專利名稱：：在包含植物蛋白水解產(chǎn)物的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液中生產(chǎn)多肽的制作方法在包含植物蛋白水解產(chǎn)物的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液中生產(chǎn)多肽發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于在無(wú)血清培養(yǎng)液中于真核細(xì)胞中生產(chǎn)目的多肽的改進(jìn)方法。發(fā)明背景用于在真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)多肽例如凝血因子VII多肽的方法是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)例如WO02/29083、WO02/29084和WO03/29442。在多肽例如凝血因子VII多肽的大規(guī)模生產(chǎn)中，出于經(jīng)濟(jì)原因希益。此外，設(shè)想在較長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)更均勻的多肽生產(chǎn)速率將致使多肽批次更均一，因?yàn)檎J(rèn)為對(duì)于"非應(yīng)激的"細(xì)胞培養(yǎng)，翻譯后過(guò)程(例如糖基化和Y-羧酸的形成)可更精確地進(jìn)行。WO01/23527公開(kāi)了用于無(wú)蛋白質(zhì)和無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基包含一定比例的大豆水解產(chǎn)物(大豆蛋白胨)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及在培養(yǎng)過(guò)程中改變細(xì)胞培養(yǎng)液中的植物蛋白水解產(chǎn)物組分的濃度，以便，同時(shí)，1)在繁殖階段期間實(shí)現(xiàn)最佳細(xì)胞生長(zhǎng)，和2)在生產(chǎn)階段中實(shí)現(xiàn)最佳的、長(zhǎng)期的、關(guān)于性能的培養(yǎng)穩(wěn)定性，并且從而增加所考慮的多肽例如凝血因子VII多肽的總產(chǎn)率。本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及用于在包含在無(wú)血清培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括(i)所述細(xì)胞的繁殖階段，其中使所述細(xì)胞在第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中繁殖，和(ii)所述細(xì)胞的生產(chǎn)階段，其中所述細(xì)胞存在于第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)液各自包含植物蛋白水解產(chǎn)物，并且其中第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(d)和第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C2)之比為至少1.5:1(C1:C2)。本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及用于在包含在無(wú)血清培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述細(xì)胞的繁殖階段，其中使所述細(xì)胞在第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中繁殖，和(U)所述細(xì)胞的生產(chǎn)階段，其中所述細(xì)胞存在于第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)液各自包含植物蛋白水解產(chǎn)物，例如大豆蛋白水解產(chǎn)物，并且其中所述第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C2)為0.7-3.0g/L。附圖簡(jiǎn)述圖1舉例說(shuō)明了培養(yǎng)過(guò)程的流程圖。圖2的圖表顯示了來(lái)自在20L發(fā)酵罐中的微載體培養(yǎng)的結(jié)果，參照實(shí)施例1。圖3的圖表顯示了來(lái)自在500L發(fā)酵罐中的微載體培養(yǎng)的結(jié)果，參照實(shí)施例2。發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明的一個(gè)主要方面涉及用于在包含在無(wú)血清培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括(i)所述細(xì)胞的繁殖階段，其中使所述細(xì)胞在第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中繁殖，和(ii)所述細(xì)胞的生產(chǎn)階段，其中所述細(xì)胞存在于第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)液各自包含植物蛋白水解產(chǎn)物，并且其中第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(d)和第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C2)之比為至少1.5:1(C1:C2)。術(shù)語(yǔ)"大規(guī)模生產(chǎn)"指涉及至少IOOL的培養(yǎng)容器的生產(chǎn)。然而，在優(yōu)選實(shí)施方案中，規(guī)模一般為至少250L，例如至少500L，例如至少1000L或甚至5000L或更大。術(shù)語(yǔ)"大規(guī)模，，可以與術(shù)語(yǔ)"工業(yè)規(guī)模"和"生產(chǎn)規(guī)模"互換使用。用于大規(guī)模生產(chǎn)多肽的方法一般在至少120小時(shí)例如1-26周的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明應(yīng)被理解為迄今已知的用于在包含在無(wú)血清培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)多肽的方法的改進(jìn)。已知在此類方法中使用植物蛋白水解產(chǎn)物，但本發(fā)明提供了用于改進(jìn)此類方法的結(jié)果的指導(dǎo)。本發(fā)明主要方面的方法的特征是，以使得繁殖階段以及生產(chǎn)階段最優(yōu)化的方式控制細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的含量。這是通過(guò)確保第一種細(xì)胞培養(yǎng)液(用于繁殖階段)中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(d)和第二種細(xì)胞培養(yǎng)液(用于生產(chǎn)階段)中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C2)之比為至少1.5:1(d:C2)來(lái)完成的。通常，細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度為0.01-10.0g/L。在某些實(shí)施方案中，在繁殖階段期間可以使用約5.Og/L的濃度(d)，然后減少濃度從而使得第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C2)在生產(chǎn)階段開(kāi)始時(shí)是例如l.Og/L。隨后，在生產(chǎn)階段期間，濃度可以維持在基本上固定的水平，或可以備選地在低和高值之間例如在l.Og/L和2.0g/L之間增加和減少，以便維持穩(wěn)定的培養(yǎng)。這也就是說(shuō)，比例d:C2優(yōu)選為2:1-10:1,例如2.5:1-8:1或3:1-6:1。此外，濃度C2—般為0.2-3.5g/L，例如0.7-3.0g/L，例如0.9-2.5g/L,例如0.9-2.2g/L，和濃度C！一般為4.0-10.0g/L,例如4.5-8.0g/L。如上所述，在生產(chǎn)階段過(guò)程中略微改變植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度有時(shí)是有利的，例如，通過(guò)改變?cè)谏衔慕o出的范圍之一內(nèi)的濃度，例如在O.2-3.5g/L的范圍內(nèi)，例如在O.7-3.0g/L的范圍內(nèi)，例如在O.9-2.5g/L的范圍內(nèi)，例如在O.9-2.2g/L的范圍內(nèi)的濃度。備選地，濃度保持在基本上固定的水平。植物蛋白水解產(chǎn)物可以從各種來(lái)源之一獲得，例如商業(yè)來(lái)源。水解產(chǎn)物的一般類型是大豆蛋白水解產(chǎn)物、小麥蛋白水解產(chǎn)物、豌豆蛋白水解產(chǎn)物、水稻蛋白水解產(chǎn)物等。引入本文作為參考的W001/23527Al公開(kāi)了大豆蛋白水解產(chǎn)物的制備和一般用途。優(yōu)選地，植物蛋白水解產(chǎn)物是大豆蛋白水解產(chǎn)物。本發(fā)明一般不限于生產(chǎn)特定的多肽或使用特定的真核細(xì)胞。但是，下文還是提供了相關(guān)多肽和有用的真核細(xì)胞的舉例說(shuō)明性的實(shí)例。然而，在某些本發(fā)明的當(dāng)前最令人感興趣和優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽是凝血因子VII多肽。此外，在此類實(shí)施方案中，真核細(xì)胞通常選自CH0、BHK、HEK293、骨髓瘤細(xì)胞等。因此，本發(fā)明主要方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于在包含在無(wú)血清培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述細(xì)胞的繁殖階段，其中使所述細(xì)胞在第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中繁殖，和(ii)所述細(xì)胞的生產(chǎn)階段，其中所述細(xì)胞存在于第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中，其中所述第一種細(xì)胞培養(yǎng)液包含濃度為4.0-10.0g/L的大豆蛋白水解產(chǎn)物，所述第二種細(xì)胞培養(yǎng)液包含濃度為0.2-3.5g/L的大豆蛋白水解產(chǎn)物，并且其中所述第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中大豆蛋白水解產(chǎn)物的濃度(d)和所述第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中大豆蛋白水解產(chǎn)物的濃度(c2)之比為至少1.5:1(d:C2)。本發(fā)明的另一方面涉及用于在包含在無(wú)血清培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述細(xì)胞的繁殖階段，其中使所述細(xì)胞在第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中繁殖，和(ii)所述細(xì)胞的生產(chǎn)階段，其中所述細(xì)胞存在于第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)液各自包含植物蛋白水解產(chǎn)物，例如大豆蛋白水解產(chǎn)物，并且其中所述第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C2)為0.7-3.0g/L。優(yōu)選地，濃度C2為0.9-2.5g/L，例如0.9-2.2g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)液各自包含植物蛋白水解產(chǎn)物，并且其中第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(d)和第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C2)之比為至少1.5:1,例如2:1-10:1，例如2.5:1-8:1或3:1-6:1。優(yōu)選地，濃度C!為4.0-10.0g/L，例如4.5-8.0g/L。到目前為止獲得的結(jié)果表明，在生產(chǎn)階段中植物蛋白水解產(chǎn)物濃度太高將不可逆地?fù)p害培養(yǎng)，從而導(dǎo)致相當(dāng)短的有效生產(chǎn)階段(參見(jiàn)，例如圖2,,5.0g/L水解產(chǎn)物)，而植物蛋白水解產(chǎn)物濃度太低將不利于培養(yǎng)，但為可逆方式。在生產(chǎn)階段中植物蛋白水解產(chǎn)物濃度太低可能導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目減少，從而減少產(chǎn)物濃度，但已顯示這可以通過(guò)略微升高植物蛋白水解產(chǎn)物濃度來(lái)克服。不希望束縛于任何特定理論，認(rèn)為植物蛋白水解產(chǎn)物濃度的特性有利地具有下列特性在所述繁殖階段中的高濃度(d);在所述生產(chǎn)階段中的低濃度-低水平A(C2A);在所述生產(chǎn)階段中的低濃度-低水平B(C2B);在所述生產(chǎn)階段中的低濃度-低水平A(C2A);在所述生產(chǎn)階段中的低濃度-低水平B(C2B);等，其中C,〉C2B〉Cu，并且濃度C"和C2B在對(duì)于C2而指定的濃度范圍內(nèi)，并且其中當(dāng)在例如2-5天內(nèi)已觀察到細(xì)胞數(shù)目逐漸減少時(shí)，進(jìn)行從低水平A(C2A)至低水平B(C2B)的首次轉(zhuǎn)換，和當(dāng)細(xì)胞數(shù)目已恢復(fù)至大約相應(yīng)于減少前水平的水平時(shí)，進(jìn)行從低水平B(C2B)至低水平A(C2A)的后續(xù)轉(zhuǎn)換。優(yōu)選地，濃度Cu為0.2-2.0g/L，例如0.7-1.5g/L，例如0.9-1.3g/L,例如0.9-1.2g/L，和濃度C2B優(yōu)選為1.0-3.5g/L,例如1.1-3.0g/L,.例如1.2-2.5g/L，例如1.2-2.2g/L。術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)液"意指在合適的液體介質(zhì)中包含真核細(xì)胞培養(yǎng)物的液體。在一個(gè)重要的實(shí)施方案中，通過(guò)附著在固體微載體表面上或通過(guò)附著至或物理包載在大孔微栽體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中來(lái)固定細(xì)胞。這將在下文中進(jìn)一步詳細(xì)解釋。^于義魂模政產(chǎn)^多農(nóng)如上所述，本發(fā)明涉及與改進(jìn)的真核細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有關(guān)的方法，所述真核細(xì)胞表達(dá)一種或多種目的蛋白，所述目的蛋白來(lái)自外源基因或在將編碼該蛋白質(zhì)的重組基因?qū)氪祟惣?xì)胞中之后產(chǎn)生。這樣的蛋白質(zhì)包括，但不限于，凝血因子VII多肽；凝血因子VIII;凝血因子IX;凝血因子X(jué);蛋白C;組織因子；凝乳酶；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素；牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；曱狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；心房鈉尿肽；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活劑，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-a和-P;腦啡肽酶；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-a);血清白蛋白例如人血清白蛋白；苗勒抑制物質(zhì)(mullerian-inhibitingsubstance);松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，例如P-內(nèi)酰胺酶；DM酶；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF);激素或生長(zhǎng)因子的受體；整合素；蛋白A或D;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子例如骨源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF),神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長(zhǎng)因子例如NGF-P，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF);成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子例如a-FGF和P-FGF;表皮生長(zhǎng)因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)例如TGF-a和TGF-P，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1和-II(IGF-I和IGF-II);CD蛋白例如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19;促紅細(xì)胞生成素；骨資導(dǎo)因子(osteoinductivefactors);免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP);干擾素例如干擾素-a、-p和-y;集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白介素(ILs);例如IL-1至IL-10;超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原例如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；抗體；和上述多肽中任何一種的片段。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽是凝血因子VII多肽。在關(guān)于這點(diǎn)的某些實(shí)施方案中，用于實(shí)踐本發(fā)明的細(xì)胞是表達(dá)外源的凝血因子VII基因的人細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，外源基因可以是完整的或可以已被原位修飾，或者在凝血因子VII基因之外的序列可以已被原位修飾以改變外源的凝血因子VII基因的表達(dá)。在關(guān)于這點(diǎn)的其他實(shí)施方案中，來(lái)自任何真核來(lái)源的細(xì)胞是經(jīng)改造的以從重組基因表達(dá)人凝血因子VII。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"凝血因子VII多肽"和"FVII多肽"表示包含野生型人凝血因子Vila(即，具有美國(guó)專利號(hào)4，784,950中/>開(kāi)的氨基酸序列的多肽)的氨基酸序列1-406的任何蛋白質(zhì)、其變體，以及凝血因子VII相關(guān)多肽、凝血因子VII衍生物和凝血因子VII綴合物。這包括顯示出相對(duì)于野生型人凝血因子Vila來(lái)說(shuō)基本上相同或改進(jìn)的生物學(xué)活性的FVII變體、凝血因子VII相關(guān)多肽、凝血因子VII衍生物和凝血因子VII綴合物。術(shù)語(yǔ)"凝血因子VII"希望包括其未切割(酶原)形式的凝血因子VII多肽，以及已經(jīng)經(jīng)蛋白水解加工而產(chǎn)生它們各自的生物活性形式的那些，其可以稱為凝血因子VIIa。通常，凝血因子VII在第152位和第153位殘基之間切割而產(chǎn)生凝血因子VIIa。凝血因子VII的此類變體可以顯示出相對(duì)于人凝血因子VII來(lái)說(shuō)不同的性質(zhì)，包括穩(wěn)定性、磷脂結(jié)合、改變的比活性等。如本文所使用的，"野生型人FVIIa"是具有美國(guó)專利號(hào)4,784，950中公開(kāi)的氨基酸序列的多肽。如本文所使用的，"凝血因子VII相關(guān)多肽"涵蓋了這樣的多肽，包括變體，其中凝血因子Vila的生物學(xué)活性相對(duì)于野生型凝血因子Vila的活性來(lái)說(shuō)已經(jīng)實(shí)質(zhì)上進(jìn)行了修飾，例如減少。這些多肽包括，酸序列改變的凝血因子VII或凝血因子VIIa。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"凝血因子VII衍生物"意指顯示出相對(duì)于野生型凝血因子VII來(lái)說(shuō)基本上相同或改進(jìn)的生物學(xué)活性的FVII多肽，其中親本肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸已經(jīng)采用遺傳和/或化學(xué)和/或酶促的方法進(jìn)行了修飾，例如通過(guò)烷化、糖基化、PEG化、酰化、酯形成或酰胺形成等。這包括但不限于PEG化的人凝血因子VIIa、半胱氨酸-PEG化的人凝血因子Vila及其變體。凝血因子VII衍生物的非限制性實(shí)例包括在WO03/31464和美國(guó)專利申請(qǐng)US20040043446、US20040063911、US20040142856、US20040137557和US20040132640(NeoseTechnologies,Inc.)中/>開(kāi)的糖PEG化的FVII衍生物；在WO01/04287、美國(guó)專利申請(qǐng)20030165996、WO01/58935、WO03/93465(MaxygenApS)和WO02/02764、美國(guó)專利申請(qǐng)20030211094(UniversityofMinnesota)中7>開(kāi)的FVII綴合物。術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的生物學(xué)活性，，指i)與重組野生型人凝血因子Vila相比具有基本上相同或增加的蛋白水解活性的FVII多肽，或ii)與重組野生型人凝血因子VIla相比具有基本上相同或增加的TF結(jié)合活性的FVII多肽，或iii)與重組野生型人凝血因子Vila相比具有基本上相同或增加的在血漿中的半衰期的FVII多肽。術(shù)語(yǔ)"PEG化的人凝血因子Vila"表示具有與人凝血因子Vila多肽綴合的PEG分子的人凝血因子VIIa。應(yīng)當(dāng)理解，PEG分子可以連接至凝血因子Vila多肽的任何部分，包括凝血因子Vila多肽的任何氨基酸殘基或糖部分。術(shù)語(yǔ)"半胱氨酸-PEG化的人凝血因子Vila"表示具有PEG分子的凝血因子Vila,所述PEG分子綴合至引入人凝血因子Vila中的半胱氨酸的巰基上。與重組野生型人凝血因子Vila相比具有基本上相同或增加的蛋白水解活性的凝血因子VII變體的非限制性實(shí)例包括S52A-FVIIa、卩60A-FVIIa(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352:182-192，1998);在美國(guó)專利號(hào)5，580，560中公開(kāi)的顯示出增加的蛋白水解穩(wěn)定性的FVIIa變體；已經(jīng)在第290位和第291位殘基之間或在第315位和第316位殘基之間經(jīng)蛋白水解切割的凝血因子Vila(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48:501—505，1995);凝血因子Vila的氧化形式(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.363:43-54，1999);在PCT/DK02/00189(相應(yīng)于W002/077218)中公開(kāi)的FVII變體；和在W002/38162(ScrippsResearchInstitute)中/>開(kāi)的顯示出增加的蛋白水解穩(wěn)定性的FVII變體；在WO99/20767、美國(guó)專利US6017882和US6747003、美國(guó)專利申請(qǐng)20030100506(UniversityofMinnesota)和WO00/66753、美國(guó)專利申i青US20010018414、US2004220106和US200131005、美國(guó)專利US6762286和US6693075(UniversityofMinnesota)中公開(kāi)的FVII變體，其具有經(jīng)修飾的Gla-結(jié)構(gòu)域并顯示出增強(qiáng)的膜結(jié)合；和在WO01/58935、美國(guó)專利US6806063、美國(guó)專利申請(qǐng)20030096338(MaxygenApS)、WO03/93465(MaxygenApS)、WO04/029091(MaxygenApS)、WO04/083361(MaxygenApS)和WO04/111242(MaxygenApS)以及WO04/108763(CanadianBloodServices)中乂〉開(kāi)的FVII變體。與野生型FVIIa相比具有增加的生物學(xué)活性的FVII變體的非限制性實(shí)例包括，在WO01/83725、WO02/22776、WO02/077218、PCT/DK02/00635(相應(yīng)于WO03/027147)、丹麥專利申請(qǐng)PA200201423(相應(yīng)于WO04/029090)、丹麥專利申請(qǐng)PA200101627(相應(yīng)于WO03/027147)、WO02/38162(ScrippsResearchInstitute)中公開(kāi)的FVII變體；和在JP2001061479(Chemo-Sero-TherapeuticResInst.)中公開(kāi)的具有增強(qiáng)的活性的FVIIa變體。凝血因子VII的變體的實(shí)例包括，但不限于，L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII,F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII,V158D/E296V/M298Q-FVII,K337A-FVII,M298Q-FVII,V158D/M298Q-FVII,L305V/K337A-FVI1，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII,V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII,K157A-FVII,E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII,和S336G-FVII，L305V/K337A-FVI1，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVI1，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII,L305V/K337A/V158T-FVI1，L305V/K337A/M298Q-FVI1，L305V/K337A/E296V-FVII,L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q-FVI1，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII:U05V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/K316Q-FVII,S314E/L305V-FVILS314E/E296V-FVILK316H/L305V-FVII:K316H/E296V-FVII:K316Q/L305V-FVII:K316Q/E296V-FVILS314E/L305V/K337A-S314E/V158D-FVIIS314E/V158T-FVIIK316H/V158D-FVIIK316H/V158T-FVIIK316Q/V158D-FVIIK316Q/V158T-FVI1S314E/K316H-FVI1S314E/K337A-FVIIS314E/M298Q-FVIIK316H/K337A-FVIIK316H/M298Q-FVI1K316Q/K337A-FVIIK316Q/M298Q-FVI1-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVIIS314E/L305V/K337A/E296V-FVII,S314E/L305V/K337A/V158D-FVIIS314E/L305V/V158D/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158D/E296V-FVIIS314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V-FVIIS314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVn，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVI1，K316H/L305V/V158D-FVI1，K316H/L305V/E296V-FVI1，K316H/L305V/M298Q-FVI1，K316H/L305V/V158T-FVI1，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII,K316H/L305V/K337A/M298Q-FVn，K316H/L305V/K337A/E296V-FVIIK316H/L305V/K337A/V158D-FVII,K316H/L305V/V158D/M298Q-FVIIK316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVIIK316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVIIK316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVI1，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVI1，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/U05V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII,K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V—FVII，K316Q/L305V/M298Q—FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII,K316Q/L305V/K337A/V158T-FVI1，K316Q/L305V/K337A/M298Q—FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII,K316Q/L305V/K337A/V158D-FVI1，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V-FVI1，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVI1，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVI1，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVIIK316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVIIK316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVIIK316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVIIK316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337AK316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337AF374Y/V158D-FVI1，F(xiàn)374Y/E296V-FVII,F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVI1，F(xiàn)374Y/L305V/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D-FVIIF374Y/L305V/E296V-FVII,F374Y/L305V/M298Q-FVIIF374Y/L305V/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/S314E-FVIIF374Y/K337A/V158T-FVIIF374Y/K337A/E296V-FVIIF374Y/V158D/S314E-FVIIF374Y/V158D/E296V-FVIIF374Y/V158T/M298Q-FVIIF374Y/E296V/S314E-FVIIF374Y/E296V/M298Q-FVI1FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/E296V-FVII,FVII，F(xiàn)VII，F(xiàn)374Y/K337A-FVn，F(xiàn)374Y/M298Q-FVII,F374Y/L305V-FVII,F374Y/K337A/S314E-FVIIF374Y/K337A/M298Q-FVI1F374Y/K337A/V158D-FVIIF374Y/V158D/M298Q-FVIIF374Y/V158T/S314E-FVIIF374Y/V158T/E296V-FVI1F374Y/S314E/M298Q-FVIIF374Y/L305V/K337A/V158DF374Y/L305V/K337A/M298Q-FVI1F374Y/L305V/K337A/S314E-FVIIF374Y/L305V/V158D/M298Q-FVIIF374Y/L305V/E296V/M298Q-FVIIF374Y/L305V/E296V/S314E-FVIIF374Y/L305V/M298Q/S314E-FVIIF374Y/K337A/S314E/V158T-FVIIF374Y/K337A/S314E/E296V-FVI1F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVIIF374Y/K337A/M298Q/E296V-FVIIF374Y/K337A/E296V/V158D-FVIIF374Y/V158D/S314E/E296V-FVIIF374Y/V158T/S314E/E296V-FVIIF374Y/V158T/M298Q/E296V-FVIIF374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E.F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E'F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E'F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337AF374Y/L305V/E296V/M298Q/S314EF374Y/V158D/E296V/M298Q/K337AF374Y/V158D/E296y/M298Q/S314EF374Y/L305V/V158D/K337A/S314EF374Y/V158D/M298Q/K337A/S314EF374Y/V158D/E296V/K337A/S314EF374Y/L305V/V158D/E296V/M298QF374Y/L305V/V158D/M298Q/K337AF374Y/L305V/V158D/E296V/K337AF374Y/L305V/V158D/M298Q/S314EF374Y/L305V/V158D/E296V/S314EF374Y/L305V/K337A/V158T-FVIIF374Y/L305V/V158D/E296V-FVIIF374Y/L305V/V158D/S314E-FVIIF374Y/L305V/E296V/V158T-FVIIF374Y/L305V/M298Q/V158T-FVIIF374Y/L305V/V158T/S314E-FVIIF374Y/K337A/S314E/M298Q-FVIIF374Y/K337A/S314E/V158D-FVIIF374Y/K337A/V158T/E296V-FVIIF374Y/K337A/M298Q/V158D-FVIIF374Y/V158D/S314E/M298Q-FVIIF374Y/V158D/M298Q/E296V-FVIIF374Y/V158T/S314E/M298Q-FVIIF374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII國(guó)FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVIIF374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVI1，F(xiàn)374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVI1，F(xiàn)374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVI1，F(xiàn)374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVI1，F(xiàn)374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVI1，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVn，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVI1，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVn,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVI1，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVI1，S52A-凝血因子VII，S60A-凝血因子VII;R152E-凝血因子VII，S344A-凝血因子VII，T106N-FVII,K143N/N145T-FVI1，V253N-FVII，R290N/A292T-FVI1，G291N-FVII,R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII;以及在233Thr-240Asn的氨基酸序列中具有置換、添加或缺失的FVII;在304Arg-329Cys的氨基酸序列中具有置換、添加或缺失的FVII;和在15311e-223Arg的氨基酸序列中具有置換、添加或缺失的FVII。因此，凝血因子VII多肽中的置換變體包括但不限于在位置PIO、K32、L305、M306、D309、L305、L305、F374、V158、M298、V158、E296、K337、M298、M298、S336、S314、K316、K316、F374、S52、S60、R152、S344、T106、K143、N145、V253、R290、A292、G291、R315、V317處的置換，以及在從T233至N240或從R304至C329;或從1153至R223的氨基酸序列中的置換、添加或缺失，或它們的組合，特別是變體例如P10Q、K32E、L305V、M306D、D309S、L305I、L305T、F374P、V158T、M298Q、V158D、E296V、K337A、M298Q、M298K、S336G、S314E、K316H、K316Q、F374Y、S52A、S60A、R152E、S344A、T106N、K143N、N145T、V253N、R290N、A292T、G291N、R315N、V317T,以及從T233至N240,或從R304至C329，或從1153至R223的氨基酸序列中的置換、添加或缺失，或它們的組合。在某些實(shí)施方案中，凝血因子VII多肽是人凝血因子Vila(hFVIIa),優(yōu)選重組制備的人凝血因子Vila(rhVIIa)。在其他實(shí)施方案中，凝血因子VII多肽是凝血因子VII序列變體。在某些實(shí)施方案中，凝血因子VII多肽具有不同于野生型人凝血因子VII的糖基化。勿應(yīng)在實(shí)施本發(fā)明中，所述細(xì)胞是真核生物細(xì)胞，更優(yōu)選已建立的真核生物細(xì)胞系，包括但不限于CHO(例如ATCCCCL61)、C0S-1(例如ATCCCRL1650)、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)和HEK293(例如ATCCCRL1573;Graham等人，/.Ce/.K/ro厶36:59-72，1977)細(xì)胞系。優(yōu)選的BHK細(xì)月包系是tk—tsl3BHK細(xì)月包系(Waechter和Baserga，戶roc.#"7.C2'.yW79:1106-1110，1982),下文中稱為BHK570細(xì)胞。BHK570細(xì)胞系可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，12301ParklawnDr.，Rockville，MD20852，在ATCC登記號(hào)CRL10314下獲得。tk-tsl3BHK細(xì)胞系還可以從ATCC在登記號(hào)CRL1-632下獲得。優(yōu)選的CHO細(xì)胞系是可從ATCC在登記號(hào)CC161下獲得的CH0Kl細(xì)胞系。其他合適的細(xì)胞系包括但不限于RatHepI(大鼠肝瘤；ATCCCRL1600)，RatHepII(大鼠肝瘤；ATCCCRL1548),TCMK(ATCCCCL139)，人肺(ATCCHB8065)，NCTC1469(ATCCCCL9.1);DUKX細(xì)胞(CH0細(xì)胞系)(Urlaub和Chasin，Jcad.M」77:4216-4220，1980)(DUKX細(xì)胞也稱為訓(xùn)ll細(xì)胞),和DG44(CHO細(xì)胞系)(Ce//，33:405,1983，和So肌〃cCe//#o/ec"73i"(7e/e〃"12:555，1986)。同樣可以使用的是3T3細(xì)胞、Namalwa細(xì)胞、骨髓瘤和骨髓瘤與其他細(xì)胞的融合細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是突變細(xì)胞或重組細(xì)胞，例如表達(dá)與它們所源自的細(xì)胞類型相比在性質(zhì)或數(shù)量上不同的酶i瞽的細(xì)胞，其中所述酶催化蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(例如，糖基化酶如糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖普酶，或者加工酶，例如前肽)。合適的昆蟲(chóng)細(xì)胞系還包括但不限于鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞系，例J(口草地夜蛾(5^odo/^era/Vi^i'/erc^)細(xì)月包或粉纟丈夜蛾(7y/c/op/^/a/n')細(xì)胞(參見(jiàn)，例如US5,077,214)。在某些實(shí)施方案中，用于實(shí)施本發(fā)明的細(xì)胞能夠在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)。如本文所使用的，懸浮-勝任性細(xì)胞(suspension-competentcell)是可以在懸浮液中生長(zhǎng)而不形成大的、牢固的聚集體的細(xì)胞，即為單分散的或在每個(gè)聚集體中只有少數(shù)細(xì)胞的松散聚集體中生長(zhǎng)的細(xì)胞。懸浮-勝任性細(xì)胞包括，但不限于，無(wú)需適應(yīng)或處理即可在懸浮液中生長(zhǎng)的細(xì)胞(例如，造血細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞)，和通過(guò)使附著依賴性細(xì)胞(例如，上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)逐漸適應(yīng)懸浮生長(zhǎng)而制成懸浮-勝任性狀態(tài)的細(xì)胞。用于實(shí)施本發(fā)明的細(xì)胞可以是粘附細(xì)胞(也稱為貼壁依賴性或附著依賴性細(xì)胞)。如本文所使用的，粘附細(xì)胞是需要將其自身粘附或錨定至合適表面以進(jìn)行增殖和生長(zhǎng)的那些細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的細(xì)胞是粘附細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，繁殖階段和生產(chǎn)階段包括微載體的使用。所使用的粘附細(xì)胞應(yīng)當(dāng)能夠在繁殖階段期間遷移到載體上(并且如果使用大孔栽體，則遷移到載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中)，并且當(dāng)轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)生物反應(yīng)器中時(shí)遷移至新載體。如果粘附細(xì)胞沒(méi)有足夠的能力通過(guò)自身遷移至新載體，那么可以通過(guò)使包含細(xì)胞的微載體與蛋白水解酶或EDTA接觸來(lái)將它們從載體中釋放出來(lái)。所使用的介質(zhì)(特別是當(dāng)不含動(dòng)物來(lái)源組分時(shí))應(yīng)進(jìn)一步包含適合于支持粘附細(xì)胞的組分；用于培養(yǎng)粘附細(xì)胞的合適的介質(zhì)可從供應(yīng)商例如Sigma獲得。細(xì)胞還可以是懸浮-適應(yīng)性或懸浮-勝任性細(xì)胞。如果使用此類細(xì)胞，那么可以在懸浮液中進(jìn)行細(xì)胞的繁殖，因此微載體只在生產(chǎn)培養(yǎng)容器本身中的最后繁殖階段中和在生產(chǎn)階段中使用。在懸浮-適應(yīng)性細(xì)胞的情況下，所使用的微載體通常是大孔載體，其中細(xì)胞通過(guò)物理包載在載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中而附著其上。在這樣的實(shí)施方案中，真核細(xì)胞一般選自CH0、BHK、HEK293、骨髓瘤細(xì)胞等。本發(fā)明的方法通常在攪拌培養(yǎng)容器中進(jìn)行，并且優(yōu)選采用基于微載體的方法類型。在基于微載體的方法中，細(xì)胞已遷移至載體(大孔載體)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中或已將其自身附著至載體(固體載體)表面，或兩者。在基于微載體的方法中，最初將真核細(xì)胞、微載體和細(xì)胞培養(yǎng)液置于培養(yǎng)容器中。在接下來(lái)的幾天里，如果培養(yǎng)體積沒(méi)有達(dá)到開(kāi)始時(shí)容器的最終工作體積，那么可以加入額外的細(xì)胞培養(yǎng)液。在接下來(lái)的時(shí)間內(nèi)，定期收獲包含產(chǎn)物的培養(yǎng)物上清液并用新的培養(yǎng)液替換，直至培養(yǎng)最終結(jié)束。當(dāng)收獲包含產(chǎn)物的上清液時(shí)，停止攪動(dòng)例如攪拌培養(yǎng)物，并在允許包含細(xì)胞的載體沉淀后取出包含產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液部分。為了改進(jìn)程序的總體結(jié)果，優(yōu)選地可以在收獲包含產(chǎn)物的上清液之前應(yīng)用冷卻步驟，參見(jiàn)，例如W003/029442。在某些實(shí)施方案中，在允許載體沉淀之前將培養(yǎng)液冷卻至約18°C-約32°C，或約20°C-約30。C，或約22°C-約28。C的溫度。細(xì)胞培養(yǎng)程序的其他可應(yīng)用的變化形式公開(kāi)于WO02/29084中。繁殖步驟在達(dá)到其中有規(guī)律地收獲包含產(chǎn)物的培養(yǎng)物上清液以用于進(jìn)一步下游處理的生產(chǎn)階段前，根據(jù)可能適合于所考慮的特定細(xì)胞的任何方案或規(guī)程來(lái)繁殖細(xì)胞。繁殖階段可以是單步驟或多步驟的程序。在單步驟的繁殖程序中，從貯庫(kù)中取出細(xì)胞并直接接種至其中將進(jìn)行生產(chǎn)的包含微栽體的培養(yǎng)容器中。在多步驟的繁殖程序中，從貯庫(kù)中取出細(xì)胞，并通過(guò)逐漸增加尺寸的多個(gè)培養(yǎng)容器進(jìn)行繁殖，直至到達(dá)其中將進(jìn)行生產(chǎn)的包含微載體的最終培養(yǎng)容器。在繁殖步驟期間，細(xì)胞在對(duì)于生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)進(jìn)行了優(yōu)化的條件下生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件，例如溫度、pH、溶解氧張力(tension)、溶解C02濃度等是已知對(duì)于特定細(xì)胞來(lái)說(shuō)是最優(yōu)的那些，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的(參見(jiàn)，1"列i口，爿/z/邁a7Ce//Cw/fwre..^戶racf/ca/JpproacA岸二成，Rickwood:D.和Hames，B.D.，編者，OxfordUniversityPress,NewYork(1992))。在一種方法中，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程在一個(gè)培養(yǎng)容器中進(jìn)行將細(xì)胞直接接種到其中將進(jìn)行生產(chǎn)的包含微載體的培養(yǎng)容器中；讓細(xì)胞進(jìn)行繁殖直至達(dá)到適合的細(xì)胞密度，并開(kāi)始生產(chǎn)階段。在另一種方法中，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程在至少2個(gè)不同的培養(yǎng)容器中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)種子培養(yǎng)容器(第一繁殖步驟)，隨后為生產(chǎn)培養(yǎng)容器(最后的繁殖步驟，隨后為生產(chǎn)階段)。在第一繁殖步驟中，將表達(dá)所需多肽的細(xì)胞接種到包含培養(yǎng)基的種子培養(yǎng)容器中，并進(jìn)行繁殖直至細(xì)胞到達(dá)最小交叉移種密度(minimumcross-seedingdensity)。隨后，將繁殖的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至包含(a)培養(yǎng)基和(b)微載體的生產(chǎn)培養(yǎng)容器中。在這個(gè)培養(yǎng)容器中，在細(xì)胞遷移至固體載體的表面或大孔載體的內(nèi)和外表面上的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并且它們?cè)谠撟詈蟮姆敝巢襟E中持續(xù)生長(zhǎng)直至載體完全被細(xì)胞占據(jù)。在該最后的繁殖步驟期間，通過(guò)允許微載體下沉至培養(yǎng)容器底部來(lái)進(jìn)行介質(zhì)更換，之后取出預(yù)定罐體積百分比的介質(zhì)并向容器中加入相應(yīng)罐體積百分比的新鮮介質(zhì)。然后，將微載體重懸浮于介質(zhì)中，并且以預(yù)定的時(shí)間間隔，例如每24小時(shí)重復(fù)這一取出介質(zhì)和替換的過(guò)程。所替換的介質(zhì)的量取決于細(xì)胞密度，并且一般可以是罐體積的10-95%,優(yōu)選25%-80%,如下表1中所示。應(yīng)當(dāng)理解，在其中繁殖階段是多步驟程序的方法中，繁殖可以在逐漸增加尺寸的培養(yǎng)容器中進(jìn)行，直至獲得足夠數(shù)目的細(xì)胞用于進(jìn)入最終的培養(yǎng)容器。例如，可以順次使用一個(gè)或多個(gè)5L、50L、100L或500L的培養(yǎng)容器。種子培養(yǎng)容器一般具有5L至1000L的容量。通常，以約0.2-0.4x1(T細(xì)胞/mL的初始密度將細(xì)胞接種到種子培養(yǎng)容器中，并進(jìn)行繁殖直至培養(yǎng)物達(dá)到約1.Gx1()6細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度。通常，最小交叉移種密度為約0.8-約1.5x1(T細(xì)胞/mL。適合于生產(chǎn)所需多肽例如凝血因子VII的一些設(shè)定點(diǎn)(set-point)不一定必需適合于細(xì)胞的最初生長(zhǎng)(在種子培養(yǎng)中或在微載體上)。例如，所述兩個(gè)階段的溫度、溶解氧張力、溶解C02濃度和pH可以不同。在繁殖過(guò)程中進(jìn)行介質(zhì)更換以使細(xì)胞保持存活和生長(zhǎng)，而不收獲培養(yǎng)物上清液用于下游處理。在下面的表1中概括了用于在最終培養(yǎng)容器(包含微載體)中的最后繁殖步驟的可能培養(yǎng)條件。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>-在下列時(shí)才幾更換在l.0—12.Ox10'在l.0-12.Ox106在2.0-10x106細(xì)在2.0—10x106細(xì)的培養(yǎng)基的％細(xì)胞/mL時(shí)更換60細(xì)胞/mL時(shí)更換80月^/mL時(shí)更換80%月&AnL時(shí)更換80%-90%的培養(yǎng)基%的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基生產(chǎn)階段除了對(duì)于本發(fā)明方法而限定的特征和措施外，需要采取許多其他措施用于生產(chǎn)以得到令人滿意的結(jié)果，如下文中將進(jìn)行描述的。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到適合于開(kāi)始生產(chǎn)階段(即適合于對(duì)包含產(chǎn)物的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行下游處理)的值時(shí)，每24小時(shí)收獲60-95%的培養(yǎng)物上清液，優(yōu)選80%。這個(gè)細(xì)胞密度值一般為1-12x1(T細(xì)胞/mL。設(shè)定點(diǎn)可以在這時(shí)進(jìn)行改變，并且設(shè)定在適合于生產(chǎn)所需多肽的值上。通過(guò)允許微載體下沉至罐底部來(lái)進(jìn)行介質(zhì)更換，之后取出所選罐體積百分比的介質(zhì)并向罐中加入相應(yīng)罐體積百分比的新鮮介質(zhì)。一般替換25-90%的罐體積；優(yōu)選地，用新鮮介質(zhì)替換80%的罐體積。然后，將微載體重懸浮于介質(zhì)中，并且一般每10-48小時(shí)，優(yōu)選地每24小時(shí)重復(fù)這一取出介質(zhì)和替換的過(guò)程。該過(guò)程的這個(gè)方面的概述顯示于表2中。表2設(shè)定點(diǎn)范圍優(yōu)選范圍優(yōu)選值C優(yōu)選值D溶解C。2濃度80-200ramHg100-環(huán)mmHg120-180mmHg120-160mmHg6-86.6_7.6對(duì)于CHO為7.0,和對(duì)于B服為6.7-6.9對(duì)于CHO為7.0,和對(duì)于BHK為6.7-6.9溫度26-40'C30-37。C36。C36'C溶解氧張力10-90%飽和20-80%飽和50%50%-更換的培養(yǎng)基的％每10-48小時(shí)更換25-90%的培養(yǎng)基每10-48小時(shí)更換80%的培養(yǎng)基每24小時(shí)更換80%的培養(yǎng)基每24小時(shí)更換80%的培養(yǎng)基任選地，當(dāng)進(jìn)入生產(chǎn)階段時(shí)和在生產(chǎn)階段過(guò)程中可以采用培養(yǎng)的溫度設(shè)定點(diǎn)的下降。當(dāng)進(jìn)入生產(chǎn)階段時(shí)，通常將溫度、溶解氧張力、溶解C02濃度、工作pH和介質(zhì)更換頻率改變?yōu)閷?duì)于生產(chǎn)來(lái)說(shuō)最佳的值。從表1和表2中可以分別看出生長(zhǎng)和生產(chǎn)階段中的溫度范圍和值的實(shí)例。在生產(chǎn)階段期間，對(duì)于CH0細(xì)胞系來(lái)說(shuō)優(yōu)選約36X:的溫度。微裁謬如本文所使用的，微載體是足夠小以允許它們?cè)趹腋∨囵B(yǎng)(以對(duì)細(xì)胞不引起明顯剪切損害的攪拌速率)中使用的顆粒。它們是固體的、多孔的，或具有在表面上有涂層的固體核。微載體可以例如，但不限于，是基于纖維素或葡聚糖的，并且它們的表面(在多孔載體的情況下是內(nèi)和外表面)可以是帶正電的。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可以在W002/29083和"Microcarriercel1culture，principlesandmethods.AmershamPharmaciaBiotech.18-1140—62.EditionAA"中找到。在一系列實(shí)施方案中，微載體具有約150-350um的總體顆粒直徑；并且具有約0.8-2.Omeq/g的正電荷密度。在一系列實(shí)施方案中，微栽體是固體載體。有用的固體微載體包括，但不限于，Cytodex1和Cytodex2(GEHealthcare)。固體載體特別適合于粘附細(xì)胞(貼壁依賴性細(xì)胞)。在另一系列實(shí)施方案中，微栽體是大孔載體。如本文所使用的，大孔載體是顆粒，例如基于纖維素的，其具有下列性質(zhì)(a)它們足夠小以允許它們?cè)趹腋∨囵B(yǎng)(以對(duì)細(xì)胞不引起明顯剪切損害的攪拌速率)中使用；和(b)它們具有足夠大小的孔和內(nèi)部空間以允許細(xì)胞遷移至顆粒的內(nèi)部空間中。在一個(gè)實(shí)施方案中，它們的表面(內(nèi)和外)可以是帶正電的。在一系列實(shí)施方案中，所述載體(a)具有約l50-350um的總體顆粒直徑；(b)具有平均孔開(kāi)^:直徑(poreopeningdiameter)為約15-約40um的孔；和(c)具有約0.8-2.0meq/g的正電荷密度。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)DEAE(N，N，-二乙基氨基乙基)基團(tuán)提供正電荷。有用的大孔載體包括，但不限于，Cytoporel和Cytopore2(GEHealthcare)。特別優(yōu)選的是Cytopore1載體，它具有230um的平均顆粒直徑，30um的平均孔大小，和1.1meq/g的正電荷密度。義說(shuō)一#培#務(wù)伴如本文所使用的，大規(guī)模培養(yǎng)容器具有至少約100L的容量，優(yōu)選至少約500L，更優(yōu)選至少約1000L,和最優(yōu)選至少約5000L。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程在至少2個(gè)不同的培養(yǎng)容器中進(jìn)行運(yùn)作的情況下，例如一個(gè)或多個(gè)種子培養(yǎng)容器(第一繁殖步驟)，隨后為生產(chǎn)培養(yǎng)容器(最后的繁殖步驟，隨后為生產(chǎn)階段)，該過(guò)程一般包括將約50L經(jīng)增殖的種子培養(yǎng)物(約1.Ox1()6細(xì)胞/mL)轉(zhuǎn)移至包含150L培養(yǎng)基的500L培養(yǎng)容器中。在適當(dāng)?shù)睦鐪囟取H、溶解氧張力(DOT)、溶解C()2濃度和攪動(dòng)速率條件下維持大規(guī)模培養(yǎng)，并且通過(guò)向培養(yǎng)容器中加入介質(zhì)而逐漸增加體積。在微載體方法的情況下，培養(yǎng)容器還包括相應(yīng)于I-IOg/L的最終微載體濃度的微載體量。轉(zhuǎn)移后，細(xì)胞通常在最初24小時(shí)內(nèi)遷移至載體的表面上或的栽體的內(nèi)部中。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞培養(yǎng)液"和"培養(yǎng)基"(或簡(jiǎn)單地稱為"介質(zhì)")指用于培育真核細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)液，它一般提供至少一種來(lái)自一個(gè)或多個(gè)下列類別的組分(1)促成介質(zhì)重量摩爾滲透壓濃度的鹽，例如鈉、鉀、鎂和鈣；(2)能量來(lái)源，通常為碳水化合物的形式例如葡萄糖；(3)所有必需氨基酸，并且通常為基本的那一組20種氨基酸；(4)以低濃度需要的維生素和/或其他有機(jī)化合物；和(5)微量元素，其中微量元素被定義為一般以極低濃度需要的，通常處于微體積摩爾濃度范圍內(nèi)的無(wú)機(jī)化合物。所述營(yíng)養(yǎng)液可以任選補(bǔ)充有一種或多種來(lái)自下列任一類別的組分(a)激素及其他生長(zhǎng)因子，例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和表皮生長(zhǎng)因子；和(b)蛋白質(zhì)和組織的水解產(chǎn)物。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基不包含任何源自動(dòng)物的組分。重要地，細(xì)胞培養(yǎng)液包含如上文進(jìn)一步限定的植物蛋白水解產(chǎn)物。本發(fā)明包括在缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的介質(zhì)中培養(yǎng)真核細(xì)胞。如本文所使用的，"動(dòng)物來(lái)源"組分是在完整動(dòng)物中產(chǎn)生的(例如，從血清中分離和純化的蛋白質(zhì))或通過(guò)使用在完整動(dòng)物中產(chǎn)生的組分來(lái)生產(chǎn)的(例如，通過(guò)使用從動(dòng)物中分離和純化的酶來(lái)水解植物來(lái)源的材料而制得的氨基酸)任何組分。相反地，具有動(dòng)物蛋白序列(即具有動(dòng)物基因組來(lái)源)但在介質(zhì)中于體外在細(xì)胞培養(yǎng)中(例如在重組酵母或細(xì)菌細(xì)胞中，或在重組或非重組的已建立的連續(xù)真核細(xì)胞系中)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不是"動(dòng)物來(lái)源"組分，所述介質(zhì)缺乏在完整動(dòng)物中產(chǎn)生并從中分離和純化出的組分，(例如，在酵母或細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的胰島素，或在已建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系例如CH0、BHK或HEK細(xì)胞中產(chǎn)生的胰島素，或在Namalwa細(xì)胞中產(chǎn)生的干擾素)。例如，具有動(dòng)物蛋白序列(即具有動(dòng)物基因組來(lái)源)但在缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的介質(zhì)中于重組細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(例如，在酵母或細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的胰島素)不是"動(dòng)物來(lái)源組分"。因此，缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的細(xì)胞培養(yǎng)基是可以包含重組產(chǎn)生的動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基；然而，這樣的培養(yǎng)基不包含例如動(dòng)物血清或者從動(dòng)物血清中純化的蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物。這樣的培養(yǎng)基可以例如包含一種或多種來(lái)源于植物的組分?？梢允褂迷诒景l(fā)明的條件下支持細(xì)胞生長(zhǎng)和維持的任何細(xì)胞培養(yǎng)基，特別是缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的細(xì)胞培養(yǎng)基。通常，培養(yǎng)基包含水、重量摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)劑、緩沖液、能量來(lái)源、氨基酸、無(wú)機(jī)或重組的鐵源、一種或多種合成或重組的生長(zhǎng)因子、維生素和輔助因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基缺乏動(dòng)物來(lái)源組分并缺乏蛋白質(zhì)("無(wú)蛋白質(zhì)的")。缺乏動(dòng)物來(lái)源組分和/或蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商例如Sigma、SAFCBiosciences、Gibco和Gemini獲得。除了常規(guī)組分外，適合于生產(chǎn)凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的介質(zhì)包含維生素K,其是凝血因子VII中的谷氨酸殘基的Y-羧化作用所必需的，濃度為約0.l-50mg/L，優(yōu)選約0.5-25mg/L，更優(yōu)選約1-10mg/L，和最優(yōu)選約5mg/L。適合于在本發(fā)明中使用的介質(zhì)可從供應(yīng)商例如Gibco和SAFCBiosciences獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，介質(zhì)如表3a中所示構(gòu)成。下表(表3a)是適合于在本發(fā)明中使用的介質(zhì)的組成。表3a<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>在一個(gè)實(shí)施方案中，介質(zhì)如表3b中所示構(gòu)成。下表(表3b)是適合于在本發(fā)明中使用的介質(zhì)的組成。表3b<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>介質(zhì)優(yōu)選是缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的介質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，介質(zhì)是商購(gòu)可得的、缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的、無(wú)蛋白質(zhì)的CHO介質(zhì)(SAFCBiosciences)。在某些實(shí)施方案中，在本發(fā)明實(shí)施中使用的細(xì)胞適應(yīng)于在缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的介質(zhì)，例如缺乏血清的介質(zhì)中懸浮生長(zhǎng)。這樣的適應(yīng)程序4笛述于，j:i口Scharfenberg，等人,」//邁a/Ce//Tec力/2o/o^K"e7e/o/7/z7e/^5"fo『ar^51f力eCe//^r/,E.C.Beuvery等人(編者)，KluwerAcademicPublishers,第619—623頁(yè)，1995(BHK和CH0細(xì)月包)；Cruz,"/Wec/wo/.7bc力.11:117—120,1997(昆蟲(chóng)細(xì)胞)；Keen,Cj^c^ec力"o/.17:203-211，1995(骨髓瘤細(xì)胞)；Berg等人，A/Wec力//《"^14:972-978，1993(人腎293細(xì)胞)中。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是BHK21或CH0或HEK293細(xì)胞，它們已被改造成表達(dá)人凝血因子VII，并且已適應(yīng)在不存在血清或動(dòng)物來(lái)源組分的情況下生長(zhǎng)。在本發(fā)明中可用的培養(yǎng)容器可以例如基于常規(guī)的攪拌罐式反應(yīng)器(CSTR)，其中攪動(dòng)通過(guò)常規(guī)葉輪類型而獲得，或者氣升式反應(yīng)器，其中攪動(dòng)通過(guò)從容器底部導(dǎo)入空氣而獲得。一般控制在特定界限內(nèi)的進(jìn)一步的參數(shù)包括pH、溶解氧張力(DOT)、溶解C0,濃度和溫度。溶解氧張力可以通過(guò)例如噴射純氧來(lái)維持。溶解C02濃度可以通過(guò)噴射空氣來(lái)維持。溫度控制媒介物一般是水，必要時(shí)加熱或冷卻。水可以流過(guò)圍繞容器的夾套或流過(guò)浸入培養(yǎng)物中的盤(pán)管。術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)容器"可以與"罐"、"反應(yīng)器"、"發(fā)酵罐"和"生物反應(yīng)器"互換使用。下游處理一旦將介質(zhì)從培養(yǎng)容器中取出，就可對(duì)其實(shí)施一個(gè)或多個(gè)處理步驟以獲得所需蛋白質(zhì)，包括，但不限于，離心或過(guò)濾以去除沒(méi)有固定在載體中的細(xì)胞；親和色譜，疏水相互作用色譜；離子交換色譜；大小排阻色譜；電泳程序(例如制備型等電聚焦(IEF)電泳)，差異溶解度(例如，硫酸銨沉淀)，或提取等。一般可參見(jiàn)，Scopes,尸rofe//7尸wW/7ca〃叫Springer-Verlag,NewYork,1982;和戶rc^e/"尸wr/Z7ca〃0/，J._C.Janson和LarsRyden，編者,VCHPublishers，NewYork,1989。凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的純化可以涉及，例如在抗凝血因子VII抗體柱上的親和色譜(參見(jiàn)，例如，Wakabayashi等人，/."/o人C力e瓜261:11097，1986;和Thim等人，"/oc力e瓜27:7785，1988)，和通過(guò)蛋白水解切割而激活，其中使用凝血因子X(jué)IIa或具有胰蛋白酶樣特異性的其他蛋白酶，例如凝血因子IXa、激肽釋it酵、凝血因子X(jué)a和凝血酵原、。參見(jiàn)，伊J^t口0sterud等人，^'oc力e瓜11:2853(1972);Thomas,美國(guó)專利號(hào)4，456，591;和Hedner等人，/.//^eW.71:1836(1983)。備選地，凝血因子VII可以通過(guò)使其經(jīng)過(guò)離子交換色譜柱，例如MonoQ(Pharmacia)等，來(lái)激活。下列實(shí)施例旨在作為本發(fā)明的非限制性的舉例說(shuō)明。實(shí)施例實(shí)施例1:無(wú)血清地生產(chǎn)凝血因子VII(小型中試規(guī)模培養(yǎng))進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以在小型中試規(guī)模培養(yǎng)(20L)中生產(chǎn)凝血因子VII。圖1中顯示了培養(yǎng)過(guò)程的流程圖。該過(guò)程的生產(chǎn)部分是高細(xì)胞密度(HCD)過(guò)程，其中細(xì)胞借助于微載體而保留在發(fā)酵罐中。從FVII生產(chǎn)性細(xì)胞系的細(xì)胞庫(kù)中解凍出細(xì)胞。該FVII生產(chǎn)性細(xì)胞系是CH0K1細(xì)胞系，其用編碼凝血因子VII的基因轉(zhuǎn)染，并且適應(yīng)于在不存在動(dòng)物來(lái)源組分的情況下在無(wú)血清懸浮液中生長(zhǎng)。解凍后，細(xì)胞順次在增加尺寸的旋轉(zhuǎn)瓶中在無(wú)動(dòng)物來(lái)源組分的液體介質(zhì)中繁殖。用于繁殖的介質(zhì)含有濃度為約5.0g/L的大豆蛋白水解產(chǎn)物。隨著細(xì)胞數(shù)目增加，通過(guò)添加新介質(zhì)來(lái)逐漸增加體積。所使用的介質(zhì)不含血清及其他動(dòng)物來(lái)源組分。當(dāng)體積達(dá)到4L，并且細(xì)胞數(shù)目達(dá)到《0.8x107ml時(shí)，將旋轉(zhuǎn)瓶的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至20L攪拌罐式反應(yīng)器(小型中試規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵罐)中。該生產(chǎn)發(fā)酵罐包含大孔Cytopore載體(GEHealthcare)，并且在將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)發(fā)酵罐中后，將細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)固定在載體中。隨著細(xì)胞數(shù)目增加，通過(guò)添加新介質(zhì)來(lái)逐漸增加生產(chǎn)發(fā)酵罐中的體積。幾天后，當(dāng)體積達(dá)到20L時(shí)，開(kāi)始生產(chǎn)階段。在生產(chǎn)發(fā)酵罐中使用的介質(zhì)含有濃度為1.25g/L(實(shí)施方案a)或5.0g/L(參照)的大豆蛋白水解產(chǎn)物。在生產(chǎn)階段期間，每24小時(shí)進(jìn)行介質(zhì)更換停止攪動(dòng)以允許載體沉淀，隨后收獲約80%的培養(yǎng)物上清液并用新介質(zhì)替換。將收獲的培養(yǎng)物上清液轉(zhuǎn)移以用于下游處理。在生產(chǎn)階段中該過(guò)程以這種方式進(jìn)行數(shù)周。在生產(chǎn)發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物在約36。C的溫度，約50%用空氣飽和的溶解氧水平，和約100-150mmHg的溶解C02水平下維持。在生產(chǎn)階段期間，細(xì)胞密度達(dá)到1-2x1(T細(xì)胞/ml，并且在每日收獲物中的FVII濃度達(dá)到10-20mg/L。pH維持在6.70以上。圖2中的圖表顯示了來(lái)自在20L發(fā)酵罐(小型中試規(guī)模發(fā)酵罐)中的微載體培養(yǎng)的結(jié)果。該圖表舉例說(shuō)明了，當(dāng)在生產(chǎn)發(fā)酵罐中使用1.25g/L大豆水解產(chǎn)物代替5.0g/L大豆水解產(chǎn)物時(shí)，與凝血因子VII生產(chǎn)率有關(guān)的穩(wěn)定性的差異。實(shí)施例2:無(wú)血清地生產(chǎn)凝血因子VII(大型中試規(guī)模培養(yǎng))從FVII生產(chǎn)性細(xì)胞系的細(xì)胞庫(kù)中解凍出細(xì)胞。該FVII生產(chǎn)性細(xì)胞系是CH0K1細(xì)胞系，其用編碼凝血因子VII的基因轉(zhuǎn)染，并且適應(yīng)于在不存在動(dòng)物來(lái)源組分的情況下在無(wú)血清懸浮液中生長(zhǎng)。解凍后，細(xì)胞順次在增加尺寸的旋轉(zhuǎn)瓶中在無(wú)動(dòng)物來(lái)源組分的液體介質(zhì)中繁殖。用于繁殖的介質(zhì)含有濃度為約5.0g/L的大豆蛋白水解產(chǎn)物。隨著細(xì)胞數(shù)目增加，通過(guò)添加新介質(zhì)來(lái)逐漸增加體積。所使用的介質(zhì)不含血清及其他動(dòng)物來(lái)源組分。當(dāng)體積達(dá)到4L，并且細(xì)胞數(shù)目達(dá)到《0.8x107ml時(shí)，將旋轉(zhuǎn)瓶的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至50L攪拌罐式反應(yīng)器(種子發(fā)酵罐)中。在50L發(fā)酵罐中用于繁殖的介質(zhì)含有濃度為約5.0g/L的大豆蛋白水解產(chǎn)物。隨著細(xì)胞數(shù)目增加，通過(guò)添加新介質(zhì)來(lái)逐漸增加體積。所使用的介質(zhì)不含血清及其他動(dòng)物來(lái)源組分。當(dāng)體積達(dá)到50L，并且細(xì)胞數(shù)目達(dá)到a1.0xl0Vml時(shí)，將50L發(fā)酵罐的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至500L攪拌罐式反應(yīng)器(大型中試規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵罐)中。該生產(chǎn)發(fā)酵罐包含大孔Cytopore載體(GEHealthcare)，并且在將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)發(fā)酵罐中后，將細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)固定在載體中。隨著細(xì)胞數(shù)目增加，通過(guò)添加新介質(zhì)來(lái)逐漸增加生產(chǎn)發(fā)酵罐中的體積。幾天后，當(dāng)體積達(dá)到450L時(shí)，開(kāi)始生產(chǎn)階段。在生產(chǎn)發(fā)酵罐的繁殖階段中使用的介質(zhì)含有濃度為5g/L的大豆蛋白水解產(chǎn)物，而在生產(chǎn)階段中使用的介質(zhì)含有濃度為1g/L的大豆蛋白水解產(chǎn)物(實(shí)施方案a)。在參照運(yùn)行中，介質(zhì)在繁殖階段中含有的大豆蛋白水解產(chǎn)物的濃度與在生產(chǎn)階段中一樣。在生產(chǎn)階段期間，每24小時(shí)進(jìn)行介質(zhì)更換停止攪動(dòng)以允許載體沉淀，隨后收獲約80%的培養(yǎng)物上清液并用新介質(zhì)替換。將收獲的培養(yǎng)物上清液轉(zhuǎn)移以用于下游處理。在生產(chǎn)階段中該過(guò)程以這種方式進(jìn)行數(shù)周。在生產(chǎn)發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物在約36。C的溫度，約50%用空氣飽和的溶解氧水平，和約100-150mmHg的溶解0)2水平下維持。在生產(chǎn)階段期間，細(xì)胞密度達(dá)到1-2x1()7細(xì)胞/ml,并且在每日收獲物中的FVII濃度達(dá)到10-20mg/L。pH維持在6.70以上。圖3中的圖表顯示了來(lái)自在500L發(fā)酵罐(大型中試規(guī)模發(fā)酵罐)中的微載體培養(yǎng)的結(jié)果。該圖表舉例說(shuō)明了，當(dāng)在生產(chǎn)發(fā)酵罐的生產(chǎn)階段中使用1g/L大豆水解產(chǎn)物代替5g/L大豆水解產(chǎn)物時(shí)，與凝血因子VII生產(chǎn)率有關(guān)的穩(wěn)定性的差異。實(shí)施例3:無(wú)血清地生產(chǎn)凝血因子VII(大規(guī)模)從FVII生產(chǎn)性細(xì)胞系的細(xì)胞庫(kù)中解凍出細(xì)胞。該FVII生產(chǎn)性細(xì)胞系是CHO細(xì)胞系，其用編碼凝血因子VII的基因轉(zhuǎn)染，并且適應(yīng)于在無(wú)血清懸浮液中生長(zhǎng)。解凍后，細(xì)胞順次在增加尺寸的旋轉(zhuǎn)瓶中繁殖。隨著細(xì)胞數(shù)目增加，通過(guò)添加新介質(zhì)來(lái)逐漸增加體積。所使用的介質(zhì)不含血清及其他動(dòng)物來(lái)源組分。最后，將4L旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至第一個(gè)種子發(fā)酵罐步驟(50L發(fā)酵罐)。隨著細(xì)胞數(shù)目增加，將種子發(fā)酵罐中的體積逐漸增加至50L。然后將50L種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至第二個(gè)種子發(fā)酵罐步驟(500L發(fā)酵罐)。隨著500L種子發(fā)酵罐中的細(xì)胞數(shù)目增加，將體積逐漸增加至500L。生產(chǎn)發(fā)酵罐(5000L)包含大孔Cytopore栽體(GEHealthcare)，并且在將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)發(fā)酵罐中后，將細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)固定在載體中。隨著細(xì)胞數(shù)目增加，通過(guò)添加新介質(zhì)來(lái)逐漸增加生產(chǎn)發(fā)酵罐中的體積。旋轉(zhuǎn)瓶、種子發(fā)酵罐和生產(chǎn)發(fā)酵罐的繁殖階段中的介質(zhì)含有濃度(d)為約5g/L的大豆水解產(chǎn)物。幾天后，當(dāng)體積達(dá)到4500L時(shí)，開(kāi)始生產(chǎn)階段。在生產(chǎn)階段期間，每24小時(shí)進(jìn)行介質(zhì)更換停止攪動(dòng)以允許載體沉淀，隨后收獲約80%的培養(yǎng)物上清液并用新介質(zhì)替換。生產(chǎn)階段中的介質(zhì)含有濃度(C2)為約1g/L的大豆水解產(chǎn)物。將收獲的培養(yǎng)物上清液轉(zhuǎn)移以用于下游處理。在生產(chǎn)階段中該過(guò)程以這種方式進(jìn)行數(shù)周。在生產(chǎn)發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物在約36。C的溫度，約50%用空氣飽和的溶解氧水平，和在100-180mmHg例如100-150miiiHg范圍內(nèi)的溶解C02水平下維持。安裝好所有生物反應(yīng)器(50L、500L、5000L)以控制溫度、溶解氧(通過(guò)微量噴射器噴射氧)、攪動(dòng)速率、頂部空間通氣速率和pH(通過(guò)向頂部空間添加C02氣體向下調(diào)控，而不通過(guò)添加堿向上調(diào)控)。此外，安裝好生產(chǎn)發(fā)酵罐(5000L)以控制溶解的C02。借助于YSI8500CO廣裝置進(jìn)行在線COr測(cè)量。根據(jù)0)2信號(hào)，通過(guò)經(jīng)由管將大氣空氣噴射到液體中來(lái)控制co2水平。當(dāng)co2濃度在設(shè)定點(diǎn)或以下時(shí)，將噴射速率設(shè)定為0L/分鐘/L培養(yǎng)液，和當(dāng)C02濃度處于設(shè)定點(diǎn)以上時(shí)，將噴射速率設(shè)定為0.01-0.05L/分鐘/L培養(yǎng)液。在生產(chǎn)階段期間，細(xì)胞密度達(dá)到1-2x107細(xì)胞/ml,并且在每日收獲物中的FVII濃度達(dá)到10_20mg/L。pH維持在6.70以上。權(quán)利要求1.用于在包含在無(wú)血清培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括(i)所述細(xì)胞的繁殖階段，其中使所述細(xì)胞在第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中繁殖，和(ii)所述細(xì)胞的生產(chǎn)階段，其中所述細(xì)胞存在于第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)液各自包含植物蛋白水解產(chǎn)物，并且其中第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C1)和第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C2)之比為至少1.5∶1(C1∶C2)。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述比例C1:&為2:1-10:1。3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述濃度G為0.2-3.5g/L。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述濃度d為4.0-10.0g/L。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物蛋白水解產(chǎn)物是大豆蛋白水解產(chǎn)物。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽是凝血因子VII多肽。7.用于在包含在無(wú)血清培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述細(xì)胞的繁殖階段，其中使所述細(xì)胞在第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中繁殖，和(ii)所述細(xì)胞的生產(chǎn)階段，其中所述細(xì)胞存在于第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中，其中所述第一種細(xì)胞培養(yǎng)液包含濃度為4.0-10.0g/L的大豆蛋白水解產(chǎn)物，所述第二種細(xì)胞培養(yǎng)液包含濃度為0.2-3.5g/L的大豆蛋白水解產(chǎn)物，并且其中所述笫一種細(xì)胞培養(yǎng)液中大豆蛋白水解產(chǎn)物的濃度(c,)和所述第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中大豆蛋白水解產(chǎn)物的濃度(c2)之比為至少1.5:1(d:C2)。8.用于在包含在無(wú)血清培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述細(xì)胞的繁殖階段，其中使所述細(xì)胞在第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中繁殖，和(ii)所述細(xì)胞的生產(chǎn)階段，其中所述細(xì)胞存在于第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)液各自包含植物蛋白水解產(chǎn)物，例如大豆蛋白水解產(chǎn)物，并且其中所述第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C2)為0.7-3.0g/L。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述濃度C2為0.9-2.5g/L。10.根據(jù)權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)液各自包含植物蛋白水解產(chǎn)物，并且其中所述第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(d)和所述第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C2)之比為至少1.5:1。11，根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述濃度d為4.0-10.0g/L。12.根據(jù)權(quán)利要求l-6、7和8-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度具有下列特性在所述繁殖階段中的高濃度(d);在所述生產(chǎn)階段中的低濃度-低水平A(C2A)在所述生產(chǎn)階段中的低濃度-低水平B(C2B)在所述生產(chǎn)階段中的低濃度-低水平A(C2A)在所述生產(chǎn)階段中的低濃度-低水平B(C2B);等，其中d》C2B〉C"，并且濃度Cu和"在對(duì)于C2而指定的濃度范圍內(nèi)，并且其中當(dāng)觀察到細(xì)胞數(shù)目減少時(shí)，進(jìn)行從低水平A(Cu)至低水平B(C2B)的首次轉(zhuǎn)換，和當(dāng)細(xì)胞數(shù)目已恢復(fù)至大約相應(yīng)于減少前水平的水平時(shí)，進(jìn)行從低水平B(C2B)至低水平A(C2A)的后續(xù)轉(zhuǎn)換。全文摘要本發(fā)明涉及用于在包含在無(wú)血清培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括(i)所述細(xì)胞的繁殖階段，其中細(xì)胞在第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中繁殖，和(ii)所述細(xì)胞的生產(chǎn)階段，其中細(xì)胞存在于第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)液各自包含植物蛋白水解產(chǎn)物，并且其中第一種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C<sub>1</sub>)和第二種細(xì)胞培養(yǎng)液中植物蛋白水解產(chǎn)物的濃度(C<sub>2</sub>)之比為至少1.5∶1(C<sub>1</sub>∶C<sub>2</sub>)。文檔編號(hào)C12P21/02GK101120085SQ200680004744公開(kāi)日2008年2月6日申請(qǐng)日期2006年2月6日優(yōu)先權(quán)日2005年2月11日發(fā)明者I·M·克努德森申請(qǐng)人:諾和諾德醫(yī)療保健公司