉醇施用聯(lián)合KS-IL2降低68％。盡管沒有觀察到協(xié)同作用，但單次紫杉醇施用聯(lián)合KS-IL2與紫杉醇單獨施用相比有顯著的差異(p＝0.047)。
所有的實驗組都觀察到了＜10％的體重降低，但是當紫杉醇以25mg/kg每隔1天共3次施用時，體重降低最大?；谝陨蠑?shù)據(jù)，考慮到最佳的聯(lián)合治療效應(yīng)，在該4T1肺轉(zhuǎn)移檢測中最好的方案為單次紫杉醇施用后接著進行KS-IL2處理，對LLC/KSA腫瘤生長回歸模型也是這樣的情況。由于在此情況下施用間隔僅為4小時，對有效的腫瘤攝入來說結(jié)果可能還不是最好的。
實施例6.KS-IL2和紫杉烷聯(lián)合治療CT26皮膚腫瘤實施例5中描述的實驗結(jié)果提示在兩次施用之間4小時的時間間隔可能太短了?；蛟S在KS-IL2施用時動物體內(nèi)仍保持的紫杉醇水平可直接干擾淋巴細胞活化，因此降低了聯(lián)合處理的潛在抗腫瘤活性。而且，在4小時時間點可能還沒有達到對腫瘤間質(zhì)壓力的最大效應(yīng)。因此，我們設(shè)計了另一實驗，這次使用CT26/KSA結(jié)腸癌已經(jīng)建立的皮膚腫瘤，其中我們把單次紫杉醇施用(75mg/kg)與在該紫杉烷施用24小時后開始的5天的KS-IL2處理結(jié)合起來。紫杉醇單獨對腫瘤生長沒有效果(圖5)。以亞最佳劑量的KS-IL2(10μg，從第1至第5天)處理導(dǎo)致腫瘤體積降低到對照的71％。紫杉醇和KS-IL2聯(lián)合處理觀察到腫瘤體積顯著性地和協(xié)同性地降低到對照組的8％，與紫杉醇單獨處理相比有顯著性差異(p＜0.001)。兩個紫杉醇處理組均觀察到～5％的動物體重降低。
使用CT26/KSA模型進行了第二個實驗，這次檢測聯(lián)合治療對已經(jīng)建立的肝轉(zhuǎn)移的效果，并且再次在紫杉醇施用和KS-IL2處理間使用了24小時延遲。我們也比較了聯(lián)合治療中紫杉醇的劑量反應(yīng)。小鼠在癌轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)之后第5天分別單獨注射25、50和75mg/kg紫杉醇，或在1天后接著以KS-IL2(7μg)處理5天。紫杉醇單獨施用觀察到了劑量反應(yīng)效應(yīng)，其中25、50和75mg/kg的劑量分別降低腫瘤負荷至對照組的49％、23％和10％(圖6)。紫杉醇與KS-IL2聯(lián)合進一步降低肺轉(zhuǎn)移到相同的每個紫杉醇劑量對照組的12％、9％和6％。最低紫杉醇劑量(25mg/kg)聯(lián)合KS-IL2與較高紫杉醇劑量聯(lián)合KS-IL2相比前者導(dǎo)致了腫瘤負荷最大的和最顯著(p＜0.001)的降低。因此，KS-IL2聯(lián)合紫杉醇比兩者單獨應(yīng)用產(chǎn)生了更強的抗腫瘤效應(yīng)。此外，最低劑量的紫杉醇與KS-IL2聯(lián)合產(chǎn)生了與最高劑量的紫杉醇單獨施用相似的抗腫瘤效應(yīng)。因此，使用較低劑量的紫杉醇與KS-IL2聯(lián)合將在降低毒性的同時維持良好的功效。
實施例7.測定腫瘤對KS-IL2的攝入如果在免疫細胞因子治療前單次細胞毒性藥物處理的效應(yīng)是降低腫瘤間質(zhì)壓力并增加對腫瘤細胞的穿透，那么這將可使用放射性標記的免疫細胞因子例如KS-IL2來測定。通過與廠商(New England Nuclear，Billerica，MA)簽定合同，使用標準方法(參考文獻)將純化的KS-IL2標記125I。如實施例1中所述將CT26/KSA皮膚腫瘤皮下植入并使之生長至100-200mm3。使用溶于載體的紫杉醇(50mg/kg)或單獨用載體注射兩組小鼠，每組4只小鼠，接下來1小時(實驗1)或24小時(實驗2)后注射10μg125I-KS-IL2(95μCi)。在注射放射性標記的免疫細胞因子6小時后，處死小鼠并外科切除腫瘤。作為對照，收集動物的肝臟并且所有的組織都被稱重并在伽瑪計數(shù)儀上計數(shù)。通過將組織的總CPM值除以組織重量，結(jié)果以每克組織的每分鐘計數(shù)(CPM)表示。
當標記的KS-IL2在紫杉醇處理1小時后注射時(圖7A)，在接受藥物的動物上切下的腫瘤中僅觀察到放射活性的小的增加。相反，標記的KS-IL2在紫杉醇處理24小時后注射時，攝入的放射性活性與載體對照相比有了顯著性的增加(＞200％)。在1小時和24小時時間點腫瘤攝入的巨大差異與關(guān)于紫杉烷誘導(dǎo)的間質(zhì)壓力變化的數(shù)據(jù)(Griffon-Etienne等1999，癌研究593776-3782)相一致，這也與我們的腫瘤模型顯示的紫杉醇施用24小時后開始處理比更早的時間(4小時)開始處理更為有效的數(shù)據(jù)相一致。
我們也檢測了是否其它種類的藥物也能增加實體瘤對放射性標記的免疫細胞因子的攝入。在這種情況下，小鼠在實驗前24小時或3天單次注射環(huán)磷酰胺(40mg/kg)。包括以PBS預(yù)處理的對照小鼠在內(nèi)的所有小鼠均注射125I標記的KS-IL2，16小時后測量切下腫瘤中的放射性活性的數(shù)量。結(jié)果(圖8)顯示在24小時前環(huán)磷酰胺預(yù)處理的小鼠KS-IL2攝入增加了48％，而預(yù)處理3天的小鼠KS-IL2攝入增加了70％。
實施例8 huKS-huγ4-IL2和紫杉烷的聯(lián)合治療近來已描述了由于對Fc受體具較低的親和力而具有循環(huán)半壽期增加和功效改善的新免疫細胞因子(參見Gillies等，1999，癌研究592159-2166)。檢測了這些改良的IL-2免疫細胞因子中的一個代表huKS-huγ4-IL2與單次紫杉醇的聯(lián)合治療。再次表明當兩種藥物依次施與負荷CT26/KSA皮膚腫瘤的小鼠具有改善的功效。
實施例9.huKS-muγ2a-muIL12和紫杉烷的聯(lián)合治療為了檢測協(xié)同治療效應(yīng)是否僅為基于IL-2的免疫細胞因子特異性的，我們首先以紫杉醇(單次施用75mg/kg)然后是5天的huKS-muγ2a-muIL12(每天5μg)處理了已建立的CT26/KSA大體積腫瘤。此免疫細胞因子代表了鼠源化HuKS抗體(即恒定區(qū)變?yōu)槭笤葱缘腃κ和Cγ2a)和鼠IL-12的融合。因為不象IL-2，IL-12是高度種屬特異性的，人的IL-12在小鼠體內(nèi)活性不很好，所以必須使用鼠IL-12序列。結(jié)果顯示紫杉醇單獨處理對腫瘤生長有很少的影響。以亞最適劑量的huKS-muγ2a-muIL12處理具有抗腫瘤效應(yīng)，并且抗腫瘤效應(yīng)在首先以單次紫杉醇處理的小鼠體內(nèi)增加了。
實施例10.huKS-IL2和烷化劑藥劑聯(lián)合治療i.證實了huKS-IL2與歸于烷化劑藥劑類的化學(xué)治療藥物環(huán)磷酰胺聯(lián)合提高了治療效果。治療前3天將4T1乳腺癌細胞靜脈注射入免疫健全的小鼠體內(nèi)以建立肺轉(zhuǎn)移。小鼠以單次環(huán)磷酰胺(15、40或80mg/kg)處理，3天后繼續(xù)接受5天的huKS-IL2(每天15μg)處理。盡管兩個較低劑量單獨施用僅造成肺轉(zhuǎn)移腫瘤負荷的適當?shù)慕档?，環(huán)磷酰胺和huKS-IL2聯(lián)合與環(huán)磷酰胺單獨處理相比前者造成腫瘤負荷顯著性地(p＜0.05，圖9)大大降低。但是在最高劑量(80mg/kg)沒有發(fā)生協(xié)同作用。
ii.在荷有建立的乳腺癌皮下腫瘤的免疫健全小鼠體內(nèi)，腫瘤生長測定也證實huKS-IL2與環(huán)磷酰胺聯(lián)合提高了治療性效果。小鼠以單次環(huán)磷酰胺80mg/kg單獨處理或者在環(huán)磷酰胺處理3天后聯(lián)合5天的huKS-IL2單獨施用(30μg)處理。對于huKS-IL2和環(huán)磷酰胺80mg/kg單獨施用，平均腫瘤體積分別降低了31％和69％(圖9B)。聯(lián)合治療在第25天100％地降低了平均腫瘤體積，其與huKS-IL2單獨或環(huán)磷酰胺單獨處理相比具有顯著性差異(p＜0.05)，并且在開始治療后最多12周的時間內(nèi)8只小鼠中有6只完全清除了腫瘤。動物較好地耐受了這些處理，在所有的實驗組中體重降低小于10％。
iii.在荷有已建立的肺癌皮下腫瘤的免疫健全小鼠體內(nèi)，腫瘤生長測定也證實huKS-IL2與環(huán)磷酰胺聯(lián)合提高了治療性效果。小鼠以單次環(huán)磷酰胺80mg/kg單獨處理或者在環(huán)磷酰胺處理3天后聯(lián)合5天的huKS-IL2(20μg)處理。對于huKS-IL2單獨施用和環(huán)磷酰胺80mg/kg單獨施用，平均腫瘤體積分別降低了2％和27％(圖9C)。聯(lián)合治療在第20天使平均腫瘤體積降低了48％，其與huKS-IL2單獨或環(huán)磷酰胺單獨處理相比具有顯著性差異(p＜0.05)。動物較好地耐受了處理，在所有的實驗組中體重降低小于10％。
實施例11.huKS-IL2和烷化劑藥劑聯(lián)合治療證實了huKS-IL2與歸于烷化劑藥劑類的另一化學(xué)治療藥物卡鉑聯(lián)合提高了治療效果。在第0天以卡鉑(75mg/kg)處理荷有已建立的非小細胞肺癌皮下腫瘤(LLC/KSA)的小鼠，3天后繼續(xù)接受5天的KS-IL2(每天20μg)處理?？ㄣK和KS-IL2處理單獨均造成腫瘤生長適當?shù)亟档?，但是僅有聯(lián)合治療在第20天顯著地降低了平均腫瘤體積(p＜0.05，圖10)。此外，接受聯(lián)合治療的小鼠體內(nèi)腫瘤的生長與卡鉑單獨處理小鼠相比具有顯著性差異(p＜0.05)。
不偏離本發(fā)明的精神和本質(zhì)特征，本發(fā)明也可以有其它特定形式的具體體現(xiàn)。因此，前述的實施方案應(yīng)理解為是全方位地舉例說明本發(fā)明，而不是限制此處描述的本發(fā)明。本發(fā)明的范圍通過附加的權(quán)利要求書而不是通過前邊的描述來體現(xiàn)，在與權(quán)利要求書等同的本發(fā)明的意義和范圍之內(nèi)產(chǎn)生的所有改變都將包括在本發(fā)明之內(nèi)。
上述公開的每份專利文件和科學(xué)出版物均在此引用作為參考。
權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)哺乳動物體內(nèi)抗腫瘤的殺細胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括以下施用于哺乳動物的步驟(i)包含抗體結(jié)合位點的免疫細胞因子；和(ii)增強免疫細胞因子誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的免疫細胞因子攝入促進劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中抗體結(jié)合位點結(jié)合癌細胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中抗體結(jié)合位點結(jié)合腫瘤特異性抗原。
4.權(quán)利要求1的方法，其中免疫細胞因子攝入促進劑與免疫細胞因子共同施用。
5.權(quán)利要求1的方法，其中免疫細胞因子攝入促進劑在免疫細胞因子施用之前施用。
6.權(quán)利要求1的方法，其中抗體結(jié)合位點從氨基末端到羧基末端的方向包含免疫球蛋白可變區(qū)、CH1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求6的方法，其中抗體結(jié)合位點還包含與CH2結(jié)構(gòu)域羧基末端連接的CH3結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求1的方法，其中免疫細胞因子是融合蛋白，從氨基末端到羧基末端的方向包含(i)抗體結(jié)合位點，其包含可結(jié)合預(yù)先選定細胞類型上的細胞表面抗原的免疫球蛋白可變區(qū)、免疫球蛋白CH1結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域，和(ii)細胞因子。
9.權(quán)利要求8的方法，其中抗體結(jié)合位點還包含插入CH2結(jié)構(gòu)域和細胞因子之間的CH3結(jié)構(gòu)域。
10.權(quán)利要求1的方法，其中免疫細胞因子中的細胞因子選自腫瘤壞死因子、白細胞介素、集落刺激因子和淋巴因子。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述的免疫細胞因子攝入促進劑為紫杉烷。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的紫杉烷選自紫杉醇、多烯紫杉醇、10-脫乙酰漿果赤霉素III和它們的衍生物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的免疫細胞因子攝入促進劑為烷化劑類化學(xué)治療劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的烷化劑類化學(xué)治療劑選自環(huán)磷酰胺、卡鉑和它們的衍生物。
15.權(quán)利要求1的方法，其中將兩種或多種不同的免疫細胞因子攝入促進劑施與所述的哺乳動物。
16.權(quán)利要求1的方法，其中將兩種或多種不同的免疫細胞因子施與所述的哺乳動物。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述的免疫細胞因子攝入促進劑在所述的免疫細胞因子施用前約24小時施用。
18.用以在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的組合物，該組合物包含(i)含有抗體結(jié)合位點和細胞因子的免疫細胞因子；和(ii)免疫細胞因子攝入促進劑。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中抗體結(jié)合位點從氨基末端到羧基末端的方向包含免疫球蛋白可變區(qū)、CH1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中抗體結(jié)合位點還包含與CH2結(jié)構(gòu)域羧基末端連接的CH3結(jié)構(gòu)域。
21.權(quán)利要求18的組合物，其中免疫細胞因子是融合蛋白，其從氨基末端到羧基末端的方向包含(i)抗體結(jié)合位點，其包含可結(jié)合預(yù)先選定細胞類型上的細胞表面抗原的免疫球蛋白可變區(qū)、免疫球蛋白CH1結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域，和(ii)細胞因子。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中抗體結(jié)合位點還包含插入CH2結(jié)構(gòu)域和細胞因子之間的CH3結(jié)構(gòu)域。
23.權(quán)利要求18的組合物，其中免疫細胞因子中的細胞因子選自腫瘤壞死因子、白細胞介素、集落刺激因子和淋巴因子。
24.權(quán)利要求18的組合物，其中所述的免疫細胞因子攝入促進劑為紫杉烷類。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述的紫杉烷類選自紫杉醇、多烯紫杉醇、10-脫乙酰漿果赤霉素III和它們的衍生物。
26.權(quán)利要求18的組合物，其中所述的免疫細胞因子攝入促進劑為烷化劑類化學(xué)治療劑。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述的烷化劑類化學(xué)治療劑選自環(huán)磷酰胺、卡鉑和它們的衍生物。
全文摘要
本專利公開的是用于治療腫瘤的方法和組合物。公開的方法和組合物增強了腫瘤對免疫細胞因子的攝入，并且是基于免疫細胞因子和免疫細胞因子攝入促進劑的聯(lián)合。公開的方法和組合物尤其用于在哺乳動物體內(nèi)降低腫瘤大小和腫瘤轉(zhuǎn)移。
文檔編號C07K19/00GK1529619SQ01811924
公開日2004年9月15日 申請日期2001年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月29日
發(fā)明者S·D·吉利斯, S D 吉利斯, 蘭燕, 霍爾登, S·A·霍爾登 申請人:默克專利有限公司