專利名稱：脂肪酶的仿生親和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的規(guī)?；苽浞椒?，特別是一種脂肪酶的仿生親和純化方法。
背景技術(shù)：
脂肪酶是甘油酯水解酶(EC 3.1.1.3)，能夠?qū)⒏视腿ニ獬蔀橹舅岷透视?，底物是水溶液難以溶解的長鏈脂肪酰酯。在水解和合成反應(yīng)中，脂肪酶都表現(xiàn)出良好的立體和手性選擇性質(zhì)，可合成多種具有重要藥物經(jīng)濟(jì)價值的特殊酯類化合物，在合成手性醫(yī)藥、農(nóng)藥和化學(xué)中間體產(chǎn)品中具有廣泛用途。脂肪酶一般由微生物發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵液中脂肪酶與微生物分泌的其它蛋白和酶混合在一起，占總蛋白的10％以下。發(fā)酵液中常常還存在其它的酶，如蛋白酶，在最終脂肪酶產(chǎn)品中不去除會降解脂肪酶的肽鏈，并會縮短脂肪酶的使用壽命和循環(huán)周期。同時，與脂肪酶共存的還可能有其它底物專一性的酶，可能增加脂肪酶催化反應(yīng)副產(chǎn)物的含量，降低目的手性產(chǎn)品的產(chǎn)率，加大產(chǎn)品后續(xù)分離純化的技術(shù)難度和生產(chǎn)成本。此外，其它惰性雜蛋白的存在也會降低固定化材料的脂肪酶載量、增加固相材料的用量和成本，因此需要對脂肪酶進(jìn)行純化處理。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Gupta等在《Appl.Microbiol.Biotechnol.》(《應(yīng)用微生物生物技術(shù)》，2005年67卷648-653頁)上發(fā)表了題為“Single-steppurification of lipase from Burkholderia multivorans using polypropylenematrix”(“用聚丙烯基質(zhì)從伯克霍爾德菌一步純化脂肪酶”)的論文，提出如下技術(shù)方案首先將含脂肪酶發(fā)酵液的pH調(diào)至9.0，上至裝有多微孔聚丙烯樹脂材料的層析柱中，室溫孵育12小時，再用表面活性劑Triton X-100進(jìn)行洗脫，用丙酮(50％，體積百分比)沉淀回收。但該方法存在著脂肪酶在層析柱中需要與吸附材料孵育12小時以上，樹脂材料載量低，從而使生產(chǎn)效率難于提高等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種脂肪酶的仿生親和純化方法，使其能夠快速、簡便、低成本、大批量純化脂肪酶。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明以專一性識別脂肪酶的分離材料作為基礎(chǔ)，其步驟如下(1)制備仿生親和分離材料仿生親和分離材料是通過三氮嗪結(jié)構(gòu)骨架作為間臂分別固定烯丙胺和環(huán)己胺兩個基團(tuán)，首先用帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪進(jìn)行反應(yīng)，得到基礎(chǔ)層析介質(zhì)氨基二氯三氮嗪，然后在50℃溫度下與烯丙胺反應(yīng)得到1-基礎(chǔ)層析介質(zhì)氨基-2-胺丙烯一氯三氮嗪，最后在95℃溫度下與環(huán)己胺反應(yīng)，得到1-基礎(chǔ)層析介質(zhì)氨基-2-胺丙烯基-3-胺環(huán)己基三氮嗪，稱為仿生親和分離材料，這樣，仿生親和分離材料的關(guān)鍵是烯丙胺和環(huán)己胺兩個基團(tuán)通過三氮嗪結(jié)構(gòu)骨架固定到氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)上；所述步驟(1)中，基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖-N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚分離材料、甲基丙烯酸聚合分離材料、瓊脂糖凝膠、交聯(lián)瓊脂糖凝膠，瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺-瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠或涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。
(2)用仿生親和分離材料純化脂肪酶粗品用上述合成的仿生親和分離材料裝層析柱，用平衡緩沖液平衡后將含脂肪酶的原料上至該親和層析柱中，脂肪酶被柱中仿生親和分離材料專一地吸附留在層析柱中，其它不能被吸附的蛋白隨緩沖液流出，最后用洗脫緩沖液將脂肪酶從柱中專一洗脫下來，得到純脂肪酶。
所述步驟(2)中，脂肪酶的吸附條件為pH5.0-8.0的緩沖液。
所述步驟(2)中，脂肪酶的洗脫條件為pH1.0-3.0的緩沖液，或含有機(jī)溶劑，或含表面活性劑。
所述的洗脫緩沖液含有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑是指能夠與水混溶的醇類和酮類，如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或丙酮。
所述的洗脫緩沖液含有表面活性劑，表面活性劑是指含疏水和親水兩種基團(tuán)的分子，如斯潘20、斯潘40、斯潘60、斯潘65、斯潘80、斯潘85、吐溫20、吐溫21、吐溫40、吐溫60、吐溫61、吐溫65、吐溫80、吐溫81或吐溫85。
所述的仿生親和分離材料，其關(guān)鍵的配體結(jié)構(gòu)是通過三氮嗪結(jié)構(gòu)骨架作為間臂分別固定烯丙胺和環(huán)己胺兩個基團(tuán)。
所述的脂肪酶，其原料為天然微生物發(fā)酵，或通過基因工程技術(shù)改造的微生物發(fā)酵液，或菌體破碎液。
本發(fā)明合成了仿生親和分離材料，該材料上的一個化學(xué)基團(tuán)能夠與脂肪酶分子發(fā)生專一和高度特異的、非共價和可逆的相互作用，從而使含脂肪酶的樣品與仿生親和分離材料接觸時，能夠與具有識別和結(jié)合能力的化學(xué)基團(tuán)結(jié)合吸附在分離材料上，未結(jié)合的物質(zhì)被溶液攜帶離開分離材料被除去。在不同條件下，如不同鹽濃度，不同酸堿度的緩沖液與分離材料接觸，吸附在分離材料上的脂肪酶可特異地從分離材料上解離下來，從而制備高純度的脂肪酶。
本發(fā)明克服了現(xiàn)有脂肪酶生產(chǎn)技術(shù)中的缺點(diǎn)，使脂肪酶生產(chǎn)分離純化時步驟少、生產(chǎn)周期短、成本低、效率高，利用脂肪酶專一的親和分離材料，可快速、簡便、低成本、大批量純化制備脂肪酶。
具體實施例方式
以下對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。
實施例1取NH2-交聯(lián)瓊脂糖珠300ml，依次用5倍體積的1M NaCl，10倍體積蒸餾水充分洗滌后，抽干轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中，然后加入50ml冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪100g，其后用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)和維持反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6.0-7.0之間，反應(yīng)4小時后取出，依次用3×10倍交聯(lián)瓊脂糖珠體積的水/丙酮(體積比分別為0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗滌，得到1-氨基-交聯(lián)瓊脂糖珠-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪，共250ml。
取烯丙胺80ml用去離子水100ml混合，加入含1-氨基-交聯(lián)瓊脂糖珠-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪240ml中混勻，然后用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)和維持反應(yīng)pH在6.0-7.0之間，置于溫度50℃中攪拌反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將交聯(lián)瓊脂糖珠依次用10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1-氨基-交聯(lián)瓊脂糖珠-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪240ml，待用。
取環(huán)己胺90ml用去離子水150ml混合，加入含1-氨基-交聯(lián)瓊脂糖珠-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪200ml中混勻，然后用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)和維持反應(yīng)pH在6.0-7.0之間，置于溫度95℃中攪拌反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將交聯(lián)瓊脂糖珠依次用3×10倍交聯(lián)瓊脂糖珠體積的去離子水充分洗滌，得到1-氨基-交聯(lián)瓊脂糖珠-3-胺丙烯基-5-胺環(huán)己基-2，4，6-三氮嗪200ml，用30％乙醇保存，待用。
調(diào)含粗脂肪酶的酵母發(fā)酵液pH至7.0，然后從中取0.5ml上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.0)平衡好的裝1-氨基-交聯(lián)瓊脂糖珠-3-胺丙烯基-5-胺環(huán)己基-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(5ml)中，用10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.0)洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再用1.5ml 0.1M醋酸洗脫，收集得到純化脂肪酶。取純化脂肪酶溶液4μl加至含192μl pH8.0、1M TrisCl和4μl 25mM對硝基苯酚葵酸酯(用DMSO配制)的對硝基苯酚酯測定脂肪酶活反應(yīng)體系中，混勻，室溫反應(yīng)10min，加100μl無水乙醇終止反應(yīng)，測光吸收A405nm，根據(jù)對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)濃度的光吸收A405nm曲線計算反應(yīng)體系生成的對硝基苯酚，再計算樣品每分鐘分解硝基苯酚葵酸酯產(chǎn)生對硝基苯酚的μg數(shù)，即酶活力單位(U)。用Lowry法測定蛋白含量，以聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析脂肪酶蛋白純度。實驗結(jié)果表明純化的脂肪酶總活力達(dá)到20U，純度達(dá)到85％。
實施例2調(diào)含天然微生物發(fā)酵得到的粗脂肪酶樣品pH至7.0，然后從中取0.5m上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.0)平衡好的裝1-氨基-交聯(lián)瓊脂糖珠-3-胺丙烯基-5-胺環(huán)己基-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(5ml)中，用10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH8.0)洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再用1.5ml 0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH3.0，含0.1％吐溫80)洗脫，收集得到純化脂肪酶。按照實施例1中的方法測定脂肪酶活力。實驗結(jié)果表明純化的脂肪酶總活達(dá)到25U，純度達(dá)到88％。
實施例3取NH2-葡聚糖凝膠150ml，依次用5倍體積的1M NaCl，10倍體積蒸餾水充分洗滌后，抽干轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中，加入40ml冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪50g，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)和維持反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6.0-7.0之間，反應(yīng)4小時后取出，將葡聚糖凝膠依次用3×10倍葡聚糖凝膠體積的水/丙酮(體積比分別為0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗滌，得到1-氨基-葡聚糖凝膠-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪120ml。
取烯丙胺40ml用去離子水50ml混合，加至1-氨基-葡聚糖凝膠-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪120ml中混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)和維持反應(yīng)pH在6.0-7.0之間，置于50℃條件下攪拌反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后，依次用10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1-氨基-葡聚糖凝膠-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪110ml，待用。
取環(huán)己胺45ml用去離子水100ml混合，加至1-氨基-葡聚糖凝膠-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪80ml中混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)和維持反應(yīng)pH在6.0-7.0之間，置于溫度95℃中攪拌反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將葡聚糖凝膠依次用3×10倍葡聚糖凝膠體積的去離子水充分洗滌，得到1-氨基-葡聚糖凝膠-3-胺丙烯基-5-胺環(huán)己基-2，4，6-三氮嗪80ml，用30％乙醇(體積百分比)保存，待用。
調(diào)基因工程技術(shù)改造的酵母發(fā)酵液粗脂肪酶樣品pH至7.0，取30ml上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.0)平衡好的裝有實施例3合成的1-氨基-葡聚糖凝膠-3-胺丙烯基-5-胺環(huán)己基-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(50ml)中，用10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.0)洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再用10ml醋酸(0.1M)洗脫，收集得到純化脂肪酶。按照實施例1中的方法測定脂肪酶活力。實驗結(jié)果表明純化的脂肪酶總活力1200U，純度89％。
實施例4調(diào)含粗脂肪酶的酵母發(fā)酵液pH至7.0，取30ml上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.0)平衡好的裝實施例3合成的1-氨基-葡聚糖凝膠-3-胺丙烯基-5-胺環(huán)己基-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(50ml)中，用10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH5.0)洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再用10ml醋酸(0.1M，用鹽酸調(diào)pH至1.0)洗脫，收集得到純化脂肪酶。按照實施例1中的方法測定脂肪酶活力。實驗結(jié)果表明純化的脂肪酶總活力800U，純度70％。
實施例5取NH2-甲基丙烯酸聚合分離材料250ml，依次用5倍體積的1M NaCl，10倍體積蒸餾水充分洗滌后，抽干轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中，然后加入40ml冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪70g，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)和維持反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6.0-7.0之間，反應(yīng)4小時后取出，依次用3×10倍層析材料體積的水/丙酮(體積比分別為0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)混合溶液洗滌，得到1-氨基-NH2-甲基丙烯酸聚合分離材料-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪220ml。
取烯丙胺60ml用去離子水50ml混合，加入含1-氨基-甲基丙烯酸聚合分離材料-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪200ml中混勻，然后用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)和維持反應(yīng)pH在6.0-7.0之間，置于溫度50℃中攪拌反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將層析材料依次用10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1-氨基-甲基丙烯酸聚合分離材料-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪180ml，待用。
取環(huán)己胺80ml用去離子水150ml混合，加至1-氨基-甲基丙烯酸聚合分離材料-3-胺丙烯基-5-氯-2，4，6-三氮嗪160ml中混勻，然后用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)和維持反應(yīng)pH在6-7之間，置于溫度95℃中攪拌反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)后的層析材料依次用3×10倍層析材料體積的去離子水充分洗滌，得到1-氨基-甲基丙烯酸聚合分離材料-3-胺丙烯基-5-胺環(huán)己基-2，4，6-三氮嗪135ml，用30％乙醇保存，待用。
調(diào)含粗脂肪酶的酵母發(fā)酵液pH至7.0，取20ml上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.0)平衡好的裝有實施例5合成的1-氨基-甲基丙烯酸聚合分離材料-3-胺丙烯基-5-胺環(huán)己基-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(10ml)中，用10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.0)洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再用10ml含50％乙醇的(體積百分比)、0.05M醋酸洗脫，收集得到純化脂肪酶。按照實施例1中的方法測定脂肪酶活力。實驗結(jié)果表明純化的脂肪酶總活力491U，純度95％。
實施例6調(diào)脂肪酶生產(chǎn)菌南極假絲酵母菌體破碎液pH至7.0，取20ml上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.0)平衡好的裝有實施例5合成的1-氨基-甲基丙烯酸聚合分離材料-3-胺丙烯基-5-胺環(huán)己基-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(10ml)中，用10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.0)洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再用10ml含50％乙醇的(體積百分比)、0.05M醋酸洗脫，收集得到純化脂肪酶。按照實施例1中的方法測定脂肪酶活力。實驗結(jié)果表明純化的脂肪酶總活力560U，純度93％。
本發(fā)明的上述各個實施例從上樣至獲得高純脂肪酶操作簡單，時間少于5小時，只需要一步層析操作，生產(chǎn)成本低。利用分離材料與脂肪酶之間的高度專一的相互作用實現(xiàn)純化的目的，不受生產(chǎn)規(guī)模的影響，因此很容易放大進(jìn)行批量生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酶的仿生親和純化方法，其特征在于，包括下列步驟(1)制備仿生親和分離材料首先用帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪進(jìn)行反應(yīng)，得到基礎(chǔ)層析介質(zhì)氨基二氯三氮嗪，然后在50℃溫度下與烯丙胺反應(yīng)得到1-基礎(chǔ)層析介質(zhì)氨基-2-胺丙烯一氯三氮嗪，最后在95℃溫度下與環(huán)己胺反應(yīng)，得到1-基礎(chǔ)層析介質(zhì)氨基-2-胺丙烯基-3-胺環(huán)己基三氮嗪，稱為仿生親和分離材料；(2)用仿生親和分離材料純化脂肪酶粗品用上述制備的仿生親和分離材料裝層析柱，隨后將含脂肪酶的樣品上至該親和層析柱中，脂肪酶被柱中仿生親和分離材料專一地吸附留在層析柱中，其它不能被吸附的蛋白隨緩沖液流出，最后用洗脫緩沖液將脂肪酶從柱中專一洗脫下來，得到純脂肪酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的仿生親和純化方法，其特征是，所述的仿生親和分離材料，其配體結(jié)構(gòu)是通過三氮嗪結(jié)構(gòu)骨架作為間臂分別固定烯丙胺和環(huán)己胺兩個基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的仿生親和純化方法，其特征是，步驟(1)中，所述的基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖-N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚分離材料、甲基丙烯酸聚合分離材料、瓊脂糖凝膠、交聯(lián)瓊脂糖凝膠，瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺-瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠或涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的仿生親和純化方法，其特征是，在步驟(2)中，所述的脂肪酶被柱中仿生親和分離材料析吸附，吸附條件為pH5.0-8.0的緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的仿生親和純化方法，其特征是，在步驟(2)中，所述的洗脫緩沖液，是pH1.0-3.0的緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的脂肪酶的仿生親和純化方法，其特征是，在步驟(2)中，所述的洗脫緩沖液，是pH1.0-3.0的緩沖液，含有機(jī)溶劑或表面活性劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂肪酶的仿生親和純化方法，其特征是，所述的有機(jī)溶劑是指甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或丙酮。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂肪酶的仿生親和純化方法，其特征是，所述的表面活性劑是斯潘20、斯潘40、斯潘60、斯潘65、斯潘80、斯潘85、吐溫20、吐溫21、吐溫40、吐溫60、吐溫61、吐溫65、吐溫80、吐溫81或吐溫85。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的仿生親和純化方法，其特征是，在步驟(2)中，所述的脂肪酶，其原料為天然微生物發(fā)酵液、通過基因工程技術(shù)改造的微生物發(fā)酵液或菌體破碎液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脂肪酶的仿生親和純化方法，屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的。本發(fā)明包括下列步驟(1)制備仿生親和分離材料首先用帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪進(jìn)行反應(yīng)，然后在50℃與烯丙胺反應(yīng)，最后在95℃與環(huán)己胺反應(yīng)，合成仿生親和分離材料；(2)用仿生親和分離材料純化脂肪酶粗品用上述制備的仿生親和分離材料裝入層析柱，得到親和層析柱，隨后將含脂肪酶的樣品上至該親和層析柱中，脂肪酶被柱中仿生親和分離材料專一地吸附留在層析柱中，其它不能被吸附的蛋白隨緩沖液流出，最后用洗脫緩沖液將脂肪酶從柱中專一洗脫下來，得到純脂肪酶。本發(fā)明能夠高效率、低成本的大規(guī)模生產(chǎn)高純度的脂肪酶。
文檔編號C12N9/20GK1970745SQ20061011925
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者李榮秀, 唐克軒, 姚紅艷, 董德賢 申請人:上海交通大學(xué)