專利名稱：一種牛乳鐵蛋白工程菌及抗菌肽牛乳鐵蛋白素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種牛乳鐵蛋白工程菌，同時還涉及牛乳鐵蛋白工程菌制備抗菌肽牛乳蛋白素的方法，該抗菌肽廣泛應(yīng)用于動物飼料中。
背景技術(shù)：
Horoaki等(1991年)在研究脫鐵牛乳鐵蛋白(lactoferrin，LfB)的熱穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下LfB明顯發(fā)生了降解，然而其抗菌活性反而有所增加，于是推測Lf中存在耐熱的抗菌活性多肽，酸性條件下其活性穩(wěn)定，但中性或堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。Tomita等(1991年)研究了LfB的蛋白酶水解物的抗菌效果，結(jié)果表明，豬胰蛋白酶水解得到的小分子多肽具有較強的抗菌作用，其抗菌活性是未降解前的20倍以上。此后，Bellamy等(1992年)分離到乳鐵蛋白N-端附近的一條多肽，具有比Lf強400多倍的抗菌活性，取名為牛乳鐵蛋白素(BLactoferricin，LfcinB)，乳鐵蛋白的另一個活性中心為Ampin。由于從天然牛乳中分離牛乳鐵蛋白素造價高，無法實現(xiàn)其商業(yè)化生產(chǎn)，而目前利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)牛乳鐵蛋白素的根本制約因素是表達產(chǎn)物對宿主自殺作用強，表達水平低。有研究報道photorhabdus luminescensin基因CipA和CipB所編碼的晶體蛋白占總細(xì)胞蛋白的40％(Bowen和Ensign，2001)，同時photorhabdus luminescensin易裂解，CipA和CipB所編碼的晶體蛋白在pH 5-11下不溶解，但在pH 2-3下溶解，因此利用此性更易分離純化。因此本研究設(shè)想通過兩個牛乳鐵蛋白活性中心LfcinB及Ampin和CipB融合表達來解決LfcinB對宿主自殺作用這一難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種牛乳鐵蛋白工程菌，該工程菌易裂解，生產(chǎn)的新型抗菌肽牛乳鐵蛋白素不僅表達量高，具有高效、廣譜抗菌、抗病毒、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等生物學(xué)活性。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種牛乳鐵蛋白工程菌制備抗菌肽牛乳鐵蛋白素的方法，方法易行，操作簡便，高效表達，成本低廉，該抗菌肽牛乳鐵蛋白素具有高效廣譜抗菌活性。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種牛乳鐵蛋白工程菌的制備方法如下所需材料為野生型photorhabdus luminescens subsp.akhurstii購自德國生物材料資源中心(即the German Resource Centre for Biological Material，DSMZwww.dsmz.de)。TOPO TA克隆試劑盒購自Invitrogen公司(www.invitrogen.com)。Red/ET試劑盒、pBAD24、Gentamycin和Apramycin抗性基因模板由德國gene brigdes公司(www.genebrigdes.com)提供。
photorhabdus luminescens subsp.Akhurstii和大腸桿菌GB2005培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其組成成分為酵母提取物5g；蛋白胨10g；NaCl 5g；加水900ml，用1M NaOH將pH值調(diào)為7.0，定容至1L。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉使其終濃度為1.5％。
(L+)阿拉伯糖，Ampcillin購于Sigma公司。
具體操作步驟A、利用Red/ET同源重組技術(shù)來修飾野生型photorhabdus luminescens subsp.akhurstii晶體蛋白基因CipA和CipB，得到photorhabdus luminescens subsp.akhurstii突變株，命名為photorhabdus luminescens TZR其詳細(xì)過程為以photorhabdusluminescens subsp.akhurstii基因組DNA為模板，以GGA TCC ACA CAT ACAACA TCT CAT TTG C和CAG CTG GAT CCT GTT GCA TAA CCT GAGGAT GGC為引物，通過PCR擴增獲得CipA基因；以photorhabdus luminescens subsp.akhurstii基因組DNA為模板，以GAA TTC TAT TAT AAT AGA TGA ATGGGA TG和AAT TCT AAC AAC TGT ATT AAT TGC GAC引物，通過PCR擴增獲得CipB基因。采用TOPO TA克隆試劑盒進行質(zhì)粒構(gòu)建按TOPO TA克隆試劑盒說明書進行得到質(zhì)粒pTA-CipA和pTOPO-CipB。采用Red/ET同源重組方法分別將Gentamycin和Apramycin抗性基因替換photorhabdus luminescens subsp.akhurstii的CipA和CipB中部分序列而得到質(zhì)粒pTA-GentaInCipA和pTA-CipB-Apra。用BamHI對pTA-GentaInCipA進行酶切得到GentaInCipA，采用電穿孔法(1200V/cm)將酶切產(chǎn)物CipA-Genta轉(zhuǎn)化入photorhabdus luminescens subsp.akhursti+pASK-αβγA中，通過篩選得到敲除CipA基因photorhabdus luminescenssubsp.akhurstii突變株+pASK-αβγA。用EcoRI對pTA-ApraIncipB進行酶切得到ApraInCipB，采用電穿孔法(1200V/cm)將酶切產(chǎn)物CipA-Genta轉(zhuǎn)化入photorhabdus luminescens subsp.akhursti+pASK-αβγA中，通過篩選得到敲除CipA和CipB基因photorhabdus luminescens subsp.akhurstii TZR+pASK-αβγA，42℃熱激去除質(zhì)粒pASK-αβγA。通過篩選得到敲除CipA和CipB基因photorhabdusluminescens subsp.akhurstii TZR，應(yīng)用克隆PCR及SDS-PAGE電泳進行鑒定。(全過程見附圖1)B、利用Red/ET同源重組技術(shù)構(gòu)建表達質(zhì)粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin，構(gòu)建質(zhì)粒的詳細(xì)過程為以photorhabdus luminescens subsp.Akhurstii基因組為模板，通過三次PCR擴增將牛乳鐵蛋白素基因BLfcin和Ampin引入，最終得到帶同源臂的PCR產(chǎn)物CipB-BLfcin-Ampin，利用Red/ET同源重組技術(shù)，以pBAD24為載體，構(gòu)建表達質(zhì)粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin，經(jīng)限制性酶切鑒定及測序結(jié)果可知所構(gòu)建質(zhì)粒正確無誤。(全過程見附圖2)C、采用電穿孔法(1200V/cm)將表達pBAD-CipB-BLfcin-Ampin轉(zhuǎn)化入photorhabdus luminescens TZR中，通過篩選得到牛乳鐵蛋白工程菌。該菌株已保藏，保藏編號CCTCC NOM206132。
一種牛乳鐵蛋白工程菌制備抗菌肽牛乳鐵蛋白素的方法，其步驟是A、材料與溶液配制所用工程菌為本發(fā)明所提供工程菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD-CipB-BLfcin-Ampin。
工程菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其組成成分為酵母提取物5g；蛋白胨10g；NaCl 5g；加水900ml，用1M NaOH將pH值調(diào)為7.0，定容至1L。(固體培養(yǎng)基加入1.5％終濃度的瓊脂粉)。溶液I100mM Tris-Cl(pH 8.0)，150mM NaCl，1mM EDTA。溶液II0.5M的醋酸鈉溶液。溶液III0.5M的醋酸溶液。
(L+)阿拉伯糖，Ampcillin，胰蛋白酶購于Sigma公司。
B、重組抗菌肽牛乳鐵蛋白素的制備方法1)在含有100ug/mlAmpcillin的LB平板上復(fù)蘇工程菌photorhabdus luminescensTZR+表達質(zhì)粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin；2)從復(fù)蘇平板上挑單克隆于含有100ug/mlAmpcillin的LB培養(yǎng)基中，30℃振搖(240rmp/min)過夜(約12h)；3)將1體積過夜培養(yǎng)菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD-CipB-BLfcin-Ampin，接種于50體積含有100μg/ml Ampcillin的LB培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)6h(OD約為1-1.5)；4)加10％(L+)阿拉伯糖至終濃度為0.2％，30℃誘導(dǎo)18h；5)4000rmp(4℃)離心10min，收集細(xì)胞；6)用溶液I重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新離心管中；7)4000rmp(4℃)，10min離心收集細(xì)胞，棄上清，可馬上進行下一步細(xì)胞裂解實驗或保存于-80℃?zhèn)溆茫?)加無菌雙蒸水反復(fù)凍溶(3-6次)裂解細(xì)胞；9)加等體積溶液II(pH值為7.0)于離心管中，6000rmp(4℃)，10min離心，棄上清，加等體積溶液III(pH值為3.0)于離心管中，6000rmp(4℃)，10min離心，收集上清(約占總菌體蛋白20％)。(利用CipB所編碼的晶體蛋白在pHpH5-11下不溶解，但在pH 2-3下溶解的特性分離CipB融合乳鐵蛋白素)；10)加胰蛋白酶酶解CipB融合牛乳鐵蛋白素，釋放純牛乳鐵蛋白素(約占總菌體蛋白5％)，便得到一種抗菌肽牛乳鐵蛋白素。
本基因工程技術(shù)生產(chǎn)新型抗菌肽牛乳鐵蛋白素解決了牛乳鐵蛋白素對宿主菌自殺作用強這一難點，所生產(chǎn)的新型抗菌肽牛乳鐵蛋白素不僅表達量高，具有高效、廣譜抗菌、抗病毒、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等生物學(xué)活性，而且同現(xiàn)有其它基因工程技術(shù)生產(chǎn)新型抗菌肽牛乳鐵蛋白素相比具備以下特點1、使用本表達系統(tǒng)生產(chǎn)新型抗菌肽牛乳鐵蛋白素可克服牛乳鐵蛋白素對宿主菌的自殺性，其原因是本表達系統(tǒng)應(yīng)用photorhabdus luminescens subsp.akhurstii晶體蛋白CipB作為融合蛋白；2、利用Red/ET同源重組技術(shù)敲除photorhabdus luminescens subsp.akhurstii基因CipA和CipB作為宿主菌，該宿主菌具有易裂解的特點；3、CipB是photorhabdus luminescens subsp.akhurstii中的一種表達量極高的晶體蛋白(達菌體蛋白表達量的40％)，分子量小(11.3kDa)，以CipB作為乳鐵蛋白素融合表達蛋白解決了牛乳鐵蛋白素對宿主菌自殺作用強這一難點，進而實現(xiàn)了牛乳鐵蛋白素的高效表達(20％)；4、與從天然牛乳中獲得牛乳鐵蛋白素的成本相比，本基因工程技術(shù)生產(chǎn)新型抗菌肽牛乳鐵蛋白素更廉價。
保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編430072，保藏日期2006年11月27日，保藏編號CCTCC NOM206132，分類命名發(fā)光桿菌TZR photorhabdus luminescens TZR。


圖1為獲得photorhabdus luminescens TZR全過程示意2為牛乳鐵蛋白素表達質(zhì)粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin構(gòu)建全過程示意圖其中P1

P2

P3

P4

具體實施方式
突變株photorhabdus luminescens TZR的制備及牛乳鐵蛋白素表達質(zhì)粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin的構(gòu)建1材料1.1菌種和載體菌種及載體基因型和來源見表1。
表1 菌種及載體基因型和來源


注Apr，ampicillin resistance；Aprar，Apramycin resistance；Gentar，Gentamycinresistance.
1.2工具酶RNaseA、ProteinaseK、限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司。Taqpolymerase購自Eppendorf公司。
1.3試劑盒PCR純化試劑盒購自Inviteck公司，小量、中量及大量提取質(zhì)粒試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。PCR2.1TOPO TA克隆試劑盒購自Invitrogen公司(www.invitrogen.com)。Red/ET試劑盒由德國gene brigdes公司(www.genebrigdes.com)提供。
1.4大腸桿菌GB2005(德國gene brigdes公司提供)及發(fā)光桿菌photorhabdusluminescens subsp.akhurstii培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基酵母提取物5g；蛋白胨10g；NaCl 5g；加水定容至1L。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中加入終濃度為1.5％的瓊脂粉。
(一)根據(jù)附圖1操作流程所示，制備突變株photorhabdus luminescens TZR的具體實施方法如下A、CipA和CipB基因的獲得以photorhabdus luminescens subsp.akhurstii基因組DNA為模板，以GGA TCCACA CAT ACA ACA TCT CAT TTG C和CAG CTG GAT CCT GTT GCATAA CCT GAG GAT GGC為引物，按50μl反應(yīng)體系(ddH2O38μl；dNTP(5mM)2.0μl；10*Taq buffer5.0μl；Oligo up(50pmol/l)1.5μl；0ligo down(50pmol/l)1.5μl；模板(100ng)1.0μl；Taq polymarase1.0μl。)及反應(yīng)程序(預(yù)變性95℃，3min；32個循環(huán)(變性95℃，40sec；退火50℃，40sec；延伸72℃，2min50sec)；最后延伸72℃，10min)進行PCR擴增獲得CipA基因。以photorhabdus luminescens subsp.akhurstii基因組DNA為模板，以GAA TTCTAT TAT AAT AGA TGA ATG GGA TG和AAT TCT AAC AAC TGT AT TAAT TGC GAC引物，按50μl反應(yīng)體系(ddH2O38μl；dNTP(5mM)2.0μl；10*Taqbuffer5.0μl；Oligo up(50pmol/l)1.5μl；Oligo down(50pmol/l)1.5μl；模板(100ng)1.0μl；Taq polymarase1.0μl。)及反應(yīng)程序(預(yù)變性95℃，3min；32個循環(huán)(變性95℃，45sec；退火50℃，40sec；延伸72℃，1min50sec)；最后延伸72℃，10min℃)進行PCR擴增獲得以CipB基因。
B、用于修飾CipA和CipB基因的質(zhì)粒構(gòu)建1)質(zhì)粒pTA-CipA和pTA-CipB的構(gòu)建采用PCR純化試劑盒按操作說明對CipA和CipB基因PCR產(chǎn)物進行純化，按TOPO TA克隆試劑盒說明書進行操作，獲得質(zhì)粒pTA-CipA和pTA-CipB。
2)GentaInCipA和ApraInCipB基因的獲得以pYZP-Genta為模板，以CTTATTTATC AATTAATTAC ATTATATTTT GGAGTTTACATTGAA TTC TGA AGG CAC GAA CCC AGT TGA C和TAAGGAATTA GGTGGAGCTA TTTAACAATTTATGACTTTATC GAA TTC GGC TTG AAC GAA TTG TTA GG(其中帶下劃線堿基為同源臂，其余堿基為引物)為引物，按50μl反應(yīng)體系(ddH2O38μl；dNTP(5mM)2.0μl；10*Taq buffer5.0μl；Oligo up(50pmol/l)1.5μl；Oligo down(50pmol/l)1.5μl；模板(100ng)1.0μl；Taq polymarase，1.0μl。)及反應(yīng)程序(預(yù)變性95℃，3min；32個循環(huán)(變性95℃，40sec；退火50℃，40sec；延伸72℃，2min50sec)；最后延伸72℃，10min)進行PCR擴增獲得帶同源臂的Gentamycin基因。以pR6k-Apra為模板，以TATTTATCAA TCGGTTAGAT TAAATTTTGGAGTTTATGTC GGATCCGGT TCA TGT GCA GCT CCA TCA G(其中帶下劃線堿基為同源臂，其余堿基為引物)和TATTTTAATT CACGCACCCA TTTAGAAATT TAACAAATACTTCGGATCCTCA GCC AAT CGA CTG GCG AGC(其中帶下劃線堿基為同源臂，其余堿基為引物)為引物，按50μl反應(yīng)體系(ddH2O38μl；dNTP(5mM)2.0μl；10*Taqbuffer5.0μl；Oligo up(50pmol/l)1.5μl；Oligo down(50pmol/l)1.5μl；模板(100ng)1.0μl；Taq polymarase1.0μl。)及反應(yīng)程序(預(yù)變性95℃，3min；32個循環(huán)(變性95℃，45sec；退火50℃，40sec；延伸72℃，1min50sec)；最后延伸72℃，10min。)進行PCR擴增獲得帶同源臂的Apramycin基因。
3)pTA-GentaInCipA和pTA-ApraInCipB的構(gòu)建采用Red/ET試劑盒按說明書操作構(gòu)建質(zhì)粒pTA-GentaInCipA和pTA-ApraInCipB。
C、CipA基因敲除1)用BamHI對pTA-GentaInCipA進行酶切得到GentaInCipA，采用PCR純化試劑盒按操作說明純化酶切產(chǎn)物GentaInCipA；2)將40μl過夜菌photorhabdus luminescens subsp.akhurstii+pASK-αβγA接種于1.4ml含有100μg/ml Apramycin的LB培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)2h；3)加2μl 2mg/ml水解四環(huán)素，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)1h；4)采用電轉(zhuǎn)的方法(1200V/cm)將酶切產(chǎn)物GentaInCipA轉(zhuǎn)化入photorhabdusluminescens subsp.akhurstii+pASK-αβγA中；5)30℃恢復(fù)培養(yǎng)1h；6)將其鋪在含有3μg/ml Gentamycin的LB平板上，30℃過夜培養(yǎng)。
D、CipB基因敲除1)用EcoRI對pTA-ApraInCipB進行酶切，采用PCR純化試劑盒按操作說明純化酶切產(chǎn)物ApraInCipB；2)將40μl過夜菌敲除CipA基因的photorhabdus luminescens subsp.akhursti+pASK-gba接種于含有100μg/ml Ampicillin的LB，30℃振搖培養(yǎng)2h；3)加2μl 2mg/ml水解四環(huán)素，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)1h；4)采用電轉(zhuǎn)的方法(1200V/cm)將酶切產(chǎn)物ApraInCipB導(dǎo)入敲除CipA基因的photorhabdus luminescens subsp.akhursti+pASK-αβγA中；5)30℃恢復(fù)培養(yǎng)1h；6)將其鋪在含有25μg/ml Apramycin的LB平板上，30℃過夜培養(yǎng)。
E、42℃熱激去除質(zhì)粒pASK-αβγA1)將40ul過夜菌photorhabdus luminescens subsp.akhursti+pASK-αβγA接種于1.0ml 3μg/ml Gentamycin和25μg/ml Apramycin的LB平板上，42℃振搖培養(yǎng)過夜；2)30℃恢復(fù)培養(yǎng)1h；3)將其鋪在含有3μg/ml Gentamycin和25μg/ml Apramycin的LB平板上，30℃培養(yǎng)過夜；4)從含3μg/ml Gentamycin和25μg/ml Apramycin的LB平板上挑單克隆分別在含100ug/ml Ampcillin的LB平板及含3μg/ml Gentamycin和25μg/mlApramycin的LB平板上進行雙劃線；5)將在含100μg/mlAmpcillin的LB平板不長，但能在含3μg/ml Gentamycin和25μg/ml Apramycin的LB平板上生長的菌落接種于1.0ml含3μg/mlGentamycin和25μg/ml Apramycin LB中，30℃振搖培養(yǎng)過夜；6)用EcoRI進行限制性酶切，檢測質(zhì)粒是否存在并保存沒有質(zhì)粒的克隆。
(二)按附圖2操作流程所示，構(gòu)建牛乳鐵蛋白素表達質(zhì)粒pBAD-cipB-BLfcin-Ampin具體實施方法如下
A、表達質(zhì)粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin構(gòu)建1)帶同源臂的CipB-BLfcin-Ampin PCR產(chǎn)物的獲得以photorhabdus luminescens subsp.akhurstii基因組DNA為模板，以P1(TCCATACCCG TTTTTTTGGG CTAAGCTTAG GAGATTACAT TATG ATA ATT AAG AAA GATATT)和P2(CAGCATACGG CGCACACAGG TGATAGACGG AGCACCCAGT TTTTTCCAACGCCACTGCCA GCGACGACAT TTAAA CAT AAT TTC AAC ACC AAC TAT)(其中帶下劃線堿基為同源臂，斜體堿基為BLfcin基因，其余堿基為引物)為引物，按50l反應(yīng)體系(ddH2O38ul；dNTP(5mM)2.0μl；10*Taq buffer5.0μl；Oligo up(50pmol/l)1.5μl；Oligo down(50pmol/l)1.5μl；模板(100ng)1.0μl；Taq polymarase1.0μl。)及反應(yīng)程序(預(yù)變性95℃，3min；32個循環(huán)(變性95℃，55sec；退火54℃，55sec；延伸72℃，50sec)；最后延伸72℃，10min)，通過PCR擴增獲得cipB-BLfcin基因。
以CipB-BLfcin基因PCR產(chǎn)物為模板，以P1(TCCATACCCG TTTTTTTGGGCTAAGCTTAG GAGATTACAT TATG ATA ATT AAG AAA GAT ATT)和P3(ACGAGA TTTATTTTTACCAAA TTTTTCTTG AGCTTTAGAC AGCAGTTTCC AAAT CAG CAT ACG GCG CAC ACAGGT)(其中帶下劃線堿基為同源臂，斜體堿基為Ampin基因，其余堿基為引物)為引物，按50μl反應(yīng)體系(ddH2O38μl；dNTP(5mM)2.0μl；10*Taq buffer5.0μl；Oligo up(50pmol/l)1.5μl；Oligo down(50pmol/l)1.5μl；模板(100ng)1.0μl；Taq polymarase1.0μl。)及反應(yīng)程序(預(yù)變性95℃，3min；32個循環(huán)(變性95℃，55sec；退火54℃，55sec；延伸72℃，50sec)；最后延伸72℃，10min)，通過PCR擴增獲得CipB-BLfcin-Ampin基因。
以CipB-BLfcin-Ampin基因PCR產(chǎn)物為模板，以P1(TCCATACCCG TTTTTTTGGGCTAAGCTTAG GAGATTACAT TATG ATA ATT AAG AAA GAT ATT)和P4(TCCGCCAAAACAGCCAAGCT TTCCTTTCGG GCTTTGTTAG CAGCCGGATC CCCTTAACG AGA TTT ATT TTTACC AAA)(其中帶下劃線堿基為同源臂，其余堿基為引物)為引物，按50μl反應(yīng)體系(ddH2O38μl；dNTP(5mM)2.0μl；10*Taq buffer5.0μl；Oligo up(50pmol/l)1.5μl；Oligo down(50pmol/l)1.5μl；模板(100ng)1.0μl；Taq polymarase1.0μl)及反應(yīng)程序(預(yù)變性95℃，3min；32個循環(huán)(變性95℃，55sec；退火54℃，55sec；延伸72℃，50sec)；最后延伸72℃，10min)，通過PCR擴增獲得帶同源臂的CipB-BLfcin-Ampin基因。
B、pBAD-CipB-BLfcin-Ampin的構(gòu)建利用PCR純化試劑盒按操作說明對帶同源臂的CipB-BLfcin-Ampin PCR產(chǎn)物進行純化。采用Red/ET同源重組的方法構(gòu)建pBAD-CipB-BLfcin-Ampin。
C、工程菌的獲得1)將40ul過夜培養(yǎng)菌photorhabdus luminescens subsp.akhursti TZR接種于1.4ml含3μg/ml Gentamycin和25μg/ml Apramycin的LB培養(yǎng)基中，30℃振搖3h2)采用電轉(zhuǎn)的方法(1200V/cm)分別將pBAD-CipB-BLfcin-Ampin轉(zhuǎn)化入photorhabdus luminescens subsp.akhursti TZR中；3)30℃恢復(fù)培養(yǎng)1h；4)將其鋪在含有100μg/ml Apramycin LB平板上，30℃過夜培養(yǎng)；5)從過夜培養(yǎng)的含有100μg/ml Apramycin LB平板挑單克隆于1.8ml含有Amp100μg/ml的LB中，振搖過夜；6)少量制備質(zhì)粒DNA，溶于8ulddH2O，取4μl質(zhì)粒DNA用BamHI和HindIII進行限制性酶切鑒定并保存正確的克隆。
7)將1體積以上正確且過夜培養(yǎng)的克隆，接種于50體積含有100μg/mlAmpcillin的LB培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)6h(OD約為1-1.5)；4)加10％(L+)阿拉伯糖至終濃度為0.2％，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)18h；5)4000rmp(4℃)離心10min，收集細(xì)胞，取10μl進行SDS-PAGE鑒定，并保存能表達重組牛乳鐵蛋白的克隆。
(三)、一種抗菌肽牛乳鐵蛋白素的制備方法如下A、材料與溶液配制所用工程菌為本發(fā)明所提供工程菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD-CipB-BLfcin-Ampin。
工程菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其組成成分為酵母提取物5g；蛋白胨10g；NaCl 5g；加水900ml，用1M NaOH將pH值調(diào)為7.0，定容至1L。(固體培養(yǎng)基加入1.5％終濃度的瓊脂粉)。溶液I100mM Tris-Cl(pH 8.0)，150mM NaCl，1mM EDTA。溶液II0.5M的醋酸鈉溶液。溶液III0.5M的醋酸溶液。
(L+)阿拉伯糖，Ampcillin，胰蛋白酶購于Sigma公司。
B、重組抗菌肽牛乳鐵蛋白素的制備方法1)在含有100μg/mlAmpcillin的LB平板上復(fù)蘇工程菌photorhabdus luminescensTZR+表達質(zhì)粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin；2)從復(fù)蘇平板上挑單克隆于含有100μg/mlAmpcillin的LB培養(yǎng)基中，30℃振搖(240rmp/min)過夜(約12h)；3)將1體積過夜培養(yǎng)菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD-CipB-BLfcin-Ampin，接種于50體積含有100μg/ml Ampcillin的LB培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)6h(OD約為1-1.5)；4)加10％(L+)阿拉伯糖至終濃度為0.2％，30℃誘導(dǎo)18h；5)4000rmp(4℃)離心10min，收集細(xì)胞；6)用溶液I重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新離心管中；7)4000rmp(4℃)，10min離心收集細(xì)胞，棄上清，可馬上進行下一步細(xì)胞裂解實驗或保存于-80℃?zhèn)溆茫?)加無菌雙蒸水反復(fù)凍溶3-6次裂解細(xì)胞；9)加等體積溶液II(pH值為7.0)于離心管中，6000rmp(4℃)，10min離心，棄上清，加等體積溶液III(pH值為3.0)于離心管中，6000rmp(4℃)，10min離心，收集上清(約占總菌體蛋白20％)。(利用CipB所編碼的晶體蛋白在pHpH5-11下不溶解，但在pH2-3下溶解的特性分離CipB融合乳鐵蛋白素)；10)加胰蛋白酶酶解CipB融合牛乳鐵蛋白素，釋放純牛乳鐵蛋白素(約占總菌體蛋白5％)，便得到一種抗菌肽牛乳鐵蛋白素。
11)通過體外抑菌試驗表明重組牛乳鐵蛋白素對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和沙門氏菌具有極好的抗菌性能(結(jié)果見表2)。通過斷奶仔豬試驗表明重組牛乳鐵蛋白素能降低腹瀉率，也能提高斷奶仔豬生長性能和免疫功能(結(jié)果見表3、4)。
表2 重組牛乳鐵蛋白素與不同抗生素對各種病原菌的最小抑菌濃度濃度單位μg/ml


表3 重組牛乳鐵蛋白素對斷奶仔豬生長性能的影響

表中同行肩注相同字母表示差異不顯著(P＞0.05)，相鄰字母表示差異顯著(P＜0.05)，相間a字母表示差異極顯著(P＜0.01)。
表4 重組牛乳鐵蛋白素對斷奶仔豬血清免疫球蛋白濃度的影響

表中同行肩注相同字母表示差異不顯著(P＞0.05)，相鄰字母表示差異顯著(P＜0.05)，相間字母表示差異極顯著(P＜0.01)。
權(quán)利要求
1.一種牛乳鐵蛋白工程菌，其特征在于牛乳鐵蛋白工程菌(photorhabdusluminescens TZR)，CCTCC NOM206132。
2.一種用于實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的牛乳鐵蛋白工程菌制備抗菌肽牛乳鐵蛋白素的方法，它包括下列步驟A、在含有100μg/mlAmpcillin的LB平板上復(fù)蘇工程菌photorhabdusluminescens TZR+表達質(zhì)粒pBAD-CipB-BLfcin-Ampin；B、從復(fù)蘇平板上挑單克隆于含有100μg/mlAmpcillin的LB培養(yǎng)基中，30℃振搖/240rmp/min過夜；C、將1體積過夜培養(yǎng)菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD-CipB-BLfcin-Ampin，接種于50體積含有100μg/ml Ampcillin的LB培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)6h/OD約為1-1.5；D、加10％/L+阿拉伯糖至終濃度為0.2％，30℃誘導(dǎo)18h；E、4000rmp，4℃離心10min，收集細(xì)胞；F、用溶液I重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新離心管中；G、4000rmp，4℃，10min離心收集細(xì)胞，棄上清，進行細(xì)胞裂解或保存于一80℃?zhèn)溆?；H、加無菌雙蒸水反復(fù)凍溶3-6次裂解細(xì)胞；I、加等體積溶液II，pH值為7.0于離心管中，6000rmp，4℃，10min離心，棄上清，加等體積溶液III，pH值為3.0于離心管中，6000rmp，4℃，10min離心，收集上清，在pH2-3下溶解的特性分離CipB融合乳鐵蛋白素；J、加胰蛋白酶酶解CipB融合牛乳鐵蛋白素，釋放純牛乳鐵蛋白素，占總菌體蛋白5％，便得到一種抗菌肽牛乳鐵蛋白素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛乳鐵蛋白工程菌及抗菌肽牛乳鐵蛋白素的制備方法，牛乳鐵蛋白工程菌，CCTCC NOM206132。首先在LB平板上復(fù)蘇工程菌photorhabdus luminescens TZR+表達質(zhì)粒pBAD－CipB－BLfcin－Ampin；其次是挑單克隆于LB培養(yǎng)基中；第三是將培養(yǎng)菌photorhabdus luminescens TZR+pBAD－CipB－BLfcin－Ampin，接種于LB培養(yǎng)基中；第四是誘導(dǎo)；第五是離心，收集細(xì)胞；第六是用溶液I重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新離心管中；第七是離心收集細(xì)胞；第八是凍溶裂解細(xì)胞；第九是特性分離CipB融合乳鐵蛋白素；第十是加胰蛋白酶酶解CipB融合牛乳鐵蛋白素，釋放純牛乳鐵蛋白素，便得到一種抗菌肽牛乳鐵蛋白素。對宿主菌自殺強，高效表達，成本低廉。
文檔編號C12N15/09GK101063101SQ20061016653
公開日2007年10月31日 申請日期2006年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月28日
發(fā)明者唐志如, 張友明, 印遇龍 申請人:中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所