專利名稱：重組酵母基因工程菌pPICZαA－K1－KDR(1－3)/GS115的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制備方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤即癌癥，是威脅人類健康的最嚴(yán)重的疾病之一。惡性實(shí)體腫瘤的常規(guī)治療包括手術(shù)摘除、化學(xué)治療、放射治療等，這些治療方法存在易復(fù)發(fā)，對(duì)人體的毒副作用大，會(huì)誘導(dǎo)抗藥性產(chǎn)生等不理想之處。生命科學(xué)基礎(chǔ)研究的突破和生物技術(shù)的發(fā)展，為惡性腫瘤的最終攻克提供了其他更加有效和可行的手段。
20世紀(jì)70年代初，F(xiàn)olkman博士提出“腫瘤增殖具有血管依賴性”的觀點(diǎn)，即體積超過(guò)1mm3～2mm3的腫瘤需要新生血管維持營(yíng)養(yǎng)和氧氣的供給并且排出代謝產(chǎn)物，還需要新生血管提供轉(zhuǎn)移的通道。從這個(gè)觀點(diǎn)出發(fā)，提出一種治療腫瘤的新策略，即不直接從正面攻擊腫瘤，而是阻斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，間接地抑制腫瘤生長(zhǎng)，使其處于休眠狀態(tài)。這就是抗血管生成療法，也被形象地稱為腫瘤的“餓死療法”。
抗血管生成療法是近幾年來(lái)腫瘤生物治療研究的熱點(diǎn)，與以往的方法相比，有著顯著的優(yōu)越性①?gòu)V泛的抑瘤譜；②不易產(chǎn)生耐藥性；③無(wú)明顯毒副作用；④藥物易于到達(dá)靶部位；⑤可同時(shí)治療腫瘤的轉(zhuǎn)移；⑥與化療和放療有協(xié)同作用。目前已發(fā)現(xiàn)了多種血管生成抑制劑，有數(shù)百種藥物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，大多數(shù)處于二期臨床，有十幾種藥物進(jìn)入了三期臨床，它們都顯示出了初步療效和光明的治療前景。
血管抑素(Angiostatin)是人纖溶酶原(Plasminogen)的kringle 1-kringle4區(qū)域，具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力。目前血管抑素已進(jìn)入一期臨床試驗(yàn)。其中K1(Kringle 1)不僅能有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，還具有結(jié)合賴氨酸的能力(可以用賴氨酸親和柱純化蛋白)。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR)是位于內(nèi)皮細(xì)胞上的一類跨膜受體，它與VEGF結(jié)合后能促進(jìn)內(nèi)皮分裂增殖、增生、轉(zhuǎn)移，增加血管通透性并促進(jìn)新血管生成。KDR，即VEGFR-2，是其中重要的亞類。KDR的Kringle1-3區(qū)域具有結(jié)合VEGF的能力，但是不能催化酶反應(yīng)的發(fā)生。所以KDR(1-3)一方面能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合VEGF，另一方面，配體/受體復(fù)合物KDR(1-3)/VEGF不能催化酶反應(yīng)，所以有效抑制了血管新生的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制備方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制備方法，其特征在于該方法，包括以下步驟a.重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的構(gòu)建融合基因K1-KDR(1-3)包括2個(gè)功能域片段和1段連接臂，2個(gè)功能域片段分別是K1基因和KDR基因的Kringle1-3區(qū)域；1段連接臂是連接K1基因和KDR基因Kringle1-3區(qū)域的柔性連接臂(Gly)3；其構(gòu)建方法包括如下步驟(1)重組質(zhì)粒pPICZαA-K1的構(gòu)建；(2)重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的構(gòu)建；b.重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的構(gòu)建；上述的重組質(zhì)粒pPICZαA-K1的構(gòu)建方法為以K1的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約270bp的K1片段，K1片段用EcoRI和KpnI雙酶切后插入質(zhì)粒pPICZαA的EcoRI/KpnI之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pPICZαA-K1。轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽(yáng)性克隆。
上述的重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的構(gòu)建的方法為提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的總RNA，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，得到KDR(1-3)的cDNA。以KDR(1-3)的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約900bp的KDR(1-3)基因，KDR(1-3)片段用KpnI和NotI雙酶切后插入重組質(zhì)粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)；轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽(yáng)性克隆。
上述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的構(gòu)建的方法為重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)用SacI線性化后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長(zhǎng)出。
畢赤酵母是真核表達(dá)系統(tǒng)，能以甲醇為唯一碳源，pPICZαA是分泌型表達(dá)質(zhì)粒，含有醇氧化酶的強(qiáng)啟動(dòng)子(PAOX1)，在甲醇的誘導(dǎo)下能表達(dá)外源蛋白，并能分泌到胞外，方便蛋白的提取與純化。畢赤酵母能通過(guò)發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)大量的目的蛋白，不需要外加熱源，成本低，規(guī)模大。


圖1為重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的構(gòu)建流程圖具體實(shí)施方式
本發(fā)明主要包括兩大部分重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的構(gòu)建，重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的構(gòu)建。
具體方案敘述如下1重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的構(gòu)建和鑒定融合基因K1-KDR(1-3)包括2個(gè)功能域片段和1段連接臂，2個(gè)功能域片段分別是K1基因和KDR(1-3)基因；1段連接臂是連接K1基因和KDR(1-3)基因的柔性連接臂(Gly)3。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，參見(jiàn)圖1，將K1基因和KDR(1-3)基因通過(guò)連接臂(Gly)3連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)。
1.1重組質(zhì)粒pPICZαA-K1的構(gòu)建和鑒定根據(jù)K1的核苷酸序列設(shè)計(jì)K1的上下游引物上游引物5’-GCCGAATTCGTGTATCTCTCAGAG-3’；下游引物5’-TTTGGTACCGCCACCTTCCTCTTCACAC-3’。
以K1的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約270bp的K1片段，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。K1片段用EcoRI和KpnI雙酶切后插入質(zhì)粒pPICZαA的EcoRI/KpnI之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pPICZαA-K1。轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽(yáng)性克隆。重組質(zhì)粒pPICZαA-K1用EcoRI和KpnI雙酶切，得到270bp和3.6kb兩個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果相符。DNA序列測(cè)定表明，K1基因的序列正確。
1.2構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)根據(jù)KDR(1-3)的核苷酸序列設(shè)計(jì)其上下游引物上游引物5’-GGTGGTACCAGTGTTTCTCTTGATCTG-3’；下游引物5’-GGGTCTAGAGGTTTTTCATGGACCCTGAC-3’。
提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的總RNA，利用KDR(1-3)的上下游引物，通過(guò)一步法RT-PCR得到KDR(1-3)的cDNA。以KDR(1-3)的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約900bp的KDR(1-3)基因。KDR(1-3)片段用KpnI和NotI雙酶切后插入重組質(zhì)粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽(yáng)性克隆。
重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)用EcoRI和NotI雙酶切，得到1170bp和3.6kb兩個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果相符。DNA序列測(cè)定表明，K1-KDR(1-3)基因的序列正確。
2重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的構(gòu)建和鑒定重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)用SacI線性化后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長(zhǎng)出。挑選Zeocin濃度為1000ug/ml平板上長(zhǎng)出的克隆。用玻璃珠法提取重組酵母的染色體組，以其為模板，以K1的上游引物和KDR(1-3)的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1170bp大小的片段，說(shuō)明融合基因K1-KDR(1-3)成功地整合到了酵母染色體上。
3重組菌株的遺傳穩(wěn)定性將重組酵母菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115傳代10次以上后，PCR分析表明目的基因仍穩(wěn)定地整合在染色體上。
最終獲得的重組融合基因K1-KDR(1-3)的核苷酸序列為GTGTA TCTCTCAGAG TGCAAGACTG GGAATGGAAA GAACTACAGA GGGACGATGT CCAAAACAAAAAATGGCATC ACCTGTCAAA AATGGAGTTC CACTTCTCCC CACAGACCTA GATTCTCACC TGCTACACACCCCTCAGAGG GACTGGAGGA GAACTACTGC AGGAATCCAG ACAACGATCC GCAGGGGCCC TGGTGCTATACTACTGATCC AGAAAAGAGA TATGACTACT GCGACATTCT TGAGTGTGAA GAGGAAGGTG GCGGTACCAGTGTTTCTCTT GATCTGCCCA GGCTCAGCAT ACAAAAAGAC ATACTTACAA TTAAGGCTAA TACAACTCTTCAAATTACTT GCAGGGGACA GAGGGACTTG GACTGGCTTT GGCCCAATAA TCAGAGTGGC AGTGAGCAAAGGGTGGAGGT GACTGAGTGC AGCGATGGCC TCTTCTGTAA GACACTCACA ATTCCAAAAG TGATCGGAAATGACACTGGA GCCTACAAGT GCTTCTACCG GGAAACTGAC TTGGCCTCGG TCATTTATGT CTATGTTCAAGATTACAGAT CTCCATTTAT TGCTTCTGTT AGTGACCAAC ATGGAGTCGT GTACATTACT GAGAACAAAAACAAAACTGT GGTGATTCCA TGTCTCGGGT CCATTTCAAA TCTCAACGTG TCACTTTGTG CAAGATACCCAGAAAAGAGA TTTGTTCCTG ATGGTAACAG AATTTCCTGG GACAGCAAGA AGGGCTTTAC TATTCCCAGCTACATGATCA GCTATGCTGG CATGGTCTTC TGTGAAGCAA AAATTAATGA TGAAAGTTAC CAGTCTATTATGTACATAGT TGTCGTTGTA GGGTATAGGA TTTATGATGT GGTTCTGAGT CCGTCTCATG GAATTGAACTATCTGTTGGA GAAAAGCTTG TCTTAAATTG TACAGCAAGA ACTGAACTAA ATGTGGGGAT TGACTTCAACTGGGAATACC CTTCTTCGAA GCATCAGCAT AAGAAACTTG TAAACCGAGA CCTAAAAACC CAGTCTGGGAGTGAGATGAA GAAATTTTTG AGCACCTTAA CTATAGATGG TGTAACCCGG AGTGACCAAG GATTGTACACCTGTGCAGCA TCCAGTGGGC TGATGACCAA GAAGAACAGC ACATTTGTCA GGGTCCATGA AAAA
權(quán)利要求
1.一種重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制備方法，其特征在于該方法，包括以下步驟a.重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的構(gòu)建融合基因K1-KDR(1-3)包括2個(gè)功能域片段和1段連接臂，2個(gè)功能域片段分別是K1基因和KDR(1-3)基因；1段連接臂是連接K1基因和KDR(1-3)基因的柔性連接臂(Gly)3；其構(gòu)建方法包括如下步驟(1)重組質(zhì)粒pPICZαA-K1的構(gòu)建；(2)重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的構(gòu)建；b.重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的構(gòu)建。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制備方法，其特征在于所述的重組質(zhì)粒pPICZαA-K1的構(gòu)建方法為設(shè)計(jì)K1的上下游引物上游引物5’-GCCGAATTCGTGTATCTCTCAGAG-3’；下游引物5’-TTTGGTACCGCCACCTTCCTCTTCACAC-3’。以K1的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約270bp的K1片段，K1片段用EcoRI和KpnI雙酶切后插入質(zhì)粒pPICZαA的EcoRI/KpnI之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pPICZαA-K1。轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽(yáng)性克隆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制備方法，其特征在于所述的重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的構(gòu)建的方法為設(shè)計(jì)KDR(1-3)的上下游引物上游引物5’-GGTGGTACCAGTGTTTCTCTTGATCTG-3’；下游引物5’-GGGTCTAGAGGTTTTTCATGGACCCTGAC-3’。提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的總RNA，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，得到KDR(1-3)的cDNA。以KDR(1-3)的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約900bp的KDR(1-3)基因，KDR(1-3)片段用KpnI和NotI雙酶切后插入重組質(zhì)粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)；轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽(yáng)性克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-KDR(1-3)的制備方法，其特征在于所述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的構(gòu)建的方法為重組質(zhì)粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)用Sac I線性化后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長(zhǎng)出。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組酵母基因工程菌pPICZαA－K1－KDR(1－3)/GS115的制備方法。該方法包括以下步驟重組質(zhì)粒pPICZαA－K1－KDR(1－3)的構(gòu)建(包括重組質(zhì)粒pPICZαA－K1的構(gòu)建、重組質(zhì)粒pPICZαA－K1－KDR(1－3)的構(gòu)建)、重組酵母基因工程菌pPICZαA－K1－KDR(1－3)/GS115的構(gòu)建。畢赤酵母是真核表達(dá)系統(tǒng)，能以甲醇為唯一碳源，pPICZαA是分泌型表達(dá)質(zhì)粒，含有醇氧化酶的強(qiáng)啟動(dòng)子(P
文檔編號(hào)C12N15/62GK101070523SQ20061002620
公開(kāi)日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2006年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日
發(fā)明者黃筱穎, 陳宇光 申請(qǐng)人:上海大學(xué)