專利名稱：結(jié)核分枝桿菌rpfc基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及結(jié)核分枝桿菌rpfc基因及其用途，尤其是在rpfC活性調(diào)控分子篩選、利用rpfC的結(jié)核病預(yù)防性疫苗和結(jié)核病診斷試劑方面的用途。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是人類重要的致病菌。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，每年有兩百萬人死于結(jié)核??；每三個人中就有一個人被感染；從2000年到2020年間，將會有近十億人新感染結(jié)核病(http://www.theglobalfund.org/en/about/tuberculosis/default.asp)。特別是近年來，隨著多重耐藥菌株的出現(xiàn)及增多和艾滋病的流行，結(jié)核病的發(fā)病率也呈急劇上升趨勢。結(jié)核分枝桿菌作為一種病原菌，成功之處主要在于能在寄主體內(nèi)進(jìn)入休眠狀態(tài)，并保持持久的活性。當(dāng)寄主的免疫系統(tǒng)因?yàn)槟承┰?如衰老，感染HIV)免疫力下降時，這些休眠期的病原菌將會被重新激活并引發(fā)明顯的臨床癥狀。
藤黃微球菌的Rpf是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個能使休眠狀態(tài)的細(xì)菌復(fù)蘇并促進(jìn)其生長的因子。結(jié)核分枝桿菌與rpf相似的基因共5個，分別為rpfA(Rv0867c)，rpfB(Rv1009)，rpfC(Rv1884c)，rpfD(Rv2389c)和rpfE(Rv2450c)。在這五個基因中，rpfC的表達(dá)量最大，活性最高，突變后引起的全基因組表達(dá)圖譜變化最大。
從rpfC出發(fā)，有可能開發(fā)治療潛伏性結(jié)核病的新藥，以及以其作為預(yù)防性疫苗，或者作為潛伏性結(jié)核病的診斷試劑的組分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供，1.一種重組表達(dá)結(jié)核菌rpfC的工程菌；2.獲得大量純化的rpfC，進(jìn)行抗體制備；3.利用含有rpfC的工程菌作為藥物靶標(biāo)研發(fā)新的藥物的模型；4.含有rpfC的DNA疫苗或者亞單位疫苗的構(gòu)建及其應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，從結(jié)核菌基因組擴(kuò)增rpfC基因，在大腸桿菌等適宜的宿主表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)行抗體制備，亞單位疫苗制備以及DNA疫苗制備并檢測效果。
實(shí)現(xiàn)上述目的的基本技術(shù)路線為總體技術(shù)方案是克隆包括提取結(jié)核菌基因組，利用合適的載體和限制性內(nèi)切酶片段，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，將基因組DNA克隆到合適的大腸桿菌宿主細(xì)胞。
1.基因模板提取將待克隆菌株在LB培養(yǎng)基或YE培養(yǎng)基或者M(jìn)iddlebrook 7H9、sauton等分枝桿菌能夠生長的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到合適的菌體濃度，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA。
2.工程菌的構(gòu)建 按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法，將基因組DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骶ㄟ^一定的選擇標(biāo)記，收集獲得的工程菌。
3.功能基因的篩選 按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑、完全可以從商業(yè)途徑獲得的載體、限制性內(nèi)切酶和方法，將目標(biāo)基因克隆到載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子。分別根據(jù)已知的結(jié)核菌入侵人體和動物模型可能遭遇的不利環(huán)境，進(jìn)行人工模擬，從基因組表達(dá)文庫篩選相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)一步驗(yàn)證。
4.利用含有功能基因的重組菌，進(jìn)行功能基因抑制劑或激活劑的篩選。
發(fā)明效果利用本技術(shù)方案涉及的方法，得到了1.一種重組表達(dá)結(jié)核菌rpfC的工程菌；2.獲得大量純化的rpfC，進(jìn)行抗體制備；3.利用含有rpfC的工程菌作為藥物靶標(biāo)研發(fā)新的藥物的模型；4.含有rpfC的DNA疫苗或者亞單位疫苗的構(gòu)建及其應(yīng)用。


圖1.結(jié)核分枝桿菌rpfc PCR產(chǎn)物。
圖2.重組表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌rpfc產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和培養(yǎng)基MTB H37Rv由重慶市肺科醫(yī)院提供并滅活。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、質(zhì)粒pET28a(+)和宿主菌E.coli BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。藤黃微球菌(Micrococcus luteus CNCC(B)28001)由四川省抗生素研究所王明蓉惠贈。LB培養(yǎng)基，LMM(lactate minimal medium)含0.5％lithium L-lactate[3]。
1.1.2主要試劑限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；PfuDNA聚合酶、dNTP和buffer、IPTG購自merck；DNA膠回收試劑盒購自Bioflux；Ni2+-Sepharose和KTA prime蛋白純化系統(tǒng)購自Amersham Biosciences；低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購自上海生化所研究所。
1.2目的基因PCR擴(kuò)增和克隆根據(jù)GenBank中mycobacterium tuberculosis H37Rv株rpfc的基因序列，自行設(shè)計一對擴(kuò)增該成熟蛋白基因的PCR引物(由Invitrogen公司合成)，序列為cf 5’-ACAGGATCCACTTCCGGCGATATG-3’；cr5’TACTGAATTCTCAGCGCGGAATACTTG-3’(劃線序列分別為BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn))。MTB基因組DNA按文獻(xiàn)[4]抽提。以MTB基因組DNA為模板，以cf，cr為引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件95℃5min；95℃60s，56.8℃30s，72℃90s，30個循環(huán)；72℃10min。純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a(+)以BamH I和EcoR I雙酶切后，切膠純化后，以T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli BL21(DE3)，經(jīng)菌體PCR篩選獲得原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-rpfc。送Invitrogen公司進(jìn)行測序。
1.3目的基因的表達(dá)和SDS-PAGE分析將原核表達(dá)重組克隆接種于10ml(含50μg/ml卡那霉素)的LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm/min培養(yǎng)過夜。1％接種到50ml LB(含50ug/ml卡那霉素)中，37℃200rpm/min培養(yǎng)至OD6000.5～0.8，加IPTG至1mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)4h。以同樣的方法誘導(dǎo)含空質(zhì)粒pET28a(+)的E.coli BL21(DE3)做對照。
誘導(dǎo)收獲的的菌液1ml，離心收集菌體。加入100μl 2×SDS凝膠上樣緩沖液，振蕩混勻，沸水煮沸5min，12000rpm/min離心10min，取上清15μl進(jìn)行15％SDS-PAGE。
1.4重組Rpfc蛋白的純化及濃度測定按上面的方法誘導(dǎo)1L重組菌。菌液4℃離心30min。用20ml 1×Ni2+-SepharoseBinding buffer(20mmol/LNaH2PO4，500mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH 7.4)重懸細(xì)胞，再加入PMSF至終濃度1mmol/L。冰上超聲破碎菌體，4℃離心，棄沉淀，上清0.45μm的濾膜過濾，然后用Ni2+-Sepharose親合柱對蛋白進(jìn)行純化。10倍柱體積Binding buffer，10倍柱體積的Wash buffer(20mmol/L NaH2PO4，500mmol/L NaCl，80mmol/L咪唑，pH7.4)，10倍柱體積的Elution buffer(20mmol/LNaH2PO4，500mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，pH 7.4)。收集洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE分析。洗脫的重組蛋白4℃透析過夜，透析緩沖液含tris 50mmol/L pH 7.9，EDTA 0.5mmol/L，NaCl 50mmol/L，甘油5％(V/V)。蛋白濃度采用Bradford法進(jìn)行測定。
1.5重組蛋白活性測定Rpfc樣蛋白能促進(jìn)休眠期的結(jié)核分枝桿菌的復(fù)蘇，且能縮短在基本培養(yǎng)基上的延滯期。同時，由于Rpfc蛋白有種間活性，因此可以通過測定重組Rpfc能否縮短藤黃微球菌低密度(1∶103)在基本培養(yǎng)基LMM來檢測其活性。
藤黃微球菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上傳代。接少量菌體至LMM培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，離心，上清0.22μm濾膜過濾除菌后立即使用作為陽性對照，透析buffer作為陰性對照，以及透析出鹽后的重組Rpfc，各加40μl至30ml的LMM培養(yǎng)基中(調(diào)整RPF終濃度為pmol水平)，37℃，200rpm/min振蕩培養(yǎng)，每4h觀測一次OD600值(取200μl樣品，在96孔板上，Moleculer Devices Spectra MAX 190讀數(shù))。
1.6Rpfc的生物信息學(xué)分析使用Vector NT I Suite9對蛋白氨基酸組成進(jìn)行分析。使用在線軟件SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對蛋白信號肽進(jìn)行預(yù)測。使用NCBI的RPS-BLAST對氨基酸一級結(jié)構(gòu)保守域進(jìn)行比對。
2結(jié)果2.1Rpfc基因的擴(kuò)增和克隆以MTB基因組DNA為模板，以cf，cr為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳分析，可見1條約450bp的DNA片斷，與預(yù)期DNA片斷大小一致。純化的Rpfc PCR產(chǎn)物與pET28a(+)連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過菌體PCR檢測，再通過測序鑒定，該序列和GenBank中Mycobacterium tuberculosis H37Rv rpfc除信號肽段部分的基因序列完全一致。
2.2重組RPFc的表達(dá)與純化經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)凝膠掃描分析，目的蛋白占總蛋白的％。上清中的可溶重組蛋白經(jīng)親和層析后在考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE上只有單一的條帶。
2.3重組Rpfc蛋白活性的測定從表一可以看出，Rpfc能顯著縮短藤黃微球菌低密度接種到LMM培養(yǎng)基上的延滯期。
權(quán)利要求
1.結(jié)核分枝桿菌rpfc基因，其特征是表達(dá)結(jié)核菌rpfC的重組工程菌、純化的重組酶以及利用純化的酶或工程菌進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌rpfC調(diào)節(jié)分子的篩選。
2.權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌rpfc基因，其特征是rpfc包括其活性位點(diǎn)關(guān)鍵殘基的不影響活性的變異體，包括rpfC的溶菌酶樣功能域、糖苷酶功能域的關(guān)鍵殘基如色氨酸-天冬氨酸二聯(lián)體和甘氨酸-甘氨酸-任意氨基酸-丙氨酸-色氨酸-脯氨酸六肽區(qū)。
3.權(quán)利要求1或2所述的結(jié)核分枝桿菌rpfc基因在結(jié)核病診斷和藥物治療效果監(jiān)控中的用途，其特征是利用重組表達(dá)的rpfC的抗體或者抗體類似分子進(jìn)行免疫檢測。
4.權(quán)利要求1或2所述的結(jié)核分枝桿菌rpfc基因在DNA疫苗或者亞單位疫苗中的應(yīng)用，其特征是利用結(jié)核分枝桿菌rpfc基因及其產(chǎn)物，作為疫苗組分，預(yù)防結(jié)核病。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及結(jié)核分枝桿菌rpfc基因及其用途，尤其是在rpfC活性調(diào)控分子篩選、利用rpfC的結(jié)核病預(yù)防性疫苗和結(jié)核病診斷試劑方面的用途。
文檔編號C12N1/21GK101037698SQ200610095339
公開日2007年9月19日 申請日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者謝建平, 柳云帆, 王洪海 申請人:西南大學(xué)