專利名稱：：殘粒樣脂蛋白(rlp)中的膽固醇的定量方法、試劑及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在臨床檢查中被認(rèn)為是動(dòng)脈硬化癥等的危險(xiǎn)因子的殘粒樣脂蛋白(以下簡(jiǎn)稱為RLP)中的膽固醇的定量方法、試劑及試劑盒。
背景技術(shù)：
：血液中含有各種脂蛋白。根據(jù)比重不同，這些脂蛋白分類為乳糜微粒(以下簡(jiǎn)稱為CM)、極低密度脂蛋白(以下簡(jiǎn)稱為VLDL)、低密度脂蛋白(以下簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)DL)、高密度脂蛋白(以下簡(jiǎn)稱為HDL)。各種脂蛋白其膽固醇、甘油三酯、磷脂、蛋白質(zhì)等構(gòu)成成分的比例不同，在生物體內(nèi)具有不同的作用。在臨床檢查中，HDL中的膽固醇作為動(dòng)脈硬化癥的危險(xiǎn)因素被認(rèn)為是負(fù)因素，LDL中的膽固醇作為動(dòng)脈硬化癥的危險(xiǎn)因素被認(rèn)為是正因素，二者在臨床檢查領(lǐng)域中均被頻繁地測(cè)定。另外，與LDL中的膽固醇相比，起因于脂質(zhì)代謝等而生成的脂蛋白質(zhì)中的膽固醇作為動(dòng)脈硬化癥的危險(xiǎn)因素是更為密切相關(guān)的指標(biāo)。作為起因于脂質(zhì)代謝等而生成的脂蛋白質(zhì)，可列舉出例如RLP。最近，開發(fā)了利用免疫吸附法測(cè)定RLP中的膽固醇(以下簡(jiǎn)稱為RLP-C)的定量法。在本定量法中，應(yīng)用免疫親合色鐠從血清中分離RLP并定量測(cè)定在該分離出的RLP中所含有的膽固醇，所述免疫綜合色譜使用含有抗apoA-I單克隆抗體和不識(shí)別apoB-48的特異抗apoB-100單克隆抗體的親合性凝膠。適用于本定量法的RLP中的膽固醇定量用試劑，可從(林)日本抗體研究所購買(產(chǎn)品名RLP-膽固"JIMRO"II)(參照非專利文獻(xiàn)l、非專利文獻(xiàn)2)E對(duì)于采用該免疫吸附法的RLP-C的定量法，由厚生勞動(dòng)省賦予健康保險(xiǎn)分?jǐn)?shù)。但是，因?yàn)樵摲椒ㄊ菓?yīng)用一種使用了抗體的親合色i普方法，所以必須進(jìn)行試樣的分離操作等，操作繁雜，花費(fèi)時(shí)間。另外，已知一種不需要試樣的分離操作、可以簡(jiǎn)便且靈敏度良好地測(cè)定RLP-C的方法(參照專利文獻(xiàn)1)。專利文獻(xiàn)l:特開2001-231597號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)l:動(dòng)脈硬化、25(9，10)、371(1998)非專利文獻(xiàn)2:ClinicalCheraistry、48(2)、217(2002)
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供一種不需要試樣的分離操作、可以簡(jiǎn)便且靈敏度良好地定量測(cè)定RLP-C的定量方法、試劑以及試劑盒。用于解決課題的手段本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在特定的表面活性劑的組合以及水解磷脂質(zhì)的酶的存在下，膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶對(duì)殘粒樣脂蛋白膽固醇具有特異性的作用，基于這一發(fā)現(xiàn)，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及下述(1)~(20)。(l)試樣中的殘粒樣膽固醇的定量方法，其特征在于，在含有試樣的水性介質(zhì)中，在(a)(i)選自聚氧乙烯聚氧丁烯共聚物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚和聚氧乙烯聚氧丙烯長(zhǎng)支鏈烷基醚中的一種或二種以上的表面活性劑[下文稱為表面活性劑(dl)]，與選自聚氧乙烯聚氧丙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和聚氧乙烯聚氧丙烯短支鏈烷基醚中的一種或二種以上的表面活性劑[下文稱為表面活性劑(d2)]的組合，或者，(ii)聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物[下文稱為表面活性劑(d3)],與選自聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和聚氧乙烯聚氧丙烯短支鏈烷基醚中的一種或二種的表面活性劑[下文稱為表面活性劑(d4)]的組合，以及(b)水解磷脂質(zhì)的酶的存在下，使(c)膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶，或者，在(d)氧化型輔酶的存在下，使膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶，對(duì)試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇發(fā)生作用，生成過氧化氬或者還原型輔酶，然后定量測(cè)定所生成了的過氧化氫或者還原型輔酶。(2)上述(1)中所述的方法，其中，過氧化氫的定量是通過在過氧化物酶的存在下，使生成的過氧化氫與氧化發(fā)色型色素原(chromogen)反應(yīng)，然后定量所生成的色素來進(jìn)行的。(3)上述(1)中所述的方法，其中，還原型輔酶的定量是通過測(cè)定反應(yīng)液的吸光度來進(jìn)行的。(4)上述(1)中所述的方法，其中，還原型輔酶的定量是通過使生成了的還原型輔酶與還原發(fā)色型色素原反應(yīng)，然后定量所生成的色素來進(jìn)行的。(5)上述(1)~(4)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，聚氧乙烯聚氧丁烯共聚物為由通式(I)表示的表面活性劑R0-(C2H40)A-(C4H80)B—(C2H40)c—H(I)(式中，A、B和C相同或不同，表示1200的整數(shù)；R表示氫原子、直鏈或支鏈的烷基)。(6)上述(1)~(5)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，水解磷脂質(zhì)的酶為磷脂酶D、磷脂酶C或者磷脂酶A2。(7)試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑，其特征在于，其中含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、以及表面活性劑(dl)與表面活性劑(d2)的組合、或者表面活性劑(d3)與表面活性劑(d4)的組合。(8)上述(7)中所述的試劑，其中還含有過氧化氫定量用試劑。(9)試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑，其特征在于，其中含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶、以及表面活性劑(dl)與表面活性劑(d2)的組合、或者表面活性劑(d3)與表面活性劑(d4)的組合。(10)上述(9)中所述的試劑，其中還含有還原型輔酶定量用試劑。(11)上述(7)~(10)中任一項(xiàng)所述的試劑，其中，聚氧乙烯聚氧丁烯共聚物為由通式(I)表示的表面活性劑R0-(C2H40)A-(C4H80)B-(C2H40)c-H(I)(式中，A、B和C相同或不同，表示1200的整數(shù)；R表示氫原于、直鏈或支鏈的烷基)。(12)上述(7)~(11)中任一項(xiàng)所述的試劑，其中，水解磷脂質(zhì)的酶為磷脂酶D、磷脂酶C或者磷脂酶A2。(13)試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑盒，其特征在于，其中含有含有表面活性劑(dl)的第l試劑、以及含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的第2試劑；且在第l試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有表面活性劑(d2)。(14)試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑盒，其特征在于，其中含有含有表面活性劑(d3)的第l試劑、以及含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的第2試劑；且在第l試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有表面活性劑(d4)。(15)上述(13)或(14)中所述的試劑盒，其中，在第l試劑、第2試劑的至少一個(gè)中還含有過氧化氫定量用試劑。(16)試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑盒，其特征在于，其中含有含有表面活性劑(dl)的第l試劑、以及含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶的第2試劑；在第l試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有表面活性劑(d2);且在第l試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有氧化型輔酶。(17)試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑盒，其特征在于，其中含有舍有表面活性劑(d3)的第l試劑、以及含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶的第2試劑；在第l試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有表面活性劑(d4);且在第1試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有氧化型輔酶。(18)上述(16)或(17)中所述的試劑盒，其中，在第l試劑、笫2試劑的至少一個(gè)還含有還原型輔酶定量用試劑。(19)上述(13)、(15)、(16)或(18)中所述的試劑盒，其中，聚氧乙烯聚氧丁烯共聚物為由通式(I)表示的表面活性劑R0-(C2H40)a-(C4H80)B-(C2H40)c-H(I)(式中，A、B和C相同或不同，表示1~200的整數(shù)；R表示氫原子、直鏈或支鏈的烷基)。(20)上述(13)~(19)中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，水解禱脂質(zhì)的酶為磷脂酶D、磷脂酶C或者磷脂酶A2。發(fā)明的效果按照本發(fā)明，可以提供一種不需要試樣的分離操作而可以簡(jiǎn)便且靈敏度良好地定量測(cè)定RLP-C的方法、試劑及試劑盒。圖1表示使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)的定量法與實(shí)施例4的定量法的相關(guān)圖。圖2表示使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)的定量法與實(shí)施例5的定量法的相關(guān)圖。圖3表示使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)的定量法與實(shí)施例6的定量法的相關(guān)圖。圖4表示使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)的定量法與比較例2的定量法的相關(guān)圖。圖5表示使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)的定量法與實(shí)施例11的定量法的相關(guān)圖。圖6表示使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)的定量法與實(shí)施例12的定量法的相關(guān)圖。圖7表示使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)的定量法與實(shí)施例13的定量法的相關(guān)圖。圖8表示使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)的定量法與實(shí)施例14的定量法的相關(guān)圖。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中，所謂"殘粒樣脂蛋白(RLP)"的術(shù)語，是指將VLDL殘粒與CM殘粒通稱的脂蛋白。另夕卜，所謂"殘粒樣脂蛋白膽固醇(RLP-C)"的術(shù)語，是指將RLP中的酯型膽固醇和游離型膽固醇通稱的意思。因此，RLP-C包括VLDL殘粒中的酯型膽固醇、VLDL殘粒中的游離型膽固醇、CM殘粒中的酯型膽固醇和CM殘粒中的游離型膽固醇。按照本發(fā)明的定量方法，可以定量分析全血、血漿、血清等試樣中的RLP-C。本發(fā)明的特征在于，在水解磷脂質(zhì)的酶的存在下，作為可使用于膽固醇定量反應(yīng)的酶特異地作用于RLP-C的表面活性劑是下迷組合，這些組合具有優(yōu)良的效果，所述組合為由選自聚氧乙烯聚氧丁烯共聚物(以下簡(jiǎn)稱為P0E'P0B共聚物)、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚(以下簡(jiǎn)稱為POE苯乙烯化苯基醚)和聚氧乙烯聚氧丙烯長(zhǎng)支鏈烷基醚(以下簡(jiǎn)稱為POE'POP長(zhǎng)支鏈烷基醚)中的一種或二種以上的表面活性劑[下文稱為表面活性劑(dl)]、與選自聚氧乙烯聚氧丙烯烷基芳基醚(以下簡(jiǎn)稱為POE.POP烷基芳基醚)、聚氧乙烯烷基芳基醚(以下筒稱為POE烷基芳基醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(以下簡(jiǎn)稱為POE.POP烷基醚)和聚氧乙烯聚氧丙烯短支鏈烷基醚(以下簡(jiǎn)稱為POE.POP短支鏈烷基醚)中的一種或二種以上的表面活性劑[下文稱為表面活性劑(d2)]形成的組合，或者，由聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物(以下簡(jiǎn)稱為POEPOP共聚物)[下文稱為表面活性劑(d3)〗，與選自聚氧乙烯烷基芳基醚(以下簡(jiǎn)稱為POE烷基芳基醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(以下簡(jiǎn)稱為POE.POP烷基醚)和聚氧乙烯聚氧丙烯短支鏈烷棊醚(以下簡(jiǎn)稱為POE'POP短支鏈烷基醚)中的一種或二種的表面活性劑[下文稱為表面活性劑(d4)]形成的組合。即，這些表面活性劑的組合，在水解磷脂質(zhì)的酶的存在下，能使膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氬酶對(duì)RLP-C產(chǎn)生特異性作用。根據(jù)本發(fā)明方法，試樣中的RLP-C可以通過如下方法來定量在水性介質(zhì)中，在水解磷脂質(zhì)的酶的存在下，在能使膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶對(duì)RLP-C產(chǎn)生特異性作用的表面活性劑的組合，即，(i)表面活性劑(dl)與表面活性劑(d2)的組合、或者(ii)表面活性劑(d3)與表面活性劑(d4)的組合的存在下，在(c)膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶，或者在(d)氧化型輔酶的存在下，使膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶，對(duì)試樣中的RLP-C發(fā)生作用，生成過氧化氫或還原型輔酶，然后定量生成的過氧化氫或還原型輔酶。通過在氧的存在下，使膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶作用于試樣中的RLP-C,使得試樣中的RLP中的酯型膽固醇由于膽固醇酯水解酶的作用而轉(zhuǎn)變成游離型膽固醇，由該轉(zhuǎn)變而生成的游離型膽固醇和RLP中的游離型膽固醇與氧，通過膽固醇氧化酶的作用，生成過氧化氫。另外，通過在氧化型輔酶的存在下，使膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶作用于試樣中的RLP-C，使得試樣中的RLP中的酯型膽固醇由于膽固醇酯水解酶的作用而轉(zhuǎn)變成游離型膽固醇，由該轉(zhuǎn)變而生成的游離型膽固醇和RLP中的游離型膽固醇與氧化型輔酶，通過膽固醇脫氫酶的作用，生成還原型輔酶。酶反應(yīng)是在緩沖液等水溶液中進(jìn)行的，所述緩沖液含有表面活性劑(dl)和表面活性劑(d2)的組合、或者表面活性劑(d3)和表面活性劑U4)的組合，以及在水解磷脂質(zhì)的酶的存在下，用于膽固醇定量所必須的膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氬酶(在使用膽固醇脫氫酶時(shí)，氧化型輔酶是必需的)。在表面活性劑(dl)和表面活性劑(d2)的組合、以及表面活性劑(d3)和表面活性劑(d4)的組合中，作為表面活性劑(dl)、表面活性劑U2)、表面活性劑(d3)、表面活性劑(d4)，可以使用構(gòu)成表面活性劑(dl)~(d4)的表面活性劑中的一種或二種以上。作為表面活性劑(dl)和表面活性劑(d2)的組合，可列舉出表1~表7中所示的組合。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在表面活性劑(dl)與表面活性劑(d2)的組合中，優(yōu)選在水解磷脂質(zhì)的酶的存在下促使膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶對(duì)殘粒樣脂蛋白膽固醇產(chǎn)生特異性作用的作用強(qiáng)的組合。具體地說，優(yōu)選表1中記載的P0E'P0B共聚物與表面活性劑(d2)的組合。在POE.POB共聚物與表面活性劑(d2)的組合中，更優(yōu)選表8中所示的以下組合。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>作為表面活性劑(d3)與表面活性劑(d4)的組合，可列舉出下述表9中所示的組合。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在表面活性劑(d3)和表面活性劑(d4)的組合中，優(yōu)選在水解磷脂質(zhì)的酶的存在下促使膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶對(duì)RLP-C產(chǎn)生特異性作用的作用強(qiáng)的組合。具體地說，優(yōu)選表10中所示的以下組合。表10表面活性劑(d3)表面活性劑(d4)POE.P0P共聚物POE.P0P烷基醚POE.P0P共聚物POE.POP短支鏈烷基醚P0E,P0P共聚物P0E烷基芳基醚POE.P0P烷基醚P0E,P0P共聚物P0E烷基芳基醚POE.POP短支鏈烷基醚POE.P0P共聚物POE.P0P烷基醚POE.POP短支鏈烷基醚根據(jù)反應(yīng)生成的過氧化氫或還原型輔酶的定量，按照其本身公知的方法來進(jìn)行。在酶反應(yīng)的反應(yīng)液中，根據(jù)需要，也可以在環(huán)糊精或其衍生物、白蛋白或脂蛋白凝聚劑的存在下進(jìn)行。由于環(huán)糊精或其衍生物、白蛋白或脂蛋白凝聚劑可以抑制酶對(duì)殘粒樣脂蛋白以外的脂蛋白膽固醇所產(chǎn)生的作用，因此是優(yōu)選的。另外，根據(jù)需要，在不影響RLP-C定量反應(yīng)的特異性的范圍內(nèi)，在酶反應(yīng)的反應(yīng)液中也可以共存下列物質(zhì)為了使膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶活化而經(jīng)常使用的酶活化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、抗干擾劑，以及用于使生物試樣中的球蛋白等蛋白質(zhì)增溶的各種鹽類。膽固醇酯水解反應(yīng)、游離膽固醇的氧化或脫氬反應(yīng)，可以在水解磷脂質(zhì)的酶、以及表面活性劑(dl)與表面活性劑(d2)的組合、或者表面活性劑(d3)與表面活性劑(d4)的組合的存在下依次進(jìn)行。另外，也可以預(yù)先使試樣與表面活性劑在水溶液中接觸，然后向該溶液中添加水解磷脂質(zhì)的酶以及參與膽固醇反應(yīng)的酶，以進(jìn)行膽固醇的反應(yīng)。膽固醇的反應(yīng)也可以在含有RLP-C定量所必需的全部成分的水溶液中進(jìn)行，但也可以通過將RLP-C的定量所必需的成分分成2~3組，將分組的成分依次添加到反應(yīng)液中來進(jìn)行。RLP-C的定量?jī)?yōu)選使用下述的RLP-C定量用試劑盒來進(jìn)行。在水性介質(zhì)中，膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶和膽固醇脫氫酶，通常按0.001~400U/mL、優(yōu)選按0.01~200U/mL、更優(yōu)選按0.05~100U/mL的濃度來使用。水性介質(zhì)中，水解磷脂質(zhì)的酶的濃度沒有特殊限制，優(yōu)選為0.001~400U/mL，更優(yōu)選為0.01~200U/mL，特別優(yōu)選為0.05~100U/mL。水性介質(zhì)中，表面活性劑(dl)、表面活性劑(d2)、表面活性劑(d3)和表面活性劑(d4)的濃度，分別優(yōu)選為0.001~5(w/v)%,更優(yōu)選為0.005~2.5(w/v)%，特別優(yōu)選為0.05~1(w/v)%。酶反應(yīng)通常在10~50"C、優(yōu)選在20~40'C的溫度下進(jìn)行，通常在2~30分鐘內(nèi)結(jié)束。生成的過氧化氫例如通過下列方法進(jìn)行定量在過氧化物酶的存在下，過氧化氫與可通過氧化而轉(zhuǎn)換成色素的色素原反應(yīng)生成色素，在生成的色素的吸收最大波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度的變化，由此進(jìn)行定量。另外，用例如化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，例如魯米諾、異魯米諾、光澤精、吖啶鎮(zhèn)酯等與過氧化氫反應(yīng)生成光子，通過定量生成的光子來定量生成的過氧化氫。還原型輔酶例如可以通過在300~500nm、優(yōu)選330~400nm、更優(yōu)選340nm左右處通過測(cè)定由酶反應(yīng)生成的含還原型輔酶的溶液的吸光度來定量。另外，生成的還原型輔酶可以通過例如在心肌黃酶或電子載體的存在下，使還原型輔酶與可通過還原而轉(zhuǎn)換成色素的色素原反應(yīng)生成色素，并在例如生成的色素的吸收最大波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度的變化，由此來定量。電子載體的例子為1-甲氧基-5-甲基吩喚鎮(zhèn)硫酸曱酯。使用例如預(yù)先已知濃度的含有RLP-C的試樣，制成表示膽固醇濃度與過氧化氫或還原型輔酶的量之間的關(guān)系的校準(zhǔn)曲線，就可以據(jù)此求出試樣中的RLP-C的濃度。作為膽固醇酯水解酶，可以使用那些能夠水解膽固醇酯的酶，例如膽固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等，來自動(dòng)物、植物或微生物或利用遺傳工程的方法制備的酶、化學(xué)修飾過的酶等。作為化學(xué)修飾過的酶，包括那些被如下化學(xué)修飾基團(tuán)例如以聚乙二醇或聚丙二醇為主要成分的基團(tuán)、具有聚丙二醇和聚乙二醇的共聚物的基團(tuán)、含有水溶性多糖類的基團(tuán)、磺丙基、磺丁基、聚氨酯基、具有螯合功能的基團(tuán)等修飾過的酶。特別優(yōu)選是以聚乙二醇為主要成分的基團(tuán)修飾過的酶。作為水溶性多糖類，包括例如葡聚糖、普魯蘭多糖、可溶性淀粉等。用于化學(xué)修飾的試劑(化學(xué)修飾劑)，包括同時(shí)具有上述化學(xué)修飾基團(tuán)和可以與酶中的氨基、羧基、巰基等反應(yīng)的官能團(tuán)或結(jié)構(gòu)的化合物等。可以與酶中的氨基反應(yīng)的官能團(tuán)或結(jié)構(gòu)的例子，包括例如羧基、活性酯基(N-羥基琥珀酰亞胺基等)、酸酐、?；?、醛、環(huán)氧基、1,3-丙烷磺內(nèi)酯、1，4-丁烷磺內(nèi)酯等?？梢耘c酶中的羧基反應(yīng)的官能團(tuán)或結(jié)構(gòu)的例子，包括例如氨基。與酶中的巰基具有反應(yīng)性的基團(tuán)或結(jié)構(gòu)的例子，包括例如馬來酰亞胺基、二硫化物、oc-鹵代酯(a-碘代酯等)等?；瘜W(xué)修飾劑的例子有含有以聚乙二醇作為主要成分的基團(tuán)和N-羥基琥珀酰亞胺基的SunbrightVFM-4101、SunbrightMEAC-50HS、SunbHghtMEC-50HS(均為日本油脂公司制)、含有以聚亞烷基二醇作為主要成分的基團(tuán)和酸酐結(jié)構(gòu)的SunbrightAKM系列(例如SunbrightAKM-1510等)、SunbrightADM系列、SunbrightACM系列(均為日本油脂公司制)、含有以聚乙二醇作為主要成分的基團(tuán)和環(huán)氧基的EPOX-3400、M-EPOX-5000(均為SheawaterPolymers公司制)、含有具有螯合功能的基團(tuán)和酸酐結(jié)構(gòu)的二亞乙基三胺-N，N，r，N",N，，-五乙酸酐(DTPA酸酐；同仁化學(xué)研究所公司制)、聚氨酯修飾用的活化聚氨酯P4000(BoehringerMannheim公司制)、葡聚糖修飾用的葡聚糖T40、活化TCT(BoehringerMannheim公司制)等。酶的化學(xué)修飾可以用例如以下方法來進(jìn)行。首先，將膽固醇酯水解酶溶解于pH8.0以上的緩沖液例如HEPES緩沖液中，在0-55t:下添加0.01~500倍摩爾量的化學(xué)修飾劑，然后攪拌5分鐘5小時(shí)。在實(shí)際的酶反應(yīng)中，作為化學(xué)修飾過的膽固醇酯水解酶，不僅可使用該反應(yīng)液本身，還可以根據(jù)需要，使用通過超濾膜等除去未反應(yīng)的化學(xué)修飾劑等而獲得的產(chǎn)品。膽固醇氧化酶可以使用來自動(dòng)物、植物或微生物的酶、按遺傳工程方法制備的酶、化學(xué)修飾過的酶等?；瘜W(xué)修飾酶可以利用上述化學(xué)修飾方法來制備。作為膽固醇脫氫酶，只要是在氧化型輔酶的存在下具有能夠氧化膽固醇、生成還原型輔酶的能力的酶即可，可以使用來自動(dòng)物、植物或微生物的酶、利用遺傳工程的方法制備的酶、化學(xué)修飾過的酶。化學(xué)修飾過的酶，例如可以使用上述化學(xué)修飾劑通過上述化學(xué)修飾方法來制備。作為水解磷脂質(zhì)的酶，只要是具有分解磷脂質(zhì)的能力的酶，就沒有特殊限制?？闪信e出例如能夠分解來自動(dòng)物、植物和微生物的磷脂質(zhì)的酶。作為具體的可以分解磷脂質(zhì)的酶，可列舉出例如磷脂酶D、磷脂酶C、磷脂酶A2、溶血磷脂酶等。在本發(fā)明使用膽固醇脫氫酶的定量法中使用的氧化型輔酶的例子，可列舉出NAD、NADP、；琉代-NAD、；琉代-NADP。當(dāng)將本發(fā)明中使用的表面活性劑(dl)與本發(fā)明中使用的表面活性劑(d2)組合起來使用時(shí)，在水解磷脂質(zhì)的酶的存在下，具有能使膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶對(duì)RLP-C產(chǎn)生特異性作用的功能。在分別單獨(dú)地使用表面活性劑(dl)和表面活性劑(d2)時(shí)，不一定要具有很高的使膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶特異性地作用于RLP-C的功能。當(dāng)將本發(fā)明中使用的表面活性劑(d3)與本發(fā)明中使用的表面活性劑(d4)組合起來使用時(shí)，在水解磷脂質(zhì)的酶的存在下，具有能使膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氬酶對(duì)RLP-C產(chǎn)生特異性作用的功能。在分別單獨(dú)地使用表面活性劑(d3)和表面活性劑(d4)時(shí)，不一定要具有很高的使膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶特異性作用于RLP-C的功能。POE'POB共聚物包括聚氧乙烯與聚氧丁烯的無規(guī)聚合物、嵌段聚合物，可列舉出例如由通式(I)表示的化合物[下文稱為化合物(I)]等。RO-(C2H40)a-(C4H80)b-(C2H40)c-H(I)(式中，A、B和C相同或不同，表示1~200的整數(shù)；R表示氫原子、直鏈或支鏈的烷基)通式(I)中，R優(yōu)選為氫原子?；衔?I)中的直鏈或支鏈的烷基，包括碳原子數(shù)1~30的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、庚基、異庚基、辛基、異辛基、壬基、異壬基、癸基、異癸基、十一烷基、異十一烷基、十二烷基、異十二烷基、十三烷基、異十三烷基、十四烷基、異十四烷基、十五烷基、異十五烷基、十六烷基、異十六烷基、十七烷基、異十七烷基、十八烷基、異十八烷基、十九烷基、異十九烷基、二十烷基、異二十烷基、二十一烷基、異二十一烷基、二十二烷基(山茶基)、異二十二烷基、二十三烷基、異二十三烷基、二十四烷基、異二十四烷基、二十五烷基、異二十五烷基、二十六烷基、異二十六烷基、二十七烷基、異二十七烷基、二十八烷基、異二十八烷基、二十九烷基、異二十九烷基、三十烷基、異三十烷基等。作為聚氧丁烯部分的分子量，優(yōu)選在700以上，更優(yōu)選在1000以上，特別優(yōu)選在1500以上。化合物(I)的具體例，包括PrononB-204、PrononB-208(以上為日本油脂公司制)。POE苯乙烯化苯基醚的例子，包括BLAUNONDSP-9、BLAUNONDSP-12.5、BLAUN0NDSP-20、BLAUNONDSP-10、BLAUNONTSP-5、BLAUNONTSP-7.5、BLAUNONTSP-16、BLAUNONTSP-20、BLAUNONTSP-50(以上為青木油脂公司制)等，市場(chǎng)上有售。作為POE'POP長(zhǎng)支鏈烷基醚中的長(zhǎng)支鏈烷基，可列舉出例如碳原子數(shù)2030的支鏈烷基，例如異二十烷基、辛基十二烷基、異二十一烷基、異二十二烷基、異二十三烷基、異二十四烷基、癸基十四烷基、異二十五烷基、異二十六烷基、十二烷基十四烷基、異二十七烷基、異二十八烷基、異二十九烷基、異三十烷基等。作為P0E.P0P長(zhǎng)支鏈烷基醚的具體例，包括UNILUBMT-0620B(日本油脂^^司制)等，市場(chǎng)上有售。作為P0E-P0P烷基芳基醚和P0E烷基芳基醚中的烷基，可列舉出例如碳原子數(shù)為8以上的烷基，例如辛基、壬基等，作為芳基，可列舉出例如苯基、萘基等。作為芳基，優(yōu)選苯基。作為POE'P0P烷基醚中的烷基，可列舉出碳原子數(shù)為6~30的烷基，例如己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鯨蠟基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山薟基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。作為P0E'POP短支鏈烷基醚中的短支鏈烷基，可列舉出碳原子數(shù)為6~19的支鏈烷基，例如異己基、異庚基、異辛基、異壬基、異癸碁、異十一烷基、異十二烷基、異十三烷基、異十四烷基、異十五烷基、異十六烷基、異十七烷基、異十八烷基、異十九烷基等。作為P0E'P0P烷基芳基醚，可列舉出例如聚氧乙烯聚氧丙烯烷基苯基醚等。作為具體例，包括EmulgenL-40(花王公司制)、AcronecesKP-189R(日本油脂公司制)等，市場(chǎng)上有售。作為P0E烷基芳基醚，可列舉出例如聚氧乙烯烷基苯基醚等。作為具體例，包括Emulgen911、Emulgen810(以上為花王公司制)、NonionHS-210、NonionHS-215、NonionNS-208.5、NonionHS-208(以上為日本油脂公司制)等，市場(chǎng)上有售。作為POE.POP烷基醚和POE.POP支鏈烷基醚，優(yōu)選親水性-親油性平衡(HLB)為9~20的P0E.POP烷基醚和POEPOP支鏈烷基醚。作為POE.POP烷基醚的具體例，包括WondersurfRL-100、WondersurfS-1000(以上為青木油脂公司制)等，市場(chǎng)上有售。作為POE.POP短支鏈烷基醚的具體例，包括WondersurfID-70、WondersurfID-90(以上為青木油脂公司制)等，市場(chǎng)上有售。作為POEPOP共聚物，包括聚氧乙烯與聚氧丙烯的無規(guī)聚合物、嵌段聚合物，可列舉出例如由通式(II)表示的化合物等。R0-(C2H40)A-(C3H60)B-(C2H40)c-H(II)(式中，A、B和C相同或不同，表示1~200的整數(shù)；R表示氫原子、直鏈或支鏈的烷基)。通式(II)中，R優(yōu)選為氫原子。化合物(II)中的直鏈或支鏈的烷基，可列舉出與上述化合物(I)中的直鏈或支鏈的烷基相同的烷基。作為本化合物中的聚氧丙烯部分的分子量，優(yōu)選為2050以上，更優(yōu)選為2750以上，特別優(yōu)選為3250以上。作為具體例，包括PluronicF-108、PluronicL-121、PluronicL-122、PluronicL-101、PluronicL-103(以上為旭電化工業(yè)/>司制)、Pro讓102、Prononl04、Pronon201、Pro廳204、Pronon208、Pronon202B(以上為日本油脂公司制)等，市場(chǎng)上有售。水性介質(zhì)包括例如去離子水、蒸餾水、緩沖液等，優(yōu)選緩沖液。作為緩沖液中使用的緩沖劑的例子，可列舉出三(羥甲基)氨基曱烷緩沖劑、磷酸緩沖劑、硼酸緩沖劑、Good氏緩沖劑等。作為Good氏緩沖劑，包括例如2-嗎啉代乙磺酸(MES)、二(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺)亞氨基二乙酸(ADA),哌嗪-N,N，-二(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2—氨基乙磺酸(ACES)、3-p馬啉^R-2-羥基丙磺酸(M0PS0)、N，N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-嗎啉代丙磺酸(MOPS)、N-[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌"秦基]乙磺酸(HEPES)、3-[N，N-二(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPS0)、N-[三(羥曱基)甲基]-2-羥基-3-氨基丙磺酸(TAPS0)、哌嗪-N，N，-二(2-羥基丙磺酸)(P0PS0)、3-[4-(2-羥乙基)-1-哌溱基]-2-羥基丙磺酸(HEPPS0)、3-[4-(2-羥乙基)-1-哌溱基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-環(huán)己基-3-氨基-2-羥基丙磺酸(CAPS0)、N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)。緩沖液所使用的pH值通常為4~10，優(yōu)選為5~9，所使用的濃度通常為0.001~0.5mol/L，優(yōu)選為0.005~0.2mol/L，更優(yōu)選為0.01~0.lmol/L。作為過氧化氫定量中使用的色素原，可以使用那些例如在過氧化物酶的存在下可以被過氧化氫氧化而轉(zhuǎn)變成色素的色素原。其例子包括無色型(leuco-type)色素原、氧化偶合型(oxidativecoupling-type)色素原。無色型色素原是一種可以在過氧化氫和過氧化物酶等的過氧化活性物質(zhì)的存在下，單獨(dú)轉(zhuǎn)變成色素的物質(zhì)。無色型色素原的例子有l(wèi)O-N-羧甲基氨基曱?；?3,7-雙(二曱氨基)-lOH-吩噻嗪(CCAP)、10-(N-甲基氨基甲?；?-3，7-雙(二曱氨基)-lOH-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4，-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉鹽(DA-64)、4，4，-雙(二曱氨基)二苯基胺、雙[3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二曱氨基苯基]胺(BCMA)。氧化偶合型色素原是一種可以在過氧化氫和過氧化物酶等過氧化活性物質(zhì)的存在下，通過2個(gè)化合物被氧化而發(fā)生偶合，從而轉(zhuǎn)變成色素的色素原。2個(gè)化合物的組合的例子包括偶合劑與苯胺類的組合、偶合劑與苯酚類的組合。偶合劑的例子為4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噢唑啉酮肼。苯胺類的例子包括N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基一N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(T00S)、N-乙基一N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MA0S)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DA0S)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羥基一3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDA0S)、N，N-二甲基-3-甲基苯胺、N，N-二(3-磺丙基)-3，5-二曱氧基苯胺、N-乙基-N一(3-磺丙基)-3-曱氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基一N-(3-磺丙基)-3，5-二曱基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-曱氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N，-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N，-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-4-氟-3，5-二曱氧基苯胺(F-DA0S)。苯酚類的例子包括苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-鞋基-2，4,6-三碘苯曱酸(HTIB)。過氧化物酶通常按1~100kU/L的濃度使用。色素原通常按0.01~10g/L的濃度使用。作為還原型輔酶的定量中使用的色素原，使用那些例如可以在心肌黃酶或者電子栽體的存在下被還原型輔酶還原而轉(zhuǎn)變成色素的色素原。其例子包括3-(4，5-二甲基-2-塞哇基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎮(zhèn)溴化物(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑錯(cuò)一鈉鹽(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎮(zhèn)一鈉鹽(WST-3)。心肌黃酶和電子載體，通常按1~100kU/L的濃度來使用。色素原通常按0.01~10g/L的濃度來使用。環(huán)糊精或其衍生物的例子為環(huán)糊精、二甲基環(huán)糊精、三甲基環(huán)糊精、羥乙基環(huán)糊精、羥丙基環(huán)糊精、羧甲基環(huán)糊精、糖基環(huán)糊精、麥芽糖基環(huán)糊精、環(huán)糊精硫酸酯、環(huán)糊精聚合物，優(yōu)選羥乙基環(huán)糊精和羥丙基環(huán)糊精。環(huán)糊精的例子為cx-環(huán)糊精、p-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精。二甲基環(huán)糊精的例子為二甲基-cc-環(huán)糊精、二甲基-P-環(huán)糊精、二甲基-Y-環(huán)糊精。三甲基環(huán)糊精的例子為三甲基-oc-環(huán)糊精、三曱基-p-環(huán)糊精、三甲基-y-環(huán)糊精。羥乙基環(huán)糊精的例子為羥乙基-a-環(huán)糊精、羥乙基-P-環(huán)糊精、羥乙基-y-環(huán)糊精。羥丙基環(huán)糊精的例子為羥丙基-ot-環(huán)糊精、羥丙基-P-環(huán)糊精、羥丙基-y-環(huán)糊精。羧甲基環(huán)糊精的例子為羧曱基-ct-環(huán)糊精、羧甲基-P-環(huán)糊精、羧甲基-Y-環(huán)糊精。糖基環(huán)糊精的例子為糖基-a-環(huán)糊精、糖基-P-環(huán)糊精、糖基-Y-環(huán)糊精。麥芽糖基環(huán)糊精的例子為麥芽糖基-a-環(huán)糊精、麥芽糖基-p-環(huán)糊精、麥芽糖基-Y-環(huán)糊精。環(huán)糊精硫酸酯的例子為ot-環(huán)糊精硫酸酯、P-環(huán)糊精硫酸酯、Y-環(huán)糊精硫酸酯。環(huán)糊精聚合物的例子為P-環(huán)糊精聚合物。也可以將2種以上的環(huán)糊精或其衍生物組合使用。在水性介質(zhì)中，環(huán)糊精或其衍生物的濃度優(yōu)選為0.001~5(w/v)%，更優(yōu)選為0.005~2.5(w/v)%，特別優(yōu)選為0.01~1(w/v)%。白蛋白的例子包括來自牛、馬、羊、人的白蛋白，優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)。也可以使用通過遺傳工程方法制備的白蛋白。也可以將2種以上的白蛋白組合使用。在水性介質(zhì)中，白蛋白的濃度優(yōu)選為0.001~5(w/v)%，更優(yōu)選為0.005~2.5(w/v)%，特別優(yōu)選為0.01~1(w/v)%。作為脂蛋白凝聚劑，可列舉出磷鎢酸鹽、葡聚糖硫酸鹽、肝素等聚陰離子；鎂、鈣、鈷等2價(jià)金屬鹽。在水性介質(zhì)中，脂蛋白凝聚劑的濃度各自獨(dú)立地優(yōu)選為0.001~5(w/v)%，更優(yōu)選為0.005~2.5(w/v)%，特別優(yōu)選為0.01~l(w/v)%。酶活化劑的例子包括膽汁酸類、烷基磺酸鹽等陰離子型表面活性劑。膽汁酸類的例子包括膽酸、脫氧膽酸、?；悄懰?、鵝脫氧膽酸。烷基磺酸鹽的例子包括l-戊磺酸鹽、l-己磺酸鹽、l-庚磺酸鹽、1-辛磺酸鹽。烷基磺酸鹽中的鹽的例子包括銨鹽、鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鉤鹽。穩(wěn)定劑的例子包括乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化鈣。防腐劑的例子包括疊氮化鈉、抗生素?？垢蓴_劑的例子包括，用于抑制抗壞血酸影響的抗壞血酸氧化酶、用于抑制膽紅素影響的亞鐵氰化鉀。鹽類的例子包括氯化鋰、硫酸鋰、氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、氯化鎂、硫酸鎂、乙酸鎂、氯化銨、硫酸鎂、硝酸鎂、硝酸4丐。作為本發(fā)明的RLP-C的定量方法，可以示例以下的具體方式。定量方法1(1)在水性介質(zhì)中，在試樣、水解磷脂質(zhì)的酶、表面活性劑(dl)、表面活性劑(d2)、膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的存在下，進(jìn)行酶反應(yīng)；(2)測(cè)定生成的過氧化氫；(3)從(2)中測(cè)得的值和預(yù)先制成的校準(zhǔn)曲線，判定試樣中的RLP-C濃度的方法。定量方法2(1)在水性介質(zhì)中，在試樣、水解磷脂質(zhì)的酶、表面活性劑(d3)、表面活性劑(d4)、膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的存在下，進(jìn)行酶反應(yīng)；(2)測(cè)定生成的過氧化氫；(3)從(2)中測(cè)得的值和預(yù)先制成的校準(zhǔn)曲線，判定試樣中的RLP-C濃度的方法。定量方法3(1)在水性介質(zhì)中，在試樣、水解磷脂質(zhì)的酶、表面活性劑(dl)、表面活性劑(d2)、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶的存在下，進(jìn)行酶反應(yīng)；(2)測(cè)定生成的還原型輔酶；(3)從(2)中測(cè)得的值和預(yù)先制成的校準(zhǔn)曲線，判定試樣中的RLP-C濃度的方法。定量方法4(1)在水性介質(zhì)中，在試樣、水解磷脂質(zhì)的酶、表面活性劑(d3)、表面活性劑(d4)、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶的存在下，進(jìn)行酶反應(yīng)；(2)測(cè)定生成的還原型輔酶；(3)從(2)中測(cè)得的值和預(yù)先制成的校準(zhǔn)曲線，判定試樣中的RLP-C濃度的方法。(RLP-C定量用試劑)本發(fā)明的RLP-C定量用試劑，含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、以及表面活性劑(dl)與表面活性劑(d2)的組合或者表面活性劑(d3)與表面活性劑(d4)的組合。該試劑可以含有過氧化氫定量用試劑。作為過氧化氫定量用試劑的例子，可列舉出含有過氧化物酶以及上述的可以在過氧化物酶的存在下被過氧化氬氧化而轉(zhuǎn)變成色素的色素原的試劑。另外，本發(fā)明的其他RLP-C定量用試劑，含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、以及表面活性劑(dl)與表面活性劑(d2)的組合或者表面活性劑(d3)與表面活性劑(d4)的組合。該試劑可以含有還原型輔酶定量用試劑。作為還原型輔酶定量用試劑的例子，可列舉出含有心肌黃酶或電子載體以及上述的可以在心肌黃酶或電子載體的存在下被還原型輔酶還原而轉(zhuǎn)變成色素的色素原的試劑。作為本發(fā)明的RLP-C定量用試劑，可列舉出以下的具體方式。試劑1含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、表面活性劑(dl)、表面活性劑(d2)以及過氧化氫測(cè)定用試劑的試劑。試劑2含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、表面活性劑(d3)、表面活性劑(d4)以及過氧化氫測(cè)定用試劑的試劑。試劑3含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、表面活性劑(dl)以及表面活性劑(d2)的試劑。試劑4含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、表面活性劑U3)以及表面活性劑(dO的試劑。試劑5含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、表面活性劑(dl)、表面活性劑(d2)以及還原型輔酶測(cè)定用試劑的試劑。試劑6含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、表面活性劑(d3)、表面活性劑(d4)以及還原型輔酶測(cè)定用試劑的試劑。(RLP-C定量用試劑盒)本發(fā)明的RLP-C定量用試劑，優(yōu)選以試劑盒的形式保存、流通和使用。試劑盒的形式使用兩種試劑和三種試劑，但優(yōu)選兩種試劑的試劑盒。在具有笫l試劑和第2試劑的雙試劑系列的試劑盒中，膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶可以被含有在各自不同的試劑中，但優(yōu)選是被含有在同一種試劑中的試劑盒，特別優(yōu)選是被含有在笫2試劑中的試劑盒。水解磷脂質(zhì)的酶可以被含有在第1試劑、第2試劑的任一方中或者被含有在雙方中，但優(yōu)選是被含有在第2試劑中。表面活性劑(dl)和表面活性劑(d2)可以被含有在第l試劑、第2試劑的任一方或者雙方中，但優(yōu)選是表面活性劑(dl)被含有在第l試劑中。表面活性劑(d3)和表面活性劑(d4)可以被含有在第1試劑、第2試劑的任一方或者雙方中，但優(yōu)選是表面活性劑(d3)被含有在第1試劑中。氧化型輔酶可以被含有在第1試劑、第2試劑的至少一個(gè)中。過氧化氫定量用試劑可以被含有在第l試劑、第2試劑的至少一個(gè)中，但當(dāng)該試劑含有氧化偶合型色素原時(shí)，氧化偶合型色素原的各化合物優(yōu)選被含有在各自不同的試劑中。還原型輔酶定量用試劑被含有在第l試劑、第2試劑的至少一個(gè)中。作為本發(fā)明的RLP-C定量用試劑盒，可列舉出以下的具體方式。試劑盒1第1試劑含有表面活性劑(dl)以及過氧化氫定量用試劑的一部分的試劑。第2試劑含有表面活性劑(d2)、水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶以及過氧化氫定量用試劑的其余部分的試劑。試劑盒2第1試劑含有表面活性劑(d3)以及過氧化氫定量用試劑的一部分的試劑。笫2試劑含有表面活性劑(d4)、水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶以及過氧化氫定量用試劑的其余部分的試劑。試劑盒3第1試劑含有表面活性劑(dl)的試劑。第2試劑含有表面活性劑(d2)、水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶的試劑。試劑盒4第1試劑含有表面活性劑(d3)的試劑。第2試劑含有表面活性劑(d4)、水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶的試劑。試劑盒5第1試劑含有表面活性劑(dl)的試劑。第2試劑含有表面活性劑(d2)、水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶以及還原型輔酶定量用試劑的試劑。試劑盒6第1試劑含有表面活性劑(d3)的試劑。第2試劑含有表面活性劑(d4)、水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶以及還原型輔酶定量用試劑的試劑。本發(fā)明的RLP-C定量用試劑和試劑盒，可以用于試樣中的RLP-C的定量。在本發(fā)明的RLP-C定量用試劑和試劑盒中的各種成分，可以使用在上述RLP-C定量方法中記載的水解磚脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、表面活性劑(dl)、表面活性劑(d2)、表面活性劑(d3)、表面活性劑(d4)、過氧化氬定量用試劑以及還原型輔酶定量用試劑。本發(fā)明的RLP-C定量用試劑和試劑盒中，也可以根據(jù)需要含有上述的水性介質(zhì)、環(huán)糊精或其衍生物、白蛋白、脂蛋白凝聚劑、酶活化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、抗干擾劑、以及用于使生物試樣中的球蛋白等蛋白質(zhì)增溶的各種鹽類等。本發(fā)明的RLP-C定量用試劑和試劑盒中的酶、2種表面活性劑，按照溶解在水性介質(zhì)中的狀態(tài)存在，其含量達(dá)到在RLP-C定量方法一項(xiàng)中所記載的濃度。下面，用實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不限定本發(fā)明的范圍。應(yīng)予說明，在本實(shí)施例中，使用下述生產(chǎn)廠的試劑和儀器。MOPS(Good氏緩沖劑；同仁化學(xué)研究所7>司制)、T00S[Trinder試劑(氧化偶合型色素原)；同仁化學(xué)研究所公司制]、4-氨基安替比林(半井化學(xué)公司制)、硫酸鈉(和光純藥工業(yè)公司制)、PrononB-208{P0E.P0B共聚物[表面活性劑(dl)];日本油脂公司制}、PrononB-204{P0E.P0B共聚物[表面活性劑(dl)];日本油脂公司制}、WondersurfRL-100{P0E.POP烷基醚[表面活性劑(d2)];青木油脂公司制}、WondersurfID-70{P0E.P0P短支鏈烷基醚[表面活性劑U2)];青木油脂公司制}、WondersurfID-90{P0E.POP短支鏈烷基醚[表面活性劑(d2)];青木油脂公司制}、EmulgenL-40{P0E.P0P烷基芳基醚[表面活性劑(d2)];花王公司制)、PluronicF-108(P0E.P0P共聚物；旭電化工業(yè)公司制)、磷脂酶D(旭化成公司制)、膽固醇氧化酶(CH0D;協(xié)和發(fā)酵工業(yè)公司制)、膽固醇酯水解酶(CHER;東洋紡織公司制)、過氧化物酶(POD)(東洋紡織公司制)、抗壞血酸氧化酶(A0D)(旭化成>^司制)。實(shí)施例1RLP一C定量用試劑盒制作含有下面的第1試劑和笫2試劑的RLP-C定量用試劑盒。第1試劑M0PS(pH6.8)20mmol/LT00S0.3g/L硫酸鈉2g/LWondersurfRL-1001g/L過氧化物酶(POD)10U/mL抗壞血酸氧化酶(AOD)2U/mL第2試劑MOPS(pH6.8)20mmol/L4-氨基安替比林0.5g/LWondersurfRL-1001g/L過氧化物酶10U/mL膽固醇酯水解酶(CHER)1U/mL膽固醇氧化酶(CHOD)3U/mL磷脂酶D5U/mL實(shí)施例2RLP-C定量用試劑盒制作含有下面的第1試劑和第2試劑的RLP-c定量用試劑盒第1試劑MOPS(pH6.8)20mmol/LTOOS0.3g/L硫酸鈉2g/LPro麵B-2048g/LWondersurfID-701g/L過氧化物酶(POD)10U/mL抗壞血酸氧化酶(AOD)2U/mL第2試劑MOPS(pH6.8)20mmol/L4-氨基安替比林0.5g/LWondersurfID-701g/L過氧化物酶10U/mL膽固醇酯水解酶(CHER)1U/mL膽固醇氧化酶(CHOD)3U/mL躊脂酶D實(shí)施例3RLP-C定量用試劑盒制作含有下面的第1試劑和第2試劑的RLP.第1試劑MOPS(pH6.8)TOOS疏酸鈉Pro醒B-208EmulgenL—40過氧化物酶(POD)抗壞血酸氧化酶(AOD).第2試劑MOPS(pH6.8)4-氨基安替比林EmulgenL—40過氧化物酶膽固醇酯水解酶(CHER)膽固醇氧化酶(CHOD)磷脂酶D比較例1RLP-C定量用試劑盒制作含有下面的第l試劑和第2試劑的RLP-配方是在特開2001-231597號(hào)公報(bào)的實(shí)施例1中.第1試劑MOPS(pH6.8)TOOS硫酸鈉PluronicF—1085U/mL-C定量用試劑盒。20mmol/L0.3g/L2g/L8g/L2g/L10U/mL2U/mL20mmol/L0.5g/L3g/L10U/mL1U/mL3U/mL5U/mLC定量用試劑盒。該i己載的配方。20鵬ol/L0.3g/L2g/L1g/L過氧化物酶(POD)抗壞血酸氧化酶(AOD).第2試劑MOPS(pH6.8)4-氨基安替比林Emu1gent—40過氧化物酶膽固醇酯水解酶(CHER)膽固醇氧化酶(CHOD)磷脂酶D10U/mL2U/mL0.5g/L2g/L10U/mL1U/mL2U/mL5U/mL實(shí)施例4RLP-C的定量使用實(shí)施例1的試劑盒，對(duì)人新鮮血清64個(gè)樣品，用日立7170型自動(dòng)分析儀，按照以下的方法定量分析各樣品中的RLP-C。(1)校準(zhǔn)曲線的制作將通過使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)測(cè)定已確定RLP-C濃度為32.4mg/dl的血清標(biāo)準(zhǔn)液用作標(biāo)準(zhǔn)品，將該血清標(biāo)準(zhǔn)液適宜稀釋而配制的稀釋血清作為校準(zhǔn)曲線制作用的樣品。作為測(cè)定用試劑盒，使用實(shí)施例l的試劑盒，按照以下的順序，用日立7170型自動(dòng)分析儀測(cè)定各稀釋血清中的RLP-C濃度，制成校準(zhǔn)曲線。向反應(yīng)池中添加稀釋血清(3.8jaL)和第1試劑(0.18mL)，在"n下加溫5分鐘，在主波長(zhǎng)600mn、副波長(zhǎng)700nm的條件下測(cè)定反應(yīng)液的吸光度(E1)(測(cè)光點(diǎn)16)，接著，向該反應(yīng)液中添加預(yù)先加溫至"t;的第2試劑(0,06mL)，進(jìn)一步在37TC下加溫5分鐘，在主波長(zhǎng)600nm、副波長(zhǎng)700nm的條件下測(cè)定反應(yīng)液的吸光度(E2)(測(cè)光點(diǎn)32)。根據(jù)反應(yīng)中的吸光度變化(E2-E1)與稀釋血清中的RLP-C濃度的關(guān)系制作校準(zhǔn)曲線。(2)人新鮮血清64樣品中的RLP-C的定量使用人新鮮血清64樣品代替血清標(biāo)準(zhǔn)液，采用與(1)同樣的方法，分別使該64樣品進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)后反應(yīng)液的吸光度和在(1)中制作的才交準(zhǔn)曲線，定量各樣品中的RLP-C濃度。實(shí)施例5RLP-C的定量使用實(shí)施例2的試劑盒代替實(shí)施例1的試劑盒，除此之外，與實(shí)施例4的定量法同樣地進(jìn)行，用日立7170型自動(dòng)分析裝置，對(duì)在實(shí)施例4的定量中使用的人新鮮血清64樣品的各樣品中的RLP-C濃度進(jìn)行定量。實(shí)施例6RLP-C的定量使用實(shí)施例3的試劑盒代替實(shí)施例1的試劑盒，除此之外，與實(shí)施例4的定量法同樣地進(jìn)行，用日立7170型自動(dòng)分析裝置，對(duì)在實(shí)施例4的定量中使用的人新鮮血清64樣品的各樣品中的RLP-C濃度進(jìn)行定量。比較例2RLP-C的定量使用比較例1的試劑盒代替實(shí)施例1的試劑盒，除此之外，與實(shí)施例4的定量法同樣地進(jìn)行，用日立7170型自動(dòng)分析裝置，對(duì)在實(shí)施例4的定量中使用的人新鮮血清64樣品的各樣品中的RLP-C濃度進(jìn)行定量。試驗(yàn)例1與使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)的測(cè)定的相關(guān)性對(duì)于上述的人新鮮血清64樣品，使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)，對(duì)各樣品中的RLP-C濃度進(jìn)行定量。對(duì)于各個(gè)樣品，按照相關(guān)系數(shù)對(duì)實(shí)施例4~6和比較例2的定量法與使用RLP-膽固醇"JIMRO"II的定量法的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。其結(jié)果示于表ll中。另外，相關(guān)圖示于圖1~圖4中。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>如表ll所示，可以看出，與比較例2(使用在特開2001-231597號(hào)公報(bào)的實(shí)施例1中記載的試劑盒進(jìn)行定量)相比，本發(fā)明的方法均為與使用RLP-膽固醇"JIMR0"II的定量法具有良好相關(guān)性的方法。試驗(yàn)例2III型高脂血癥樣品中的RLP-C的定量使用RLP-膽固醇"JIMR0"II(日本抗體研究所公司制)、實(shí)施例1~3和比較例1的試劑盒，測(cè)定了III型高脂血癥患者的血清樣品中的RLP-C濃度。應(yīng)予說明，將通過使用RLP-膽固醇"JIMR0"II(日本抗體研究所公司制)測(cè)定已確定其RLP-C濃度為32.4mg/dl的血清標(biāo)準(zhǔn)液用作標(biāo)準(zhǔn)品，將該血清標(biāo)準(zhǔn)液適宜稀釋而配制的稀釋血清作為校準(zhǔn)曲線制作用的樣品。其結(jié)果示于表12中。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在ni型高脂血癥患者的血清中，已知存在特別多的VLDL殘粒。因此，從表12的結(jié)果看出，與比較例1的試劑盒(特開2001-231597號(hào)公報(bào)的實(shí)施例1中記載的試劑盒)相比，在本發(fā)明的定量法中，VLDL殘粒中的膽固醇的反應(yīng)性提高。另外，即便與使用RLP-膽固醇"JIMRO"II的定量法相比，也可以看出，在本發(fā)明的定量法中，對(duì)RLP-C的反應(yīng)性提高。實(shí)施例7RLP-C定量用試劑盒制作含有下面的第1試劑和第2試劑的RLP第1試劑MOPS(pH6.8)TOOS硫酸鈉Pro麵B-208EmulgenL-40WondersurfID-70過氧化物酶(POD)抗壞血酸氧化酶(AOD).第2試劑MOPS(pH6.8)4-氨基安替比林WondersurfID-70過氧化物酶膽固醇酯水解酶(CHER)膽固醇氧化酶(CH0D)磷脂酶D實(shí)施例8RLP-C定量用試劑盒制作含有下面的第l試劑和第2試劑的RLP第1試劑MOPS(pH6.8)TOOS硫酸鈉Pro織B—208C定量用試劑盒,20mmol/L0.3g/L2g/L8g/L1g/L1g/L10U/mL2U/mL20mmol/L0.5g/L1g/L10U/mL1U/mL3U/mL5U/mL-C定量用試劑盒,20mmol/L0.3g/L2g/L8g/LEmulgenL-401g/LWondersurfID-701g/L過氧化物酶(P0D)10U/mL抗壞血酸氧化酶(AOD)2U/mL.第2試劑MOPS(pH6.8)20mmol/L4-氨基安替比林G.5g/LWondersurfID-701g/LEmulgenL-401g/L過氧化物酶10U/mL膽固醇酯水解酶(CHER)1U/mL膽固醇氧化酶(CHOD)3U/mL磷脂酶D5U/mL實(shí)施例9RLP-C定量用試劑盒制作含有下面的第l試劑和第2試劑的RLP-C定量用試劑盒。第1試劑MOPS(pH6.8)20mmol/L簡(jiǎn)G.3g/L硫酸鈉2g/LPrononB-2088g/LEmulgenL-401g/LWondersurfID-901g/L過氧化物酶(POD)10U/mL抗壞血酸氧化酶(AOD)2U/mL第2試劑MOPS(pH6.8)20mmol/L4-氨基安替比林0.5g/LWondersurfID-901g/L過氧化物酶膽固醇酯水解酶(CHER)膽固醇氧化酶(CH0D)磷脂酶D實(shí)施例10RLP-C定量用試劑盒制作含有下面的第1試劑和第2.第1試劑MOPS(pH6.8)TOOS石克酸鈉Pro醒B-208EmulgenL-40WondersurfID-90過氧化物酶(POD)抗壞血酸氧化酶(A0D).第2試劑MOPS(pH6.8)4-氨基安替比林WondersurfID-90EmulgenL—40過氧化物酶膽固醇酯水解酶(CHER)膽固醇氧化酶(CHOD)磷脂酶D實(shí)施例11RLP-C的定量作為定量用試劑盒，使用實(shí)施例盒；作為樣品，使用人新鮮血清35氺10UM1U/mL3U/mL5U/mL試劑的RLP-C定量用試劑盒。20mmol/L0.3g/L2g/L8g/L1g/L1g/L10UM2U/mL20mmol/L0.5g/L1g/L1g/L10U/mL1U/mL3U/mL5U/mL7的試劑盒代替實(shí)施例1的試劑L品代替在實(shí)施例5~8中使用的人新鮮血清64樣品，除此之外，采用與實(shí)施例4的定量法同樣的方法，用日立7170型自動(dòng)分析裝置，對(duì)該35樣品的各樣品中的RLP-C濃度進(jìn)行定量。實(shí)施例12RLP-C的定量使用實(shí)施例8的試劑盒代替實(shí)施例7的試劑盒，除此之外，采用與實(shí)施例11的定量法同樣的方法，用日立7170型自動(dòng)分析裝置，對(duì)人新鮮血清35樣品的各樣品中的RLP-C濃度進(jìn)行定量。實(shí)施例13RLP-C的定量使用實(shí)施例9的試劑盒代替實(shí)施例7的試劑盒，除此之外，采用與實(shí)施例11的定量法同樣的方法，用日立7170型自動(dòng)分析裝置，對(duì)人新鮮血清35樣品的各樣品中的RLP-C濃度進(jìn)行定量。實(shí)施例14RLP-C的定量使用實(shí)施例10的試劑盒代替實(shí)施例7的試劑盒，除此之外，釆用與實(shí)施例11的定量法同樣的方法，用日立7170型自動(dòng)分析裝置，對(duì)人新鮮血清35樣品的各樣品中的RLP-C濃度進(jìn)行定量。試驗(yàn)例3與使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)的測(cè)定的相關(guān)性對(duì)于在實(shí)施例11~14中使用的人新鮮血清35樣品，使用RLP-膽固醇"JIMRO"II(日本抗體研究所公司制)，對(duì)各樣品中的RLP-C濃度進(jìn)行定量。對(duì)于各個(gè)樣品，按照相關(guān)系數(shù)對(duì)實(shí)施例11~14的定量法與使用RLP-膽固醇"JIMRO"II的定量法的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。其結(jié)果示于表13中。另外，相關(guān)圖示于圖5圖8中。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>如表13所示，可以確認(rèn)作為表面活性劑(d2)，既使使用2種表面活性劑的試劑盒，也與使用RLP-膽固醇"JIMR0"II的定量法之間具有良好的相互關(guān)系。另外，通過與表11所示的實(shí)施例46的比較可以確認(rèn)，與使用1種表面活性劑(d2)的試劑盒相比，使用2種表面活性劑的試劑盒的定量方法顯示出與使用RLP-膽固醇"JIMR0"II的定量法之間具有更好的相關(guān)性。產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，提供了對(duì)動(dòng)脈硬化性疾病的診斷有用的RLP-C的定量方法、試劑以及試劑盒。權(quán)利要求1.試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇的定量方法，其特征在于，在含有試樣的水性介質(zhì)中，在(a)(i)選自聚氧乙烯聚氧丁烯共聚物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚和聚氧乙烯聚氧丙烯長(zhǎng)支鏈烷基醚中的一種或二種以上的表面活性劑[下文稱為表面活性劑(d1)]，與選自聚氧乙烯聚氧丙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和聚氧乙烯聚氧丙烯短支鏈烷基醚中的一種或二種以上的表面活性劑[下文稱為表面活性劑(d2)]的組合，或者，(ii)聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物[下文稱為表面活性劑(d3)]，與選自聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚和聚氧乙烯聚氧丙烯短支鏈烷基醚中的一種或二種的表面活性劑[下文稱為表面活性劑(d4)]的組合，以及(b)水解磷脂質(zhì)的酶的存在下，使(c)膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶，或者，在(d)氧化型輔酶的存在下，使膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶，對(duì)試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇發(fā)生作用，生成過氧化氫或者還原型輔酶，然后定量所生成的過氧化氫或者還原型輔酶。2.權(quán)利要求l中所述的方法，其中，過氧化氬的定量是通過在過氧化物酶的存在下，使生成了的過氧化氫與氧化發(fā)色型色素原反應(yīng)，然后定量所生成的色素來進(jìn)行的。3.權(quán)利要求l中所述的方法，其中，還原型輔酶的定量是通過測(cè)定反應(yīng)液的吸光度來進(jìn)行的。4.權(quán)利要求l中所述的方法，其中，還原型輔酶的定量是通過使生成了的還原型輔酶與還原發(fā)色型色素原反應(yīng)，然后定量所生成的色素來進(jìn)行的。5.權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，聚氧乙烯聚氧丁烯共聚物為由通式(I)表示的表面活性劑R0-(C晶O)a-(C4H80)B-(C2H40)c-H(I)式中，A、B和C相同或不同，表示1~200的整數(shù)；R表示氫原子、直鏈或支鏈的烷基。6.權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，水解磷脂質(zhì)的酶為磷脂酶D、磷脂酶C或者磷脂酶A2。7.試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑，其特征在于，其中含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、以及表面活性劑(dl)與表面活性劑(d2)的組合、或者表面活性劑(d3)與表面活性劑(d4)的組合。8.權(quán)利要求7中所述的試劑，其中還含有過氧化氫定量用試劑。9.試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑，其特征在于，其中含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶、以及表面活性劑(dl)與表面活性劑(d2)的組合、或者表面活性劑(d3)與表面活性劑(dO的組合。10.權(quán)利要求9中所述的試劑，其中還含有還原型輔酶定量用試劑。11.權(quán)利要求7~10中任一項(xiàng)所述的試劑，其中，聚氧乙烯聚氧丁烯共聚物為由通式(I)表示的表面活性劑R0-(C2H40)A—(C4H80)B—(C2H40)c—H(I)式中，A、B和C相同或不同，表示1~200的整數(shù)；R表示氫原子、直鏈或支鏈的烷基。12.權(quán)利要求7~11中任一項(xiàng)所述的試劑，其中，水解磷脂質(zhì)的酶為磷脂酶D、磷脂酶C或者磷脂酶A2。13.試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑盒，其特征在于，其中含有含有表面活性劑(dl)的第l試劑、以及含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的第2試劑；且在第l試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有表面活性劑(d2)。14.試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑盒，其特征在于，其中含有含有表面活性劑(d3)的第l試劑、以及含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的第2試劑；且在第l試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有表面活性劑(d4)。15.權(quán)利要求13或M中所述的試劑盒，其中，在第1試劑、第2試劑的至少一個(gè)中還含有過氧化氫定量用試劑。16.試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑盒，其特征在于，其中含有含有表面活性劑(dl)的第l試劑、以及含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶的第2試劑；在第l試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有表面活性劑(d2);且在第1試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有氧化型輔酶。17.試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試劑盒，其特征在于，其中含有一種含有表面活性劑(d3)的第l試劑、以及一種含有水解磷脂質(zhì)的酶、膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶的笫2試劑；在第l試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有表面活性劑(d4);且在第l試劑和第2試劑的至少一個(gè)中含有氧化型輔酶。18.權(quán)利要求16或17中所述的試劑盒，其中，在第1試劑、第2試劑的至少一個(gè)還含有還原型輔酶定量用試劑。19.權(quán)利要求13、l5、16或18中所述的試劑，其中，聚氧乙烯聚氧丁烯共聚物為由通式(I)表示的表面活性劑R0-(C2H40)A—(C4H80)B-(C2H40)c-H(I)式中，A、B和C相同或不同，表示1~200的整數(shù)；R表示氫原子、直鏈或支鏈的烷基。20.權(quán)利要求H-19中任一項(xiàng)所迷的試劑盒，其中，水解磷脂質(zhì)的酶為磷脂酶D、磷脂酶C或者磷脂酶A2。全文摘要本發(fā)明提供了一種不需要試樣的分離操作、可以簡(jiǎn)便且靈敏度良好地定量測(cè)定殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的定量方法、試劑以及試劑盒。試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇的定量方法的特征在于，在含有試樣的水性介質(zhì)中，在特定的表面活性劑的組合以及水解磷脂質(zhì)的酶的存在下，使試樣中的殘粒樣脂蛋白膽固醇與膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶(氧化型輔酶共存)反應(yīng)，然后定量測(cè)定所生成的過氧化氫或者還原型輔酶。文檔編號(hào)C12Q1/26GK101120097SQ200680004748公開日2008年2月6日申請(qǐng)日期2006年2月14日優(yōu)先權(quán)日2005年2月14日發(fā)明者宮內(nèi)一人,藤中真由美申請(qǐng)人:協(xié)和梅迪克斯株式會(huì)社