專利名稱：：Hpd3cell、制備方法及其用于構建絲狀噬菌體單鏈抗體庫的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及分子生物學和醫(yī)學領域。具體地說，本發(fā)明涉及一種Hpd3cdl細胞、制備方法和用途。Hpd3cel1為含有缺乏基因III的輔助噬菌體基因組的F因子陽性細菌，己于2007年5月25日在中國科學院微生物研究所保藏，分類命名為大腸埃希氏桿菌(EscherichiaColi)，菌種保藏編號為CGMCC2057。可以用于構建單鏈抗體噬菌體文庫以pIII為基礎的新的絲狀噬菌體抗體展示庫，提供了一種制備多肽展示的噬菌粒顆粒的方法。
背景技術：
：pin為基礎的噬菌體展示已經被廣泛用于篩選并獲得各種各樣的抗原的特異抗體。為了增加抗體庫的展示水平，RondotS，等采用基因III缺失的輔助噬菌體(命名為Hyperphage，Rondot,S.，J.Koch，F(xiàn).Breitling，andS.Dubel.2001.Ahelperphagetoimprovesingle-chainantibodypresentationinphagedisplay.NatBiotechnol.19:75-78.)去,丞救編碼抗體-pIII融合蛋白。用該方法，scFv展示在噬菌粒顆粒表面的數(shù)量可以增加100倍。但是，Hyperphage的方法非常繁瑣，需要構建一個大腸桿菌包裝細胞系(DH5a/pIII)去提供pIII用于輔助噬菌體制備，以免在輔助噬菌體的產生過程中有質粒的污染。此外Hyperphage的產量(大約1.34xl09/ml)相當?shù)汀＿€有就是用于構建單鏈抗體噬菌體展示庫的噬菌粒的蛋白III所用啟動子為野生型Lac啟動子并不是絕對嚴格的，pIII可以在缺乏IPTG的情況下產生從而誘導pin抵抗輔助噬菌體超感染(Boeke，J.D.，P.Model,andN.D.Zinder.1982.EffectsofbacteriophageflgeneIIIproteinonthehostcellmembrane.Mol.Gen.Genet.186:185-192.)。因此，葡萄糖，pLac抑制子(repressor)經常被添加到培養(yǎng)基中去抑制pIII表達(KrebberA.,J.Burmester,andA.Pluckthun.1996.Inclusionofanupstreamtranscriptionalterminatorinphagedisplayvectorsabolishesbackgroundexpressionoftoxicfbsionswithcoatproteing3p.Gene178:71-74.)。為了解決以上問題，本發(fā)明人采用含有基因III缺失的輔助噬菌體基因組(VCSM13d3)的F+大腸桿菌(TGI)去構建pIII為基礎的噬菌體單鏈抗體庫。
發(fā)明內容本發(fā)明目的是提供一種Hpd3cdl細胞。本發(fā)明目的還提供一種上述Hpd3cdl細胞的制備方法。本發(fā)明另一目的是提供一種上述Hpd3cdl細胞的用途。本發(fā)明的Hpd3cdl細胞，其菌種保藏編號為CGMCC2057。是一種含有缺乏基因III的輔助噬菌體基因組的F因子陽性大腸埃希氏桿菌；所述的輔助絲狀噬菌體基因組指包含了除pIII蛋白編碼序列外的輔助絲狀噬菌體基因組序列，該基因組上攜帶和不攜帶抗性標記。所述的Hpd3cdl細胞，所述的抗性標記是指能表達抑制或降解氨節(jié)抗生素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素等。本發(fā)明的Hpd3cdl細胞的制備方法，是由缺少基因III的輔助噬菌體基因組(VCSM13d3)轉化F因子陽性的細菌獲得。本發(fā)明的Hpd3cel1細胞的用途，是用于構建以pIII為基礎的單鏈抗體噬菌體庫。將編碼scFv-pIII融合蛋白的噬菌粒轉化Hpd3cdl，可以高效制備噬菌粒顆粒，產生的噬菌粒顆粒滴度高達1.2x1011cfb/ml培養(yǎng)基，并使單鏈抗體在噬菌粒顆粒上獲得高水平展示。采用Hpd3cdl構建單鏈抗體噬菌體文庫，可以充分提高特異性富集效率。此外，采用Hpd3cell還可以克服pIII抗性。因此，Hpd3cell可以提高噬菌體抗體庫的富集效率并增加獲得同種抗原的不同抗體的效率。圖1是一種Hpd3cell設計圖。圖2是Hpd3cdl增加單鏈抗體展示水平圖。圖3是Hpd3cdl增強篩選效率示意圖。圖4是19單鏈抗體所編碼的氨基酸序列。其中，附圖2中，附圖2a是WesternBlot檢測單鏈抗體的展示水平，2b是ELISA方法檢測M13K07或Hpd3cel1制備的噬菌體與抗原結合的特異性，2c是ELISA方法檢測M13K07或Hpd3cel1制備的噬菌體與抗原結合的靈敏度；附圖3中，附圖3a是每輪篩選后洗脫得到的噬菌體滴度，附圖3b是多克隆噬菌體ELISA檢測每輪篩選后洗脫得到的噬菌體與EGFP-S2蛋白結合的能力，附圖3c是第二輪篩選后得到的噬菌體隨機挑選的單克隆與EGFP-S2結合的能力。符號說明圖1中的flori指的是絲狀噬菌體復制起始位點。Hpd3cells是Hpd3cel1的復數(shù)形式。scFv:單鏈抗體；E.coligenome:大腸桿菌基因組；Transformation:轉化。圖2中ScFv-pIII指的是單鏈抗體和pin的融合蛋白；BSA:牛血清白蛋白；EGFP:增強型綠色熒光蛋白；M13wt:野生型M13噬菌體；Panningl:第一輪篩選；Panning2:第二輪篩選；Ctrl:對照(10'。cfu的M13KO7)。Cloneno.:克隆號。具體實施方式通過下述實施例將有助于理解本發(fā)明，但並不能限制本發(fā)明的內容。本發(fā)明人經過了深入的研究，提供了一種Hpd3cdl細胞、制備方法和用途。Hpd3cdl為含有缺乏基因III的輔助噬菌體基因組的F因子陽性細菌，菌種保藏編號為CGMCC2057。發(fā)展了新的噬菌體單鏈抗體庫制備方法。該方法首先制備了Hpd3cdl，它是將缺少基因III的輔助噬菌體基因組(VCSM13d3)轉化F因子陽性的細菌(TG1)。然后將編碼單鏈抗體庫與pIII外殼蛋白融合蛋白(scFv-pin)的噬菌粒轉化Hpd3cdl，從而獲得噬菌體單鏈抗體庫。首先采用這種方法展示一個針對EGFP(增強性綠色熒光蛋白)的單鏈抗體的噬菌體，結果發(fā)現(xiàn)該噬菌體和傳統(tǒng)方法(用M13K07超感染方法制備)相比，展示水平明顯增高。隨后用EGFP-S2(增強型綠色熒光蛋白與表皮生長因子受體S2結構域融合的蛋白)免疫Balb/c小鼠，然后分離小鼠脾臟，抽提mRNA,并利用Hpd3cdl的方法制備噬菌體單鏈抗體庫，結果發(fā)現(xiàn)這個方法可以增強單鏈抗體選擇性富集。實施例l質粒構建根據(jù)Sambrook(Sambrook,J.,E.F.Fritsch，andT.Maniatis.1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.CSHLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork.)等進行標準的克隆步驟。VCSM13d3由JasnaRakonjac博士禾口PeterModel教授友情饋贈；pCANTAB5E-T,來源于pCANTAB-5E(Amersham,Piscataway,NJ,USA)。將編碼Thrombin切割位點的寡核苷酸編碼序列插到pCANTAB-5E的Notl限制性內切酶位點后。從pEGFP-Nl(Clontech，USA)在替中克隆獲得EGFP(增強的綠色熒光蛋白)編碼序列，然后插入pET28a(Novagen,USA)。將EGFR(表皮生長因子受體)的S2結構域的編碼序列插入pET28a-EGFP，產生質粒pET-EGFP-S2。實施例2Hpd3cell制備根據(jù)Sambrook(Sambrook,丄，E.F.Fritsch,andT.Maniatis.1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.CSHLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork.)的氯化韓法轉化法，將VCSM13d3(Rakonjac,J.,G.Jovanovic,andP.Model.1997.Filamentousphageinfection-mediatedgeneexpression:constructionandpropagationofthegilldeletionmutanthelperphageR408d3.Gene198:99畫103,)質粒轉化TG1細胞，然后鋪于卡那霉素(終濃度為50Pg/ml)的瓊脂平板，倒置，37。C生化培養(yǎng)箱過夜，第二天挑取單克隆，即為Hpd3cdl。將Hpd3cdl制備成電轉感受態(tài)。實施例319單鏈抗體的展示及其與EGFP的結合pCANTAB-5ET-19噬菌粒是pCANTAB5E-T載體插入了編碼19單鏈抗體(可以與EGFP特異結合)的編碼序列。將pCANTAB-5ET-19轉化Hpd3cdl，收集噬菌粒顆粒，然后用ELISA滴定，結果所產生的噬菌粒顆粒滴度高達1.2X10"cfu/ml。另外作為對照，將pCANTAB-5ET-19轉化TG1，鋪于氨芐抗生素瓊脂平板，過夜，挑單克隆，用M13K07輔助噬菌體拯救，結果所得到的噬菌粒顆粒滴度為1.5X10"cfWml。兩者幾乎沒有差別。實施例4免疫印跡檢測單鏈抗體展示水平上樣約l(Tcfii噬菌體每泳道于10。/。聚丙烯酰胺膠。用含2%脫脂奶粉的PBS室溫下孵育2h，然后用小鼠抗-pIII抗體(NewEnglandBiolabsInc,Beverly,MA,USA)及辣根過氧化物酶標記的山羊抗-小鼠IgG二抗(ImmuClubLabs,Sunnyvale,CA,USA)進行免疫染色,然后用SuperSignalWestPicokit(PierceBiotechnologies,Rockford，IL,USA)顯色。如圖2A所示，采用Hpd3cdl制備的噬菌粒顆粒主要是scFv-pIII融合蛋白，而用M13K07制備的噬菌粒顆粒主要是野生型pIII，表明Hpd3cdl能明顯增加單鏈抗體的展示水平。實施例5噬菌體ELISA確定抗原結合能力為了確定重組噬菌體顆粒的抗原結合特異性，100ngBSA(Sigma:St.Louis,MO.USA),或重組EGFP于包被緩沖液(0.1MNaHC03pH9.1)包被于96孔板，4。C過夜。用含有pET28-EGFP質粒的BL21(DE3)大腸桿菌表達重組EGFP蛋白，并用M-NTA樹脂親和純化(Qiagen,Germany)。平板用含1%BSA的PBS封閉。每孔加入1X1(^用M13K07或Hpd3cell包裝的單鏈抗體噬菌體(溶于1%BSA)，室溫孵育lh。用M13K07(101QcfU)輔助噬菌體作為陰性對照。用含0.5%Tween-20的PBS洗滌，用anti-M13antibodyconjugatedwithHRP(Amersham)檢測結合的噬菌體，結合信號用ABTS底物(Sigma)顯示并用ELISAreader(Bio-Rad)檢測OD405。如圖2B所示，pCANTAB-5ET-19/Hpd3cell和pCANTAB-5ET-19/M13K07制備的噬菌粒顆粒都可以與重組的EGFP結合，而不與BSA(牛血清白蛋白)結合。但是，前者產生的信號超過后者的兩倍，表明單鏈抗體的展示水平可以增加抗原(EGFP)的親和力。然后用ELISA檢測1(TpCANTAB-5ET-19/Hpd3cel1噬菌體或pCANTAB-5ET-19/M13K07噬菌體的抗原結合能力。在產生同樣的ELISA信號(OD405=0.37)的情況下，前者與后者相比，其所需要結合的抗原的濃度要低100倍。前者產生陽性信號所需要抗原的濃度也比后者低得多，表明增加scFv-pIII融合蛋白可以直接增強重組噬菌粒顆粒的抗原結合敏感性(如圖2Q。實施例6抗原準備及免疫用BL21(DE3)表達EGFP-S2重組蛋白，然后用Ni-NTA樹脂親和純化。將100pl弗氏佐劑(Sigma)與100嗎EGFP-S2蛋白(溶于lOO)il0.9%NaCl)混合，然后皮下免疫小鼠。每隔兩周用同樣劑量免疫l次，重復3次。在第三次免疫后，尾靜脈注射50嗎EGFP-S2蛋白。4天后，犧牲小鼠，取脾臟。實施例6構建單鏈抗體噬菌體文庫抽取脾臟總RNA，用純化的mRNA擴增抗體輕鏈和重鏈編碼序列。采用搭橋PCR(OverlapAssemblyPCR)單鏈抗體編碼序列，然后用SfilandNotl酶切。所用引物參考見附表l。將所得片斷純化并與pCANTAB-5ET的Sfil/Notl骨架連接，16°C，4小時。根據(jù)Bio-RadMicroPulserElectroporationApparatus操作手冊進行電轉化到Hpd3cel1。具體操作如下(1)準備電轉化的感受態(tài)細胞1)接種2ml過夜細菌培養(yǎng)產物于200mlofLB。2)37°C，300轉，直到OD6QQ約為0.6。3)冰浴細胞20分鐘。以下所有步驟，全部在冰上進行[3)-8)]。把所有容器也先冰上預冷。4)轉移細胞到50ml管子，4000Xg,4'C,15分鐘。5)輕輕倒掉上清，(切記上清一定要去干凈)。6)用200ml冰冷的10%甘油重懸沉淀。4000Xg,4°C,15分鐘。除去上清。7)用100ml冰冷的10%甘油重懸沉淀。4000Xg，4°C,15分鐘。除去上清。8)用8ml冰冷的10%甘油重懸沉淀。4000Xg,4°C，15分鐘。除去上清。(2)電轉1)細胞在冰上解凍。放一個0.2厘米的電極杯于冰上。2)添加1一2W的DNA(DNA應該存在于低離子強度的緩沖液如TE)，混合。冰上約1分鐘。3)設定微脈沖于Ec2。4)轉移細胞和DNA混合物至冰冷的電極杯，清敲，使懸液位于杯底。把電極杯放于小腔滑片，把滑片推入腔內，電擊約6毫秒。5)取出電極杯，馬上加入lmlSOC培養(yǎng)基(具體配方見分子克隆)于電極杯。用移液槍快速溫柔重懸細胞。把細胞轉入10ml離心管，37°C，225rpm,l小時，然后瞬時離心，去掉900ul上清，把沉淀重懸，取1W梯度稀釋，涂于含有10(Htg/mL氨芐青霉素及50^ig/mL卡納霉素的瓊脂平板。將剩余的經轉化的Hpd3cell轉移到一個含有200mlLB(含有100(ig/mL氨芐青霉素及50pg/mL卡納霉素)的錐形瓶中，于37'C搖16h。收集噬菌體，具體步驟如下1)收集菌液到離心管，4°C,10000rpm離心10min，轉移上清到的新管中。2)4°C，10000rpm重離心10min，小心取上清約80%到新管中。3)力口1/6體積PEG/NaCl，4'C放置過夜。4)4。C，10000rpm離心5min，去上清，離心，去殘余上清。5)用lmlTBS重懸沉淀，轉移到1.5mlE卯endorf管中。6)4°C，10000rpm離心5min。將上清轉移至新1.5mlEppendorf離心管。7)重新用1/6體積PEG/NaCl，冰浴60min。8)4°C，10000rpm離心5min，棄上清，瞬時離心，去殘余上清。9)用200^1TBS溶解沉淀，，將上清移至新1.5mlE卯endorf管中，加入NaN3使終濃度為0.02%。然后用0.45um過濾裝置過濾。10)然后用ELISA定量。為了用M13KO7輔助噬菌體制備噬菌體庫，將編碼scFv基因的pCANTAB-5ET噬菌粒電擊轉化TG1細胞，然后鋪于含有氨芐的瓊脂平板(含l。/。glucose)。將在含有氨芐的LB生長后的細胞用M13K07輔助噬菌體超感染后(MOI等于50)，通過PEG/NaCl將所得到的噬菌體收集和純化。用Hpd3cel1構建的噬菌體抗體庫，其復雜度為3.75xl07,而用TG1cells構建的噬菌體抗體庫復雜度為4.38x107。表l:小鼠單鏈抗體庫所用引物A.用于制備VH-linker的引物上游引物序列(5,-3，)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>OP4ACTGCGGCCC4GCCGGCCATGGCCGAGGTYCAGCTGSARCARTCTGGOP5ACTGCGG(XC^GCCGGCC47Y7(7CrC4GG7TC4WCTGOP6ACTGCGGCCC4GCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTGSTGGARTCTGGOP7ACTGCGGCCC4GCCGGCCATGGCCGAGGTTCAGCTTCAGCAGWCTGGOP8ACTGCGGCCC4GCCGG(X'ATGGCCGAAGTGCAGCTGKTGGAGWCTGGOP9ACTGCGGCCC4GCCGGCCATGGCCCAGATCCAGTTGCTGCAGYCTGG下游引物序列(5，-3，)OP10G"CC4(7/4(7CC4(XTa:(7Cr7YA4CCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTRGTCCC0P11GCC4G4GCC4CCTO:G(XTGA4CCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGASAGTGGTGCCOP12(7CC4GL4GCC4CCrcrGCCTG44CCGCCTCCACCTGCAGAGACAGTGACCAG0P13GCC4GL4GCC4CCTCCGCCT(Z44CCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGASTGAGGTTCCB.制備k輕鏈的引物上游引物序列(5'國3，)OP14rrC4GGCGG4GGr(7GCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGATGWCACAGWCTCCOP157TC4G(7CGGL4(FGTGGCrCTGGCGGTGGCGGATCGGATGTTKTGATRACCCAAACTCCOP167TC4GGC:GG4GGH;GCrCTGGCGGTGGCGGATCGGATATTGTGATRACBCAGGCWGCOP177TC4GGCGG4GG7^GCTCTG(7CGGTGGCGGATCGGACATTGTGCTGACMCARTCTCCOP187TC4C7GCGGL4C(7H7(7CTCT(GCGGTGGCGGATCGSAAAWTGTKCTSACCCAGTCWCCOP197TC4GGa04(7GTGGCTCT(7(CGGTGGCGGATCGGAYATYVWGATGACMCAGWCTCCOP20rrC4G(CGG4GGrGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAAATTGTTCTCACSCAGTCWCCOP217TC4G"GC(7GL4G"GT(7GCTCrGGCGGTGGCGGATCGTCATTATTGCASGTGCTTGTGGG下游引物序列(5，-3,)___OP22GTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCWCCOP23GTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTscccccOP24GTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAGTCTGGTCCCATCOP25GTCATTCTGCGGCC(7CCCGTTTTATTTCCAACTTTGTMCCCGAOP26GTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTSCCAGCC.用于產生Vi片斷的引物上游引物序列(5'-3，)OP277TC4GGC(a4GGrGGCrCTG(CGGTGGCGGATCGCAGGATGCTGTTGTGACTCAGGAATC下游引物序列(5，-3，)OP28GTCATTCTGCG(7CCGCCCGTTTACCTAGGACAGTSAGYTTGGD:接頭引物重鏈接頭OP29GTCCTCGCAACTGCGGCCC4GCCG(7a:ATGGCC輕鏈接頭OP30TGAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTM=AorC,R=AorQW=AorT,S=CorG,Y=CorT,K=GorT,V=AorCorGH=AorCorT,D=AorGorT，B=CorGorT，N=GorAorTorC.實施例7單鏈抗體篩選將免疫管用50嗎抗原(溶于PBS)包被，4°C過夜，然后用1%BSA(溶于PBS)在37°C孵育2h。用PBS洗3次,加入5xlO"scFv噬菌體庫(溶于l。/。BSA和0.1。/c)TritonX-100),然后于37"C孵育2h。完全去掉溶液，用0.5。/oTween-20(溶于PBS)洗20次，用PBS洗20次。用4U凝血酶原(Sigma，溶于PBS)洗脫結合的噬菌體，37°C1h。將同樣體積的對數(shù)生長期的Hpd3cell或TGl細胞加于溶液中，37°C搖lh。細胞離心，然后用新鮮的LB洗滌2次。將細胞梯度稀釋然后鋪于含氨芐/卡那霉素(Hpd3ce11)或氨芐(TG1)的LB瓊脂平板，3(TC孵育過夜。對于Hpd3cdl，將剩余的細胞懸液加到含有氨芐/卡那霉素的LB中，擴大培養(yǎng)，然后收集噬菌體，用于下一輪篩選。對于TG1細胞，將它轉入含有氨芐的LB中，然后用M13K07輔助噬菌體超感染。以100ng/孔包被EGFP-S2，4'C過夜，然后進行噬菌體ELISA。對于多克隆噬菌體ELISA,將1(T篩選后并擴增的噬菌體加入96孔板；對于單克隆噬菌體ELISA,將洗脫的噬菌體感染TGl或Hpd3cdl，室溫20min,然后分別平鋪于含氨芐的LB瓊脂平板或含氨芐/卡那霉素的平板，37。C孵育過夜。對于Hpd3cdl，隨機挑取大腸桿菌克隆，然后接種于200^含氨芐/卡那霉素的LB的96孔板，30°C過夜(Corning,USA);對于TGl,隨機挑取大腸桿菌克隆接種于200(il含氨芐/卡那霉素的LB的96孔板，然后用M13K07超感染，3(TC過夜。從每孔取50nl含有噬菌體顆粒的培養(yǎng)上清，加入包被有EGFP-S2的96孔板中，然后進行ELISA。BSA作為抗原的陰性對照，M13K07作為輔助噬菌體的陰性對照。篩選兩輪后，Hpd3cdl包裝的噬菌體有顯著的富集(圖3A)。在第二輪篩選后，采用EGFP-S2作為抗原進行多克隆噬菌體ELISA分析富集的亞文庫的抗原結合能力發(fā)現(xiàn)Hpd3cell包裝的噬菌體的OD4。一1.0。相反，M13K07包裝的噬菌體在第二輪篩選后包裝的噬菌體沒有明顯的抗原結合活性(圖3B)。為了檢測特異富集至IJEGFP-S2的抗體克隆的產量，我們在第二輪篩選后隨機挑取了96個克隆。ELISA結果顯M13KO7包裝的克隆小于10。/。是與EGFP-S2結合的(圖3C)。相反，Hpd3cdl制備的噬菌體克隆超過80n/。是與EGFP-S2結合的，而且其中有19%(18/96)的克隆的，表明它的高水平結合能力。將這些噬菌粒(OD4q5>1)的DNA抽提后，然后進行測序，發(fā)現(xiàn)其scFv序列都是不一樣的，表明采用Hpd3cell可以增加獲得同一耙抗原的不同抗體。實施例8pIII抗性試驗用M13K07超感染TG1scFv文庫，然后轉至氨芐培基，3(TC搖16h.PEG/NaCl沉淀噬菌粒顆粒，然后用之感染TG1細胞。將感染的TG1細胞鋪于氨芐平板(有或無1%glucose)37'C孵育過夜，然后挑取96個單克隆，加入有或無l。/。glucose的培基，30。C搖lh。隨后，將感染的TG1cells用M13K07輔助噬菌體超感染(MOI二50)，再培養(yǎng)20h。另外，用來自TG1/M13K07scFv文庫的96個單克隆去感染Hpd3cdl，然后鋪于不含葡萄糖的氨芐/卡那霉素平板37'C過夜，隨后進行同樣的操作。觀U定培養(yǎng)無的OD,值。將噬菌體上清收集，用PEG/NaCl純化，然后于00265定量。結果所有的感染Hpd3cell的克隆的OD6。。值都大于2.0。但是，克隆感染TG1后，再用M13K07超感染后，在無葡萄糖時，其006。。值小于0.5的有17%(16/96)，在有葡萄糖時2%(2/96)(如表2所示)。為了進一步檢測噬菌體的產生情況，這些克隆的上清都分別用PEG/Nad沉淀，然后其滴度都用ELISA檢測。所有的Hpd3cell克隆都能產生噬菌體。TG1/M13K07的克隆如0D600值大于0.5時，也可產生噬菌體，但是若其OD6。()值小于0.5時，就不產生噬菌體。表2:pIII抗性實驗結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>權利要求1.一種Hpd3cell細胞，其菌種保藏編號為CGMCC2057。2.如權利要求1所述的Hpd3cdl細胞，其特征是所述的Hpd3cdl細胞為含有缺乏基因III的輔助噬菌體基因組的F因子陽性大腸桿菌；所述的輔助絲狀噬菌體基因組指包含了除pIII蛋白編碼序列外的輔助絲狀噬菌體基因組序列，該基因組上攜帶和不攜帶抗性標記。3.如權利要求2所述的Hpd3cdl細胞，其特征是所述的抗性標記是指能表達抑制或降解氨節(jié)抗生素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素的產物的基因。4.一種如權利要求1所述的Hpd3cel1細胞的制備方法，其特征是由缺少基因III的輔助噬菌體基因組(VCSM13d3)轉化F因子陽性的細菌獲得。5.如權利要求4所述的Hpd3cdl細胞的制備方法，其特征是所述的將VCSM13d3質粒轉化TGl細胞，然后鋪于含有抗性的瓊脂平板，倒置，生化培養(yǎng)箱過夜，挑取單克隆，即為Hpd3cdl。6.如權利要求5所述的Hpd3cdl細胞的制備方法，其特征是所述抗性是氨芐抗生素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素。7.—種如權利要求1所述的Hpd3cdl細胞的用途，其特征是用于構建以pIII為基礎的單鏈抗體噬菌體庫。8.如權利要求4所述的Hpd3cell細胞的用途，其特征是所述的噬菌體為絲狀噬菌體(FilamentousPhage)。9.如權利要求4所述的Hpd3cell細胞的用途，其特征是所述的單鏈抗體庫文庫構建是采用噬菌粒編碼單鏈抗體-蛋白III融合蛋白(scFv-pIII)。10.如權利要求4所述的Hpd3cell細胞的用途，其特征是將編碼scFv-pIII的抗體-蛋白III融合蛋白基因的噬菌粒文庫導入到Hpd3cel1。全文摘要本發(fā)明提供了一種Hpd3cell細胞、制備方法和用途。Hpd3cell為含有缺乏基因III的輔助噬菌體基因組的F因子陽性細菌，菌種保藏編號為CGMCC2057。將編碼scFv-pIII融合蛋白的噬菌粒轉化Hpd3cell，可用于構建以pIII為基礎的新的絲狀噬菌體抗體展示庫。該文庫構建方法采用了Hpd3cell細胞，能高效制備噬菌粒顆粒并使單鏈抗體在噬菌粒顆粒上獲得高水平展示，可以充分提高展示單鏈抗體的噬菌體的特異性富集效率。此外，采用Hpd3cell還可以克服pIII抗性。因此，Hpd3cell可以提高噬菌體抗體庫的富集效率并增加獲得同種抗原的不同抗體的效率。文檔編號C12R1/19GK101113427SQ20071004141公開日2008年1月30日申請日期2007年5月29日優(yōu)先權日2007年5月29日發(fā)明者李宗海,楊勝利,王華茂,石必枝,華蔣,顧健人申請人:上海市腫瘤研究所