專利名稱：：利用超濾進行病毒純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒制備的領(lǐng)域，更具體地，涉及用于制備疫苗或基因治療產(chǎn)品的病毒的純化，由此得到疫苗和基因治療產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
：病毒，不論是天然的還是重組形式，都可用于疫苗接種和基因治療領(lǐng)域。許多病毒或者類似病毒的顆?？梢园踩行У卦诩毎蟹敝?如WO01/38362，描述了在El-永生化視網(wǎng)膜細胞中培養(yǎng)各種病毒)。重組腺病毒是基因治療和免疫接種中的一類優(yōu)選的病毒載體。這種重組腺病毒通常缺乏至少E1區(qū)域，可以在提供E1區(qū)域的互補細胞中繁殖，例如293細胞，或者El-永生化視網(wǎng)膜細胞，例如？￡11(6@細胞(見美國專利5,994,128)。病毒在細胞內(nèi)繁殖后，對于幾乎所有應(yīng)用，在進一步使用前，必須先對病毒進行純化。國際專利項目WO98/22588描述了生產(chǎn)和純化腺病毒載體的方法。方法包括使細胞生長，用腺病毒感染細胞，收獲并裂解細胞，濃縮裂解液，置換裂解液緩沖體系，用核酸酶處理裂解液，以及進一步用層析方法純化病毒。其他一些文獻也描述了從細胞中純化病毒的方法，大部分是討論用特殊的層析介質(zhì)從細胞裂解液中純化病毒，見美國專利申請6,008,036、6,586,226、5,837,520、6，261，823、6,537,793和國際專利申請WO00/50573、WO02/44348和WO03/078592。在一些純化病毒的工業(yè)化工藝中，特別是對于那些腺病毒，通常使用了超濾步驟，主要是用于濃縮病毒并置換保存有病毒的緩沖液。盡管目前已經(jīng)有關(guān)于幾種主要針對不同層析介質(zhì)的純化工藝的描述，對于病毒的純化，仍然需要有其它可以選擇并且優(yōu)選改進的方法。本發(fā)明就提供了這樣一些方法。圖1.已知的細胞收獲方法(T/B)和本發(fā)明中的方法(B/T)的對比圖解，見例1。T:Triton，B:Benzonase。p丄:感染后。圖2.T/B法或B/T法之后，澄清時宿主細胞蛋白的去除。的對比(圖解見圖1)。圖中顯示5份獨立的純化處理樣品的銀染SDS-PAGE(4-12%bis-trisNuPAGE，Invitrogen)分析(樣品見例1和表1)。圖2為T/B收獲產(chǎn)物，其中裂解先于核酸酶的添加；圖3—7為B/T收獲產(chǎn)物，其中核酸酶的添加先于裂解。收獲物(泳道l)用0.5pm的Clarigard過濾器澄清過濾(泳道2)，接著用0.8/0.45pm的Sart叩ore2過濾器過濾(泳道3)。M:標圖3.病毒純化方法的圖解(見實施例1;也見于PCT/EP2005/050739)。圖4.低純度TFF滲余物(retentate)樣品(A)和高純度TFF滲余物樣品(B)的RP-HPLC圖譜。詳見實施例2。圖5.低純度TFF滲余物樣品(A，TFF過程中無背壓)和高純度TFF滲余物樣品(B，TFF過程中有背壓)的陰離子交換洗脫圖譜。詳見實施例2。圖6.跨膜壓力(TMP，圖A)效果的統(tǒng)計分析和每濾過面積(圖B)的進液量。詳見實施例2。圖7.回收腺病毒時施加背壓到滲透物側(cè)的統(tǒng)計分析。詳見實施例2。圖8.TFF實驗的圖解表示。A.在滲透物側(cè)無背壓(符合本
技術(shù)領(lǐng)域：
狀況的病毒純化TFF)。B.在滲透物側(cè)有背壓(本發(fā)明的病毒純化TFF)。P0:P。ut，Pi:Pin,PP:Pp函。見實施例3。圖9.無背壓時的對照TFF(A)的流量和本發(fā)明中有背壓時TFF(B)的流量。詳見實施例3。圖IO.TFF滲余物的SDS-PAGE。1:標記物，2:A實驗(無背壓對照)，3:B實驗(本發(fā)明中的有背壓實驗)。4:CsCl純化的Ad35.詳見實施例3。圖11.TFF滲余物的RP-HPLC分析。A.無背壓(對照)。B.有背壓(本發(fā)明)。詳見實施例3。圖12.從20L裂解液中用帶背壓的TFF獲得的滲余物的SDS-PAGE分析。除了條帶2外的所有條帶都含有5E9的病毒粒子。1:澄清后的病毒。2:5倍濃縮后的滲透液。3:滲濾過的病毒。4:捕獲的病毒(MustangQ陰離子過濾后)。5:預(yù)先配比后的原液(基團分離和除菌過濾后)。6:標記物。詳見實施例4。圖13.從20L裂解液中用帶背壓的TFF獲得的滲余物的RP-HPLC分析(如同圖12中的樣品)。3:滲濾過的病毒。4:捕獲的病毒(MustangQ陰離子過濾后)。5:預(yù)先配比后的原液(基團分離和除菌過濾后)。6:標記物。詳見實施例4。圖14.本發(fā)明中的腺病毒純化工藝圖解。圖15.CsCl梯度離心純化的Ad5(A)和實驗Bl的滲濾滲余物(B，詳見實施例5)的RP-HPLC分析。圖16.TFF純化的Ad5的SDS-PAGE分析。1:標記物。2:滲濾的病毒B1(詳見實施例5)。3:CsCl純化的Ad5病毒。圖17.TFF純化的Ad35的SDS-PAGE分析。每條帶包含5x108Ad35-TB-S病毒粒子。1:澄清過濾后的收獲液。2:5倍濃縮后的滲余物。3:TFF后的滲余物(16DFV)。4:僅通過過濾純化的病毒。5:CsCl梯度離心純化的病毒。圖18.TFF純化的Ad35的RP-HPLC分析。A:6DFV透析后的滲余物。B:IODFV透析后的滲余物。C:14DFV透析后的滲余物。D:16DFV透析后的滲余物。pVI:先驅(qū)蛋白VI。本發(fā)明的描述本發(fā)明提供了一種包含了超濾步驟的病毒純化方法，其中滲余物包含所述病毒，其特點是在滲透物側(cè)上施加了背壓。在優(yōu)選的實施方案中，上述方法還包含了在上述的超濾之前的步驟a)培養(yǎng)所述病毒感染的細胞，b)添加核酸酶到細胞培養(yǎng)物中。在更優(yōu)選的實施方案中，對于需要裂解步驟的病毒，例如腺病毒，在b)步驟后，上述細胞被裂解得到含有病毒裂解液。在更優(yōu)選的實施方案中，上述方法在裂解步驟c)后還包括了這樣的步驟d)裂解液的澄清過濾，優(yōu)選為深層過濾然后是膜過濾，其中步驟d)先于超濾步驟。在更優(yōu)選的實施方案中，超濾步驟使用切向流過濾，優(yōu)選使用中空纖維模塊。在一些實施方案中，通過泵給滲透物側(cè)提供背壓。在一些實施方案中，滲透物側(cè)的背壓在大約3—80kPa(6.89kPa:lpsi)之間。在優(yōu)選的實施方案中，跨膜壓力小于4psi，優(yōu)選小于3psi，小于2psi，或者小于lpsi。在一些實施方案中，上述超濾包含用0.8M到2M氯化鈉或其它提供相等離子強度的鹽的緩沖液對滲余物進行緩沖液置換，，優(yōu)選隨后采用這樣的緩沖液進行緩沖液置換，其離子強度為包含低于0.5MNaCl的緩沖液的離子強度。在一些實施方案中，所述病毒為重組的腺病毒。在一些實施方案中，所述方法不包括大小排阻層析步驟和/或陰離子交換層析或陰離子交換過濾，在一些實施方案中，所述方法不包括層析步驟。在另外一些實施方案中，該方法包括用至少一個層析步驟對重組腺病毒進一步純化的步驟，所述層析可為例如陰離子交換層析，或者陰離子交換過濾，和/或大小排阻層析。本發(fā)明也提供了一種純化重組腺病毒的方法，上述方法主要包括a)裂解上述的細胞，去除和/或破壞游離核酸，得到含有重組腺病毒的裂解液，b)澄清裂解液，得到腺病毒制備物，c)對腺病毒制備物進行超濾，其中腺病毒制備物在滲余物中，從而濃縮所述腺病毒制備物，d)對d)步驟的腺病毒制備物進行超濾，其中腺病毒制備物在滲余物中，并用至少5倍滲濾體積(DFVs)的緩沖液對所述腺病毒制備物進行置換，其中1DFV為d)步驟中的濃縮之后得到的滲余物體積，e)優(yōu)選對腺病毒制備物進行無菌過濾，所述方法特征在于步驟d)和e)中施加于滲透物側(cè)的背壓為至少5kPa。在一些可選擇的實施方案中，本發(fā)明也提供了一種純化重組腺病毒的方法，所述方法主要包括a)培養(yǎng)用所述重組腺病毒感染的細胞,b)裂解上述的細胞，去除和/或破壞游離核酸，得到含有重組腺病毒的裂解液，c)澄清裂解液，得到腺病毒制備物，d)對c)步驟的腺病毒制備物進行超濾，其中腺病毒制備物在滲余物中，并用至少5倍滲濾體積(DFVs)的緩沖液對所述腺病毒制備物進行置換，其中l(wèi)DFV為c)步驟之后得到腺病毒制備物的體積，e)優(yōu)選對腺病毒制備物進行無菌過濾，所述方法特征在于步驟d)中施加于滲透物側(cè)的背壓為至少5kPa。本發(fā)明也提供了一種在超濾步驟過程中增加重組腺病毒回收率或產(chǎn)率的方法，其滲余物中含有重組腺病毒，其特點是有背壓施加于滲透與已知的其中滲余物包含病毒的含超濾步驟型病毒純化方法最重要的區(qū)別是，在其它方法中，無背壓施加于滲透物側(cè)，因而濾出物能夠自由地流走，通常流到廢液收集桶中。而按照本發(fā)明的方法，有背壓(也叫做反壓)施加在滲透物側(cè)上，其有時候也被指作滲透壓。正如這里所說，我們意外發(fā)現(xiàn)到這種方法相比于那些無背壓作用的方法造成改善。按照本發(fā)明中的方法，相比于在滲透物側(cè)無背壓作用的方法，能夠提高病毒的回收率和/或提高病毒純度。本發(fā)明的詳細描述細胞病毒適合在細胞(有時叫做"宿主細胞")中繁殖。本發(fā)明所指的細胞可以是任何細胞，其中合意的病毒可以在其中繁殖。例如，重組腺病毒載體的繁殖就是在一種能夠彌補腺病毒中缺陷的細胞中生長的。這種細胞在它們的基因組中含有至少腺病毒E1序列，因而，能夠和那些缺失了El區(qū)域的重組腺病毒互補。還有的腺病毒是缺少E3區(qū)域，但是這在腺病毒基因組中不是必要的，因而不需要互補。任何E1—互補細胞都可以使用，例如被E1永生化的人視網(wǎng)膜細胞，象911(見美國專利5,994,128)，El轉(zhuǎn)化的羊水細胞(amniocytes)(見歐洲專利1230354)，El轉(zhuǎn)化的A549細胞(見WO98/39411，美國專利5,891,6卯)，GH329:Hela(Gaoeta1，2000，人類基因治療11:213-219)，293和其它相似的細胞。PER.C6TM細胞(美國專利5,994,128)，或者由它衍生出的其它細胞通常被用作所述細胞，因為它們適合很多不同種類的病毒繁殖(見WO01/38362)，包括但不僅限于重組腺病毒。進一步的對細胞系和繁殖重組腺病毒載體的方法在美國專利6,492,169禾PWO03/104467中有詳細的描述。其它可以被直接用于繁殖病毒或轉(zhuǎn)化成能夠繁殖缺陷型病毒的互補細胞的哺乳動物細胞系有Vero細胞系，Hda細胞系，中國倉鼠卵巢細胞系，W138，BHK,COS-7,HepG2，3T3，RIN，以及MDCK細胞，這些都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。細胞通過培養(yǎng)來增加細胞的數(shù)量和病毒的數(shù)量和/或滴度。按照本發(fā)明，將細胞進行培養(yǎng)，使之新陳代謝，和/或生長，和/或分裂并且產(chǎn)生本發(fā)明所需的病毒。這可通過本領(lǐng)域已知方法進行，這些方法包括(但不僅限于)給細胞提供養(yǎng)分一例如適合的培養(yǎng)基。培養(yǎng)細胞可以通過貼壁培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)，或者兩者的結(jié)合。培養(yǎng)可以在培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)瓶或者生物發(fā)酵罐中，利用分批次操作、流加式操作，連續(xù)式系統(tǒng)或中空纖維膜中進行。為了通過細胞培養(yǎng)得到大批量(連續(xù)的)病毒產(chǎn)物，在本領(lǐng)域內(nèi)，傾向于使用可以懸浮培養(yǎng)的細胞，并且優(yōu)選其不需要動物或人來源的血清或者這些血清的成分。細胞培養(yǎng)的適合條件已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)(見TissueCulture,AcademicPress,KruseandPaterson，editors(1973),禾卩R.LFreshney,Cultureofanimalcells:Amanualofbasictechnique,fourthedition(Wiley陽LissInc.,2000,ISBN0-471-34889-9))。在某些實施方案中，本發(fā)明包含將培養(yǎng)的被病毒感染過的細胞進行裂解。培養(yǎng)細胞和病毒感染的技術(shù)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。用病毒感染細胞，最簡單的方法就是在生理條件下將病毒暴露于適宜細胞，使病毒被細胞攝取。對于某些病毒，甚至不用使用病毒本身，因為它們的核酸序列就可以在培養(yǎng)的細胞中重新構(gòu)建成病毒。培養(yǎng)繁殖腺病毒的細胞的許多方面和系統(tǒng)也可以在專利wo98/22588，p.11-28中找到。培養(yǎng)細胞以及繁殖病毒的方法也可以在許多專利中發(fā)現(xiàn)，例如美國專利6,168,944，5,994,134，6,342,384，6,168,941，5,948,410，5,840,565,5，789，390，6,309,650，6,146,873和國際專利申請WO01/38362，WO01/77304，WO03/084479。病毒本發(fā)明的方法適用于范圍很廣的病毒，包括但不僅限于腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、皰疹病毒、乳頭狀病毒、副粘病毒、正粘病毒(如流感病毒)、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、腺相關(guān)病毒、牛痘病毒、輪狀病毒、黃病毒(如西尼羅河病毒)等等；腺病毒是具體優(yōu)選的。病毒優(yōu)選重組病毒，但也可以是臨床分離株，減毒疫苗株，等等。在某些實施方案中，本發(fā)明是用于純化重組病毒，優(yōu)選腺病毒，帶有異源的轉(zhuǎn)基因，用于基因治療或接種免疫。為了更具體的說明，本發(fā)明將詳細討論重組腺病毒，但不表明本發(fā)明僅限于重組腺病毒。腺病毒腺病毒載體優(yōu)選在腺病毒基因組的El區(qū)域中至少一個關(guān)鍵基因功能中有缺陷，例如Ela區(qū)域或Elb區(qū)域，它們是病毒復(fù)制所必須的。在某些實施方案中，載體在E1區(qū)域中至少一個關(guān)鍵基因功能和至少部分非關(guān)鍵的E3區(qū)域(例如E3區(qū)域的Xbal缺失)中有缺陷。腺病毒可以是"多重缺陷(multipledeficient)",意思是指腺病毒載體在兩個或更多的腺病毒基因組的每一個中的一個或多個關(guān)鍵基因功能上有缺陷。例如上述的El缺失或E1、E3缺失腺病毒載體，可以進一步在E4區(qū)域的至少1個關(guān)鍵基因和/或E2區(qū)域上至少1個關(guān)鍵基因缺失(例如E2A區(qū)域和/或E2B區(qū)域)。腺病毒載體全部缺失E4區(qū)域后會引起宿主免疫反應(yīng)的降低。適合的腺病毒載體例子包括這樣的腺病毒載體，其缺失a)所有或部分E1區(qū)域和所有或部分E2區(qū)域，b)所有或部分E1區(qū)域，所有或部分E2區(qū)域，所有或部分E3區(qū)域，c)所有或部分El區(qū)域，所有或部分E2區(qū)域，所有或部分E3區(qū)域，所有或部分E4區(qū)域，d)至少部分Ela區(qū)域，至少部分Elb區(qū)域，至少部分E2a區(qū)域，至少部分E3區(qū)域，e)至少部分E1區(qū)域，至少部分E3區(qū)域，至少部分E4區(qū)域，和f)所有關(guān)鍵腺病毒基因產(chǎn)物(例如腺病毒擴增子僅包含ITRs和包裝信號)。在腺病毒基因組關(guān)鍵區(qū)域被缺失時，必須反式提供這些基因所編碼的功能，優(yōu)選地由細胞提供，也就是，當(dāng)腺病毒中部分或全部的E1，E2禾B/或E4區(qū)域被缺失時，這些區(qū)域必須存在于細胞中，例如，被整合進細胞的基因組，或者在那些輔助腺病毒或輔助質(zhì)粒上。復(fù)制缺陷型腺病毒載體可以用腺病毒或嵌合腺病毒的任何物種、菌株、亞型或這些的混合物，或腺病毒和當(dāng)作載體DNA來源而產(chǎn)生(例如WO96/26281，WO00/03029)，這有可能提供給腺病毒載體感染某種合意細胞的能力。腺病毒載體可以是任何有在細胞中生長能力的任何腺病毒載體，這些載體的某些重要部分(雖然不是必須在實質(zhì)上)源自或基于腺病毒的基因組。腺病毒載體可能包含C組野生型腺病毒基因組，具體是血清型5(例如Ad5)或Ad2。腺病毒載體可能也包含腺病毒基因組或至少來源于B組腺病毒的纖維蛋白，例如Adll，Ad35，Ad51等等(見WO00/70071)，這個實施方案的優(yōu)點是在群體中對抗這些血清型的中和抗體較少，使得這些腺病毒載體可以作用于其它細胞類型，因而它們的取向和那些來源于Ad5的不同。當(dāng)然，該領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員也知道其它血清型也可以被應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到在特殊的細胞中繁殖不同血清型的腺病毒的可能性，使用的方法可見于美國專利6,492,169或WO03/104467，以及它們的參考文獻。腺病毒載體的構(gòu)建和繁殖方法，在本領(lǐng)域內(nèi)很常見，在很多專利中都有描述。例如美國專利5,559,099,5,837,511，5,846,782，5,851,806,5,994,106，5,994,128，5,965,541，5,981,225，6,040,174，6,020,191，禾卩6,113,913，以及ThomasShenk的"腺病毒和它們的復(fù)制",M.S.Horwitz的"腺病毒"，分別在病毒學(xué)的第67和68章，(B.N.Fieldsetal.,eds.，第三版，RavenPress,Ltd.,NewYork(1996))，還有這里提及的其它參考文獻。構(gòu)建腺病毒載體的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)被熟知，并包含標準分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，例如在Sambrook等人的分子克隆(一本實驗室手冊，第二版，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989))，Watson等人的重組DNA(第二版，ScientificAmericanBooks(1992))，和Ausubel等人的分子生物學(xué)現(xiàn)代規(guī)范(CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,NY(1995))，以及這里提及的其它參考文獻中描述的那些。轉(zhuǎn)基因在一個實施方案中，本發(fā)明所指的病毒是野生型病毒，或者其變種或部分變種，但仍然有感染本發(fā)明所述的細胞的能力。在另外一個實施方案中，病毒是指重組病毒，包含異源信息，其可用于以基因治療為目的的治療背景中，或者是用于免疫接種的抗原。優(yōu)選的實施方案利用例如腺病毒。這些異源信息稱為"轉(zhuǎn)基因"。本發(fā)明的方法適用于病毒，優(yōu)選包含任何轉(zhuǎn)基因的腺病毒，因此，轉(zhuǎn)基因本身與本發(fā)明無直接關(guān)系。一些轉(zhuǎn)基因的實例描述于WO98/22588，p.42-49中。根據(jù)本發(fā)明，病毒中的轉(zhuǎn)基因可以是治療基因，例如腫瘤抑制基因，包括但不僅限于p53，p16,APC，DCC,NF-1,WT-1,p21,BRCA1,BRCA2，以及其它類似物；酶，例如胞(核)嘧啶脫氨酶，HGPRT，葡糖腦苷脂酶，單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶或人類胸苷激酶等等；激素，例如生長激素，催乳素，紅細胞生成素，絨膜促性腺激素，甲狀腺刺激素，脂痩素，ACTH，血管緊張素，胰島素，胰高血糖素，生長激素抑制素，降血鈣素，抗利尿激素等其它類似物；白細胞介素和細胞因子，例如IL-1，IL-3，IL-12，G-CSF,GM-CSF，TNF等；某些特殊疾病中的缺失或突變的替代基因，例如ADA,因子IX，CFTR等；其它治療基因例如血管生成抑制子，細胞循環(huán)抑制子等；抑制例如原癌基因表達的反向構(gòu)建體，例如ras，myc，jun,bcl，abl等；也可以是用于疫苗的抗原，例如病毒抗原，比如來自小核糖核酸病毒，冠狀病毒，囊膜病毒(togavirus)，黃病毒，棒狀病毒，副粘病毒、正粘病毒、痘病毒，嗜肝DNA病毒，呼吸道腸道病毒，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、皰疹病毒等，更具體地，為來自以下病毒的抗原例如流感病毒(具有HA和/或NA作為潛在抗原)，乙肝(乙肝表面抗原作為潛在抗原)，西尼羅河病毒，狂犬病毒，SARS病毒，單純皰疹病毒1和2，麻疹病毒，天花病毒，小兒麻痹癥病毒，HIV(具有抗原例如來源于HIV-1的gag,env,nef，或者它們的修飾形式，包括密碼子優(yōu)化版本，見WO02/22080)，埃博拉病毒，青猴病毒(Marburg)，拉沙病毒(Lassa);或者細菌抗原，真菌抗原，寄生蟲(包括錐體蟲，絳蟲，蛔蟲，蠕蟲，瘧疾等)抗原，等等。明顯地，本領(lǐng)域技術(shù)人員會挑選他們感興趣的基因，用于例如基因治療和/或免疫接種的預(yù)期治療背景中，并且不限于此。同時我們也清楚地知道，這些轉(zhuǎn)基因的控制區(qū)域優(yōu)選地存在于重組病毒載體中，并用于表達這些轉(zhuǎn)基因，例如包括啟動子和polyA信號。這些已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。一些控制區(qū)域描述于WO98/22588，p.49-55。裂解細胞用腺病毒感染后，病毒在細胞內(nèi)復(fù)制并擴增。腺病毒感染最終會造成被感染細胞的裂解。腺病毒的這種細胞裂解特性使得病毒生產(chǎn)可以有兩種不同的模式。第一種是在細胞裂解前收獲病毒，這需要加入外來的因子裂解細胞。第二種是在細胞被病毒幾乎完全裂解后收獲位于上清液中的病毒(見美國專利6,485,958，描述了不用外來因子裂解細胞收獲腺病毒)。對于第二種模式，需要更長的保溫時間來保證細胞完全被裂解，才能得到高的病毒產(chǎn)量。而且，細胞內(nèi)物質(zhì)逐步地釋放到培養(yǎng)液中，會對病毒的完整性和產(chǎn)量有一定影響。因此，優(yōu)選使用外來因子主動地裂解細胞。裂解細胞的方法己經(jīng)為本領(lǐng)域內(nèi)的專家所知，例如WO98/22588,p.28-35中所討論的一樣。這方面有用的方法例如，凍融法，固體剪力，高滲和/或低滲裂解，液體剪力，超聲波，高壓推擠，去垢劑裂解，以及上述方法的結(jié)合，等等。在本發(fā)明的一個實施案例中，至少使用一種去垢劑裂解細胞。用去垢劑裂解細胞的好處在于它是簡便的方法，而且很容易規(guī)?；Ｈス竸┤ス竸┑氖褂梅椒ㄒ呀?jīng)為本領(lǐng)域內(nèi)的專家所知。一些示例也在WO98/22588，p.29-33中有所討論。這里使用的去垢劑可以包括，陰離子，陽離子，兩性離子和非離子去垢劑。舉例說明(但不僅限于)有牛磺膽酸，去氧膽酸，雙羥基牛黃膽酸，十六院基吡啶，氯化苯甲烷銨，ZWITTERGENT-3-14吸，CHAPS(3-[3-Cholamidopropyl)dimethylammomol]-l-丙石黃酸7K化物(propanesulfonatehydrate),Aldrich),BigCHAP,DeoxyBigCHAP,TritonX-100,TritonX-114,C12E8，Octyl-B-D-吡喃葡萄糖苷(Glucopymnoside)，PLURONIC-F68,TWEEN-20,TWEEN-80(CALBIOCHEMBiochemicals)，Thesit,NP-4(f,Brij-58⑧，10。/。辛基糖苷，等等。本領(lǐng)域內(nèi)的專家清楚地知道，去垢劑的濃度可以多種多樣，例如大約在0.1。/。-5。/。(w/w)之間。在一些實施方案中，去垢劑在裂解溶液中的濃度為l%(w/w)。在發(fā)明者的一些中試實驗中，使用Triton后使得溶液的粘性低于使用其它的去垢劑(Tween20，Tween80，去氧膽酸)。在本發(fā)明的一個實施方案中，去垢劑為TritonX-IOO。核酸酶本發(fā)明在優(yōu)選的實施方案中利用核酸酶去除或破壞游離的或污染性且大部分來自于細胞的核酸。適合于本發(fā)明的核酸酶有Benzonase氣Pulmozyme,以及其它任何在本領(lǐng)域內(nèi)常用的DNase禾H/或RNase。在優(yōu)選的實施方案中，核酸酶為Benzonase,因為它能通過水解內(nèi)在的特定核苷酸間磷酸二酯鍵來快速水解核酸，因此降低細胞裂解物的粘性。Benzonase⑧可以從MerckKGaA處購買到(貨號W214950)。核酸酶的濃度優(yōu)選在1-100單位/ml的范圍。根據(jù)本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案，核酸酶在細胞裂解前添加(也參見WO2005/0805565)。它可以在裂解步驟前的幾秒鐘(實際上可以同步)加入，但優(yōu)選在裂解步驟l分鐘前添加到培養(yǎng)物中。加入核酸酶的細胞培養(yǎng)物可以在以下溫度保溫高于保溫溫度例如大約40。C，，或者在保溫溫度(例如在大約35°C到37°C)，或者室溫(大約20°C)，或者更低(大約0°C)，通常，保溫溫度越低，所需的培養(yǎng)時間越長，才能達到同樣的效果(見Benzonase⑧手冊，MerckKGaAcodeW214950)。作為一個非限制性示例，培養(yǎng)可以在37。C進行10分鐘，之后細胞進行裂解。顯然，核酸酶可以并且優(yōu)選能在裂解步驟后仍具有降解核酸的活性，在本發(fā)明的某些實施方案中，細胞和核酸內(nèi)切酶在裂解后一起保溫可以延長到大約50分鐘(使得核酸酶的總體作用時間為1小時，當(dāng)然時間也可以更長，因為預(yù)期核酸酶有可能繼續(xù)發(fā)生效用直到下一步的純化步驟)。這比WO98/22588中所述的保溫過夜要來得短。當(dāng)然，按照本發(fā)明的方法，使用更長的時間保溫，例如2小時，或過夜，或更長(在861120旭56@手冊MerckKGaAcodeW214950中，提供了長達30小時保溫時間的數(shù)據(jù))也可以，但對于獲得可接受的結(jié)果來說并不必要。在這些實施方案中使用的裂解步驟(在這里也就是將含有病毒的細胞進行裂解)，意思是指利用外來因子(見上述"裂解細胞"部分)，例如去垢劑的裂解步驟。顯然，在培養(yǎng)繁殖有腺病毒的細胞的過程中，有些細胞可能由于病毒的作用，在沒有外來因子的情況下發(fā)生了裂解。因此，在優(yōu)選的實施方案中，這種在外來因子不存在的情況下發(fā)生的裂解出現(xiàn)于少于50%，優(yōu)選少于40%，更優(yōu)選少于30%，更優(yōu)選少于20%的細胞，條件是當(dāng)核酸酶處理開始時，也就是在加入核酸酶的時候，活細胞優(yōu)選要占50%，60%,70%,80%。盡管不優(yōu)選(見上)，但是在沒有外來因子存在的情況下裂解細胞的方法仍然被使用。上面已經(jīng)描述了"自發(fā)"裂解的工藝，其中不推薦使用Benzonase(見美國專利6,485,958)。但是，按照本發(fā)明者的發(fā)現(xiàn)，在這種系統(tǒng)中在培養(yǎng)的最后階段加入核酸酶也有好處，也就是優(yōu)選當(dāng)繁殖有病毒的細胞還有至少5%存活的時候，優(yōu)選還有至少10%存活，更優(yōu)選還有至少20%存活(也就是分別有95%，90%，80%的細胞被裂解)。可預(yù)見，利用該步驟可以提高獲得的病毒的質(zhì)量。在本發(fā)明的這些方面中，要找到添加核酸酶最佳的時間(也就是細胞自發(fā)裂解的百分數(shù))，取決于添加的核酸酶的數(shù)量和在保溫中核酸酶比活性降低的程度，本領(lǐng)域內(nèi)的專家可以根據(jù)經(jīng)驗找到這樣的最佳點，現(xiàn)在，添加核酸酶到培養(yǎng)物中的優(yōu)點已經(jīng)被揭示(參見WO2005/080556)。按照本發(fā)明所獲得的裂解物可以用這里所描述的方法，例如超濾和任選的層析進行進一步的純化。國際專利WO03/097797描述了從細胞裂解物中純化腺病毒的可選擇的方法，包含了添加選擇性沉淀劑沉淀DNA雜質(zhì)。這種方法可以和本發(fā)明的純化方法相結(jié)合，包括了滲透物側(cè)施加了背壓的超濾步驟。這是除了用核酸酶破壞核酸外，可選擇的去除游離核酸的方法，雖然在WO03/097797中指出，如果使用這樣的方法則不需要核酸酶，但是在程序后期添加一步這樣的步驟還是會有很好的效果。在上述的實施方案中，包括在細胞裂解前添加核酸酶，可能也適用于和裂解后添加沉淀劑的步驟相結(jié)合，使得在處理后期添加核酸酶的步驟(見WO03/097797)可能多余。對于一些病毒，例如出芽病毒，象流感病毒或西尼羅河病毒，不推薦使用外來因子裂解，因為在細胞培養(yǎng)一段時間后，病毒會存在于培養(yǎng)液中，這樣benzonase可以在澄清步驟前加入到培養(yǎng)液中去。澄清化在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，含有病毒的細胞裂解物要進行澄清化。澄清可以通過過濾步驟來實現(xiàn)，去除細胞碎片和其它雜質(zhì)。適合的過濾器可以利用纖維素濾器，再生纖維素濾器，纖維素和無機濾器結(jié)合(例如硅藻土，珍珠巖，熏硅)，纖維素和無機濾器以及有機介質(zhì)結(jié)合，或者上述任何方式的結(jié)合，以及聚合體濾器(包括但不限于尼龍，聚丙烯，聚醚砜膜)來獲得有效的去除率和可接受的回收率。通常，推薦使用多步結(jié)合的工藝，但不是必須的。舉例來說2到3步的工藝的實例可能包括去除大的沉淀物和細胞碎片的連接濾器(coursefilter),接著是標注的(nominal)孔徑大于0.2小于1微米的拋光型第二階段過濾器(polishingsecondstagefilter)。最佳的組合可能是根據(jù)沉淀物大小和其它變量的分布進行的結(jié)合功能。而且，使用相對緊密的濾器的單階段操作(singlestageopemtion)或離心，也可以用于進行澄清化。更通常地，任何可以用于澄清化的方法，包括但不限于端點過濾，微孔過濾，離心或過濾輔助物(例如硅藻土)和端點過濾或深層過濾(提供具有適當(dāng)澄清度的濾過液，可以不污染到后續(xù)步驟中所使用的濾膜或樹脂)相結(jié)合，都可以用于本發(fā)明的澄清步驟。在一個實施方案中，使用的是深層過濾和膜過濾。可以提供這個用途的商業(yè)化產(chǎn)品在WO03/097797，p.20-21中有提到?？墒褂玫哪た赡芎胁煌牟牧?，具有不同的孔徑，可以組合使用。它們可以從多個供應(yīng)商那里獲取。在本發(fā)明的某些實施方案中，0.8jurn和0.45jLim濾器的組合，例如Sartopore-2濾器，被用于澄清化步驟。超濾/滲濾(UF/DF)根據(jù)本發(fā)明，在工藝過程中病毒懸液至少用超濾(當(dāng)用于緩沖液置換時也叫滲濾，見下)處理一次，例如進行濃縮病毒和/或緩沖液置換，或用于澄清后收獲液的濃縮和滲濾，可以用于去除污染物，例如宿主細胞蛋白，宿主細胞DNA片段，培養(yǎng)液成分，去垢劑和benzonase。根據(jù)本發(fā)明，用于濃縮病毒的工藝可以包含任何過濾工藝(例如超濾(UF))，讓溶劑強行通過濾器，使得病毒制品中的液體被去除，而病毒卻不能通過濾器而以濃縮的形態(tài)被保留下來，以此來提高病毒的濃度。UF在諸如《MicrofiltrationandUltrafiltration:PrinciplesandApplications,LZemanandA.Zydney(MarcelDekker,Inc.,NewYork,NY,1996)》禾口《UltrafiltrationHandbook,MunirCheryan(TechnomicPublishing,1986;ISBNNo.87762-456-9)》等書中都有詳細描述。優(yōu)選的過濾工藝是切向流("TFF")，在MILLIPORE公司產(chǎn)品目錄中名為'TharmaceuticalProcessFiltrationCatalogue"pp.177-202(Bedford,Massachusetts,1995/96)的章節(jié)有描述。TFF廣泛地在生物產(chǎn)業(yè)工藝中，用于細胞收獲，病毒產(chǎn)品的澄清，純化和濃縮。該系統(tǒng)包含3個不同的液體流進料液，滲透物和滲余物。根據(jù)應(yīng)用的情況，使用不同孔徑的濾器。在本發(fā)明中，滲余物包含病毒產(chǎn)品，可以根據(jù)需要進一步進行純化。這里，特定超濾膜的選擇將使得膜孔徑足夠小因而能截留住病毒，但是又足夠大可以有效去除雜質(zhì)。根據(jù)廠家和膜類型的不同，對于腺病毒來說，理論(nominal)分子量的截留(cutoffs)值(NMWC)可以在100到1000kDa之間，例如NMWC為300或500kDa的膜。膜的組分可以是(但不局限于)再生纖維素，聚醚砜膜，聚砜或衍生物。膜可以是平板(flatsheets)(也稱作平濾板(flatscreens)),或中空纖維。UF通常指使用孔徑小于O.lpm濾器的過濾步驟。產(chǎn)品(這里指腺病毒)通常被截留住的同時，溶液體積通過滲透而減少(或者在滲濾過程中，當(dāng)含有緩沖液和雜質(zhì)的滲透物從滲透物側(cè)被除去時，以和滲透速率相同的速率加入緩沖液而使得溶液體積保持穩(wěn)定)。在生物制藥工業(yè)中兩個最常用的TFF幾何學(xué)為板框(平板)和中空纖維膜。用于超濾和微濾的中空纖維最早由Amicon和Ramicon在70年代早期發(fā)明(Cheryan，M.超濾手冊)，直到現(xiàn)在還有多家供應(yīng)商，例如Spectrum和GEHealthcare。中空纖維模塊(module)由一個自我支撐的纖維矩陣組成，并包有一層厚密的表皮，賦予膜選擇滲透性。纖維直徑范圍從0.5mm到3mm。中空纖維模塊的優(yōu)點在于，可以獲得的濾器的膜面積范圍很廣，從很小的ca.16cn^到很大的ca.20m2，方便于簡單的線性放大。在本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案中，就使用中空纖維用于TFF。有報道指出中空纖維比平濾板具有更小的剪切力和更好的病毒顆粒/感染單位(VP/IU)比值。而且，在中空纖維中的跨膜壓力通常用在平濾板的情況要小。在某些實施方案中，本發(fā)明使用0.05pm孔徑的中空纖維。超濾可能包含有使用超濾器的滲濾步驟(DF)，該步驟是去除和交換鹽、糖、非水溶劑，分離游離和結(jié)合物質(zhì)，去除低分子量物質(zhì)，或快速改變離子或pH環(huán)境的好方法。在超濾過程中，以和超濾一樣的速率加入溶劑，對微溶質(zhì)的去除效果優(yōu)選。這種方法用恒定體積的溶液洗去微小物質(zhì)，純化了被截留住的病毒。本發(fā)明利用DF步驟來置換裂解液的緩沖液，可選在進一步的層析或其它純化步驟之前，但主要是為了去除病毒制品中的雜質(zhì)。按照本發(fā)明的一個實施方案，進行利用TFF的DF用于緩沖液置換，其中加入緩沖液的速率相等于滲透物去除的速率。按照本發(fā)明，UF/DF可以用于在純化工藝的不同階段進行病毒懸液的濃縮或緩沖液置換，所述病毒懸液例如裂解液或經(jīng)過進一步純化如層析的病毒懸液。但是，使用本發(fā)明的這個方法，其中在滲透物側(cè)施加了背壓，我們意外地發(fā)現(xiàn)，它足以純化腺病毒而不需要進一步的層析或離子交換步驟。這有幾個好處a)工藝變得簡單，不需要昂貴的柱材料，因而所述柱材料不需要驗證、清洗，等等；b)工藝變得快捷，因為不需要那些諸如層析和分級法等耗費時間的步驟；c)總體產(chǎn)量的提高，因為任何在超濾之后的額外的純化步驟都將不可避免地造成病毒產(chǎn)品的損失。因此，本發(fā)明提供了一種新的，有利的方法，用于純化重組腺病毒，該方法包括純化重組腺病毒的方法，所述方法主要包括a)培養(yǎng)用所述重組腺病毒感染的細胞，b)裂解上述的細胞，去除和/或破壞游離核酸(例如核酸雜質(zhì)，諸如宿主細胞DNA)，得到含有重組腺病毒的裂解液，c)澄清裂解液，得到腺病毒制備物，d)對腺病毒制備物進行超濾，其中腺病毒制備物在滲余物中，從而濃縮所述腺病毒制備物，e)對d)步驟的腺病毒制備物進行超濾(滲濾)，其中腺病毒制備物在滲余物中，并用至少5倍,優(yōu)選至少6、至少7、至少8、至少9、至少10倍滲濾體積(DFVs)的緩沖液對所述腺病毒制備物進行置換，其中1DFV為d)步驟中的濃縮之后得到的滲余物體積，f)優(yōu)選對腺病毒制備物進行無菌過濾，，該方法的特點在于在步驟d)和e)中有背壓施加于滲透物側(cè)，而且該方法不包括陰離子交換或大小排阻層析步驟。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種純化重組腺病毒的方法，該方法主要包括a)培養(yǎng)用所述重組腺病毒感染的細胞，b)裂解上述的細胞，去除和/或破壞游離核酸，得到含有重組腺病毒的裂解液，c)澄清裂解液，得到腺病毒制備物，d)對腺病毒制備物進行超濾，其中腺病毒制備物在滲余物中，從而濃縮所述腺病毒制備物，e)對d)步驟的腺病毒制備物進行超濾(滲濾)，其中腺病毒制備物在滲余物中，并用至少5倍,優(yōu)選至少6、至少7、至少8、至少9、至少10倍滲濾體積(DFVs)的緩沖液對所述腺病毒制備物進行置換，其中1DFV為d)步驟中的濃縮之后得到的滲余物體積，該方法的特征在于在步驟d)和e)中有背壓施加于滲透物側(cè)。因此該方法不包括大小排阻層析步驟，進而也不包含陰離子交換層析或陰離子交換過濾步驟。如果有需要可以增加這些步驟，但本發(fā)明的其中一個優(yōu)點就是層析步驟的數(shù)目減少到零，因而才能得到上述所描述的其它好處。我們意外的發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明的工藝所獲得的重組腺病毒，很可能達到了臨床用重組腺病毒批次的標準(hcDNA殘留量〈10ng/劑，推定劑量為1E11vp/ml，VP/IU比率<30)。該方法的步驟d)嚴格上來說不是必須的，但在步驟e)中進行滲濾來置換緩沖液前減少病毒懸液的體積有好處，因此本發(fā)明也提供了沒有d)步驟的方法，但優(yōu)選包括d)步驟的方法。在這些方法的一個優(yōu)選的實施方案中，步驟b)包括b，i)添加核酸酶到細胞培養(yǎng)物中，然后b,ii)裂解上述細胞得到含有重組腺病毒的裂解液。通過按這樣的順序，先添加核酸酶再裂解細胞，宿主細胞DNA的含量比先裂解細胞再用核酸酶處理的情況要少(見上和WO2005/080556)。在該工藝的最后，也就是在滲濾TFF步驟以后，腺病毒制備物優(yōu)選要經(jīng)過除菌過濾，因為這是制藥級別材料的常用工藝，已經(jīng)為本領(lǐng)域內(nèi)的專家所知。這樣的除菌過濾步驟可以用例如0.22|_im的濾器過濾。可選擇地，在0.22pm過濾之前，可以增加一步0.45pm的過濾，可以理解這樣的步驟也包含在了本發(fā)明工藝的范疇之內(nèi)(也就是不會添加偏離上述主要包括步驟a)-e)或a)-f)的工藝的步驟)。在除菌過濾步驟后，腺病毒制備物就可以用于臨床試驗。除了用諸如Benzonase這樣的核酸酶片段化游離核酸(主要是宿主細胞DNA)之外，在裂解后的細胞培養(yǎng)液中也可以選擇性地沉淀(去除)雜質(zhì)DNA，例如，用適量選擇性沉淀試劑沉淀，例如度米芬(DB)，CTAB(十六基三甲基銨溴化物(cetyltrimethylammoniumbromide))，十六基吡啶氯化物(cetylpyridiniumchloride)(CPC)，芐索氯銨(benzethoniumchloride)(BTC),十四烷基三甲基氯化銨(tetradecyltrimethyl-ammoniumchloride)(TTA),聚乙烯亞胺(polyethyleneimine)(PEI),等等，詳見WO03/097797。這里所使用的優(yōu)選的超濾/滲濾方法包含TFF。按照本發(fā)明，有背壓施加于滲透物側(cè)。這導(dǎo)致本文揭示的改進的結(jié)果，第一次使得一種工藝可以獲得足夠純度的達到臨床試驗標準的腺病毒，而不需要使用柱層析步驟，或繁瑣且不經(jīng)濟的氯化銫密度梯度離心。在滲透物側(cè)施加的背壓使本發(fā)明有別于本領(lǐng)域中用于純化腺病毒的超濾方法，在這些方法中，沒有背壓作用，也就是說滲透物側(cè)完全敞開(在這些例子中背壓為O[這里所指的壓力都是與大氣壓作比較，大氣壓設(shè)為0])。在滲透物側(cè)提供背壓的方法對本發(fā)明不是至關(guān)重要的，只要能在滲透物側(cè)產(chǎn)生背壓(相反的壓力)，可以通過任何合適的方法來獲得這個背壓。這種在滲透物側(cè)的背壓舉例來說可以用一個合適的泵來提供，這個泵在滲透物側(cè)提供背壓。一種提供背壓的簡單方法是部分關(guān)閉滲透物側(cè)的出口，例如將滲透物側(cè)的管道部分夾住，或使用一個滲透物側(cè)泵，像軟管泵，離心泵，轉(zhuǎn)子泵，循環(huán)泵等等，就是通過提供一種方法阻止?jié)B透物側(cè)完全敞開到大氣壓中，等等。對于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員一旦知道了本發(fā)明的好處，這些方法就顯而易見。使用滲透物側(cè)泵可能會造成背壓的一些跳動(pulsation)(波動)，但這并不影響在這里所揭示的方法，反而會帶來好處。用泵來提供背壓的好處是背壓可以很容易地被控制。按照本發(fā)明，所提供的背壓(滲透壓力)至少3kPa，優(yōu)選不低于5kPa。在某些實施方案中背壓至少10kPa，或者至少15kPa，至少20kPa，至少25kPa，至少30kPa,至少40kPa，至少50kPa，至少100kPa,至少150kPa，至少200kPa，至少250kPa。在某些實施方案中，舉例來說背壓大約在3-80kPa。本領(lǐng)域技術(shù)人員憑經(jīng)驗可以容易地決定合適的背壓，背壓也可以根據(jù)滲濾膜的結(jié)構(gòu)(比如說長度)來決定。通常推薦使用和滲余物側(cè)出口壓力相近的背壓，因為如果背壓太高，滲濾模塊的使用效果較差。越長的中空纖維所導(dǎo)致的出口壓力越高，所以在這些時候，也需要增加背壓。通常，本發(fā)明所指的背壓不超過400kPa。在某些實施方案中，本發(fā)明所指的背壓不超過300kPa，或不超過200kPa，不超過100kPa，不超過80kPa。中空纖維最小的進口壓力大約在10kPa，它的進口壓力高于出口壓力，所能承受的最大壓力大約500kPa。在滲透物側(cè)施加背壓可以減小超濾步驟中的跨膜壓力(TMP)，TMP的減小可以導(dǎo)致這里所描述的結(jié)果。TMP可以按照下列公式計算TMP={(Pin+P。ut)/2}—Pperm(這里Pjn是指進口壓力，P。ut是指出口壓力，Pperm是指滲透物側(cè)壓力[迄今為止有關(guān)病毒純化工藝的報導(dǎo)中，滲透物側(cè)壓力都為O，而在本發(fā)明中至少3kPa])。在某些實施方案中，跨膜壓力保持在低于150kPa，或低于100kPa,低于50kPa,低于27kPa,低于月20kPa，低于約13kPa,低于約7kPa。這些值為沿中空纖維長度的壓力的平均值，本領(lǐng)域內(nèi)的專家可以根據(jù)滲余物側(cè)的進口和出口壓力以及滲透物側(cè)的背壓來建立合適的跨膜壓力。這些值也是在TFF步驟過程中的平均值，在優(yōu)選的實施方案中，這些值是對于TFF步驟整個過程的至少20%,30%,40%,50%,更好地60%,70%,80%,卯％，95%而言的最大壓力。此外，膜的結(jié)構(gòu)，例如長度可以影響到TMP壓力的值舉例來說越長的中空纖維通常會造成越高的TMP(由于高的出口壓力)，除非按照本發(fā)明施加的背壓也根據(jù)上述公式相應(yīng)地增加。在滲透物側(cè)施加背壓(結(jié)果導(dǎo)致跨膜壓力的降低)提高了所獲得的腺病毒的產(chǎn)量(見實施例3)，同時也提高了純度(這樣就不需要后續(xù)的純化步驟)。在優(yōu)選的實施方案中，超濾首先被用于減少病毒懸液的體積，例如5倍，只要在超濾的時候不往滲余物(包含病毒)中添加緩沖液。在這一步中應(yīng)當(dāng)己經(jīng)在滲透物側(cè)施加了背壓。接著，對病毒懸液進行滲濾(使用和超濾相同的膜，優(yōu)選是中空纖維TFF模塊)，其中可能用不同的緩沖液進行置換。在滲濾的過程中，應(yīng)使用至少5倍，優(yōu)選不少于6、7、8、9或10倍滲濾體積(DFVs)，同樣地也需要按照本發(fā)明在滲透物側(cè)施加背壓。如果需要進一步提高病毒的純度，應(yīng)適宜地使用更多倍的緩沖液進行滲濾，例如至少11,12，13,14，15,20，30,40,50或更多倍的DFVs。這一歩的滲濾通常是等體積滲濾，這通過以和從滲透物側(cè)去除含緩沖液和雜質(zhì)的濾出物的速率相同的速率來向滲余物(細胞懸液)中添加緩沖液來進行。在優(yōu)選的實施方案中，純化工藝的最后，病毒用合適的(腺)病毒配比緩沖液滲濾，這些配比溶液已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。如果有需要的話，病毒也可以用適合后續(xù)工藝步驟的緩沖液滲濾，例如適合后續(xù)的陰離子交換的緩沖液(例如0.25NaCl，將其上樣到用來純化Ad35的MustangQ陰離子交換的濾器)。本發(fā)明的特征在于在病毒純化的超濾部分中(病毒存在于滲余物中)，滲透物側(cè)施加了至少3kPa的背壓。在本領(lǐng)域以往所描述的病毒純化的工藝中沒有施加背壓，例如US2002/182723，WO98/22588或WO03/097797。而且美國專利5，947，689描述了一種自動化過濾系統(tǒng)，其中滲余物的流速(橫向流動)基于測定的壓力來控制。當(dāng)壓力增加的時候橫向流速降低，造成壓力降低。其中沒有對濾出液(滲透物側(cè))施加壓力。此外，美國專利4,579,662描述了一種過濾方法，該方法通過迫使一種洗滌液從滲透物側(cè)(過濾端)流向滲余物端來清洗臟的表面。清洗過程中，過濾被臨時打斷，液體的流向被反轉(zhuǎn)(滲透物側(cè)到滲余物側(cè))。這個發(fā)現(xiàn)并沒有描述在液體連續(xù)地從滲余物側(cè)過濾到滲透物側(cè)時在滲透物側(cè)施加了壓力。進一步的純化盡管需要提供一種盡可能簡單而且經(jīng)濟的腺病毒純化工藝，以獲得本文所揭示的方法所獲得的結(jié)果，所述方法中在超濾/滲濾過程中在滲透物側(cè)施加背壓，并優(yōu)選在UF/DF步驟后不需要進一步的純化，但是如果有需要，仍然可以在UF/DF步驟后添加進一步的純化步驟。因此，按照本發(fā)明的某個實施方案，可對按照本發(fā)明的方法所獲得的病毒懸液進行進一步的純化，例如使用本領(lǐng)域?qū)＜宜姆椒?，比如說密度梯度離心(WO98/22588，p.59-61)，或者優(yōu)選層析(WO98/22588,p.61-70)。很多方法被用于病毒的進一步純化，其中包括了層析步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解這些工藝，并能通過不同的層析方法來優(yōu)化本發(fā)明的工藝。舉例來說，可以通過陰離子交換和陽離子交換層析步驟來純化某些病毒(美國專利6，008，036)。也可能用羥磷灰石培養(yǎng)液來純化腺病毒(見WO02/44348)。也可以使用一種反相吸附步驟(見WO03/097797,p.26)。對于腺病毒的純化，通常推薦使用至少一個陰離子交換層析步驟。用陰離子交換層析來純化腺病毒已經(jīng)被廣泛地描述過，所以對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說可以輕易地獲取到相關(guān)的信息(見美國專利5,837,520;Huygheetal.,1995,人類基因治療6:1403-1416;美國專利6,485,958;WO00/50573;美國專利6,586,226;美國專利6,537,793)。除了陰離子交換柱，陰離子交換膜層析產(chǎn)品(陰離子交換濾器)也可以使用。這些濾器的使用方法和他們在腺病毒純化中的優(yōu)點可見于WO03/078592。顯而易見地，使用這些濾器也包含于這里所用到的"陰離子交換層析"的范疇中。適用于本發(fā)明中這些方法的陰離子交換濾器，已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并可以購買到(見WO03/078592，段落[40]-[41]，例如Pall的Mustang系列和Sartorius的Sartobind系列)。如上面所描述的，這種工藝也可以適宜地使用大小排阻層析步驟(見WO97/08298;美國專利6,261,823)。在大小排阻步驟中，通過基團分離將病毒顆粒從低分子量的雜質(zhì)中分離出來。舉例來說，可以將大約5-30%，優(yōu)選10%柱體積的樣品上樣到大小排阻柱子上(基團分離模式的大小排阻層析)。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，按照本發(fā)明的方法所制備的腺病毒懸液通過陰離子交換層析和大小排阻層析進行進一步的純化。緩沖液根據(jù)本發(fā)明的方法純化病毒時，可以使用很多種緩沖液。在本發(fā)明的一些實施方案中，用于UF/DF和陰離子交換層析的緩沖液通常包含0.1-1.0MNaCl和TRIS緩沖液(50mM，pH7.5)。在某些實施方案中，包含0.25NaC1/0.05%PS80，2mMMgC12/50mMTrispH8.0的緩沖液用于純化Ad35。在本發(fā)明的一些實施方案中，滲濾過程中將腺病毒制備物的緩沖液置換成含有1MNaCl的緩沖液，然后再置換成含有低離子強度的緩沖液。在國際專利WO2005/080556中指出通過這種步驟可以提高制品中蛋白和DNA的去除率。但是這種步驟并不是必須的，而且由于在高離子強度的條件下會增加聚合的風(fēng)險，本發(fā)明者測試了不包含這樣高鹽步驟的工藝是否能夠獲得足夠純的(Ad35)病毒。盡管用含有1MNaCl的緩沖液進行滲濾能夠略微提高DNA和蛋白的去除率，人們發(fā)現(xiàn)用高鹽(含有1MNaCl)滲濾對于按照本發(fā)明的較好腺病毒純化工藝來說并不是必須的。因此，滲濾過程中的離子強度可以維持在含有1MNaCl溶液的離子強度以下。但是，由于這不能夠提供足夠純的病毒制備物，它優(yōu)選包括這樣的步驟，用含有0.8M到2M氯化鈉或含有產(chǎn)生相同離子強度的其他鹽的緩沖液液來對滲余物進行緩沖液置換。優(yōu)選地，這種工藝包含隨后用離子強度小于0.5MNaCl的緩沖液進行緩沖液置換。這種高鹽滲濾步驟的需要(例如用離子強度與含有至少0.8M，優(yōu)選小于2MNaCl，如1MNaCl的溶液相同的緩沖液來置換)取決于起始物質(zhì)中病毒濃度和/或宿主細胞的濃度，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過中試實驗中對病毒材料DNA成分和純度的分析，可以決定是否要包含這樣的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中，腺病毒的緩沖液在基團分離時被置換成一并最終儲存于一腺病毒國際標準緩沖液(Hogansonetal，Developmentofastableadenoviralvectorformulation,BioprocessingMarch2002，p.43-48):20mMTrispH8，25mMNaCl，2.5%甘油。但是在一個優(yōu)選的實施方案中，不需要基團分離步驟，腺病毒的緩沖液在滲濾中直接被置換成配比緩沖液。顯然，也可以使用很多其它緩沖液，一些適用于儲存和藥物學(xué)給藥的(腺)病毒制品的配方示例可以在歐洲專利0853660和國際專利WO99/41416，WO99/12568,WO00/2卯24，WO01/66137，WO03/049763中找到。本說明書中引用的參考針對所指出的特定部分并入本文，若未指出特定部分，則以其全文并入本文。下面的示例通過一些本發(fā)明的具體實施方案來進一步闡述本發(fā)明的內(nèi)容，但并不是要將本發(fā)明的范圍局限在這些實例中。實施例實施例1.添加核酸酶到細胞培養(yǎng)物中而不是到細胞裂解液中以改進病毒純化工藝在這個實施例中說明了在裂解細胞以前，添加核酸酶到細胞培養(yǎng)物中可以減少最終的純化后原液中宿主細胞的殘留DNA量。在實驗1和2中，10升PER.C6細胞培養(yǎng)物在用腺病毒載體感染2.5天后用1X的TritonX-10(f(Sigma)裂解。裂解30分鐘后，加入核酸酶Benzonase(MerckKgaA，50units/ml)禾BMgCl2(2mM)。再經(jīng)過30分鐘后，TritonX-10(f/Benzonase⑧(T/B)的收獲液進行澄清過濾。這是按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的工藝進行的實驗。在實驗3—8中，先將Benzonase(50U/ml)禾卩MgCl2(2mM)力口入到10升PERC.6細胞培養(yǎng)物中(感染2.5天后)，培養(yǎng)10分鐘后細胞用1%Triton乂-100@裂解。再培養(yǎng)50分鐘后，對Benzonase/TritonX-100(B/T)的收獲液進行澄清化。與本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法不同的是核酸酶(Benzonase⑧)和裂解劑(TritonX-10(f)添加的順序傳統(tǒng)上細胞先裂解然后再加入核酸酶(這里指T/B收獲液)，而在本發(fā)明的工藝中，先加入核酸酶然后才裂解細胞(這里指B/T收獲液)。示意圖見圖1。對樣品進行進一步的純化。澄清化如下進行進行深層過濾(0.5)imClarigardfilter,Millipore)，然后用0.8/0.45pmSartopore2(Sartorius)濾器進一步澄清。澄清后的樣品用0.05中空纖維(Spectrum)濃縮5倍，然后用6倍體積的1.0MNaCl/50mMTRISpH7.5和4倍體積的0.4MNaCl/50mMTrispH7.5溶液進行滲濾。滲濾后的滲余物上樣到SepharoseQ-XL(Amersham)柱子上，病毒級分用0.55MNaCl/50mMTRISpH7.5溶液洗脫。該級分進一步用Sepharose4FF(Amersham)純化并進行緩沖液置換。生成的純化原液用中空纖維(0.05pmporesize,Spectrum)濃縮到所需的濃度，再進行0.22pm過濾和分裝。最后，純化好的原液樣品用Q-PCR檢測殘留宿主細胞DNA含量。T/B處理方式能降低填充的且為最終的(filledandfinal)物質(zhì)中的DNA含量，使得在下游純化工藝后，恰好達到所需的規(guī)格。對含有活病毒的配方中殘留宿主細胞DNA含量的規(guī)程要求是每劑<10ng(以每劑含1E11個病毒粒子為準預(yù)測)。如表1所示，顛倒TritonX-10(f和Benzonase⑧步驟可以很大程度上降低純化液中宿主細胞DNA的殘留量。在主動裂解細胞前加入核酸酶，可以使宿主細胞DNA殘留量減少10到40倍，達到少于0.1ng/lEll病毒粒子。而且，從SDS-PAGE分析(圖2)中也可以清楚看到，B/T收獲液在經(jīng)過深層過濾和膜過濾的澄清化后，大量的宿主細胞蛋白，其中包括大量組蛋白(分子量在10—20kD之間，通過質(zhì)譜分析確定)在澄清過程中去除，而在澄清后的T/B收獲液中，這些蛋白還仍然存在。因此，在裂解細胞前加入核酸酶比以往本領(lǐng)域內(nèi)所采用的方法(見PCT/EP2005/050739)有很大的優(yōu)勢。拋開理論的約束，這里發(fā)現(xiàn)的實驗1、2(T/B)和實驗3—8(B/T)之間存在的差別可能的原因有如下幾點1.當(dāng)加入Benzonase⑤后，從由于病毒產(chǎn)生而從細胞釋放的DNA可以容易地消化。當(dāng)用Triton裂解細胞釋放DNA，由于已經(jīng)存在Benzonase,可以立即消化DNA，因此阻止形成大的DNA聚合物。消化未聚合的DNA可能比消化大的DNA聚合物來的容易。2.Benzonas^總的保溫時間增加了30分鐘，使消化更有效(見Benzonase⑧手冊MerckKGaAcodeW214950)。3.在DNA剛釋放就被降解的情況下有可能會形成較大的組蛋白復(fù)合物，這些較大的顆粒會在隨后的澄清過濾中被截留住。這種在澄清過程中對組蛋白一DNA復(fù)合物的截留作用可能也會造成宿主細胞DNA殘留量的減少。我們測試了幾種陰離子交換樹脂，例如QAE550C和SuperQ650M(從Tosoh購買)，QSepharoseHP,ANXSepharose4FF,DEAESepharose，QSepharoseXL,QSepharoseBigBead禾口QSepharoseFF(從Amersham購買)。雖然這些樹脂都適用于純化重組腺病毒，但是我們發(fā)現(xiàn)QSepharoseXL最適合我們的從宿主細胞的蛋白質(zhì)和DNA中分離病毒的目的和流動特性。而且，用Sartobind75過濾器(包含有陰離子基團的帶電過濾器，Sartorius)代替陰離子交換柱也取得很好的結(jié)果。我們測試了幾種大小排阻樹脂，例如SephacrylS300,SephacrylS500Sepharose4FFandSepharose6FF(所有都是從Amersham購買)。雖然這些樹脂都適用于純化重組腺病毒，但是我們發(fā)現(xiàn)Sepharose4FF最適合我們的從宿主細胞的蛋白質(zhì)和DNA中分離病毒的目的?；谏鲜龊推渌膶嶒灲Y(jié)果，可用于純化腺病毒的工藝在圖3中以圖解表示(也參見WO2005/080556)。實施例2:在UF/DF中在滲透物側(cè)施加背壓可以提高腺病毒的純度和回收率PER.C6細胞在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)到細胞密度在0.9到2.6百萬個細胞/毫升之間。用包含有CS轉(zhuǎn)基因(瘧原蟲密碼子優(yōu)化的[瘧原蟲]環(huán)子孢子(CS)基因，克隆02-659，描述于WO2004/055187;重組腺病毒叫作Ad35.dE3.Ad5orf6/7.AdApt535，或者簡稱Ad35.CS，也參見WO2005/080556)的Ad35載體感染細胞，感染復(fù)數(shù)(MOI)為40vp/細胞(vp:病毒顆粒)。經(jīng)過3—4天的病毒產(chǎn)生，被感染的細胞培養(yǎng)物用Benzonase和Triton(B/T方法)處理，見實施例1。B/T收獲液(滴度大約2E11vp/ml)用深層過濾和隨后的膜過濾來澄清化。澄清后的收獲液作為多種使用0.05中空纖維TFF實驗的進液料(feed)。TFF實驗以減少TFF步驟中的沉積物的方式進行。減少沉積物將有助于提高最終滲余物的純度，提高病毒顆粒的回收率，并且增加流通量。測試的參數(shù)為進液的相對數(shù)量(升/每平方米過濾面積)，跨膜壓力(TMP)和滲透物側(cè)的壓力。在所有的實驗中，進液料被濃縮5倍，然后用10倍滲濾體積的TRIS緩沖液(pH7.5-8.0，包含不同濃度的NaCl，0.1-1.0M之間)滲濾(用TFF)。在一些實驗中，滲濾緩沖液里還添加了0.05。/。PS80和2mMMgCl2。Ad35病毒顆粒的回收率用HPLC-AEX測量，純度用RP-HPLC測定或者當(dāng)用進一步純化最終滲余物時產(chǎn)生的層析圖譜(用陰離子交換或基團分離柱層析)測定。高和低純度滲余物的RP-HPLC圖譜實施例可見圖4。如果在RP-HPLC圖譜中約60分鐘時的峰值<0.01AU，樣品可以被認為是高純度樣品，而當(dāng)這個"60分鐘峰值">0.1AU時則樣品被認為是低純度。如果沒有RP-HPLC數(shù)據(jù)，滲余物純度就用陰離子交換層析來判定。"60分鐘RP-HPLC峰值"內(nèi)的物質(zhì)不會結(jié)合到陰離子交換樹脂或帶電過濾器中，而會出現(xiàn)在流出級分里。當(dāng)流出峰的面積小于洗脫峰的面積時，樣品被認為是高純度的。否則則被認為是低純度(圖5)。實驗得到的滲余物被分為高純度和低純度，并相對于不同的TMP，每平米過濾面積的進液量，以及滲透物側(cè)壓力作圖。統(tǒng)計分析表明，TMP和每平米過濾面積進液量對于純度有顯著的影響(圖6)。圖7顯示在滲透物側(cè)施加壓力對回收率有正面的顯著影響未施加滲透物側(cè)背壓的回收率為46%(n=7)，施加背壓后的平均回收率為81%(n=4)。回收率的提高可能是因為滲透物側(cè)背壓本身的作用也可能是由于背壓的作用而使得TMP減少的緣故TMP,in+P叫t)/2卜Pp醒。實施例3:UF/DF時有無背壓的比較PER.C6細胞在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)到細胞密度為2.4百萬個細胞/毫升。細胞用Ad35.CS感染，感染復(fù)數(shù)40vp/ce11。病毒產(chǎn)生3天后，感染的細胞培養(yǎng)物用Benzonase(50U/ml,10min37。C)處理，之后添加入1%TritonX-100裂解細胞。B/T收獲液用深層過濾和隨后的膜過濾來澄清化。這個實驗的收獲液的病毒滴度均為2E11vp/ml，在粗收獲物和澄清后的B/T中均如此。澄清的收獲液用于2個TFF實驗的進液料。兩個TFF實驗都使用0.05nm孔徑的中空纖維(纖維長度20cm，面積0.105m2)。在兩次實驗中，6.7L/n^的進液料都以2000s"的剪切速率進液。在實驗A中滲透物側(cè)完全打開(Pin大約25-35kPa,P。ut大約12-20kPa,Pperm0kPa)，使得跨膜壓力為24kPa(滲透物側(cè)壓力為0，Ppem=0);在實驗B中滲透物側(cè)用滲透物泵(permeatepump)部分關(guān)閉，因此產(chǎn)生了在滲透物側(cè)的壓力(Pjn大約45-48kPa，P。ut大約10kPa,Pperm大約10kPa)，跨膜壓力約為17kPa。在兩次實驗中，進液料都被濃縮5倍，之后用10倍體積的Tris緩沖液滲濾。這個TFF的圖解在圖8中表示。圖9顯示在實驗A中的初始高流通量(28L/h/m2)，隨著濃縮過程降低到15L/h/m2。實驗B的初始流通量較低(10.5L/h/m2)，但在濃縮和滲濾的過程中保持恒定。滲余物A和B的純度和回收率已被測量。宿主細胞的DNA在兩份滲余物中都保持在規(guī)定的10ng/劑以下，也就是1.0nghcDNA/1E11vp(見表3)。SDS-PAGE分析顯示滲余物A和B之間無區(qū)別(圖10)，在兩份滲余物中，主要的條帶都被鑒定為Ad35蛋白。但是，反相HPLC結(jié)果顯示，在滲余物A中主峰在約60分鐘處(高度0.4AU)，而滲余物B中的該峰值降低至少10倍(高度0.03AU)(圖11)。這個峰包含有TritonX-IOO。在滲透物側(cè)施加背壓(有時候也叫作滲透壓)，回收率從75%提高到90%(見表4)。這些數(shù)據(jù)表明，使用在滲透物側(cè)施加背壓的工藝將能得到高的純度和回收率。更多使用滲透物側(cè)背壓的UF/DF工藝產(chǎn)生數(shù)據(jù)在表2中表示。本發(fā)明的這種在滲透物側(cè)施加背壓的工藝，也用于C組重組腺病毒載體(也就是以Ad5為基礎(chǔ)的載體，見實施例5)，得到的結(jié)果相似。因此，本發(fā)明的工藝適用于不同血清型的重組腺病毒載體。實施例4:20升規(guī)模的本發(fā)明的工藝PER.C6細胞在2個10升發(fā)酵罐中生長，細胞密度達到2.3百萬個細胞/ml。細胞用Ad35.CS載體感染，感染復(fù)數(shù)40vp/cdl。病毒產(chǎn)生3天后，感染的細胞用Benzonase(50U/ml，10min37。C)處理，之后添加入1%TritonX-100裂解細胞。B/T收獲液用深層過濾和隨后的膜過濾澄清。澄清的B/T收獲液(21升)進液到3.3平米中空纖維(纖維長度40cm，孔徑0.05^m)。截留端的泵啟動時，滲透物側(cè)關(guān)閉。5分鐘循環(huán)后，滲透物側(cè)泵緩慢開啟直到達到所設(shè)定的壓力為止。在整個TFF步驟中，測得下列壓力Pin6psi，P。ut4-5psi禾BPperm2-3psi,平均TMP為2.6psi。最初，進液料被濃縮5倍，隨后用10DFV的緩沖液(包含0.25MNaCl，50mMTris，2mMMgC12,0.05%Tween80,pH8.0)滲濾。獲得的病毒在0.45um過濾，第二天用MustangQ陰離子交換濾器進一步純化(獲得的樣品叫作捕獲的病毒)和基團分離步驟(Sepharose4FF柱子)純化。最后，經(jīng)過0.45um過濾和除菌過濾，獲得配比前原液。SDS-PAGE和RP-HPLC分析用于監(jiān)控每個工藝步驟后樣品的純度。SDS-PAGE(圖12)清晰地顯示滲透物(泳道2)中絕大部分的宿主細胞蛋白被去除了。進一步通過MustangQ(泳道4)和基團分離(泳道5)對滲濾后病毒(泳道3)進行純化，沒有在純度上有很大的提高。RP-HPLC的分析結(jié)果也相似(圖13)。滲濾后的病毒(泳道3)已經(jīng)被高度純化了，僅有在60分鐘截留時間檢測到很少量的殘留雜質(zhì)。這些雜質(zhì)很可能是殘留的TritonX-IOO。從這個峰的高度判斷，TritonX-100的殘留量比最初的B/T收獲液中的含量低至少100倍，使得殘留的濃度少于0.01%。如果需要，可用相同的緩沖液再進行幾次滲濾進一步地降低TritonX-100的殘留量。基于RP-HPLC的分析，除了去除殘留的Triton夕卜，MustangQ(條帶4)或基團分離步驟(條帶5)沒有進一步提高樣品的純度。在滲濾后的病毒中宿主細胞DNA的殘留量為I.4ng/1E11vp。這個實施例表明，按本發(fā)明的工藝，在TFF過程中在滲透物側(cè)施加背壓，足以得到有足夠的腺病毒制備物，而不需要層析步驟。本發(fā)明的這種工藝在圖14中用圖解表示。實施例5:使用背壓的Ad5純化，高鹽滲濾的效果PER.C6生長于10升(實驗A)或2升(實驗B)生物反應(yīng)器中，達到細胞密度1百萬個細胞/ml。細胞用Ad5.EBO.GP(S/G).mt(實驗A)或Ad5.EBO.GP(Z).mt(實驗B)載體感染，感染復(fù)數(shù)為60vp/細胞。病毒產(chǎn)生4天后，感染的細胞用Benzonase(50U/ml，10min37。C)處理，之后加入1%TritonX-100裂解細胞。B/T收獲液用深層過濾和隨后的膜過濾澄清。在澄清后的收獲液中病毒滴度(用HPLC-AEX測量)為3.8E10vp/ml(實驗A)和1.7E10vp/ml(實驗B)。澄清后的收獲液作為TFF實驗的進液料。使用0.05Hm孔徑的模塊作為中空纖維膜模塊(得自Spectrum)。TFF實驗過程中使用了實施例2和3中所描述的滲透物側(cè)背壓。兩個澄清后的收獲液都被分為兩份。最初，所有的樣品都濃縮5倍。其中1份(A1和Bl)用6倍高鹽緩沖液(含1.0MNaCl)滲濾，接著用4DFV低鹽緩沖液(實驗A0.4M，實驗B0.3M)滲濾；另外1份(A2和B2)用10DFV低鹽緩沖液(實驗A0.4M，實驗B0.3M)滲濾。在所有的實驗中，平均TMP都等于或低于1psi。獲得的滲濾后病毒樣品通過RP-HPLC分析來測定殘留的宿主細胞DNA的量和純度，結(jié)果顯示在表5。RP-HPLC分析結(jié)果顯示純度非常高(圖15)，與表2中"背壓操作程序"獲得的Ad35結(jié)果相當(dāng)。從以往的數(shù)據(jù)可以知道，如果不施加背壓就無法得到如此高的純度。通過低鹽滲濾所得到的樣品中hcDNA的殘留量比表2中Ad35的數(shù)據(jù)要高。這個有可能是因為收獲液中病毒滴度較低的緣故(Ad5的2-4E10vp/ml比Ad35的2E11vp/ml)。然而，如果使用高鹽滲濾，殘留的hcDNA量將低于10ng/劑的限制，推定劑量為1E11vp/ml。所獲得的回收率大于80%，和表2中所示Ad35的數(shù)據(jù)一致。其中一份樣品的SDS-PAGE分析在圖16中表示。實施例6:用滲透物側(cè)帶有背壓的UF/DF步驟純化流感病毒PER.C6在轉(zhuǎn)瓶中生長到細胞密度2—15百萬個細胞/ml。細胞用A或B型流感病毒感染，感染復(fù)數(shù)10'2到10—3vp/細胞，同時加入胰蛋白酶。病毒復(fù)制4一6天后，細胞培養(yǎng)物用Benzonase(10U/ml，30min37。C)處理。處理后的收獲液用深層過濾澄清。澄清后的收獲液用中空纖維或平板膜模塊(孔徑為300到1000kD)進行TFF滲濾。在預(yù)實驗中，評估在深綠過程中用高鹽濃度緩沖液(例如1MNaCl)置換的效果并與其中利用低離子強度緩沖液進行置換的實驗進行比較。而且，對在緩沖液中加入了其它添加劑，例如去垢劑(如Tween，Triton，DOC，CTAB)的效果也進行了評估。滲透物側(cè)用滲透物泵部分關(guān)閉，因此產(chǎn)生了一定的滲透物側(cè)壓力。背壓被設(shè)定為和出口的壓力值相近，造成了平均TMP的降低。濃縮后，包含病毒的滲余物用配比緩沖液或后續(xù)純化步驟所使用的緩沖液進行滲濾。在滲透物側(cè)施加背壓使純度提高。實施例7:用單一過濾的工藝純化腺病毒PER.C6細胞在2個10升規(guī)模的發(fā)酵罐中培養(yǎng)到細胞密度為2—3百萬個細胞/ml。細胞用Ad35.TB-S載體(一種由腺病毒血清型35衍生來的載體，包含肺結(jié)核抗原(將Ag85A,Ag85B和TB10.4直接融合，也可參見PCT/EP2005/055984))感染，感染復(fù)數(shù)10vp/細胞。病毒繁殖3天后，感染的細胞用Benzonase(50U/ml，10min37。C)處理，之后加入1%TritonX-100裂解細胞。B/T收獲液用深層過濾和隨后的膜過濾澄清。這個實驗中澄清后的B/T收獲液的病毒滴度為2E11vp/ml。部分澄清后的收獲液用作TFF實驗的進液料。實驗用0.05pm中空纖維(纖維長度20cm,面積0.105m"進行。6.7L/m2的進液料都以2000s"的剪切速率進液。滲透物側(cè)出口用滲透物泵部分關(guān)閉，產(chǎn)生了滲透物側(cè)壓力(Pin大約38kPa,P。ut大約31kPa，Pp^大約17kPa)，跨膜壓力大約為17kPa。進液料濃縮5倍后用10倍體積TRIS緩沖液滲濾，接著另外用6倍體積配比緩沖液滲濾。這個TFF在圖8B中圖解表示。滲濾后的病毒用0.8-0.45pm和0.22pm的濾膜過濾。確定純化病毒的純度和回收率。病毒純化后的總體回收率為69%。宿主細胞DNA低于10ng/劑的標準，也就是0.8ngheDNA/1E11vp。SDS-PAGE分析中的主要條帶被鑒定為Ad35病毒蛋白(圖17)。滲余物經(jīng)過16DFV滲濾后在反相圖譜中的所有主要峰都被鑒定為Ad35蛋白(圖18)。反相HPLC顯示在滲濾過程中在大約60分鐘時的峰有降低。這個峰含有TritonX-100。不同體積的TFF實驗后，基于60分鐘位置的峰的峰面積，對TritonX-100的殘留量進行了估計，數(shù)據(jù)顯示在表6。從這些數(shù)據(jù)中可以看出，在約10滲濾體積(DFV)后，TritonX-100的殘留量(大約0.0135%)可能已經(jīng)處于規(guī)程可接受的水平。例如，一種FDA批準的雞卵來源的流感疫苗FLUARIX,0.5ml的劑量包含《0.085mg的TritonX-100(octoxynol-10)(商標信息www.fda.gov/cber/label/inflgla083105LB.pdf)，這相當(dāng)于殘留的TritonX-100濃度S0.017%。這些結(jié)果表明，腺病毒可以通過僅使用過濾技術(shù)以高回收率純化到近似于均質(zhì)。表格<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表1:通過將T/B方法轉(zhuǎn)變成B/T收獲方法來減少純化液中的宿主細胞DNA殘留量。收獲液的規(guī)模純化為2—20升。詳見實施例l。實驗#60分鐘RP-HPLC峰的高度宿主細胞DNA(ng/lE11vp)回收率11D0.0010.487%16/17C0.0020.789%<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表2:6個在滲透物側(cè)施加有背壓的實驗。顯示TritonX-100的殘留量，表示為在截留時間為60分鐘的位置的峰高度(RP-HPLC分析)，宿主細胞DNA殘留量(通過Q-PCR測定)和病毒回收率(澄清化和UF/DF后)也顯示在表中。詳見實施例3。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表3:制備物A和B中的宿主細胞DNA。詳見實施例3。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表4:實驗A和B的數(shù)據(jù)。詳見實施例3。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表5:4個在滲透物側(cè)施加有背壓的TFF實驗。使用了兩批澄清后的收獲液(A和B)，并且先使用高鹽緩沖液后使用低鹽緩沖液進行滲濾(A1和B1)或者只用低鹽緩沖液進行滲濾(A2和B2)。TritonX-100的殘留量結(jié)果以截留時間60分鐘時的RP-HPLC峰高度(RP-HPLC分析)表示，宿主細胞DNA殘留量(通過Q-PCR測定)和病毒回收率(澄清化和UF/DF后)也顯示在表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表6:TritonX-100殘留量的預(yù)測％。詳見實施例7。權(quán)利要求1.包含超濾步驟的病毒純化方法，其中滲余物包含該病毒，所述方法的特征在于在滲透物側(cè)施加至少5kPa的背壓。2.權(quán)利要求l的方法，其中在所述超濾步驟前，所述方法還包括以下步驟a)培養(yǎng)所述病毒感染的細胞，b)向細胞培養(yǎng)物中添加核酸酶，然后，c)任選將上述細胞裂解，提供包含該病毒的裂解液，d)任選澄清該裂解液，優(yōu)選通過深層過濾和隨后的膜過濾來進行。3.上述任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述的超濾包括切向流過濾，優(yōu)選采用中空纖維模塊。4.上述任何一項權(quán)利要求的方法，其中至少5kPa的背壓是通過用泵將背壓提供給滲透物來施加的。5.上述任何一項權(quán)利要求的方法，其中的跨膜壓力維持在低于20kPa。6.上述任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述的超濾包括用含有0.8M到2M的氯化鈉或其它產(chǎn)生相等離子強度的鹽的緩沖液對滲余物進行緩沖液置換，優(yōu)選隨后釆用離子強度為包含少于0.5MNaCl的緩沖液的離子強度的緩沖液進行緩沖液置換。7.上述任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述的病毒為重組腺病毒。8.權(quán)利要求7的方法，所述的方法不包括大小排阻層析步驟。9.權(quán)利要求7或8的方法，所述方法不包括陰離子交換層析或陰離子交換過濾的步驟。10.權(quán)利要求7—9中任何一項的方法，其特征為不包括層析步驟或離子交換過濾步驟。11.權(quán)利要求7的方法，所述方法進一步包括用至少一個層析步驟對重組腺病毒進一步純化的步驟。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述方法包括陰離子交換層析步驟，任選通過將包含病毒的溶液施加到含有帶正電基團的帶電過濾器上來進行。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述方法包括大小排阻層析步驟。14.純化重組腺病毒的方法，所述方法主要包括a)培養(yǎng)用所述重組腺病毒感染的細胞，b)裂解所述的細胞，去除和/或片段化游離核酸，提供含有該重組腺病毒的裂解液，c)澄清裂解液，得到腺病毒制備物，d)對腺病毒制備物進行超濾，其中腺病毒制備物在滲余物中，從而濃縮所述腺病毒制備物，e)對d)步驟的腺病毒制備物進行超濾，其中腺病毒制備物在滲余物中，并用至少5倍滲濾體積(DFVs)))的緩沖液對其進行置換，其中1DFV為d)步驟中的濃縮之后得到的滲余物體積，f)優(yōu)選對腺病毒制備物進行無菌過濾，所述方法特征在于步驟d)和e)中在滲透物側(cè)施加至少5kPa的背壓。15.純化重組腺病毒的方法，所述方法主要包括a)培養(yǎng)用所述重組腺病毒感染的細胞，b)裂解所述細胞，去除和/或片段化游離核酸，提供含有重組腺病毒的裂解液，c)澄清裂解液，得到腺病毒制備物，d)對c)步驟的腺病毒制備物進行超濾，其中腺病毒制備物在滲余物中，并用至少5倍滲濾體積(DFVs)的緩沖液對其進行置換，其中1DFV為c)步驟之后腺病毒制備物的體積，e)優(yōu)選對腺病毒制備物進行無菌過濾，所述方法特征在于步驟d)中在滲透物側(cè)施加至少5kPa的背壓。16.權(quán)利要求14或15的方法，其中步驟b)包括b,i)添加核酸酶到細胞培養(yǎng)物中，然后，b，ii)裂解所述細胞，提供含有重組腺病毒的裂解液。17.權(quán)利要求14一16中任何一項的方法，其中的超濾包括切向流過濾，優(yōu)選采用中空纖維模塊來進行。18.權(quán)利要求14一17中任何一項的方法，其中的背壓是通過用泵將背壓提供給滲透物來施加的。19.權(quán)利要求14一18中任何一項的方法，其中超濾過程中的跨膜壓力維持在20kPa以下。20.權(quán)利要求14一19中任何一項的方法，其中所述的滲余物緩沖液置換包含利用具有不同離子強度的緩沖液進行的緩沖液置換，包括用包含0.8M到2M氯化鈉或其它產(chǎn)生相等離子強度的鹽的緩沖液進行的緩沖液置換，優(yōu)選隨后采用這樣的緩沖液進行緩沖液置換，所述緩沖液的離子強度為包含少于0.5MNaCl的緩沖液的離子強度。21.—種在超濾步驟過程中增加重組腺病毒回收率或產(chǎn)率的方法，其中滲余物包含重組腺病毒，所述方法特征是在滲透物側(cè)施加至少5kPa的背壓。全文摘要本發(fā)明提供了一種純化病毒的方法，包含通過超濾步驟，其中滲余物含有該病毒，其中在滲透物側(cè)施加的背壓為至少在5kPa。本發(fā)明也提供了純化重新腺病毒的方法，該方法主要包括a)培養(yǎng)用上述的重組腺病毒感染的細胞，b)裂解上述的細胞，去除游離核酸，得到含有重組腺病毒的裂解液，c)將裂解液澄清過濾，得到腺病毒制備物，d)將腺病毒制備物進行超濾濃縮，其中所述腺病毒制備物保留在滲余物中，e)將d)步驟得到的腺病毒制備物進行超濾，其中腺病毒在滲余物中，用至少5倍滲濾體積(DFVs)的緩沖液對其進行置換，其中步驟d)和e)中施加于滲透物側(cè)的背壓為至少5kPa。文檔編號C12N7/02GK101155915SQ200680011815公開日2008年4月2日申請日期2006年4月11日優(yōu)先權(quán)日2005年4月11日發(fā)明者M·韋格曼申請人:克魯塞爾荷蘭公司