專利名稱：人肺癌細(xì)胞ngal基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因表達(dá)調(diào)控，具體地說，涉及一種人肺癌細(xì)胞的NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
背景技術(shù)：
肺癌，又稱原發(fā)性支氣管癌，是肺部常見的惡性腫瘤。在全球，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居癌癥之首。而且目前肺癌發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)都呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。肺癌早期沒有明顯癥狀，因癥狀就診者多屬中晚期，這些是肺癌高死亡率的重要原因。目前，肺癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，NGAL基因在很多腫瘤細(xì)胞包括肺癌細(xì)胞中有高表達(dá)；我們最近的研究結(jié)果顯示，NGAL基因與細(xì)胞分化和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。
NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)，即中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，是1993年K jeldsen等在研究人中性粒細(xì)胞的明膠酶(gelatinase B，即MMP-9)時(shí)首先被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)25KD的糖蛋白，是lipocalin家族的新成員。NGAL基因是單拷貝，定位于染色體9q34區(qū)域。NGAL基因的全長(zhǎng)5869bp，其中包括1695bp的5′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，178bp的3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)及由七個(gè)外顯子和六個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成的3696bp的原初轉(zhuǎn)錄區(qū)(primary transcribedregion)。其cDNA全序列由63bp的5′端非翻譯區(qū)和591bp的編碼區(qū)組成，編碼含197個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，此肽鏈包括178個(gè)氨基酸殘基的成熟肽段(mature peptide)和19個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列(leadersequence)。
NGAL在不同組織和細(xì)胞的病理或生理?xiàng)l件下表現(xiàn)出不同的功能形式在發(fā)生炎癥反應(yīng)的上皮細(xì)胞中可見NGAL的表達(dá)；作為小分子鐵化合物結(jié)合蛋白參與機(jī)體鐵代謝和天然免疫反應(yīng)；也可參與細(xì)胞分化以及作為一種存活因子參與細(xì)胞凋亡；有研究報(bào)道NGAL與腎缺血，腎毒性損傷以及動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)。在人類腫瘤中如肺腺癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌中可見NGAL高表達(dá)，表明NGAL參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。NGAL蛋白還具有保護(hù)MMP-9的活性而促進(jìn)腫瘤侵襲。然而目前人們主要集中在對(duì)NGAL蛋白功能的研究，關(guān)于NGA基因的上游轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的機(jī)制尚不清楚。Cowland在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞中研究IL-1β對(duì)NGAL的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，曾提出在NGAL基因5′端上游-153～-90區(qū)間可能存在對(duì)基因表達(dá)調(diào)控起關(guān)鍵作用的順式作用元件，然而具體的調(diào)控元件并未報(bào)道。我們?cè)诜伟┘?xì)胞系95D和A549細(xì)胞中獲得了NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人肺癌細(xì)胞NGAL基因5′上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，確定人NGAL基因的啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供含有上述基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的載體。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供含有上述載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明提供的人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，位于NGAL基因5′上游-152～-141和-106～-79的片段，其中NGAL基因的啟動(dòng)子所包含的TATA Box在該元件下游-37的位置。
為了獲得本發(fā)明的NGAL基因的表達(dá)調(diào)控元件，正如在下述實(shí)施所詳細(xì)描述的，對(duì)人NGAL基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行不同方法的缺失，插入到pGL3-Basic載體，得到一系列序列長(zhǎng)度不同的表達(dá)質(zhì)粒，利用螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因，檢測(cè)這些質(zhì)粒在肺癌細(xì)胞系95D和A549細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。為減少細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境所造成的誤差，以表達(dá)海腎熒光素酶的質(zhì)粒pRL-TK作為內(nèi)參照，與上述缺失質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染95D和A549細(xì)胞，測(cè)定螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的酶活性，用二者的比值，即相對(duì)熒光素酶活性表示啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證-152～-141和-106～-79之間為主要轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)段。
對(duì)-152～-79之間的序列分析表明這段序列中有一個(gè)C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)(-150～-137，GTCTTGCCCAATCC)，一個(gè)AP-2結(jié)合位點(diǎn)(-106～-97，TCCGCAGGAG)，一個(gè)SP1結(jié)合位點(diǎn)(-101～-96，AGGAGT)，一個(gè)MRF4結(jié)合位點(diǎn)(-103～-94，GCAGGAGTTG)一個(gè)MyoD結(jié)合位點(diǎn)(-91～-82，GGCAATTGCC)，其中AP-2與SP1和MyoD結(jié)合位點(diǎn)有部分重疊，本發(fā)明針對(duì)C/EBPβ、AP-2、SP1、MRF4和MyoD分別作進(jìn)一步修飾，即刪除或突變C/EBPβ位點(diǎn)、對(duì)另外四個(gè)位點(diǎn)分別進(jìn)行堿基突變，檢測(cè)修飾調(diào)控元件的重組質(zhì)粒的表達(dá)能力，分析上述五個(gè)調(diào)控元件對(duì)NGAL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示，-152～-141和-106～-79是NGAL基因啟動(dòng)子關(guān)鍵調(diào)控序列，C/EBPβ和MRF4、MyoD結(jié)合位點(diǎn)是啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵調(diào)控元件。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明首次鑒定了人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子關(guān)鍵調(diào)控元件，并將5′端序列逐漸缺失和部分調(diào)控元件被修飾的啟動(dòng)子序列插入報(bào)告基因上游構(gòu)建了一系列真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)，確定了人NGAL基因啟動(dòng)子在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵調(diào)控序列。本發(fā)明將有助于從分子水平上探索肺癌的發(fā)病機(jī)制，為肺癌的防治提供新的理論依據(jù)。本發(fā)明對(duì)研究NGAL在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及以NGAL為靶點(diǎn)的臨床治療具有重要意義。


圖1為pB1431質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；圖2為啟動(dòng)子5′端嵌套缺失質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；圖3為pB110、pB106質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；圖4為啟動(dòng)子調(diào)控元件定點(diǎn)修飾質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖；圖5為啟動(dòng)子調(diào)控元件定點(diǎn)修飾質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖；圖6為NGAL啟動(dòng)子區(qū)缺失質(zhì)粒在95D和A549細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性分析；圖7為NGAL啟動(dòng)子調(diào)控元件修飾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性比較；圖8為NGAL啟動(dòng)子調(diào)控元件與核轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析；其中，圖6中，(a)為NGAL 5′側(cè)翼區(qū)(-1431～-59)系列缺失重組質(zhì)粒(在pGL3-Basic載體上)的模式圖；(b)為對(duì)應(yīng)缺失子的相對(duì)熒光素酶活性。
圖7中，(a)為NGAL啟動(dòng)子上C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)修飾質(zhì)粒在pGL3-Basic載體上的模式圖和對(duì)應(yīng)質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶活性；(b)為NGAL啟動(dòng)子上AP-2、SP1、MRF4和MyoD修飾質(zhì)粒在pGL3-Basic載體上的模式圖和對(duì)應(yīng)質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)至少被重復(fù)3次，在此顯示來自3次實(shí)驗(yàn)中有代表性的數(shù)據(jù)，誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差。
圖8中，1泳道為陽(yáng)性對(duì)照，2、3、4泳道為超滯留實(shí)驗(yàn)分析，5-9泳道為競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)分析。(a)和(b)分別為在95D和A549細(xì)胞中分析C/EBPβ調(diào)控元件的DNA-蛋白結(jié)合結(jié)合實(shí)驗(yàn)；(c)和(d)為95D和A549細(xì)胞中NGAL啟動(dòng)子調(diào)控元件與MRF4和MyoD轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 含有NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1、人NGAL基因5’上游片段(-1695～+84)的克隆和序列分析根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上的NGAL基因序列(X99133)，設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增NGAL轉(zhuǎn)錄起始密碼子下游+84到上游不同位點(diǎn)(分別為-1431，-1137，-945，-657，-416，-152)的六對(duì)引物P1～P6和R，所述引物序列如下R5′ATAGATCT+84GAGACCTAGGGGCATGATTT+653′(下劃線為BglII位點(diǎn)，此引物為以下6條引物的公用3’端引物)
P15′TACTCGAG-1431AAAGACAGTAGCAGAGGTGG-14123′(下劃線為XhoI位點(diǎn))P25′TACTCGAG-1137CAAGCAGCACGTAGGCAGAG-11183′(下劃線為XhoI位點(diǎn))P35′TACTCGAG-945GTTGAGATAACTGCTTCCCT-9263′(下劃線為XhoI位點(diǎn))P45′TACTCGAG-657GTCTCTTCCCACTGCACTCA-6383′(下劃線為XhoI位點(diǎn))P55′TACTCGAG-416CAGGAAACAGCACATGATCT-3973′(下劃線為XhoI位點(diǎn))P65′TACTCGAG-152CTGTCTTGCCCAATCCTGAC-1333′(下劃線為XhoI位點(diǎn))應(yīng)用此六對(duì)引物，從人食管癌細(xì)胞SHEEC基因組DNA中經(jīng)PCR擴(kuò)增出與預(yù)期一致的DNA片段?；厥账鶖U(kuò)增的目的片段，XhoI/BglII雙酶切后，與經(jīng)XhoI/BglII雙酶切的載體pGL3-Basic(Promega公司)連接。pGL3-Basic為螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因上游不含啟動(dòng)子的表達(dá)載體。經(jīng)過轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)過酶切鑒定以及最后的測(cè)序結(jié)果證明人NGAL基因不同長(zhǎng)度片段已定向克隆至螢火蟲熒光素酶基因上游，該重組質(zhì)粒分別命名為pB1431，pB1137，pB945，pB657，pB416，pB152。以pB1431為例的整個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1所示。
2、以pB152為基礎(chǔ)的啟動(dòng)子5’端缺失載體的構(gòu)建在缺失分析中，有種經(jīng)典的技術(shù)叫嵌套缺失，控制外切核酸酶III(ExoIII)的消化時(shí)間，使NGAL基因5′調(diào)控區(qū)從5′上游-152處開始逐漸縮短。pB152質(zhì)粒中的SacI酶切位點(diǎn)，其相應(yīng)的內(nèi)切酶作用后可使DNA形成5′突出端，進(jìn)一步被ExoIII外切核酸酶降解；而位于SacI下游的XhoI位點(diǎn)，該內(nèi)切酶位點(diǎn)酶切后形成DNA3′末端突出端，不被ExoIII降解。將pB152用SacI和XhoI依次酶切，用QuickPCR purification kit(QIAGEN)方法回收酶切產(chǎn)物，通過測(cè)量A260對(duì)回收的酶切產(chǎn)物進(jìn)行定量，將一定量的線狀酶切產(chǎn)物用ExoIII特異性切割，取不同反應(yīng)時(shí)間的酶切后產(chǎn)物，用S1核酸酶切除單鏈DNA，Klenow補(bǔ)平末端后，T4 DNA連接酶使片段自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，進(jìn)行抗性篩選及測(cè)序，得到一系列5′端縮短的NGAL啟動(dòng)子真核表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建流程參見圖2。另外一種方式就是直接針對(duì)目的片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)缺失。由于嵌套缺失所得的重組子報(bào)告基因顯示啟動(dòng)子調(diào)控元件存在于-152～-79之間，為了進(jìn)一步確定范圍，設(shè)計(jì)了引物利用PCR方法在-140的基礎(chǔ)上進(jìn)一步缺失，因而構(gòu)建了pB110和pB106真核表達(dá)質(zhì)粒。引物序列如下P75′TACTCGAG-110TGTTTCCGCAGGAGTTGCTG-913′(下劃線為XhoI位點(diǎn))P85′TACTCGAG-106TCCGCAGGAGTTGCTGGC-893′(下劃線為XhoI位點(diǎn))R5′ATAGATCT+84GAGACCTAGGGGCATGATTT+653′(下劃線為BglII位點(diǎn))應(yīng)用此兩對(duì)引物以pB140為模板擴(kuò)增出與預(yù)期長(zhǎng)度一致的DNA片斷，并成功構(gòu)建到pGL3-Basic載體上。質(zhì)粒構(gòu)建流程圖見圖3。
3、啟動(dòng)子調(diào)控元件定點(diǎn)修飾質(zhì)粒的構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示NGAL基因5′調(diào)控區(qū)從-152縮短到-140處以及從-106到-78處時(shí)，啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，提示-152～-141和-106～-79之間為調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵區(qū)域。針對(duì)C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)(-150～-137，GTCTTGCCCAATCC)設(shè)計(jì)一系列突變引物，置換或突變修飾C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)，以進(jìn)一步確定影響NGAL基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵調(diào)控元件。所述突變引物如下pB147m5′TACTCGAGCT-150GTCAACCCGTTTCC-137TGAC3′pB144m5′TACTCGAGCT-150GTCTTGGATGGTCC-137TGAC3′pB141m5′TACTCGAGCT-150GTCTTGCCCGATCC-137TGAC3′pBC/EBP5′TACTCGAGCT-150GTCTTGCGCAATCC-137TGAC3′R5′ATAGATCTGAGACCTAGGGGCATGATTT3′以上寡核苷酸序列分別與R組成四對(duì)引物，以pB152為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)XhoI/BglII雙酶切后，與pGL3-Basic的XhoI/BglII雙酶切回收片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，進(jìn)行抗性篩選及測(cè)序，即得到一系列NGAL基因啟動(dòng)子上定點(diǎn)修飾C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)的真核表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒構(gòu)建流程參見圖4。
另外，針對(duì)-106～-79區(qū)間的AP-2結(jié)合位點(diǎn)(-106～-97，TCCGCAGGAG)，SP1結(jié)合位點(diǎn)(-101～-96，AGGAGT)，MRF4結(jié)合位點(diǎn)(-103～-94，GCAGGAGTTG)，MyoD結(jié)合位點(diǎn)(-91～-82，GGCAATTGCC)設(shè)計(jì)一系列寡核苷酸序列，突變修飾AP-2、SP1、MRF4和MyoD結(jié)合位點(diǎn)，以進(jìn)一步確定在此區(qū)間影響NGAL基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵調(diào)控元件。所述寡核苷酸序列如下105m5′CAGCAA-97CTCCTGCAAA-106AACACTTGGCAAG3′100m5′CAATTGCCAGCA-96ACTAAT101GCGGAAACACTTG3′95m5′GTTTCC-103GCAGGAGTAC-94CTGGCAATTGCC3′85m5′CAGGAATGTGA-82GGTTATTGCC-91AGCAACTC3′應(yīng)用上述寡核苷酸序列，采用Site-Directed MutagenesisSystem對(duì)以上結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變修飾。合成的寡核苷酸序列磷酸化后，以堿變性的pB140為模板進(jìn)行退火雜交，得到的重組子經(jīng)T4 DNA多聚酶和T4 DNA連接酶連接環(huán)化，連接產(chǎn)物首先轉(zhuǎn)化至修復(fù)缺陷菌株BMH71-18muts感受態(tài)細(xì)胞，得到突變的重組質(zhì)粒，然后再轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，進(jìn)行抗性篩選及測(cè)序，即得到一系列NGAL基因啟動(dòng)子上定點(diǎn)修飾AP-2、SP1、MRF4和MyoD結(jié)合位點(diǎn)的真核表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建流程參見圖5。
實(shí)施例2 人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件活性分析A.方法1.細(xì)胞培養(yǎng)肺癌細(xì)胞系95D和A549細(xì)胞在5％CO2和37℃的條件下，在DMEM+HAM F12培養(yǎng)基中(Invitrogen公司)中貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞用0.25％胰酶和0.02％EDTA的細(xì)胞消化液進(jìn)行消化傳代。
2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用Qiagen Plasmid Midi Kit(QIAGEN公司)提取需轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Basic(Promega公司)及內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK(Promega公司)，測(cè)定其含量和純度。取上述表達(dá)螢火蟲熒光素酶的實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒用Buffer EB(10mM Tris·Cl，pH8.5)稀釋至100ng/μl，表達(dá)海腎熒光素酶的內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK用Buffer EB稀釋至20ng/μl。將實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒按50∶1混合，即1μg∶20ng(10μl∶1μl)。
在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將95D和A549細(xì)胞分別接種到96孔板中，每孔100μl，細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.5×105個(gè)/ml，在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞達(dá)50％～60％滿度時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染方法如下在超凈工作臺(tái)中，取7ml玻璃離心管若干支，做好標(biāo)記，加入74μl不含血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，再加入16.5μl上述混合好的相應(yīng)的質(zhì)粒混合液，空白管中加入16.5μlBuffer EB，渦旋5sec，再加入3μl的SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN公司)，渦旋10sec，室溫下放置5～10min。將96孔板做好標(biāo)記，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔，將每孔的培養(yǎng)基棄去，滴加2滴1×PBS(PH值7.4)，吸盡培養(yǎng)基，備用。向靜置5～10min后的玻璃管中加入450μl含血清的DMEM培養(yǎng)基，用加樣器上下吹打混勻，迅速將混合液加入到96孔板中，每孔170μl，于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3h后，棄去培養(yǎng)基，換上150μl新鮮的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48h。
3.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)采用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System進(jìn)行分析，在TD20/20照度計(jì)上進(jìn)行檢測(cè)(Turner Designs公司)。將轉(zhuǎn)染48h后的95D和A549細(xì)胞用1×PBS洗滌一次，去盡殘液，加入20μl新鮮配制的1×PLB，室溫下，搖床上劇烈振蕩15min以裂解細(xì)胞。取15μl上述細(xì)胞裂解液加入含100μl LARII溶液的1.5ml離心管中，混勻，測(cè)定熒火蟲熒光素酶活性，再向同一離心管中加入100μl新鮮配制的1×STOP液，混勻，測(cè)定海腎熒光素酶(內(nèi)參照)活性，計(jì)算出兩種熒光素酶活性比值，即相對(duì)熒光素酶活性。
B.結(jié)果1.NGAL基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域的確定由缺失質(zhì)粒熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果(圖6)表明在人肺癌細(xì)胞中，NGAL基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子上游的1431bp序列具有明顯的轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)啟動(dòng)子從5′端-1431處縮短到-152時(shí)，轉(zhuǎn)錄活性沒有明顯的降低，但當(dāng)片段縮短到-140時(shí)，其熒光素酶活力下降了約70％，然后一直從-106缺失到-78時(shí)，相對(duì)熒光素酶活力降低到pGLB的水平，以上結(jié)果表明在-152～-141和-106～-79之間存在有調(diào)控NGAL基因轉(zhuǎn)錄活性的順式作用元件，而且在這兩種肺癌細(xì)胞系中其表達(dá)調(diào)控機(jī)制是一致的。
2.NGAL基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的初步鑒定針對(duì)NGAL基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)域進(jìn)行的定點(diǎn)修飾質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖7)表明在人肺癌細(xì)胞中，-152～-141區(qū)間的C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生不同堿基的突變或經(jīng)典元件置換時(shí)，pB147m、pB144m和pB141m的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性下降至pB140的水平，而pBC/EBP的熒光素酶活力表現(xiàn)升高，表明C/EBPβ這個(gè)位點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵調(diào)控元件；分別突變-106～-79區(qū)間的AP-2(105m)、SP1(100m)、MRF4(95m)和MyoD(85m)結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在MRF4和MyoD結(jié)合位點(diǎn)突變時(shí)轉(zhuǎn)錄活性下降到pB78的水平。可見NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)-152～-141處的C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)和-106～-79處的MRF4和MyoD結(jié)合位點(diǎn)是NGAL基因轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵調(diào)控元件。
實(shí)施例3 人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)關(guān)鍵調(diào)控元件的證明A.方法1.提取核蛋白①肺癌細(xì)胞系95D和A549細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，待長(zhǎng)成單層后，先用1×PBS洗2次，再用含0.25％胰蛋白酶，0.02％EDTA的細(xì)胞消化液消化細(xì)胞并分別收獲到15ml離心管中。然后1×PBS洗3次，每次均在室溫下250g離心10min，棄上清。②加入5倍體積預(yù)冷的細(xì)胞勻漿緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，冰浴10min后，4℃下250g離心10min。③棄上清，加入3倍體積預(yù)冷的含0.05％NP-40的細(xì)胞勻漿緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，用Dounce勻漿器的緊型槌上下勻漿20次(冰上操作)，4℃下250g離心10min，收集細(xì)胞核。④棄上清，加入1ml細(xì)胞重懸緩沖液重懸細(xì)胞核，并加入70μl預(yù)冷的5mol/LNaCl，使NaCl終濃度為0.3mol/L。⑤4℃下20000g超速離心20min，取上清分裝于0.5ml離心管中，用Bradford法測(cè)其蛋白含量后，-70℃保存。
2.探針標(biāo)記應(yīng)用Roche公司的Dig Gel Shift Kit標(biāo)記下列兩對(duì)寡核苷酸探針。一對(duì)是-152/-1145′CTGTCTTGCCCAATCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC3′5′GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGATTGGGCAAGACAG3′其序列位于NGAL基因5′側(cè)翼區(qū)-152到-114，包含有C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。另外一對(duì)是-112/-745′AGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATTGCCTCACATTC3′5′GAATGTGAGGCAATTGCCAGCAACTCCTGCGGAAACACT3′這段序列位于NGAL基因5′側(cè)翼區(qū)-112到-74，含有MRFs家族的兩個(gè)成員MRF4(-103～-94)和MyoD(-91～-82)結(jié)合位點(diǎn)。
合成的各單鏈寡核苷酸用無菌水溶解至終濃度為40pmol/μl。①在2個(gè)作好標(biāo)記的0.5ml離心管中，加入相應(yīng)的一對(duì)寡核苷酸溶液各5μl，混勻，沸水浴中放置10min，緩慢冷卻至室溫，以使寡核苷酸退火成雙鏈。補(bǔ)加TEN Buffer使其終濃度為4pmol/μl。②再取2個(gè)新的0.5ml離心管作好標(biāo)記，依次加入下列試劑1μl 4pmol/μl的雙鏈寡核苷酸、9μl無菌水、5×Labeling Buffer4μl、CoCl2溶液4μl、Dig-ddUTP溶液1μl和Terminal Transferase1μl?；靹?，37℃溫育15min，然后迅速置于冰上。③在其中加入2μl0.2mol/LEDTA(pH8.0)終止反應(yīng)，再加入3μl無菌水至總體積為25μl。即獲得了0.16pmol/μl的兩種探針-152/-114probe和-112/-74probe。④檢測(cè)探針標(biāo)記效率取若干只0.5ml離心管，對(duì)上述標(biāo)記好的探針用TEN Buffer進(jìn)行10×稀釋，探針濃度范圍是16～0.016fmol/μl。同時(shí)設(shè)定相應(yīng)濃度的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)。然后各取1μl點(diǎn)至尼龍膜上，120℃干燥30min。干燥后的膜用20ml洗滌緩沖液浸濕5min；10ml封閉液中封閉30min；10mlAnti-Dig抗體工作液中孵育30min；10ml洗滌緩沖液洗2次，每次15min；在測(cè)定緩沖液中平衡5min。最后膜與CSPD化學(xué)發(fā)光工作液充分接觸5min后，保鮮膜包好，37℃溫箱中放置10min，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。
3.凝膠滯留和超滯留試驗(yàn)首先制備6％的聚丙烯酰胺凝膠，在預(yù)冷的0.5×TBE電泳緩沖液中4℃，80V預(yù)電泳30min。根據(jù)Roche公司的Dig Gel Shift Kit說明書，①在20μl體積下，核蛋白與標(biāo)記好的探針在含有20mmol Hepes液(pH7.9)、1mmol/L EDTA(pH8.0)、1mmol/L DTT、10mmol/L(NH4)2SO4溶液、0.2％Tween-20(w/v)、30mmol/L KCl溶液、1μg poly-[d(I-C)]和0.1μg多聚賴氨酸中室溫下孵育30min。然后各與5μl的上樣緩沖液混合上樣，4℃，80V電泳100min。②電泳結(jié)束后，將凝膠上的DNA-蛋白復(fù)合物和游離的探針轉(zhuǎn)至尼龍膜上，4℃，400mA轉(zhuǎn)30min。然后，120℃干燥30min。③免疫檢測(cè)干燥后的膜用40ml洗滌緩沖液浸濕5min；40ml封閉液中封閉30min；10mlAnti-Dig抗體工作液中孵育30min；40ml洗滌緩沖液洗2次，每次15min；在測(cè)定緩沖液中平衡5min。最后膜與CSPD化學(xué)發(fā)光工作液充分接觸5min后，保鮮膜包好，37℃溫箱中放置10min，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。超滯留試驗(yàn)分析時(shí)，首先將抗C/EBPα、β、γ抗體以及抗MRF4、MyoD和myogenin抗體(Santa公司)分別與95D和A549細(xì)胞的核蛋白在室溫下孵育20min，最后加入標(biāo)記好的探針再孵育20min，然后上樣電泳。其中，為檢測(cè)所產(chǎn)生滯留帶的特異性，同時(shí)設(shè)定競(jìng)爭(zhēng)性分析實(shí)驗(yàn)，即除了加入標(biāo)記好的探針以外，再加入≥200倍探針濃度的未標(biāo)記雙鏈寡核苷酸。包括與探針完全相同的寡核苷酸和將所包含結(jié)合位點(diǎn)突變之后的寡核苷酸。所述寡核苷酸序列如下-152/-1145′CTGTCTTGCCCAATCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC3′5′GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGATTGGGCAAGACAG3′-147/-140m5′CTGTC-147GACTAGTC-140TCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC3′5′GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGA-140GACTAGTC-147GACAG3′-145/-143m5′CTGTCTT-145TAA-143CAATCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC3′5′GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGATTG-143TTA-145AAGACAG3′-112/-745′AGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATTGCCTCACATTC3′5′GAATGTGAGGCAATTGCCAGCAACTCCTGCGGAAACACT3′-95/-94m5′AGTGTTTCCGCAGGAGT-95AC-94CTGGCAATTGCCTCACATTC3′5′GAATGTGAGGCAATTGCCAG-94GT-95ACTCCTGCGGAAACACT3′-84m5′AGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATTT-84CCC-81CACATTC3′5′GAATGTGG-81GGA-84AATTGCCAGCAACTCCTGCGGAAACACT3′B.結(jié)果1.C/EBPβ調(diào)控元件的確定由凝膠滯留的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖8a、b)表明在人肺癌細(xì)胞中，當(dāng)含有C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)的NGAL基因DNA片斷(-152～-114)與95D和A549細(xì)胞的核蛋白孵育時(shí)，能夠形成明顯的滯留帶。通過競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)分析，表明此滯留帶為特異的。而當(dāng)C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)的部分堿基突變之后，結(jié)合蛋白的能力降低。再由超滯留實(shí)驗(yàn)分析，抗C/EBPβ抗體的加入能夠阻止滯留帶的產(chǎn)生，與DNA、核蛋白形成三元復(fù)合物而出現(xiàn)超滯留帶。因此表明C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)是NGAL基因的關(guān)鍵調(diào)控元件。
2.MRF4和MyoD調(diào)控元件的確定由凝膠滯留的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖8c、d)表明在人肺癌細(xì)胞中，當(dāng)含有MRF4和MyoD結(jié)合位點(diǎn)的NGAL基因DNA片斷(-112～-74)與95D和A549細(xì)胞的核蛋白孵育時(shí)，同樣也能夠形成明顯的滯留帶。通過競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)分析，表明此滯留帶為特異的。當(dāng)MRF4和MyoD結(jié)合位點(diǎn)的部分堿基突變之后，其結(jié)合蛋白的能力降低。在超滯留實(shí)驗(yàn)分析時(shí)，當(dāng)加入抗MRF4和MyoD抗體，滯留帶消失，抗體與DNA、核蛋白形成三元復(fù)合物而出現(xiàn)超滯留帶?？梢奙RF4和MyoD結(jié)合位點(diǎn)也是NGAL基因的關(guān)鍵調(diào)控元件。
人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列表SEQUENCE LISTING<110>汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院<120>人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件<130>
<160>1<170>Patent In version 3.2<210>1<211>74<212>DNA<213>人肺癌細(xì)胞(HUMAN LUNG CANCER CELLS)<400>1-152 CTGTCTTGCC CAATCCTGAC CAGGTGCAGA AATCTTGCCA AGTGTTTCCG-102 CAGGAGTTGC TGGCAATTGC CTCA<210>2<211>
<212>DNA<213>引物<400>2P15’-TACTCGAGAAAGACAGTAGCAGAGGTGG-3’P25’-TACTCGAGCAAGCAGCACGTAGGCAGAG-3’P35’-TACTCGAGGTTGAGATAACTGCTTCCCT-3’P45’-TACTCGAGGTCTCTTCCCACTGCACTCA-3’P55’-TACTCGAGCAGGAAACAGCACATGATCT-3’P65’-TACTCGAGCTGTCTTGCCCAATCCTGAC-3’R 5’-ATAGATCTGAGACCTAGGGGCATGATTT-3’<210>3<211>
<212>DNA<213>引物<400>3P75’-TACTCGAGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTG-3’p85’-TACTCGAGTCCGCAGGAGTTGCTGGC-3’R 5’-ATAGATCTGAGACCTAGGGGCATGATTT-3’<210>4<211>
<212>DNA<213>引物<400>4pB147m5’-TACTCGAGCTGTCAACCCGTTTCCTGAC-3’pB144m5’-TACTCGAGCTGTCTTGGATGGTCCTGAC-3’pB141m5’-TACTCGAGCTGTCTTGCCCGATCCTGAC-3’pBC/EBP5’-TACTCGAGCTGTCTTGCGCAATCCTGAC-3’R5’-ATAGATCTGAGACCTAGGGGCATGATTT-3’<210>5<211>
<212>DNA<213>引物<400>5105m5’-CAGCAACTCCTGCAAAAACACTTGGCAAG-3’100m5’-CAATTGCCAGCAACTAATGCGGAAACACTTG-3’95m 5’-GTTTCCGCAGGAGTACCTGGCAATTGCC-3’85m 5’-CAGGAATGTGAGGTTATTGCCAGCAACTC-3’<210>6<211>
<212>DNA
人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列表<213>探針<400>6152/-114 5’-CTGTCTTGCCCAATCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC-3’5’-GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGATTGGGCAAGACAG-3’-147/-140m5’-CTGTCGACTAGTCTCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC-3’5’-GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGAGACTAGTCGACAG-3’-145/-143m5’-CTGTCTTTAACAATCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC-3’5’-GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGATTGTTAAAGACAG-3’-112/-74 5’-AGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATTGCCTCACATTC-3’5’-GAATGTGAGGCAATTGCCAGCAACTCCTGCGGAAACACT-3’-95/-94m 5’-AGTGTTTCCGCAGGAGTACCTGGCAATTGCCTCACATTC-3’5’-GAATGTGAGGCAATTGCCAGGTACTCCTGCGGAAACACT-3’-84m 5’-AGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATTTCCCCACATTC 3’5’-GAATGTGGGGAAATTGCCAGCAACTCCTGCGGAAACACT 3’
權(quán)利要求
1.一種人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其核苷酸序列選自下組(1)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，(2)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，或(3)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中發(fā)生一處或多處缺失突變或替換突變的功能等價(jià)物。
2.如權(quán)利要求1所述的人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其特征在于含有至少一個(gè)控制NGAL基因表達(dá)的調(diào)控元件。
3.如權(quán)利要求2所述的人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其特征在于所述調(diào)控元件含有SEQ ID NO1中的核苷酸-152～-141。
4.如權(quán)利要求2所述的人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其特征在于所述調(diào)控元件含有SEQ ID NO1中的核苷酸-106～-79。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
6.如權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，它還含有所述的啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可操作地連接的外源基因。
7.如權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，所述外源基因是報(bào)告基因。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因表達(dá)調(diào)控，公開了一種人肺癌細(xì)胞的NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本發(fā)明首次鑒定了人肺癌細(xì)胞NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)，并將5′端序列逐漸缺失和部分調(diào)控元件被修飾的啟動(dòng)子序列插入報(bào)告基因上游構(gòu)建了一系列真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)，確定了人NGAL基因啟動(dòng)子在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵調(diào)控元件。本發(fā)明對(duì)研究NGAL在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及以NGAL為靶點(diǎn)的臨床治療具有重要意義。將有助于從分子水平上探索包括肺癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)病機(jī)制，為腫瘤的防治提供新的理論依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1974768SQ20061012299
公開日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者李恩民, 常靜霞, 許麗艷, 袁華敏, 王子良 申請(qǐng)人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院