專利名稱：一種制備葡激酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備葡激酶(Staphylokinase，SAK)的方法，具體地說是涉及一種葡激酶的表達(dá)及純化方法，屬于生物工程制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡激酶是金葡菌溶源性噬菌體合成的一種胞外蛋白質(zhì)(de Waart.J.，K.C.Winkler and C.Grootsen Nature 1962，195407～408 Winkler K.C.，deWaart.J.，and C.Grootsen J.Gen.Microbiol.1965，39321～333 Kondo.I.，Kiyotaka F.，Infection and Immunity)1977，18266～272)。自1983年Sako(Sako.T，Tsuchida.N Nucleic Acids Res.1983，117679～7693)、1987年BehnkeD(Behnke D.，Gerlach D.Mol.Gen.Genet.1987，210528～534)、1992年CollenD(Collen D.，Z.A.Zhao，P.Holvoet etal.Fibnolysis 1992，6226～231)等成功將葡激酶基因在大腸桿菌或枯草桿菌中表達(dá)以后，科學(xué)家們對葡激酶的溶栓機(jī)理進(jìn)行了深入研究。隨著動物實驗的增多，葡激酶的臨床前研究工作進(jìn)展迅速，其在血栓性疾病臨床溶栓治療應(yīng)用的前景非常廣闊。
目前公開的葡激酶生產(chǎn)制備的方法主要有一、國外文獻(xiàn)中報道的方法1、采用CM-cellulose柱層析方法氯化鈉連續(xù)梯度洗脫一步純化(Sako TOverproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization.FEBS.1985，149(3)557-63)，SDS-PAGE純度在90％左右，內(nèi)毒素未測定。
2、采用離子交換層析和分子篩方法純化(Gerlach D，Kraft R，Behnke DPurification and characterization of the bacterial plasminogen activatorstaphylokinase secreted by a recombinant Bacillus subtilis.Zentralb BakteriolMikrobiol Hyg[A].1988，269(3)314-22.)，SDS-PAGE純度在90％左右，內(nèi)毒素未測定。
3、采用SP-Sepharose和Phenyl-Sepharose層析兩步純化方法(Schlott B，Hartmann M，Guhrs KH，etal.Biotechnology 1994，12(2)185-9.)，SDS-PAGE純度在95％以上，內(nèi)毒素小于10 Eu/mg。
4、采用金屬離子柱方法一步純化(N端缺失10個氨基酸)(ChattopadhyayD，Stewart JE，DeLucas LJ.Large-scale preparation of the delta1O form ofstaphylokinase by in vitro processing of recombinant staphylokinase with purifiedhuman plasminogen.Appl Biochem Biotechnol.1998，69(3)147-56.)。
二、國內(nèi)文獻(xiàn)報道的主要純化方法1、CN1096325A，菌體破菌用S-Sepharose離子交換，再結(jié)合分子篩方法純化。
2、CN1307129A，主要使用了兩步柱層析(SP-Sepharose F.F，和Phenyl-Sepharose F.F)純化。
3、CN1394952A，菌體破菌后用50KD超濾膜除雜蛋白，加入NaCL，直接在Phenyl-Sepharose H.P疏水層析柱上經(jīng)梯度純化。所純化的葡激酶為N-端缺失10個氨基酸的衍生物，其純度可達(dá)95％以上(電泳純)。
4、CN1511952A，菌體破菌用100KD超濾膜除雜蛋白，濾出液上pH8.0 PB直接在Q-Sepharose F.F柱上經(jīng)0.25M NaCL洗脫純化，所純化的葡激酶為N-端缺失15個氨基酸的衍生物。其電泳純度和HPLC純度均可達(dá)98％以上5、CN1446912A，使用了陰離子交換層析(Q-Sepharose F.F)穿濾、陽離子交換層析(SP-Sepharose F.F)、凝膠過濾層析(Sephacryl S-200)三步連用，純化重組葡激酶，結(jié)果為最終洗脫液電泳檢測無雜條帶。
6、將6聚組氨酸序列結(jié)合在葡激酶C端融合表達(dá)，使用金屬鎳離子柱純化融合表達(dá)的蛋白，該方法未除去融合序列(吳櫻，黃鶴，周加文，甘一如利用pET-29b載體進(jìn)行葡激酶基因表達(dá)與其產(chǎn)物的親和純化 吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2004，30(6)865-867)。所得到的產(chǎn)物為葡激酶融合蛋白(所加上的6聚組氨酸不易去除)，不同于天然的葡激酶。
在專利申請?zhí)枮?00510022492.5的專利申請中，發(fā)明人也公開了一種葡激酶的制備方法，該方法是以制備葡激酶和除去其中的熱原為目的，需要經(jīng)過多次離子交換層析和多次超濾后得到最終產(chǎn)品。
在制備重組葡激酶過程中，由于破菌后上清體積偏大，需要反復(fù)使用超濾濃縮，在生產(chǎn)過程中，成本高，生產(chǎn)周期長；雖然在吳櫻、黃鶴、周加文等的方法中，將6聚組氨酸序列結(jié)合在葡激酶C端融合表達(dá)，使用金屬鎳離子柱純化融合表達(dá)的蛋白，可以克服反復(fù)使用超濾濃縮的缺陷，但是，融合的6聚組氨酸卻很難去掉，所得到的產(chǎn)物為葡激酶融合蛋白，不同于天然的葡激酶，現(xiàn)有已發(fā)表的文獻(xiàn)不能為其所用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備葡激酶(Staphylokinase)的方法，具體說包括葡激酶的表達(dá)及純化方法。
本發(fā)明制備葡激酶的方法，包括以下步驟a、通過基因工程方法，得到包含具有如SEQ NO.2的氨基酸序列的可溶性融合蛋白的發(fā)酵產(chǎn)物；b、分離純化步驟a得到的融合蛋白先用金屬鎳離子親和凝膠柱吸附，并用洗脫液洗脫，得到洗脫產(chǎn)物，即具有如SEQ NO.2的氨基酸序列的可溶性融合蛋白；c、將步驟b融合蛋白用腸激酶酶切后適當(dāng)稀釋，過b步驟所述的凝膠柱，收集穿透液；d、將步驟c穿透液經(jīng)超濾濃縮后，過Q凝膠柱得葡激酶原液。
所述融合蛋白中，葡激酶氨基酸序列緊緊置于腸激酶識別位點(diǎn)-DDDDK-之后。融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切處理之后，經(jīng)進(jìn)一步純化得到表達(dá)的葡激酶。
進(jìn)一步地，制備步驟a所述的可溶性融合蛋白的方法包括a)用PCR方法得到如SEQ NO.1的基因序列；b)構(gòu)建含有SEQ NO.1的基因序列的重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，得到發(fā)酵菌種；c)將發(fā)酵菌種接種于含氨芐青霉素100μg/ml的400mlLB培養(yǎng)基中，在250rpm搖床上，30°C下培養(yǎng)至A6002.0左右，再接種到3600ml LB培養(yǎng)基中同前培養(yǎng)至A6003.0左右作為種子液接種于裝有36L的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的B.Braun D50發(fā)酵罐中，控制pH在7.0左右、溶氧在15～75％、溫度37℃培養(yǎng)至A60015.0左右，加入IPTG至0.5mM誘導(dǎo)，同前培養(yǎng)3～4小時，在5～15℃、5000rpm條件下離心收集細(xì)菌，將其用磷酸緩沖液稀釋后，破碎離心得含可溶性融合蛋白的上清液，調(diào)pH6.0～8.0，備用。
更具體地，在a)步驟中以葡激酶基因為模板，引物1、2為作PCR擴(kuò)增引物15’-AAAGGTACCGACGACGACGACAAGTCAAGTTCATTCGACAAAGGA-3’引物25’-AAAGAGCTCTCATTATTTCTTTTCTATAACAACCTT-3’，得到如SEQ NO.1的基因序列；引物1包含KpnI位點(diǎn)，引物2包含SacI位點(diǎn)。
b)將SEQ NO.1的基因序列經(jīng)KpnI和SacI酶切后插入pET(32a)的KpnI/SacI位點(diǎn)構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，得到發(fā)酵菌種；優(yōu)選的，步驟b或步驟c所述的金屬離子親和凝膠柱為Ni2+Chelating-Sepharose Fast Flow凝膠柱，流動相為pH6.0～8.0的10mM磷酸緩沖液，并用10～30mmol/L咪唑洗脫。
更優(yōu)選的，步驟b的流動相為pH為7.0的10mM磷酸緩沖液，咪唑洗脫濃度為20mmol/L進(jìn)一步地，步驟c中，先將步驟b產(chǎn)物稀釋2～10倍后按每10mg融合蛋白加入1～5個單位的腸激酶，15～37℃下酶切10～24小時；更進(jìn)一步，腸激酶加入量為每10mg融合蛋白加入2單位腸激酶。
優(yōu)選地，步驟d所述的Q凝膠柱為Q-Sepharose Fast Flow柱，流動相為pH7.0含0.15mmol/L NaCL的20mM磷酸緩沖液；所述超濾濃縮的超濾膜的截留分子量為5000道爾頓。
上述b、c、d各步驟中流動相的流速為5～40ml/min；各種凝膠柱中的層析介質(zhì)的粒徑為50～150μm。
優(yōu)選的，所述的各種凝膠柱中的層析介質(zhì)的粒徑為70～120μm。
更優(yōu)選的，所述的各種凝膠柱中的層析介質(zhì)的粒徑為90μm。
本發(fā)明中所使用的層析柱均為在市場上銷售的常規(guī)層析柱，使用的各種層析柱填料也是蛋白質(zhì)純化制備領(lǐng)域中常用的填料，均按常規(guī)方法裝柱或購買預(yù)裝柱。在本發(fā)明方法中自步驟b始所使用的溶液均為無熱原溶液，所使用的儀器設(shè)備也要經(jīng)過無熱原處理和檢驗，以確保不會在制備過程中產(chǎn)生新的熱原物質(zhì)。本發(fā)明方法緩沖液的流速是常規(guī)流速，可以做適當(dāng)調(diào)整。本方法各步驟持續(xù)的時間可以根據(jù)層析柱體積，緩沖液流速，上樣量等具體情況按常識進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
本發(fā)明葡激酶與藥物中可以接受的相應(yīng)藥用輔料或載體等輔助添加成分組合，并按相應(yīng)的相應(yīng)制藥方法加工，可制成為相應(yīng)的劑型的藥物制劑。例如，與注射藥物中允許使用的適當(dāng)溶劑和/或附加劑配合并按相應(yīng)的工藝操作處理后，即可以制備成相應(yīng)的水針、粉針或凍干制劑等肌肉或靜脈形式的注射制劑藥物。與藥學(xué)上可以被接受的崩解劑、賦形劑、潤滑劑、粘合劑、填充劑等常用的輔助添加成份混合后，按相應(yīng)的常規(guī)工藝方法處理，即可制成為片劑、丸劑、膠囊劑或適當(dāng)形式的緩釋劑、控釋劑等固體制劑形式的口服制劑；與常用的增溶劑、乳化劑、潤濕劑、起泡或消泡劑等表面活性劑、稀釋劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、矯味劑、增稠劑等混合，按相應(yīng)的常規(guī)工藝方法處理，即可制成為水劑、糖漿等液體制劑形式的口服藥物或口含制劑。
本發(fā)明方法中制備得到的葡激酶能按下述步驟制備成凍干制劑。按葡激酶蛋白量的1.5～3.0倍加入15％～30％注射用人白蛋白(或用5％甘露醇)用作穩(wěn)定和賦形劑，并用無熱原0.15M NaCL pH7.0 20mM磷酸緩沖液定容，配制成5mg/ml的r-Sak蛋白液，用無熱原0.22μm膜過濾后即得半成品，檢測內(nèi)毒素含量符合藥用要求后，在100級潔凈度下，1ml/瓶分裝，冷凍干燥，包裝即得成品。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明能夠克服現(xiàn)有方法在制備過程中破菌后體積過大的不足，直接使用親和層析方法純化出目標(biāo)融合蛋白，通過酶切除去聯(lián)結(jié)在葡激酶分子N端的融合蛋白片段，再次通過親和層析得到穿濾的葡激酶。純化步驟的簡便并易于放大，所純化的重組葡激酶純度能夠完全符合藥用要求。
本發(fā)明改變葡激酶表達(dá)方式并對純化方法進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合發(fā)明人在200510022492.5專利申請中公開的熱原高效去除方法，葡激酶純度超過99％、活性強(qiáng)、熱原質(zhì)低，超過了《中國藥典》2005版第三部對同類產(chǎn)品的要求。該方法材料設(shè)備易得，成本低廉，步驟簡便、可靠，并能夠大規(guī)模應(yīng)用。


圖1工程菌目的融合蛋白的表達(dá)；圖2重組融合蛋白的提取、酶切及葡激酶的純化。
下面結(jié)合附圖，通過對本發(fā)明較佳實施方式的詳細(xì)描述對本發(fā)明進(jìn)行說明。但這種說明不應(yīng)理解為是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的技術(shù)思想，均屬于本發(fā)明權(quán)利要求所定義的范圍。
具體實施例方式
實施例一工程菌的構(gòu)建及融合蛋白表達(dá)以專利申請
發(fā)明者吳洽慶, 楊衛(wèi)華, 李德華, 梁波, 茍興華, 黎耘, 劉忠榮, 及元喬, 李伯剛 申請人:成都地奧九泓制藥廠