一種促進(jìn)人角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)炎癥因子IL-1α的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)人角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)炎癥因子IL-1a 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 炎癥因子是一類小分子多肽和糖蛋白，具有調(diào)節(jié)和介導(dǎo)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的作 用，包括白介素類、干擾素類、腫瘤壞死因子類、生長因子類以及趨化因子類。細(xì)胞受到刺激 后產(chǎn)生大量的炎癥因子，直接或間接影響淋巴細(xì)胞或周圍細(xì)胞，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì) 胞凋亡中起重要作用。
[0003]表皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞釋放炎癥因子IL-la，又叫IL-1A或IL1F1，它與其他8個(gè) 白介素家族基因均位于人類第2號染色體上，它可以結(jié)合細(xì)胞表面受體，發(fā)揮免疫炎癥調(diào) 節(jié)，促進(jìn)細(xì)胞分化等生物學(xué)作用。
[0004] 角質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子白介素1 (IL-1a) -方面促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌IL-6,引起 成纖維細(xì)胞大量基因表達(dá)發(fā)生變化，另一方面促進(jìn)中性粒細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上，從而刺 激機(jī)體局部發(fā)生炎癥反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是促進(jìn)人角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)炎癥因子IL-1a。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種促進(jìn)離體的人角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)炎癥因子 IL-la的方法，可包括如下步驟a2):用SDS處理離體的人角質(zhì)細(xì)胞。
[0007] 上述方法中，所述步驟a2)中，可用濃度為0. 3-0. 4yg/ml的SDS處理所述離體的 人角質(zhì)細(xì)胞。
[0008] 上述方法中，所述步驟a2)中，具體可用濃度為0. 357yg/ml的SDS處理所述離體 的人角質(zhì)細(xì)胞。
[0009] 上述方法中，所述步驟a2)中，用SDS處理離體的人角質(zhì)細(xì)胞的條件參數(shù)可為： 35-39°C，5h-7h。
[0010] 上述方法中，所述用SDS處理離體的人角質(zhì)細(xì)胞的條件參數(shù)具體可為37°C和6h。
[0011] 上述方法中，還包括如下步驟al):將離體的人角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種至細(xì)胞 培養(yǎng)板，培養(yǎng)；在進(jìn)行所述步驟a2)前先進(jìn)行所述步驟al)。
[0012] 上述方法中，所述步驟a2)可為：完成所述步驟al)后，取所述細(xì)胞培養(yǎng)板，加入 SDS溶液并培養(yǎng)。
[0013] 上述方法中，所述步驟al)中，所述細(xì)胞懸液中人角質(zhì)細(xì)胞的濃度可為 18000-20000 個(gè) /cm2。
[0014] 上述方法中，所述細(xì)胞懸液中人角質(zhì)細(xì)胞的濃度具體可為19000個(gè)/cm2。
[0015] 上述方法中，所述步驟al)中，所述培養(yǎng)的條件可為：35-39°C，18h-26h。
[0016] 上述方法中，所述步驟al)中，所述培養(yǎng)的條件具體可為：37°C和24h。
[0017] 上述方法中，所述步驟al)中，所述細(xì)胞懸液的接種量可為100iiL/孔。
[0018] 上述任一所述炎癥因子IL-1a的基因序列可如序列表中序列1所示。
[0019] 上述任一所述SDS溶液可為用DMEM培養(yǎng)基溶解SDS獲得。
[0020] 上述任一所述細(xì)胞懸液的制備方法具體如下：用0. 25%胰蛋白酶消化離體的人 角質(zhì)細(xì)胞，然后用含10%胎牛血清（體積百分比）的DMEM培養(yǎng)基重懸并稀釋。
[0021] 上述任一所述DMEM培養(yǎng)基的制備方法具體如下：將高糖DMEM固體培養(yǎng)基（Gibco 公司產(chǎn)品）13. 5g和NaHC033. 7g依次溶于水，pH調(diào)至7. 2-7. 4,然后定容至1L。
[0022] 上述任一所述人角質(zhì)細(xì)胞可為人表皮角質(zhì)細(xì)胞。
[0023] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的方法可以顯著促進(jìn)人表皮角質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子IL-1a 的表達(dá)，從而可以用于篩選治療炎癥的藥物。
【附圖說明】
[0024] 圖1為MTT法測定不同濃度的SDS溶液處理人表皮角質(zhì)細(xì)胞的存活率。
[0025] 圖2為炎癥因子IL-1a在SDS溶液不同處理時(shí)間下的表達(dá)量。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0027] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0028] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029] 下述實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，如無特殊說明均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。
[0030] 人表皮角質(zhì)細(xì)胞為北京富隆康泰生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SDS為sigma公司產(chǎn)品， 產(chǎn)品目錄號為15750;胎牛血清為辦〇1〇1^公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為31130084.03 ;0.25%胰 蛋白酶為Hyc1one公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為SH30042. 01;DMS0為sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄 號為D2650。
[0031]DMEM培養(yǎng)基：將高糖DMEM固體培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品）13. 5g和NaHC033. 7g依 次溶于水，pH為7. 2-7. 4,定容至1L。使用0. 22ym微孔濾膜過濾除菌，于4°C保存。
[0032]MTT溶解液：將MTT(sigma公司產(chǎn)品）5g溶于上述DMEM培養(yǎng)基，定容至1L。使用 0? 22ym微孔濾膜過濾除菌，于4。。保存。
[0033]PBS緩沖液：購買自hyclone公司，貨號SH30256. 01B。
[0034] 實(shí)施例1、確定人表皮角質(zhì)細(xì)胞的最佳接種細(xì)胞密度和SDS處理濃度
[0035] 設(shè)置試驗(yàn)組，進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)的步驟均如下：
[0036] 1、用0. 25%胰蛋白酶消化人表皮角質(zhì)細(xì)胞，然后用含10%胎牛血清（體積百分 比）的DMEM培養(yǎng)基重懸并稀釋，獲得細(xì)胞密度為15600個(gè)/cm2的細(xì)胞懸浮液1、細(xì)胞密度為 19000個(gè)/cm2 (實(shí)際應(yīng)用中18000-20000個(gè)/cm2均可）的細(xì)胞懸浮液2、細(xì)胞密度為22000 個(gè)/cm2的細(xì)胞懸浮液3和細(xì)胞密度為25000個(gè)/cm2的細(xì)胞懸浮液4。
[0037] 2、用DMEM培養(yǎng)基溶解SDS，獲得SDS溶液。
[0038]3、取96孔培養(yǎng)板，每孔接種100yL步驟1獲得的細(xì)胞懸浮液（細(xì)胞懸浮液1、細(xì) 胞懸浮液2、細(xì)胞懸浮液3或細(xì)胞懸浮液4)，在37°C(實(shí)際應(yīng)用中37±2°C均可）、5%C02 環(huán)境中培養(yǎng)24h(實(shí)際應(yīng)用中18h-26h均可）。
[0039] 4、完成步驟3后，取所述96孔板，加入步驟2制備的SDS溶液，得到處理體系，處 理體系中的SDS的濃度為 0? 05yg/mL、0. 15yg/mL、0. 46yg/mL、1. 37yg/mL、4. 11yg/mL、 12. 35yg/mL、37. 03yg/mL、111. 1yg/mL、333. 3yg/mL或 1000yg/mL(每個(gè)SDS濃度設(shè)置 5個(gè)復(fù)孔）。5%C02、37°C培養(yǎng)44h(實(shí)際應(yīng)用中40h-48h均可），然后加入20yLMTT溶解 液，繼續(xù)5%C02、37°C培養(yǎng)4h。
[0040] 5、完成步驟4后，取所述96孔板，吸棄孔內(nèi)的液體，然后每孔加入150yLDMS0,采 用酶標(biāo)儀檢測570nm處的吸光值。
[0041] 設(shè)置空白對照組：用等體積含10%胎牛血清（體積百分比）的DMEM培養(yǎng)液代替 細(xì)胞懸浮液，其它操作同試驗(yàn)組。每個(gè)SDS濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。
[0042] 設(shè)置細(xì)胞對照組：用等體積DMEM培養(yǎng)基代替SDS溶液，其它操作同試驗(yàn)組。每種 細(xì)胞懸浮液設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。
[0043] 以SDS在處理體系中的濃度為橫坐標(biāo)，人表皮角質(zhì)細(xì)胞的存活率為縱坐標(biāo)，比較 不同濃度的SDS處理后人表皮角質(zhì)細(xì)胞的存活率。