專利名稱：一種產(chǎn)莢膜菌的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水處理領(lǐng)域中的新型菌種及其生成工藝技術(shù)，特別是涉及一種產(chǎn)莢膜菌的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
工業(yè)冷卻水中存在大量微生物，由于溫度適中，微生物迅速生長(zhǎng)繁殖，使冷卻水中的微生物數(shù)量大幅度上升。工業(yè)水中微生物主要有藻類、細(xì)菌和真菌。冷卻水中微生物的危害主要表現(xiàn)為產(chǎn)生污泥和沉積物而降低冷卻效果；產(chǎn)生嚴(yán)重的腐蝕；破壞冷卻設(shè)備的某些結(jié)構(gòu)。因而抑制和殺滅冷卻水系統(tǒng)中的微生物是保障工業(yè)生產(chǎn)正常運(yùn)行的有效措施。向冷卻水系統(tǒng)中投加殺菌滅藻劑是殺滅微生物的最為簡(jiǎn)便、直接、有效的方法。
目前殺菌劑的研制和生產(chǎn)是水處理領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)?，F(xiàn)在對(duì)殺菌劑的評(píng)價(jià)主要采用平皿計(jì)數(shù)法。即用平板法測(cè)定投加了殺菌劑的水樣中的活菌數(shù)，和對(duì)照中即未投加殺菌劑的水樣中的活菌數(shù)。然后按下式計(jì)算出殺菌率殺菌率＝(m-n)/m，其中m為對(duì)照中的活菌數(shù)，n為加殺菌劑中的水樣的活菌數(shù)。
藥劑的殺菌率越高，殺菌劑的殺生效果越好。但是無(wú)數(shù)事實(shí)證明，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)具有較高殺菌率的殺菌劑，在實(shí)際應(yīng)用中卻不能取得較好的殺菌效果。這主要是由于在實(shí)際環(huán)境中，冷卻水系統(tǒng)中往往含有大量產(chǎn)莢膜菌。這些細(xì)菌的胞外存在著一層厚度不定的膠狀物質(zhì)，稱為莢膜。莢膜的主要成分有多糖、多肽或蛋白質(zhì)。由于莢膜中含有豐富的多糖，所以莢膜有很強(qiáng)的粘結(jié)能力。莢膜不僅可以從周圍環(huán)境中吸附有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、細(xì)胞及一些顆粒物質(zhì)，還可以將菌體黏附與適當(dāng)?shù)奈矬w表面。冷卻水中的微生物由于產(chǎn)莢膜菌的作用而相互結(jié)集生成了生物膜。生物膜中含有大量的細(xì)胞、胞外代謝產(chǎn)物、營(yíng)養(yǎng)物及吸附的顆粒。添加到冷卻系統(tǒng)中的藥劑有很大一部分被生物膜中的胞外分泌物和死細(xì)胞所消耗。另外，生物膜對(duì)膜兩側(cè)的物質(zhì)交換有屏障作用，這限制了殺菌劑向生物膜內(nèi)的細(xì)菌的擴(kuò)散和滲透。因而，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室方法得到的滅菌劑的殺菌率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在實(shí)際環(huán)境中的殺菌率。所以試驗(yàn)室內(nèi)殺菌劑的評(píng)價(jià)不僅要針對(duì)某一種微生物的殺菌功能，還應(yīng)評(píng)價(jià)殺菌劑對(duì)產(chǎn)莢膜菌存在時(shí)對(duì)某菌株的殺滅率。只有在產(chǎn)莢膜菌條件下，具有良好殺滅率的殺菌劑，在實(shí)際應(yīng)用中才能取得更好的殺滅效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)方法中存在的缺點(diǎn)，尋求一種新型的產(chǎn)莢膜菌培育方法，尤其是提供一種從實(shí)海環(huán)境中分離純化的產(chǎn)莢膜菌，該菌在海水環(huán)境中胞外能產(chǎn)生厚厚的莢膜，這種莢膜菌的應(yīng)用為海水介質(zhì)中殺菌劑、粘泥剝離劑等水處理劑的研制、篩選、殺菌效果的評(píng)價(jià)提出了更為可靠的解決辦法。目前水處理劑領(lǐng)域?qū)⒕鷦┑脑囼?yàn)室評(píng)價(jià)通常以殺死細(xì)菌總數(shù)的百分率來(lái)表示。如果針對(duì)某種細(xì)菌，如鐵細(xì)菌、硫酸鹽還原菌等則以殺死該菌種的百分率來(lái)表示。試驗(yàn)方法一般采用平皿計(jì)數(shù)法。但是由于實(shí)際環(huán)境中微生物多為一層生物膜所包裹，而實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的微生物多為懸浮的單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞膜對(duì)殺菌劑的屏蔽和消耗使得殺菌劑實(shí)際的應(yīng)用效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所測(cè)的殺菌率。
實(shí)際環(huán)境中生物膜的組成主要是由產(chǎn)莢膜菌所引發(fā)和構(gòu)成的。本發(fā)明從實(shí)海環(huán)境分離純化了一株產(chǎn)莢膜菌725B，該菌的應(yīng)用為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)殺菌劑的評(píng)價(jià)提供了更為科學(xué)的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的工藝步驟包括產(chǎn)莢膜菌的分離純化和菌種的鑒定測(cè)試。
產(chǎn)莢膜菌的分離純化以無(wú)菌操作方式，從在實(shí)海中浸泡180天的銅鎳合金表面上剝離下生物膜，在室溫下用2216E培養(yǎng)基進(jìn)行隔夜富集培養(yǎng)，富集液按10-1，10-2，10-3，10-4進(jìn)行梯度稀釋后在平板上劃線分離。其平板培養(yǎng)基配方包括葡萄糖5-15g，牛肉膏10-50g，蛋白胨2-8g，海水1000ml，瓊脂20g，pH值可以取自然狀態(tài)值。上述所說(shuō)的培養(yǎng)基，其配方包括酵母膏0.5-2g，蛋白胨4-8g，磷酸鐵0.1-0.5g，海水1000ml，PH值7.6-7.8。
選取菌落光滑、濕潤(rùn)、粘稠的菌落上的細(xì)菌做莢膜染色。莢膜染色具體步驟如下先在載玻片一端滴一滴無(wú)菌水，用接種針挑取目的菌落上的細(xì)胞少許，在水滴中制成懸液；另取一塊在玻片作為推片，將推片一端平整的邊緣與菌懸液以30度角接觸后，順勢(shì)將菌懸液推向前方，使菌液成為勻薄的一層，風(fēng)干；再用純甲醇固定一分鐘；然后加番紅染色液數(shù)滴于涂片上，沖去殘余甲醇，并染30秒鐘，以細(xì)水流適當(dāng)沖洗，吸干后在光學(xué)顯微鏡下用油鏡觀察。若細(xì)胞產(chǎn)生莢膜，則在顯微鏡下可觀察到無(wú)色的莢膜，紅色的細(xì)胞，及紅色的背景。
番紅染色液配制番紅2.5g，95％酒精100ml，混合配合成番紅酒精溶液，取上述配好的番紅酒精溶液10ml與80ml蒸餾水混合后即得。
若莢膜染色結(jié)果為陽(yáng)性，則對(duì)該菌落繼續(xù)進(jìn)行劃線分離。重復(fù)以上步驟直至得到產(chǎn)莢膜菌的純培養(yǎng)。然后對(duì)所得純培養(yǎng)進(jìn)行傳代，選取經(jīng)50次傳代后，產(chǎn)莢膜性能穩(wěn)定的菌株進(jìn)行保藏。
菌種的鑒定及理化特性本發(fā)明中所培養(yǎng)和應(yīng)用的菌株725B在斜面培養(yǎng)基上，菌落成乳白色，菌落表面光滑、濕潤(rùn)、有凸起，菌落易挑起，且有連絲現(xiàn)象。在顯微鏡下細(xì)胞呈粗短桿狀，莢膜染色成陽(yáng)性。對(duì)該菌株進(jìn)行進(jìn)一步的生理生化試驗(yàn)，其結(jié)果利于表1中。根據(jù)第八版伯杰氏手冊(cè)，結(jié)合產(chǎn)莢膜菌725B的生理生化特征確定所分離菌株為弗留明拜葉林克氏菌(Beijerinckiafluminensis)。該菌株已于2004年9月1日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)典型培養(yǎng)物保藏中心登記，保藏號(hào)為CCTCC NO.M204063。
表1產(chǎn)莢膜菌725B的生理生化特征



將新鮮的產(chǎn)莢膜菌斜面制成菌懸液后，按4％的接種比例接入液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速260轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30℃。每隔兩小時(shí)取10ml菌液，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，用722型分光光度計(jì)測(cè)菌液在600nm處的吸光光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光光度值為縱坐標(biāo)繪制725B的生長(zhǎng)曲線可以看出，725B在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖迅速，接種10小時(shí)后生物量就達(dá)到最大值。10小時(shí)之后，細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期，即新繁殖的細(xì)胞數(shù)目與死亡的細(xì)胞數(shù)目基本保持一致，生物總量保持不變。
本發(fā)明所使用的液體培養(yǎng)基的配方包括酵母膏0.5-2g，蛋白胨4-8g，磷酸鐵0.1-0.5g，海水1000ml，PH值為7.6-7.8。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有所培養(yǎng)的菌種純正，工藝方法簡(jiǎn)便，原理可靠，應(yīng)用效果優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明可以通過(guò)下列關(guān)于產(chǎn)莢膜菌在殺菌劑的殺菌性能評(píng)價(jià)中的應(yīng)用實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，其中所指殺菌劑包括季銨鹽和戊二醛。
實(shí)施例1季銨鹽對(duì)硫酸鹽還原菌與產(chǎn)莢膜菌混合菌的殺滅效果用無(wú)菌水配制25ppm十二烷基二甲基芐基氯化銨10ml。取無(wú)菌試管1支，用無(wú)菌吸管吸取25ppm十二烷基二甲基芐基氯化銨4.5ml注入其中。然后吸取0.5ml硫酸鹽還原菌的菌懸液加入到上述試管中，晃動(dòng)，使其成為均勻的菌藥混合液?？瞻讓?duì)照為生理鹽水。待菌藥相互作用30分鐘后，分別吸取0.5ml菌藥混合液加入另一只盛有4.5ml經(jīng)滅菌的生理鹽水中，在手掌中振蕩，使液體混合均勻。然后吸取上述液體0.2ml于平板中，立即在培養(yǎng)皿中注入20ml，經(jīng)煮溶冷卻至約40℃的培養(yǎng)基，搖勻，使其凝固。將平板置于恒溫箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后，觀察計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，并計(jì)算殺菌率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，25ppm的十二烷基二甲基芐基氯化銨對(duì)硫酸鹽還原菌的殺滅率達(dá)到99.5％。
按上述方法測(cè)定十二烷基二甲基芐基氯化銨而對(duì)產(chǎn)莢膜菌和硫酸鹽還原菌(菌株比例為2∶1)混合菌液的殺菌率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該藥劑在產(chǎn)莢膜菌與硫酸鹽還原菌混合培養(yǎng)時(shí)對(duì)硫酸鹽還原菌的殺菌率卻只有85.7％。
實(shí)施例2戊二醛對(duì)硫酸鹽還原菌與產(chǎn)莢膜菌混合菌的殺滅效果用無(wú)菌水配制50ppm戊二醛溶液10ml。取無(wú)菌試管1支，用無(wú)菌吸管吸取50ppm戊二醛4.5ml注入其中。然后吸取0.5ml硫酸鹽還原菌的菌懸液加入到上述試管中，晃動(dòng)，使其成為均勻的菌藥混合液?？瞻讓?duì)照為生理鹽水。待菌藥相互作用至30分鐘后，分別吸取0.5ml菌藥混合液和對(duì)照分別加入到另外兩支盛有4.5ml經(jīng)滅菌的生理鹽水中，在手掌中振蕩，使液體混合均勻。然后分別吸取上述液體0.2ml于平板中，立即在培養(yǎng)皿中注入20ml，經(jīng)煮溶冷卻至約40℃的培養(yǎng)基，搖勻，使其凝固。將平板置于恒溫箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后，觀察計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，并計(jì)算殺菌率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50ppm的戊二醛對(duì)硫酸鹽還原菌的殺滅率為99.5％。
用上述方法測(cè)定戊二醛對(duì)產(chǎn)莢膜菌與硫酸鹽還原菌混合菌的殺滅效果。產(chǎn)莢膜菌與硫酸鹽還原菌的數(shù)量之比為2∶1。實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)硫酸鹽還原菌與產(chǎn)莢膜菌混合培養(yǎng)時(shí)戊二醛對(duì)硫酸鹽還原菌的殺滅率只有74.4％。
本發(fā)明所培養(yǎng)的產(chǎn)莢膜菌應(yīng)用在殺菌劑的殺菌性能評(píng)價(jià)中具有良好的作用效果，尤其是應(yīng)用在季銨鹽和戊二醛等殺菌劑的功能評(píng)價(jià)中效果更加明顯。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)莢膜菌的培養(yǎng)方法，其特征在于產(chǎn)莢膜菌的分離純化以無(wú)菌操作方式，從在實(shí)海中浸泡的銅鎳合金表面上剝離下生物膜，在室溫下用培養(yǎng)基進(jìn)行隔夜富集培養(yǎng)，富集液按10-1，10-2，10-3，10-4進(jìn)行梯度稀釋后在平板上劃線分離；選取菌落光滑、濕潤(rùn)、粘稠的菌落上的細(xì)菌做莢膜染色；當(dāng)莢膜染色結(jié)果為陽(yáng)性，繼續(xù)對(duì)菌落進(jìn)行劃線分離，直至得到產(chǎn)莢膜菌的純培養(yǎng)；然后對(duì)所得純培養(yǎng)進(jìn)行傳代，選取經(jīng)50次傳代后，產(chǎn)莢膜性能穩(wěn)定的菌株進(jìn)行保藏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)莢膜菌的培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)基配方包括酵母膏0.5-2g，蛋白胨4-8g，磷酸鐵0.1-0.5g，海水1000ml，PH值7.6-7.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)莢膜菌的培養(yǎng)方法，其特征在于平板培養(yǎng)基配方包括葡萄糖5-15g，牛肉膏10-50g，蛋白胨2-8g，海水1000ml，瓊脂20g，pH值為自然值。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)莢膜菌的培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)的產(chǎn)莢膜菌應(yīng)用于殺菌劑性能評(píng)價(jià)中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)莢膜菌的培養(yǎng)方法，屬于水處理領(lǐng)域中的新型菌種及其分離純化工藝技術(shù)，產(chǎn)莢膜菌的分離純化以無(wú)菌操作方式，從在實(shí)海中浸泡180天的銅鎳合金表面上剝離下生物膜，在室溫下用培養(yǎng)基進(jìn)行隔夜富集培養(yǎng)，富集液按10－1，10－2，10－3，10－4進(jìn)行梯度稀釋后在平板上劃線分離；選取菌落光滑、濕潤(rùn)、粘稠的菌落上的細(xì)菌做莢膜染色；當(dāng)莢膜染色結(jié)果為陽(yáng)性，繼續(xù)對(duì)菌落進(jìn)行劃線分離，直至得到產(chǎn)莢膜菌的純培養(yǎng)；然后對(duì)所得純培養(yǎng)進(jìn)行傳代，選取經(jīng)50次傳代后，產(chǎn)莢膜性能穩(wěn)定的菌株進(jìn)行保藏。該方法培養(yǎng)的菌種純正，工藝方法簡(jiǎn)便，原理可靠，應(yīng)用效果好，其培養(yǎng)的產(chǎn)莢膜菌應(yīng)用于殺菌劑性能評(píng)價(jià)中具有良好的功能效果。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1912104SQ20061006988
公開(kāi)日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2006年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月15日
發(fā)明者劉光洲, 段東霞, 王軍 申請(qǐng)人:中國(guó)船舶重工集團(tuán)公司第七二五研究所