專利名稱：：改善的纖維素酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的纖維素酶融合蛋白，含有這些纖維素酶融合蛋白、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞的制劑和組合物及其制備方法，以及所述纖維素酶、制劑和組合物在紡織品、去污劑和紙漿以及造紙業(yè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：纖維素是由葡萄糖殘基通過/5-1,4鍵相連而成的線性多糖。在自然界中，纖維素通常與木質(zhì)素以及半纖維素相連，例如木聚糖和葡甘露聚糖。纖維素水解酶能夠水解纖維素，其可由各種各樣的細(xì)菌和真菌產(chǎn)生。纖維素酶是工業(yè)的重要用酶，目前的年市售值為約1.9億美元。在紡織行業(yè)中，纖維素酶被用于粗斜紋棉布(denim)的修整，從而在生物石磨(biostoning)過程中在粗斜紋棉布衣物中造成時(shí)尚的石洗外觀，它們還被用于，例如，清除絨毛以及防止在棉衣服表面上起球。在去污劑行業(yè)中，纖維素被用來使顏色鮮亮并防止衣服泛灰和起球。纖維素酶還可用于食品工業(yè)和動(dòng)物飼料制造業(yè)，并且它們還在紙槳和造紙行業(yè)中具有強(qiáng)大的潛能，例如，在脫墨中使得墨漬從纖維表面上釋出以及改善紙漿的排水。纖維素酶在工業(yè)中的廣譜應(yīng)用建立了對包含不同纖維素酶組分并在不同pH和溫度范圍內(nèi)具有最適功能的商業(yè)化纖維素酶制品的需求。纖維素酶的實(shí)際應(yīng)用常受到已知纖維素酶的性質(zhì)的阻礙，已知纖維素酶通常是具有不同活性和底物特異性的纖維素酶混合物。出于這一原因，進(jìn)行了多種嘗試以期獲得僅具有所需活性的纖維素酶。每種纖維素酶的獨(dú)特性質(zhì)使得一些酶會(huì)比其他的酶更適合某些意圖。雖然這些酶在許多方面都有所不同，但最重要的區(qū)別之一就是最適pH。中性纖維素酶在pH6-8的范圍內(nèi)活性最高，堿性纖維素酶則在pH7.5-10，而最適pH為pH4.5-5.5的酸性纖維素酶，則在較高pH值下表現(xiàn)出了相當(dāng)?shù)偷幕钚运?。中性和酸性纖維素酶在紡織行業(yè)中特別有用。在織物處理過程中，纖維素酶可攻擊來自棉花纖維的纖維素分子鏈，從而影響所述織物的性質(zhì)。在紡織行業(yè)中，"石洗"外觀或磨損外觀一直是近年來粗斜紋棉布制造商的興趣所在。使用浮石進(jìn)行的傳統(tǒng)石洗會(huì)降低織物的強(qiáng)度并增大洗衣設(shè)備的負(fù)擔(dān)。目前的潮流是趨向于酶法粗斜紋棉布修整處理，而且纖維素酶已經(jīng)取代了浮石或與浮石一起使用，以賦予織物所希望的"磨損"外觀。受控制的酶處理導(dǎo)致對衣服和機(jī)器的損害降低并免去了處理石頭的需要。用于粗斜紋棉布處理的纖維素酶通常分為兩大類酸性和中性纖維素酶。酸性纖維素酶通常在pH4.5-5.5發(fā)揮作用而中性纖維素酶則在pH6-8。用于生物石磨的酸性纖維素酶主要來源于里氏木霉(Trichodermareesei)(紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)的有性幵》式)，而中性纖維素酶則來自多種真菌，包括子囊菌屬(Melanocarpus)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梭孢殼屬(Thielavia)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、鐮刀菌屬(Fusarium)、枝頂孢屬(Acremonium)和金孢菌屬(Chrysosporium)(Haakana等2004)。里氏木霉的酶包括，例如，來自糖苷家族5(內(nèi)切葡聚糖酶II，EGII)、家族7(纖維二糖水解酶I，CBHI)和家族12(內(nèi)切葡聚糖酶III,EGIII，Ward等1993)的纖維素酶，以及中性纖維素酶，大多數(shù)通常是內(nèi)切葡聚糖酶，其來自家族45和家族7(Henrissat，1991;Henrissat和Bairoch，1993)。纖維素酶包括表達(dá)纖維素酶活性的催化結(jié)構(gòu)域/核心(CD)。除了所述催化結(jié)構(gòu)域之外，纖維素酶分子還可含有一個(gè)或多個(gè)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，也稱作碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域/模塊(CBD/CBM)，其可位于所述催化結(jié)構(gòu)域的N-或C-末端。CBD具有碳水化合物結(jié)合活性，且能夠介導(dǎo)纖維素酶與結(jié)晶纖維素的結(jié)合，但卻對所述酶對于可溶性底物的纖維素酶水解活性作用甚微或沒有作用。這兩種結(jié)構(gòu)域通常是通過柔性和高度糖基化的接頭區(qū)域進(jìn)行連接的。因?yàn)槿玖衔挥诶w維的表面，所以主要進(jìn)攻纖維表面的纖維素酶特別適用于用靛藍(lán)染料染色的粗斜紋棉布的石洗。當(dāng)被用于處理棉織物時(shí)，中性纖維素酶通常需要比酸性纖維素酶更長的洗滌時(shí)間。然而，中性纖維素酶對棉花的攻擊性作用卻要弱于酸性纖維素酶，而且對織物強(qiáng)度的影響也不象酸性纖維素酶那樣強(qiáng)。中性纖維素酶具有較寬的pH范圍，因此，在生物石磨過程中產(chǎn)生的pH升高對中性纖維素酶的活性幾乎沒有影響。然而，由于纖維素酶處理也有不希望的作用，例如纖維損壞和強(qiáng)度喪失，所以需要在希望和不希望的效果中尋求適當(dāng)?shù)钠胶狻Ｔ诒菊f明書中被引作參考的WO97/14804公幵了三種新的來源于子囊菌屬的中性纖維素酶，其特別適用于紡織和去污劑行業(yè)。特別描述了20kDa內(nèi)切葡聚糖酶(Cel45A)、50kDa內(nèi)切葡聚糖酶(cel7A)和50kDa纖維二糖水解酶(Cel7B)。這些在本文中被分別指定為"20K-纖維素酶"、"50K-纖維素酶"以及"50K-纖維素酶B"的纖維素酶都來自于Melanocarpusalbomyces，并表現(xiàn)出良好的石洗效果。由于對對深入改進(jìn)纖維素酶存在著需求，尤其是在紡織和去污劑行業(yè)中，因此有建議認(rèn)為可通過形成融合蛋白的方法來獲得對纖維素酶的改進(jìn)。還是在WO97/14804中，一般性地建議了20K-纖維素酶、50K-纖維素酶和50K-纖維素酶B與例如，里氏木霉纖維素酶、半纖維素酶或甘露聚糖酶或其功能性結(jié)構(gòu)域的融合蛋白構(gòu)建體。此外，為了對已公開的纖維素酶產(chǎn)生新的性質(zhì)，還建議了纖維素酶與結(jié)構(gòu)域的融合，所述結(jié)構(gòu)域例如纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，優(yōu)選帶有接頭。然而，該公開文本既未給出具體的實(shí)施例，也沒有描述所感興趣的新性質(zhì)所在。同樣，纖維素酶融合蛋白也是公知的，例如，在W096/29397中，其公開了通過由來自嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)以及Crinipellisscabella的內(nèi)切葡聚糖酶與來自特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)的CBD/接頭的融合形成的內(nèi)切葡聚糖酶。所述內(nèi)切葡聚糖酶在其天然形式中不具有CBD/接頭。EP663950公開了纖維素酶的變異體，尤其是特異腐質(zhì)霉的43kD纖維素酶變異體，其中所述纖維素酶可包括來自于另一個(gè)微生物種類的連接區(qū)域，例如，為了提供改進(jìn)的性質(zhì)，例如對陰離子表面活性劑、對氧化劑或漂白劑的改善的抗性。然而，在常規(guī)使用纖維素酶的紡織工業(yè)中以及其他領(lǐng)域中，對于同樣也對纖維造成較少損傷的改進(jìn)纖維素酶的需求持續(xù)存在。特別是，對于更有效的纖維素酶存在著持續(xù)的需求，以改善加工經(jīng)濟(jì)學(xué)。本發(fā)明的目的旨在滿足這一需求。發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于提供水解性質(zhì)改進(jìn)的新型纖維素酶融合蛋白，用于紡織工業(yè)，尤其是石洗粗斜紋棉布，并可應(yīng)用于去污劑組合物以及其他領(lǐng)域。本發(fā)明的新型纖維素酶融合蛋白在中性和堿性pH值下都具有活性，其在織物生物修整(biofinishing)以及生物石磨應(yīng)用中以及在去污劑應(yīng)用中都具有高度改善的洗滌性能，但其卻不會(huì)危及到織物的強(qiáng)度。由于本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白的效率改進(jìn)，所述酶的制造方法明顯更加經(jīng)濟(jì)。當(dāng)需要較少量的酶產(chǎn)品時(shí)，所述酶產(chǎn)品在運(yùn)銷與儲(chǔ)存方面也具有額外的優(yōu)勢。本發(fā)明的另一目的是提供編碼本發(fā)明所述的新型纖維素酶融合蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的又一目的是提供含有這類多核苷酸的新型表達(dá)質(zhì)?；蜉d體，其可用于生產(chǎn)本發(fā)明的新型纖維素酶融合蛋白，以及提供用所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的新型宿主。本發(fā)明的又一目的是提供酶制劑，其含有一種或多種具有改進(jìn)水解性質(zhì)的新型纖維素酶融合蛋白。本發(fā)明的又一目的是提供使用所述酶制劑和所述纖維素酶融合蛋白用于修整紡織品、尤其是用于粗斜紋棉布生物石磨的方法。本發(fā)明的再一目的是提供在去污劑組合物中使用本發(fā)明酶制劑的方式。本發(fā)明涉及新的纖維素酶融合蛋白，其包括A.得自一個(gè)物種的纖維素酶核心的任選修飾的第一氨基酸序列，以及B.得自另一物種的接頭和/或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的任選修飾的第二氨基酸序列，其中，向所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列之間引入連接區(qū)域，從而獲得穩(wěn)定的融合蛋白。優(yōu)選，所述連接區(qū)具有以下通式!A-2B-3C-4D-5E-6F其中、選自Gly，Ala，Leu，Pro,lie和Val;優(yōu)選地，^為Gly或Val，最優(yōu)選為Gly;2B選自Gly，Ala，Leu，Pro,Ile，Phe，Val，Glu，Asp,Gin和Asn;優(yōu)選，2B為Pro，Gin或Glu;3c選自Gly，Ala，Lys,Leu，Pro,Ile，Val，Ser和Thr;優(yōu)選地，3C為lie;4D選自Gly，Ala，Leu，Pro,lie禾QVal;優(yōu)選，4D為Gly或Pro;5E選自Ser，Pro和Thr;優(yōu)選，5E為Ser;且6F選自Ser，Thr或不存在，優(yōu)選，6F為Ser或不存在；其中'A連接于纖維素酶核心的C-末端氡基酸序列且6F連接于接頭和/或結(jié)構(gòu)域(CBD)的N-末端氨基酸序列。本發(fā)明還涉及表達(dá)載體，其包括第一多核苷酸序列，其編碼得自一個(gè)物種的纖維素酶核心的任選修飾的第一氨基酸序列，以及第二多核苷酸序列，其編碼得自另一物種的接頭和/或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的任選修飾的第二氨基酸序列，以及編碼連接所述第一和第二多核苷酸序列連接區(qū)域的多核苷酸，所述多核苷酸序列編碼本發(fā)明纖維素酶融合蛋白的相應(yīng)氨基酸序列。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的新宿主，特別是能夠高水平表達(dá)本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白的宿主。本發(fā)明還涉及酶制劑，其含有一種或多種本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明酶制劑進(jìn)行織物修整、特別是對粗斜紋棉布進(jìn)行生物石磨的方法。本發(fā)明還涉及在去污劑組合物中本發(fā)明酶制劑的應(yīng)用。附圖圖1是質(zhì)粒pALK1480的示意圖。圖2是質(zhì)粒pALK492的示意圖。圖3是質(zhì)粒pALK424的示意圖。圖4是質(zhì)粒pALK1237的示意圖。圖5是質(zhì)粒pALK1241的示意圖。圖6是質(zhì)粒p3SR2的示意圖。圖7是質(zhì)粒pALK1649的示意圖。圖8是質(zhì)粒pALK1694的示意圖。圖9A所示為用于產(chǎn)生20K+CBD融合蛋白的里氏木霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的表達(dá)盒。所述20K+CBD基因處于cbhl(cel7A)啟動(dòng)子(cbhl啟動(dòng)子)的控制下，并通過使用cbhl終止子序列(終止子)確保轉(zhuǎn)錄的終止。其還包括了amdS基因(amdS)以及cbhl3'側(cè)翼區(qū)域(cbhl3'側(cè)翼)。圖9B所示為連接點(diǎn)的氨基酸序歹!j，在此，Melanocarpusalbomyces20K(Cel45A)蛋白融合到pALK1434和pALK1435質(zhì)粒中后面接著纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的里氏木霉CBHI(cd7A)的接頭威上。接頭區(qū)域所包含的氨基酸用下劃線標(biāo)記，而CBD區(qū)域的氨基酸序列則通過斜體標(biāo)記。在所述CBD區(qū)域中的第一個(gè)氨基酸通過上標(biāo)數(shù)字表示。圖10A所示為用于產(chǎn)生20K+CBD融合蛋白的里氏木霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的表達(dá)盒。所述20K+CBD基因處于cbhl(cel7A)啟動(dòng)子(cbhl啟動(dòng)子)的控制下，并通過使用cbhl終止子序列(終止子)確保了轉(zhuǎn)錄的終止。其還包括了amdS基因(amdS)以及cbhl3'側(cè)翼區(qū)域(cbhl3'側(cè)翼)。圖10B所示為連接點(diǎn)的氨基酸序列，在此，Melanocarpusalbomyces20K(Cel45A)蛋白融合到pALK1768、pALK1769、pALK1770和pALK1775質(zhì)粒中后面接著纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的里氏木霉CBHI(cel7A)的接頭肽上。接頭區(qū)域所包含的氨基酸用下劃線標(biāo)記，而CBD區(qū)域的氨基酸序列則通過斜體標(biāo)記。在所述CBD區(qū)域中的第一個(gè)氨基酸通過上標(biāo)數(shù)字表示。圖11A所示為用于產(chǎn)生20K+CBD韭融合蛋白的里氏木霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的表達(dá)盒。所述20K+CBDmut基因處于cbhl(cel7A)啟動(dòng)子(cbhl啟動(dòng)子)的控制下，并通過使用cbhl終止子序列(終止子)確保了轉(zhuǎn)錄的終止。其還包括amdS基因作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記。圖IIB所示為連接點(diǎn)的氨基酸序列，在此，所述連接點(diǎn)上Melanocarpusalbomyces20K(Cel45A)蛋白融合到后面接著纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的里氏木霉CBHI(cel7A)的接頭肽上。pALK1877-pALK1880表達(dá)盒的CDB區(qū)域中的氨基酸取代也得以呈現(xiàn)。接頭區(qū)域所包含的氨基酸用下劃線標(biāo)記，而CBD區(qū)域的氨基酸序列則通過斜體標(biāo)記。在所述CBD區(qū)域中的第一個(gè)氨基酸以及酪氨酸殘基或其取代物通過上標(biāo)數(shù)字表示。圖12A所示為里氏木霉CBHI(cd7A)域間接頭肽的氨基酸序列。接頭區(qū)域所包含的氨基酸用下劃線標(biāo)記。AG-444和△G-460分別代表殘基434-444和434-460的接頭缺失。圖12B所示為連接點(diǎn)的氨基酸序列，在此，Melanocarpusalbomyces20K(Cel45A)蛋白融合到在pALK1893、pALK1896、pALK1899和pALK1952表達(dá)盒中后面接著完整或突變的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的里氏木霉CBHI(cel7A)截?cái)嗟慕宇^肽上，之后是。連接區(qū)域所包含的氨基酸用下劃線標(biāo)記，而CBD區(qū)域的氨基酸序列則通過斜體標(biāo)記。在所述CBD區(qū)域中的第一個(gè)氨基酸以及酪氨酸殘基或其取代物上通過上標(biāo)數(shù)字表示。圖13A所示為用于產(chǎn)生50K+CBD融合蛋白的里氏木霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的表達(dá)盒。所述50K+CBD基因處于里氏木霉cbhl啟動(dòng)子(cbhl啟動(dòng)子)的控制下，并通過加入cbhl終止子(終止子)確保轉(zhuǎn)錄的終止。其還包括了amdS基因(amdS)以及cbhl3'側(cè)翼區(qū)域(cbhl3'側(cè)翼)。圖13B所示為連接于里氏木霉CBHI接頭+CBD的Melanocarpusalbomyces50K連接點(diǎn)的氨基酸序列。連接區(qū)域所包含的氨基酸用下劃線標(biāo)記，而CBD區(qū)域的氨基酸序列則通過斜體標(biāo)記。在所述CBD區(qū)域中的第一個(gè)氨基酸通過上標(biāo)數(shù)字表示。圖14A所示為用于產(chǎn)生50KB+CBD融合蛋白的里氏木霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的表達(dá)盒。所述50KB+CBD基因處于里氏木霉cbhl啟動(dòng)子(cbhl啟動(dòng)子)的控制下，并通過加入cbhl終止子(終止子)確保了轉(zhuǎn)錄的終止。其還包括了amdS基因(amdS)以及cbhl3'側(cè)翼區(qū)域(cbhl3')。圖14B所示為連接于里氏木霉CBHI接頭+CBD的Melanocarpusalbomyces50KB連接點(diǎn)的氨基酸序列。接頭區(qū)域所包含的氨基酸用下劃線標(biāo)記，而CBD區(qū)域的氨基酸序列則通過斜體標(biāo)記。在所述CBD區(qū)域中的第一個(gè)氨基酸通過上標(biāo)數(shù)字表示。圖15A所示為用于產(chǎn)生里氏木霉原生質(zhì)體制備重組橘黃嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)CBHI+CBD融合蛋白轉(zhuǎn)化的表達(dá)盒。所述CBHI+CBD基因處于cbhl(cel7A)啟動(dòng)子(cbhl啟動(dòng)子)的控制下，并通過使用cbhl終止子序列(終止子)確保了轉(zhuǎn)錄的終止。其還包括amdS基因作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記。圖15B所示為連接點(diǎn)的氨基酸序列，在此，橘黃嗜熱子囊菌CBHI蛋白融合到后面接著纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的里氏木霉CBHI的接頭肽上。接頭區(qū)域所包含的氨基酸用下劃線標(biāo)記，而CBD區(qū)域的氨基酸序列則通過斜體標(biāo)記。在所述CBD區(qū)域中的第一個(gè)氨基酸通過上標(biāo)數(shù)字表示。圖16所示為表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的菌株RF5977和RF6090與商業(yè)化20K制劑在粗斜紋棉布處理中的表現(xiàn)比較。在實(shí)施例8和9所述的洗滌條件中，亮度的升高為酶劑量的函數(shù)。圖17所示為20K+CBD融合蛋白與相'應(yīng)的商業(yè)化酶制劑對粗斜紋棉布織物的強(qiáng)度的影響。圖17A撕裂強(qiáng)度(N)，經(jīng)紗。圖17B撕裂強(qiáng)度(N)，緯紗。圖18顯示了20K+CBD融合蛋白的防起球效果。圖19圖示了20K+CBD融合蛋白在去污劑應(yīng)用中的性能。所述圖顯示了在使用或未使用所述酶洗滌的抗灰制品224與原始材料(未洗滌)之間的顏色匹配差異；A在40'C，B在6(TC。圖20圖示了20K+CBD融合蛋白在去污劑應(yīng)用中的性能。所述圖顯示了在使用酶和未使用酶洗滌的抗灰材料224之間的顏色匹配差異；A在40°C，B在60°C。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明是基于對進(jìn)一步改進(jìn)中性纖維素酶、尤其是那些在WO97/14804中所述的中性纖維素酶的工作，其目的在于在酶處理過程中降低所述織物強(qiáng)度的損失。在一些應(yīng)用中，也許是因?yàn)槠浯笮”容^小，20K纖維素酶表現(xiàn)出了有關(guān)纖維強(qiáng)度的不希望的性質(zhì)。一種簡單的假設(shè)認(rèn)為，酶的大小增加有可能降低所述酶穿透進(jìn)入纖維的能力，從而將對纖維的弱化降低至較小的程度，即，所述酶的進(jìn)攻性較弱。為此，采用了在WO97/14804中所建議的融合蛋白方法，并設(shè)計(jì)了包括子囊菌種的中性纖維素酶核心和由里氏木霉的酸性纖維二糖水解酶I的接頭/CBD組成的尾部的融合構(gòu)建體。然而，令人驚異的是，與現(xiàn)有技術(shù)的建議相反，并不能獲得完全穩(wěn)定的融合蛋白構(gòu)建體，而是融合配偶體在培養(yǎng)條件彼此分離。這大概是由于蛋白酶的存在。為了產(chǎn)生穩(wěn)定的融合蛋白，一種方法是設(shè)計(jì)出沒有相鄰疏水性氨基酸(例如，V，I,L，F(xiàn)和W)的新型連接構(gòu)建體，從而防止由天冬氨酰蛋白酶引起的切割。然而，即使所述構(gòu)建體產(chǎn)生融合蛋白，還是會(huì)時(shí)爾觀察到某些降解?；趯μ烊缓薪宇^/CBD尾部的中性纖維素酶的比對，產(chǎn)生了其他的構(gòu)建體，且這些構(gòu)建體最終被證明是最穩(wěn)定的并且最適用于進(jìn)一步的檢驗(yàn)。除此之外，還設(shè)計(jì)了在CBD中攜帶突變的融合構(gòu)建體，導(dǎo)致對于纖維素的親和性或吸附能力降低或最小化(Linder等，1995)。新型構(gòu)建體產(chǎn)生了改善的強(qiáng)度性質(zhì)，這就是目的。令人驚奇的是，所述穩(wěn)定的纖維素酶融合蛋白還在洗滌性能中另外表現(xiàn)出了意料之外的改進(jìn)，效力甚至高達(dá)其"母體"纖維素酶的6倍。然而，其產(chǎn)量卻保持在大致相同的水平上。這意味著現(xiàn)在僅需纖維素酶活性量的六分之一就足以達(dá)到與現(xiàn)有技術(shù)纖維素酶相同的洗滌性能。這在生產(chǎn)步驟中，以及在運(yùn)銷和保存中產(chǎn)生了相當(dāng)程度的節(jié)約，從而降低了環(huán)境的負(fù)擔(dān)。同樣，還減少纖維素酶制劑的不希望的作用，從而為酶制品的最終用戶帶來了進(jìn)一步的節(jié)約。考慮到每年會(huì)生產(chǎn)大約20億條粗斜紋棉布牛仔褲，且其大多數(shù)都是經(jīng)過纖維素酶進(jìn)行修整的，其優(yōu)勢極為顯著。因此，本發(fā)明提供了一種新的纖維素酶融合蛋白，其包括A.得自一個(gè)物種的纖維素酶核心的任選修飾的第一氨基酸序列以及B.得自另一物種的接頭和/或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的任選修飾的第二氨基酸序列，其中，向所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列之間引入連接區(qū)域，從而獲得穩(wěn)定的融合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述連接區(qū)域具有以下通式、-2B陽3C-4D-5E-6F其中'A選自Gly，Ala，Leu，Pro,lie禾卩Val;優(yōu)選，'A為Gly或VaI，最優(yōu)選為Gly;2B選自Gly，Ala,Leu，Pro,lie,Phe，Val,Glu，Asp，Gin和Asn;優(yōu)選，2B為Pro，Gln或Glu;3C選自Gly，Ala，Lys，Leu，Pro,Ile，Val，Ser和Thr;優(yōu)選，3C為Ile;4D選自Gly，Ala，Leu，Pro,lie和Val;優(yōu)選，4D為Gly或Pro;5E選自Ser，Pro和Thr;優(yōu)選，5E為Ser;且^選自Ser，Thr或不存在，優(yōu)選，6F為Ser或不存在；其中連接于纖維素酶核心的C-末端氨基酸序列且6F連接于接頭和/或結(jié)構(gòu)域(CBD)的N-末端氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案中，所述連接區(qū)域具有以下通式、-2B-3Ile-4D-5Ser陽6F其中2B為Pro,Gin或Glu;4D為Gly或Pro;5E為Ser;且^為Ser或不存在。在本發(fā)明的另一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案中，所述連接區(qū)域具有以下通式al-2Gln-3Ile-4Pro-5Ser-6Sor。在本發(fā)明的又一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案中，所述連接區(qū)域具有以下通式、-2Glu-3Ile-4Gly-5Ser。在本發(fā)明的又一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案中，所述連接區(qū)域具有以下通式'Gly-2Pro-3Ile-4Gly-5Ser。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一氨基酸序列來自中性纖維素酶且所述第二氨基酸序列來自酸性纖維素酶。在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一氨基酸序列來自家族45(Cel45)的纖維素酶且所述第二氨基酸序列來自家族7(Cel7)的纖維素酶。正如在本文中所使用，"纖維素酶核心"或"核心"的表述是指表達(dá)纖維素酶活性的酶的催化結(jié)構(gòu)域/核心(CD)。這樣的催化結(jié)構(gòu)域可以是其天然存在的形式(即完整形式)，或者，優(yōu)選，進(jìn)行下述的修飾。"衍生物"和功能性變異體的表述是指表達(dá)相同的纖維素酶活性但包括下述修飾的多肽。在本文中使用了常規(guī)的單字母氨基酸代碼和三字母氨基酸代碼。因此，A和Ala是指丙氨酸，R和Arg是指精氨酸，N和Asn是指天冬酰胺，D和Asp是指天冬氨酸，Cys和C是指半胱氨酸，E和GIu是指谷氨酸，Q和Gln是指谷氨酰胺，G和Gly是指甘氨酸，H和His是指組氨酸，I和Ile是指異亮氨酸，L和Leu是指亮氨酸，K和Lys是指賴氨酸，M和Met是指甲硫氨酸，F(xiàn)和Phe是指苯丙氨酸，P和Pro是指脯氨酸，S和Ser是指絲氨酸，T和Thr是指蘇氨酸，W和Trp是指色氨酸，Y和Tyr是指酪氨酸，而V和Val是指纈氨酸。除了天然存在的L-氨基酸，還可以使用D-氨基酸。在本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白中，所述中性纖維素酶優(yōu)選是真菌來源的。所述中性纖維素酶可得自子囊菌屬(Melanocarpus)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，梭孢殼屬(Thielavia)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，鐮刀菌屬(Fusarium)，枝頂孢屬(Acremoni腿)，金孢菌屬(Chrysosporium)，嗜熱菌屬(Thermoascus),帚霉屬(Scopulariopsis)，多齒菌屬(Myriococcum),踝節(jié)菌屬(Talaromyces)或毛殼菌屬(Chaetomium)。特別優(yōu)選的是子囊菌亞種，尤為優(yōu)選Melanocarpusalbomyces。用于本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白中的酸性纖維素酶源于于木霉亞種或肉座菌(Hypocrea)，尤其來自里氏木霉。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，第一氨基酸序列是SEQID.NO:2的Melanocarpusalbomyces20K纖維素酶或其衍生物，而第二氨基酸序列是SEQID.NO:4的里氏木霉纖維二糖水解酶I的接頭和/或CBD或其衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述纖維素酶融合蛋白在纖維素酶核心和/或在接頭和/或CBD中含有修飾。用在本文中，"修飾"的表述是指突變，例如一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或取代，或其他修飾，例如糖基化。這類修飾的例子包括使用脂肪族氨基酸，優(yōu)選為丙氨酸，和/或芳香族氨基酸，例如色氨酸，取代里氏木霉CBHI的CBD31位(對應(yīng)于成熟多肽的酪氨酸Y492)和/或32位(對應(yīng)于成熟多肽的酪氨酸Y493)上的保守酪氨酸殘基，如Under等1995所述。這類突變其他的例子包括Srisodsuk等1993所述的里氏木霉CBHI的接頭間突變，例如在成熟木霉CBHI序列中434-444位以及434-460位氨基酸的缺失。這類突變的其他例子還包括SEQID.NO:2的Melanocarpusalbomyces20K纖維素酶序列中207位上Ala的缺失、208位上Val的缺失、Phe209Trp的取代、以及在206位之后Pro的插入。本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的內(nèi)容中，"穩(wěn)定的纖維素酶融合蛋白"的表述是指至少20%，優(yōu)選為至少40。/。，更優(yōu)選為至少70%,最優(yōu)選為90-100%所產(chǎn)生的纖維素酶融合蛋白在發(fā)酵過程中含有在氨基酸序列之間未被切割的連接區(qū)域。這意味著20%-100%，優(yōu)選為40%-100%，更優(yōu)選為70%-100%所產(chǎn)生的纖維素酶都具有融合在一起的第一和第二氨基酸序列。"穩(wěn)定的纖維素酶融合蛋白"的表述還可以指所述纖維素酶融合蛋白制劑可本身是穩(wěn)定的，或可通過，例如熱處理或調(diào)節(jié)pH、或通過加入穩(wěn)定劑或降低蛋白活性的試劑、或通過從培養(yǎng)物中分離融合蛋白來得以穩(wěn)定。在本文中，熱處理是指在能夠允許制劑中的融合蛋白保持充分穩(wěn)定的溫度下進(jìn)行的處理。所述熱處理可以是，例如，在pH6.0在65'C處理60-70分鐘。在本文中，"完整的融合蛋白"的表達(dá)是指在本發(fā)明的融合蛋白中，第一和第二氨基酸序列之間的連接保持完整，盡管在所述序列中可能或不能出現(xiàn)末端降解。在本發(fā)明纖維素酶融合蛋白的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一氨基酸序列是具有SEQID.NO:2或其功能性變異體的Melanocarpusalbomyces20K序列。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一氨基酸序列是具有SEQID.NO:6或其功能性變異體的Melanocarpusalbomyces5OK序列。在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一氨基酸序列是具有SEQID.NO:8或其功能性變異體的Melanocarpusalbomyces50KB序列。在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一氨基酸序列是具有SEQID.NO:10或其功能性變異體的橘黃嗜熱子囊菌CBHI序列。在又一本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第二氨基酸序列是里氏木霉纖維二糖水解酶I或其功能性變異體的具有SEQID.NO:4的接頭和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列。因此在本發(fā)明纖維素酶融合蛋白高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述纖維素酶核心的第一氨基酸序列選自SEQID.NO:37，38，39，40，41,42和43，特別是SEQID.NO:39，而接頭和/或CBD序列的第二氨基酸序列則選自SEQID.NO:44，45，46，47，48，49和50。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述纖維素酶核心的第一氨基酸序列是SEQID.NO:39，而接頭和/或CBD序列的第二氨基酸序列則是SEQID.NO:47，49禾O50。本發(fā)明還涉及表達(dá)載體，所述載體包括第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列編碼纖維素酶核心任選修飾的第一氨基酸序列所述纖維素酶核心得自某一物種，還包括第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列編碼接頭和/或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的任選修飾的第二氨基酸序列，所述接頭和/或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)得自另一物種，還包括編碼連接所述第一和第二多核苷酸序列連接區(qū)域的多核苷酸，所述多核苷酸編碼如上所具體定義的相應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及纖維素酶制劑，其可只含有一種或多種本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白或加上根據(jù)擬解決的特定應(yīng)用的其他酶和添加劑。本發(fā)明還涉及出于以下特別公開的目的，使用本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白制劑的用途和方法。本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白制劑特別適用于紡織和去污劑工業(yè)。這些纖維素酶表現(xiàn)出高度改善的磨損效果以及可見和可度量的亮度的提高。它們表現(xiàn)出可接受的回染(backstaining)并與生物石磨所產(chǎn)生的聚焦對比一樣好。其可適用于紡織工業(yè)對織物或衣服進(jìn)行生物修整，例如，去球，去毛，澄色，降低粗燥程度，產(chǎn)生不同的修整(例如，'桃皮絨，，<破舊'，'沙洗，或'古舊'效果)，以及用于紗的生物修整，例如降低起毛以及改善平滑性。具有這樣良好的去球性質(zhì)對中性纖維素酶而言是不同尋常的，因?yàn)橛糜诠I(yè)生物修整應(yīng)用中的酶通常都是酸性水解酶。具有極佳去球性質(zhì)的中性纖維素酶像20K+CBD融合蛋白能夠在染色過程中同時(shí)進(jìn)行生物修整處理，獲得相當(dāng)程度的節(jié)約。同樣，顏色的牢固性也通常是在中性條件下好于酸性條件下。其他的用途包括在用于去污劑組合物，通過抗起球、抗發(fā)灰、澄色以及軟化來改善織物護(hù)理性質(zhì)，并改善織物的清潔效果，例如去污。用在本文中，織物或衣服的"生物石磨"這一表述是指使用酶來替代浮石，或添加到浮石中，對織物或衣服進(jìn)行處理，特別是對粗斜紋棉布。用在本文中，"生物修整"的表述是指在受控的纖維素纖維水解條件下使用酶，從而以防止永久性起球、改善織物手感例如柔軟性和光滑性、通過降低起毛清潔表面結(jié)構(gòu)的方式修飾織物或紗表面，這導(dǎo)致了顏色的凈化，改善了織物的懸垂性，改善了吸濕性，還可以改善可染色性。用在本文中，"回染"的表述是指釋放出的染料重新沉淀于織物纖維表面的趨勢。用在本文中，"去污劑"的表述是指清潔劑，其可含有表面活性劑(陰離子、非離子、陽離子和兩性表面活性劑)、增效助劑以及其他任選的成分，例如抗再沉淀和污漬懸浮劑、光學(xué)亮白劑、漂白劑、染料和色素以及水解酶。適合的去污劑成分清單見于美國專利第5,433,750號，適合的表面活性劑的清單見于美國專利第3,664,961號。是特異的氨基酸序列的"相等物"或"衍生物"的氨基酸序列是指所述氨基酸序列與特定的氨基酸序列不一致，而是含有至少部分氨基酸改變(缺失，取代，反向，插入等)，當(dāng)用作特定應(yīng)用時(shí)，所述改變與所述特定氨基酸序列的類似活性相比，基本不影響蛋白的生物學(xué)活性。.纖維素酶的生物學(xué)活性是指其催化活性，和/或其結(jié)合于纖維素材料的能力。表達(dá)載體是在轉(zhuǎn)化入所希望的宿主之后，能夠表達(dá)編碼本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白的DNA的克隆質(zhì)?；蜉d體。當(dāng)使用真菌宿主時(shí)，優(yōu)選向真菌宿主提供目的基因，作為整合入真菌染色體的克隆或表達(dá)載體的一部分，或使目的基因整合入宿主染色體，或作為自主復(fù)制型質(zhì)粒。在整合過程中，作為克隆載體或表達(dá)載體一部分的序列還可與所述DNA整合。除此之外，在真菌中，所述表達(dá)載體或其部分還可以靶定到預(yù)定的基因座中。編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA同樣優(yōu)選置于由所述載體(其與目的基因整合)提供的某些控制序列例如啟動(dòng)子序列的控制之下(即，可操作與其聯(lián)接)?；蛘?，所述控制序列可以是那些位于插入位點(diǎn)的序列。根據(jù)所述載體是否被設(shè)計(jì)為在原核或真核宿主中表達(dá)某種基因(例如，穿梭載體可在細(xì)菌宿主中提供用于選擇的基因)，表達(dá)載體的表達(dá)控制序列也不同。表達(dá)控制序列可以含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，例如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子元件，以及轉(zhuǎn)錄終止序列，和/或翻譯調(diào)節(jié)元件，例如翻譯起始和終止位點(diǎn)。多核苷酸分子，例如DNA，如果其含有包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息的表達(dá)控制序列，且這些序列是"可操作地聯(lián)接于"編碼多肽的核苷酸序列，則，其可被認(rèn)為"能夠表達(dá)"多肽?？刹僮鞯倪B接是這樣的連接，其中一種序列以這樣的方式連接于調(diào)節(jié)序列(或序列)，即將所述序列的表達(dá)置于調(diào)節(jié)序列的影響或控制之下。兩種DNA序列(例如聯(lián)接于蛋白編碼序列5'末端的啟動(dòng)子區(qū)域序列)，如果啟動(dòng)子的功能導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄，則可以稱為可操作地連接。本發(fā)明的載體還可以包括其他可操作連接的調(diào)節(jié)元件，例如增強(qiáng)子序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)建了遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，從而通過使用載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，，將編碼本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白的DNA整合入宿主染色體，所述載體含有啟動(dòng)所述載體整合到染色體中的序列。在其染色體中具有編碼本發(fā)明纖維素酶融合蛋白的穩(wěn)定整合的DNA的細(xì)胞，通過引入一種或多種同源或異源的標(biāo)記進(jìn)行篩選，其允許篩選在染色體中含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，例如，所述標(biāo)記可以提供殺生物劑抗性，例如對抗生素、或重金屬例如銅的抗性，或在宿主染色體中補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷型突變的標(biāo)記等等。所述可選擇的標(biāo)記基因或者可以直接連接于要表達(dá)的DNA基因序列，或可通過共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入相同的細(xì)胞。一旦制備了含有構(gòu)建體的本發(fā)明的載體或DNA序列用于表達(dá)，可通過任合各種適合的方式，包括本領(lǐng)域中公知的轉(zhuǎn)化，將所述DNA構(gòu)建體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。在導(dǎo)入所述載體之后，將受體細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行生長，其可以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)和生產(chǎn)宿主系統(tǒng)是，例如，針對真菌宿主木霉(EP244234)開發(fā)的生產(chǎn)系統(tǒng)，或曲霉(Aspergillus)生產(chǎn)系統(tǒng)，例如米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)(W09708325和W09533386，US5,843,745，US5,770,418)，或針對鐮刀霉屬，例如尖孢鐮刀霉(Fusariumoxysporum)開發(fā)的生產(chǎn)系統(tǒng)(Malardier等，1989)。針對細(xì)菌開發(fā)的適合的生產(chǎn)系統(tǒng)是針對芽孢桿菌屬(Bacillus)開發(fā)的生產(chǎn)系統(tǒng)，例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或針對大腸桿菌(E.coH)，或針對放線菌類鏈霉菌(Streptomyces)開發(fā)的生產(chǎn)系統(tǒng)。針對酵母開發(fā)的適合的生產(chǎn)系統(tǒng)是針對酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母菌屬(Shizosaccharomyces)或畢赤酵母(Pichiapastoris)開發(fā)的系統(tǒng)。在某些其他微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物中的生產(chǎn)系統(tǒng)也是有可能的。所述克隆基因序列的表達(dá)導(dǎo)致了所希望蛋白的產(chǎn)生，或這一蛋白片段的產(chǎn)生。這種表達(dá)可以連續(xù)的形式，或以受控制的形式，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中發(fā)生。片段可以理解為長度足以編碼所描述的蛋白或其生物學(xué)活性片段的核酸分子的部分。術(shù)語"衍生物"在本說明書中是指這些分子的核苷酸序列與上述核酸分子的序列在一個(gè)或多個(gè)位置上不同，并與所述序列高度同源。同源性可理解為是指至少40%的序列一致性，特別為至少60%的一致性，優(yōu)選為超過80%且更優(yōu)選為超過90%。上述核酸分子的偏差可以是缺失、取代、插入、加入或其組合的結(jié)果。同源性還可指分別的核苷酸序列或編碼的蛋白是功能和/或結(jié)構(gòu)等同的。用在本文，"酶制劑"和"纖維素酶制劑"的表述是指任意的酶制品，其含有至少一種纖維素酶融合蛋白。因此，這樣的酶制劑可以是含有一種或多種纖維素酶融合蛋白或含有一種或多種纖維素酶融合蛋白以及其他酶的耗盡的培養(yǎng)基或?yàn)V液，分離的纖維素酶融合蛋白或者一種或多種纖維素酶融合蛋白的混合物或者一種或多種纖維素酶融合蛋白與一種或多種其他酶的混合物。除了纖維素酶融合蛋白活性外，這樣的制劑還可含有添加劑，例如穩(wěn)定劑，緩沖劑，防腐劑，表面活性劑和/或培養(yǎng)基成分。優(yōu)選的添加劑是那些通常用于供應(yīng)用的酶制劑中的添加劑，在所述應(yīng)用中使用酶制劑。所述酶制劑可以是液體、粉末或顆粒形式。這里"耗盡的培養(yǎng)基"是指含有產(chǎn)生的酶的宿主培養(yǎng)基。優(yōu)選，所述宿主細(xì)胞是生產(chǎn)完成之后與所述培養(yǎng)基分離。所述酶制劑可包括本發(fā)明的一種或多種纖維素酶融合蛋白或者其他纖維素酶加上本發(fā)明的一種或多種纖維素酶融合蛋白。例如，可將具有不同性質(zhì)的纖維素酶融合蛋白組合，從而制備出更加適用于不同條件下的酶制劑。為了獲得本發(fā)明的酶制劑，可在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)具有所希望性質(zhì)的宿主(即，能夠經(jīng)濟(jì)表達(dá)可行量的本發(fā)明纖維素酶融合蛋白的宿主)，所希望的酶可從宿主分泌到培養(yǎng)基中，并通過本領(lǐng)域公知的方法從所述培養(yǎng)基中回收所述酶制劑。所述酶制劑還可包括除了纖維素酶融合蛋白之外的一種或多種其它酶，其可以是例如淀粉酶、蟲漆酶和/或過氧化酶?；蛘?，可以在使用本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白進(jìn)行處理之前、之中或之后，進(jìn)行另一種酶處理。所述酶處理可包括，例如，一種或多種淀粉酶處理，一種或多種纖維素酶處理和/或一種或多種過氧化酶處理和/或蟲漆酶處理。哪些其他酶可包括于酶制劑中或可用于酶處理中，要根據(jù)應(yīng)用來決定。所述酶制劑可以是含有或沒有天然或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基，或者是通過使用本領(lǐng)域公知方法從其中回收得來的。然而，因?yàn)楸景l(fā)明的纖維素酶融合蛋白是分泌到培養(yǎng)基中的，并且可在纖維素水解液的環(huán)境條件下表現(xiàn)出活性，本發(fā)明的優(yōu)勢是本發(fā)明的酶制劑可以從培養(yǎng)基中直接利用，無需進(jìn)一步提純。如果需要的話，這類制劑可以被冷凍干燥或者為了保存而濃縮和/或穩(wěn)定酶的活性。本發(fā)明酶制劑的提供和使用非常經(jīng)濟(jì)，因?yàn)?l)所述酶可以粗制品形式使用；并不必須從培養(yǎng)基中分離特定的酶，禾卩(2)因?yàn)樗雒阜置诘脚囵B(yǎng)基中，只需要回收培養(yǎng)基就可獲得所需要的酶制劑；不需要從宿主中提取酶。優(yōu)選，適于這類生產(chǎn)的宿主是木霉，尤其是里氏木霉。本發(fā)明的酶制劑可作為液體或固體提供，例如以干粉或顆粒或液體形式，特別是非粉化顆粒，或穩(wěn)定的液體，或者所述酶制劑也可以另行濃縮或穩(wěn)定以便保存或使用?？梢灶A(yù)見，含有一種或多種本發(fā)明中性纖維素酶的酶制劑還可以進(jìn)一步富集或在部分或完全缺乏特定酶活性中進(jìn)行制備，從而在多種應(yīng)用中，例如在紡織工業(yè)中，滿足特定使用的要求。由宿主特別是真菌分泌的酶活性的混合物，可在特定的工業(yè)應(yīng)用中，例如生物石磨中被有益地選用?？蓪Ρ景l(fā)明所述酶制劑進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而滿足在紡織、去污劑或紙衆(zhòng)或造紙行業(yè)中，各種應(yīng)用下特殊需要的要求。可使用不完全是從相同宿主產(chǎn)生的其他大分子(例如，其他酶例如內(nèi)切葡聚糖酶，蛋白酶，脂酶，過氧化物酶，氧化酶或淀粉酶)或能夠增強(qiáng)所希望的酶制劑的性能、穩(wěn)定性或緩沖能力的化學(xué)物質(zhì)來制備摻合物。還可以對非粉化顆粒進(jìn)行包衣。根據(jù)已有的方法，可通過加入二元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸、或氯化鈉來穩(wěn)定液體酶制劑?？筛鶕?jù)EP238,216所述，制備本發(fā)明的酶的保護(hù)形式。本發(fā)明的酶制劑可含有表面活性劑，其可以是陰離子的、非離子的、陽離子的、兩性離子的或這些類型的混合物，特別是當(dāng)被用作去污劑組合物時(shí)?？捎玫娜ノ蹌┙M合物記載于，例如，WO94/07998，美國專利第5,443，750和美國專利第3，664，961。如果需要的話，還可以根據(jù)現(xiàn)有條件，例如提取，沉淀，層析，親和層析，電泳等，對所希望的酶進(jìn)行進(jìn)一步地純化。本發(fā)明的酶制劑特別適用于紡織工業(yè)，優(yōu)選可用于生物石磨和生物修整或去污劑行業(yè)。其他可適用的領(lǐng)域是紙漿和造紙行業(yè)。石洗具有三個(gè)步驟脫漿，磨損和后處理。第一步，脫漿過程通常是對牛仔褲進(jìn)行首次濕處理，這意味著去除了通常應(yīng)用于經(jīng)紗的淀粉或其他上漿劑，以防止在紡織過程中的損傷?？墒褂胊-淀粉酶來去除基于淀粉的漿料，用于改善的和均勻的濕處理。脫槳之后，一般用水漂洗牛仔褲或直接繼續(xù)磨損步驟。第二步，磨損，可使用酶或浮石或這二者來進(jìn)行。在所有情況中都需要機(jī)械作用來去除染料，而所述處理通常是在洗衣機(jī)，像鼓式洗衣機(jī)中進(jìn)行的。本文中，術(shù)語"磨損的"是指當(dāng)使用纖維素酶或石頭或者二者進(jìn)行處理之后，粗斜紋棉布織物的外觀。染料去除不均勻的結(jié)果是，在染色區(qū)域和染料被去除的區(qū)域之間出現(xiàn)了對比。"石洗外觀"或"磨損外觀"是同意表達(dá)。在酶法石洗、或生物修整過程中，使用浮石進(jìn)行磨損可以完全或部分省略，而加入纖維素酶來促進(jìn)靛藍(lán)染料從纖維表面上的磨損。可使用中性或酸性纖維素酶或這二者來完成纖維素酶處理。如果織物不是經(jīng)過纖維素酶處理或石洗的，則織物的外觀被稱為是"暗淡的"，因?yàn)闀r(shí)尚的對比度消失了。當(dāng)需要更明顯的退色效果時(shí)，可使用化學(xué)試劑和/或酶學(xué)方法例如蟲漆酶處理來進(jìn)行漂白。磨損之后通常是第三步，后處理，其包括洗滌和漂洗步驟，在該步驟中可以使用去污劑、光亮劑或軟化劑。酶處理之后，必須停止反應(yīng)，以防止被處理材料的損傷，例如，通過溫度和/或pH滅活的方法，后者包括徹底的漂洗和/或洗掉去污劑。這確保了纖維的機(jī)械強(qiáng)度不會(huì)受到持續(xù)存在的酶的危害。就本發(fā)明而言，"粗斜紋棉布"是指粗斜紋棉布織物，通常是粗斜紋棉布衣服，尤其是牛仔褲。有利的是所述粗斜紋棉布是靛藍(lán)染色的粗斜紋棉布?？梢允褂玫逅{(lán)、靛藍(lán)的衍生物處理粗斜紋棉布，或使用靛藍(lán)加上一些其他染料來染色粗斜紋棉布，例如有硫磺底的靛藍(lán)染色的粗斜紋棉布。用纖維素酶處理可以完全取代用浮石處理(例如，lkg商業(yè)化酶相當(dāng)于100kg石頭)。然而，當(dāng)需要產(chǎn)生嚴(yán)重磨損的修整時(shí)，可將纖維素酶處理與浮石處理組合使用。產(chǎn)生纖細(xì)突出的毛發(fā)樣覆蓋物的桃皮絨效果也可以通過組合浮石和中性纖維素酶的洗滌來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的纖維素酶可特別適用于提供磨損的外觀并在生物石磨過程中最小化回染。生物石磨優(yōu)選在約pH4.5-9.5，且最優(yōu)選在pH6.0-8.0之間進(jìn)行。反應(yīng)的溫度可介于約40-80°C，優(yōu)選為50-70°C，且更優(yōu)選為55-65°C,最優(yōu)選為6(TC。浴比(單位重量織物的液體體積的比值)可為約2:1-30:1，優(yōu)選為4:1-15:1且最優(yōu)選為5:1-10:1。酶劑量可為約5-8000NCU/g織物，優(yōu)選為20-3000NCU/g織物且最優(yōu)選為30-1500NCU/g織物。處理時(shí)間可為15分鐘-4小時(shí)，更優(yōu)選為20分鐘-90分鐘且最優(yōu)選為30分鐘-60分鐘。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，酶劑量在很大程度上依賴于織物的類型，機(jī)器，處理?xiàng)l件(pH，溫度，浴比，處理時(shí)間，粗斜紋棉布裝載量，處理規(guī)模)以及酶制劑的類型等等。如果需要的話，可將浮石與融合纖維素酶蛋白組合使用。所需要的酶劑量隨后將顯著降低。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定適當(dāng)?shù)膭┝亢蜅l件。本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白可適用于紡織工業(yè)對織物或衣服的生物修整，例如，去球，去毛，澄色，降低粗燥度，產(chǎn)生不同的修整(例如，'桃皮絨，，'破舊'，'沙洗'或'古舊'效果)以及紗的生物修整(例如降低起毛，改善平滑度)。本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白可在酸性和中性條件下，使用與生物石洗基本相同的條件，用于生物修整。本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白可用于去污劑組合物，從而通過抗起球、抗發(fā)灰、澄色以及軟化，來改善織物的護(hù)理性質(zhì)，并改善紡織品的清潔效果，例如去污。用本發(fā)明酶制劑處理的紡織材料可用含有纖維的天然纖維素或含有纖維的人造纖維素或其混合物制造。天然纖維素的例子是棉花，亞麻，大麻，黃麻和苧麻。人造纖維素的例子是粘膠，醋酸纖維素，三乙酸纖維素，人造絲，銅銨纖維(cupro)和溶解性纖維(lyocell)。上述的纖維素還可作為合成纖維例如聚酯、聚酰胺或丙烯酸纖維的混合物使用。所述紡織材料可以是紗或通過何其他方法針織或機(jī)織或形成的。本發(fā)明的纖維素酶，除了可特別適用于織物的處理之外，還通常適用于需要纖維素酶活性的任何領(lǐng)域。在紙漿和造紙工業(yè)中，中性纖維素酶可用于，例如，對具有中性或堿性pH值的不同類型再生紙和紙板進(jìn)行脫墨，改善纖維質(zhì)量或在造紙過程中增加排水。其他的例子包括紡織品印染之后去除印膏增稠劑和過多的染料，以及對動(dòng)物詞料進(jìn)行處理。例如，如果預(yù)期的應(yīng)用是改善機(jī)械紙漿的強(qiáng)度，則本發(fā)明的酶制劑可以提供一種或多種這些蛋白從而增強(qiáng)或促進(jìn)纖維素纖維結(jié)合到一起的能力。以類似的方式，在紙漿精制的應(yīng)用中，本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白制劑可在增強(qiáng)或促進(jìn)此類溶脹的水平上提供一種或多種這些蛋白。在本發(fā)明的融合蛋白中，特別適合于紙漿應(yīng)用的是那些具有Melanocarpusalbomyces50KB或橘黃嗜熱子囊菌CBHI核心的融合蛋白。當(dāng)被用于紡織工業(yè)且特別是生物石磨時(shí)，本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白提供了意料之外的益處。本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白比現(xiàn)有技術(shù)中的纖維素酶明顯更有效力。在生物石磨中，根據(jù)施用于織物重量的中性纖維素酶活性單位的劑量，使用的是至少低兩倍，通常低至少三倍甚至是六倍的劑量，而不會(huì)損害織物的強(qiáng)度。換言之，通過使用本發(fā)明的纖維素酶融合蛋白，可實(shí)現(xiàn)多達(dá)高出6倍的性能。因?yàn)楸景l(fā)明的纖維素酶融合蛋白的產(chǎn)量對應(yīng)于公知20K纖維素酶的產(chǎn)量，所以總的生產(chǎn)效率得以顯著改進(jìn)。這可以與所需酶量的大幅節(jié)約直接成比例使用降低的酶量的可能性為制造和使用、包括運(yùn)輸都提供了相當(dāng)程度的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明將在下述實(shí)施例中更加詳細(xì)地描述，所述實(shí)施例不應(yīng)被理解為對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制，而是僅用于闡明本發(fā)明的用途。實(shí)施例1構(gòu)建20K+CBD融合蛋白的表達(dá)載體在分離、純化和酶處理DNA(質(zhì)粒，DNA片段)中，在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中，在大腸桿菌轉(zhuǎn)化中等等，用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法。所用的基本方法記載于標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)手冊，例如，Sambrook等(1989)以及Sambrool和Russel1(2001)。質(zhì)粒構(gòu)建體被設(shè)計(jì)為將Melanocarpusalbomyces20K(Cel45A，AC#AJ515703;SEQID.NO:l)的編碼序列與里氏木霉CBHI的接頭和CBD(AC#AR088330;Srisodsuk等1993;SEQID.NO:3)的編碼序列相連。總共設(shè)計(jì)了6種不同的連接，如表1所示。對表1中所述的構(gòu)建體#1和#2而言，向20K編碼序列的末端引入了唯一的Nrul位點(diǎn)。這一位點(diǎn)使得可在成熟20K的絲氨酸#213密碼子之后與具有鈍末端的任何DNA片段直接融合。使用引物20K—Nco(SEQIDNO:11)和20K—NruXho(SEQIDNO:14)，以質(zhì)粒pALK1480(圖1)為模板，使用程序A(表3)進(jìn)行PCR反應(yīng)。pALK1480含有Melanocarpusalbomycescel45A(編碼Cel45A或20K)基因組拷貝，所述基因組拷貝插入于里氏木霉cbhl啟動(dòng)子之后作為精確融合并含有位于pUC19載體(NewEnglangBiolabs,Inc.,USA)基因下游的cbhl終止子。所述PCR反應(yīng)混合物中含有l(wèi)xDyNAzymeEXT反應(yīng)緩沖液(Finnzymes，芬蘭)，8mMMg2+(通過加入MgCl2調(diào)節(jié)終濃度)，0.2mMdNTPs，0.5每種引物，1.0單位DyNAzymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes，芬蘭)，以及約50ng/100/zl的模板。使用Ncol和Xhol限制酶消化所述PCR產(chǎn)物，并在電泳之后從瓊脂糖凝膠中分離所述片段。將類似的剪切和分離的6.1kbpALK1480片段與PCR片段連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-Blue(Stratagene，USA)中。從轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒DNA，并通過測序驗(yàn)證了一個(gè)適合的候選物。所得質(zhì)粒被命名為pALK1429。PCR反應(yīng)按上述分別進(jìn)行，采用的引物對為1—BamMly(SEQIDNO:16)+XhoAge(SEQIDNO:15)和2一BamMly(SEQIDNO:17)十XhoAge(SEQIDNO:15)，以pALK492作為模板(圖2)，所得的PCR產(chǎn)物含有所述接頭和CBD，使用Mlyl(正好在接頭和CBD編碼序列所希望的第一個(gè)密碼子前面產(chǎn)生鈍末端)和Agel的進(jìn)行消化。pALK492攜帶有約6.9kb的里氏木霉QM6a染色體DNA的Pstl片段，所述里氏木霉QM6a染色體含有被亞克隆至pUC19的Pstl位點(diǎn)中的cbhl/cel7A基因。使用NruI和Agel對以上獲得的pALK492進(jìn)行消化，并將載體部分分別用以上所得的兩種消化的PCR產(chǎn)物分離和連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中。提取質(zhì)粒DNA，通過測序進(jìn)行驗(yàn)證并將所得的質(zhì)粒命名為pALK1430(攜帶有作為插入物的l一BamMly+XhoAge的PCR產(chǎn)物)和pALK1430(攜帶有作為插入物的2_BamMy+XhoAge的PCR產(chǎn)物)。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表2所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>:a;<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>pBluescriptlIKS+(Stratagene，USA)類似切割的載體部分進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLlBlue中。提取質(zhì)粒DNA，通過適當(dāng)?shù)南拗泼赶M(jìn)行檢查并通過測序進(jìn)行驗(yàn)證。選擇一種具有所希望序列的質(zhì)粒候選物并將其命名為pALK1767。對表1中的構(gòu)建體#3而言，使用引物對20K—Nco一2(SEQIDNO:12)和20K-NruXho_GPI(SEQIDNO:19)，以pALK1480DNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用了兩種反應(yīng)混合物一種具有上述構(gòu)建pALK1767的組合物，另一種具有加入達(dá)3。/。(v/v)的DMSO。這兩種反應(yīng)混合物是分開的，并使用表3中的程序C和D運(yùn)行。所有的反應(yīng)都產(chǎn)生了具有所希望大小的DNA片段，將所述制劑用Ncol和Xhol組合和消化。將所述DNA片段分離并與6.1kbpALK1480類似切割和分離的片段進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLlBlue中。提取質(zhì)粒DNA，通過適當(dāng)?shù)南拗泼赶M(jìn)行檢查并通過測序進(jìn)行驗(yàn)證。選擇一種具有所希望序列的質(zhì)粒候選物并將其命名為pALK1758。對表1中的構(gòu)建體糾而言，使用引物對20K_Nco_3(SEQIDNO:13)禾卩20K陽NruXho—WGEI(SEQIDNO:20)，以pALK1480DNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。所述PCR反應(yīng)混合物含有l(wèi)xPhusionTMGC反應(yīng)緩沖液(Finnzymes，芬蘭)，0.2mMdNTPs，0.5每種引物，3%(v/v)DMSO和1.0單位PhusionDNA聚合酶(Finnzymes，芬蘭)，以及約70ng/100/xl模板。反應(yīng)混合物是分開的，并使用表3中的程序C和D運(yùn)行。兩種反應(yīng)都產(chǎn)生了所希望大小的DNA片段，將所述制劑用NcoI和Xhol組合和消化。將所述DNA片段用pALK1480類似切割和分離的6.1kb片段分離和連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1Blue中。提取質(zhì)粒DNA，通過適當(dāng)?shù)南拗泼赶M(jìn)行檢査并通過測序進(jìn)行驗(yàn)證。選擇一種具有所希望序列的質(zhì)粒候選物并將其命名為pALK1759。對表l中的構(gòu)建體#5而言，使用引物對20K一Nco一2(SEQID.NO:12)和20K-NmXho—PavQIPS(SEQID.NO:21)，以pALK1480DNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用了兩種反應(yīng)混合物一種具有用于構(gòu)建pALK1759的上述組合物，另一種沒有DMSO。這兩種反應(yīng)混合物是分開的，并使用表3中的程序C和D運(yùn)行。所有的反應(yīng)都產(chǎn)生了希望大小的DNA片段，將所述制劑用Ncol和Xhol組合和消化。將所述DNA片段用pALK1480的類似切割和分離的6.1kb片段進(jìn)行分離和連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLlBlue中。提取質(zhì)粒DNA，通過適當(dāng)?shù)南拗泼赶M(jìn)行檢查并通過測序進(jìn)行驗(yàn)證。選擇一種質(zhì)粒候選物并將其命名為pALK1760;其在唯一的Xhol位點(diǎn)上獲得了突變，但對進(jìn)一步的亞克隆并不會(huì)造成問題。對表1中的構(gòu)建體#6而言，使用引物對20K—Nco—3(SEQID.NO:13)禾Q20K-NruXho—WGEI-2(SEQID.NO:22)，以pALK1480DNA(70ng/100/xl)作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用了與構(gòu)建質(zhì)粒pALK1767相同的反應(yīng)混合物組合物，并使用表3中的程序C運(yùn)行。制備產(chǎn)物用Ncol和Xhol消化。所述DNA片段用pALK1480的類似切割和分離的6.1kb片段分離和連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLlBlue中。提取質(zhì)粒DNA，通過適當(dāng)?shù)南拗泼赶M(jìn)行檢査并通過測序進(jìn)行驗(yàn)證。選擇一種具有所希望序列的質(zhì)粒候選物并將其命名為pALK1773。使用Nml和Agel對質(zhì)粒pALK1758、pALK1759、pALK1760和pALK1773分別進(jìn)行切割，并分離載體部分。將每種制備產(chǎn)物與從經(jīng)過Mlyl和Agel消化后的pALK1767中分離到的235bp片段相連，并將每種連接混合物分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL10-Gold中。提取質(zhì)粒DNA，通過適當(dāng)?shù)南拗泼赶M(jìn)行檢查并通過測序進(jìn)行驗(yàn)證。將經(jīng)過驗(yàn)證的質(zhì)粒分別命名為pALK1764，pALK1765，pALK1766和pALK1774(表1)。將amdS標(biāo)記和里氏木霉cbhl3'側(cè)翼區(qū)域如下插入載體pALK1764，pALK1765,pALK1766和pALK1774中用EcoRI和Spel切割pALK424，通過Klenow補(bǔ)平反應(yīng)將所得的4.8kb片段做成鈍末端，并分別與用Stul切割的質(zhì)粒pALK1764、pALK1765、pALK1766和pALK1774分開連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL10-Gold中。提取質(zhì)粒DNA，通過適當(dāng)?shù)南拗泼赶瘷z查所希望的插入方向。將驗(yàn)證的質(zhì)粒分別命名為pALK1768，pALK1769，pALK1770和pALK1775(表l)(圖10)。實(shí)施例2在里氏木霉中生產(chǎn)融合的20K+CBD蛋白從經(jīng)過EcoRI消化之后的載體骨架中分離到了來自于質(zhì)粒pALK1434和pALK1435的8.7kb線性表達(dá)盒，并轉(zhuǎn)化到里氏木霉A47原生質(zhì)體中。根據(jù)Penttila等(1987)的描述以及Karhunen等(1993)所述的修改，選擇乙酰胺作為唯一氮源進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過其在PD(土豆右旋糖瓊脂(PotatoDextroseAgar))上形成孢子之前的單個(gè)分生孢子，在篩選平板上對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行純化。對來自搖瓶培養(yǎng)(50ml)的培養(yǎng)物上清液中的轉(zhuǎn)化體的20K+CBD產(chǎn)物進(jìn)行分析。所述轉(zhuǎn)化體在用pH5.5的5%KH2P04緩沖的復(fù)合纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Joutsjoki等1993)中生長7天。融合蛋白的酶活性測定為，在50。C于pH7.0的50mMHepes緩沖液中，IO分鐘內(nèi)還原糖從羧甲基纖維素(3%CMC)中的釋放(NCU活性，nkat;Bailey和Nevalainen，1981;Haakana等，2004)。最佳的生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體的NCU活性示于表4。通過用Southern雜交驗(yàn)證了所選擇轉(zhuǎn)化體的基因型，所述Southern雜交中包括了若干基因組的消化產(chǎn)物并將各自的表達(dá)盒用作探針?？墒褂脧募兓疢elanocarpusalbomyces20K中性纖維素酶(Haakana等2004)產(chǎn)生的多克隆抗體和ProtoBlotWesternblotAP系統(tǒng)(Promega)，從培養(yǎng)物上清液中測定20K+CBD蛋白。Western雜交分析表明融合的20K+CBD酶在里氏木霉中是主要作為穩(wěn)定的融合蛋白產(chǎn)生的。表4從搖瓶培養(yǎng)中選擇的20K+CBD轉(zhuǎn)化體的NCU活性<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>在表4中，構(gòu)建編號可參見表l;RF編號是指所述轉(zhuǎn)化體作為RF菌株的命名?？赏ㄟ^Western雜交，將所述表達(dá)盒對于cbhl(cel7A)基因座可能的靶定作為CBHI-陰性基因型進(jìn)行篩選。可使用單克隆抗體CI-258或CI-261(Aho等，1991)以及ProtoBlotWesternblotAP系統(tǒng)(Promega，USA)對CBHI蛋白進(jìn)行檢測。通過使用Southern雜交驗(yàn)證了所選擇轉(zhuǎn)化體的基因型，所述Southern雜交中包括了若干基因組的消化產(chǎn)物，并將各自的表達(dá)盒用作探針。從經(jīng)過EcoRI消化之后的載體骨架中，分離到了從實(shí)施例1中制備的質(zhì)粒pALK1768、pALK176、pALK1770和pALK1775的8.7kb線性表達(dá)盒，并轉(zhuǎn)化到以乙酰胺作為唯一氮源篩選的里氏木霉RF5796和RF5798原生質(zhì)體中(兩種菌株都來自菌株QM6a(Bailey和Nevalainen，1981)，并具有對內(nèi)源型里氏木霉纖維素酶的表型CBHI-CBHII-EGI-EGII-)。通過其在PD上形成孢子之前的分生孢子，在篩選平板上對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行純化。從搖瓶培養(yǎng)(50ml)的培養(yǎng)物上清液中，分析轉(zhuǎn)化體的20K+CBD產(chǎn)物。所述轉(zhuǎn)化子在用pH5.5的5%KH2P04緩沖的復(fù)合纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Joutsjoki等1993)中生長7天。然后，產(chǎn)生的20K+CBD融合蛋白的NCU活性按上述分析。選擇的轉(zhuǎn)化體的NCU活性示于表5。通過使用Southern雜交驗(yàn)證了所選擇轉(zhuǎn)化子的基因型，所述Southern雜交中包括了若干基因組的消化產(chǎn)物，并將各自的表達(dá)盒用作探針。可使用從純化的Melanocarpusalbomyces20K中性纖維素酶(Haakana等2004)產(chǎn)生的多克隆抗體和ProtoBlotWesternblotAP系統(tǒng)(Promega)，從培養(yǎng)物上清液中檢測20K+CBD蛋白。Western雜交分析表明融合的20K+CBD酶是由轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的。一些培養(yǎng)物還表現(xiàn)出與抗20K抗血清反應(yīng)的條帶，并具有野生型20K蛋白的遷移率，說明有可能在培養(yǎng)過程中發(fā)生了所述接頭+CBD的一些剪切。pALK1770轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的20K+CBD融合蛋白由于其穩(wěn)定性，被選擇進(jìn)行深入研究。表5從搖瓶培養(yǎng)選擇的20K+CBD轉(zhuǎn)化體的NCU活性<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>在表5中，構(gòu)建編號可參見表l;RF編號是指所述轉(zhuǎn)化子作為RF菌株的命名。將里氏木霉菌株RF5582、RF5583、RF6036、RF5977和RF5978生長于生物反應(yīng)器中供檢測使用。對一些制備產(chǎn)物進(jìn)行熱處理(pH6.0，65°C，60-70分鐘)，從而滅活任何殘余的里氏木霉內(nèi)源性酶活性。所述20K+CBD是相對熱穩(wěn)定的(Miettinen-Oinonen等2004)，并且在處理過程中不會(huì)變性。實(shí)施例3在里氏木霉中生產(chǎn)融合的20K+CBD親合突變蛋白將Melanocarpusalbomyces20K(cel45A，AC#AJ515703)酶融合于里氏木霉CBHI的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，其中在31(相應(yīng)于成熟多肽的Y492)和/或32位(相應(yīng)于成熟多肽的Y493)上保守的酪氨酸殘基被突變?yōu)楸彼幔鏛inder等，1995所述。除此之外，31位上的酪氨酸殘基還可被色氨酸所替代，所述色氨酸是在例如灰色腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)CBHI(Azevedo等，1990)和里氏木霉EGV(Cel45A，Saloheimo等，1994)的CBD區(qū)域中天然發(fā)現(xiàn)的氨基酸。突變的CBD是通過PCR構(gòu)建的，并且在里氏木霉CBHI的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域中也包括了Y31A、Y32A、Y31W以及Y31A_Y32A的氨基酸取代(根據(jù)CBD的氨基酸序列進(jìn)行的編號)。在全部構(gòu)建體中，都使用了正向引物3—BamMly:5'-TAGGATCCGAGTCCCATTA-CCGGCAACCCTAGCG-3'(SEQID.NO:18)。用于擴(kuò)增不同CBDmutf物的反向引物如表6所示。所述PCR反應(yīng)混合物含有1xPfuUltraHF反應(yīng)緩沖液(Stratagene，USA)，其提供了2mMMg"濃度，0.2mMdNTP，2AtM每種引物和1.5單位PfuUltraHFDNA聚合酶(Stratagene，USA)，以及約45ngpALK492質(zhì)粒作為模板。pALK492(圖2)質(zhì)粒含有里氏木霉cbhl基因。PCR反應(yīng)條件如下95'C起始變性2分鐘，然后是30個(gè)循環(huán)的95°C1分鐘、65°C(±5°C梯度)退火1分鐘、72°C延伸2分鐘、以及72。C的最終延伸IO分鐘。表6為擴(kuò)增突變CBD產(chǎn)物設(shè)計(jì)的反向PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>在退火溫度為60°C的PCR反應(yīng)中，所有引物組合都產(chǎn)生了特定的DNA片段。PCR產(chǎn)物從這些反應(yīng)中分離，用Xhol和BamHI限制酶消化，并隨后克隆至pBluescriptlIKS+(Stratagene，USA)中。所得的質(zhì)粒被命名為pALK1884(Y31A突變)，pALK1885(Y32A突變)，pALK1886(Y31W突變)以及pALK1887(Y31A一Y32A突變)。通過測序驗(yàn)證了質(zhì)粒中的PCR片段。質(zhì)粒pALK1884至pALK1887的Mlyl和Agel消化插入物被進(jìn)一步連接于Nru和Agel消化的pALK1760載體片段，該片段含有融合于里氏木霉cbhl(cd7A)啟動(dòng)子和終止子的全長Melanocarpusalbomyces20K基因。對pALK1760中20K基因的C-末端部分進(jìn)行修飾，使得CBD片段的連接產(chǎn)生了PAVQIPSS的連接點(diǎn)(構(gòu)建體#5)，其在里氏木霉中表現(xiàn)出產(chǎn)生了穩(wěn)定的融合產(chǎn)物，如實(shí)施例1和2所述。在最后步驟中，將amdS標(biāo)記作為p3SR2質(zhì)粒(圖6)的鈍末端SpeI-EcoRI片段(4.5kb)加入，以獲得了在里氏木霉中產(chǎn)生融合的20K+CBD咖t酶的表達(dá)質(zhì)粒pALK1877(Y31A突變)，pALK1878(Y32A突變)，pALK1879(Y31W突變)，和pALK1880(Y31A—Y32A突變)。融合于后面跟著突變CBD區(qū)域的接頭肽的20K蛋白的氨基酸序列如圖IIB所示。通過測序驗(yàn)證表達(dá)載體，在Notl消化后的載體骨架中分離8.4kb的線性表達(dá)盒(圖IIA)，并轉(zhuǎn)化到里氏木霉RF5796原生質(zhì)體中。根據(jù)Penttila等(1987)以及Karhunen等(1993)所述的修改，選擇乙酰胺作為唯一氮源，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過其在PD上形成孢子之前的單個(gè)分生孢子，在篩選平板上對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行純化。從搖瓶培養(yǎng)(50ml)的培養(yǎng)物上清液中分析轉(zhuǎn)化體的20K+CBDmut產(chǎn)生。所述轉(zhuǎn)化體在用pH5.5的5%KH2P04緩沖的復(fù)合纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Joutsjoki等1993)中生長7天。融合蛋白的酶活性測定為，在5(TC、pH7.0的50mMHepes緩沖液中，10分鐘內(nèi)從羧甲基纖維素(3%CMC)釋放的還原糖(NCU活性，nkat;Bailey禾BNevalainen，1981;Haakana等，2004)。最佳的生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體的NCU活性示于表7。通過使用Southern雜交驗(yàn)證所選擇轉(zhuǎn)化體的基因型，所述Southern雜交其中包括了若干基因組的消化產(chǎn)物，并將各自的表達(dá)盒用作探針?？墒褂脧募兓腗elanocarpusalbomyces20K中性纖維素酶(Haakana等2004)產(chǎn)生的多克隆抗體和ProtoBlotWesternblotAP系統(tǒng)(Promega)，從培養(yǎng)物上清液中測定20K+CBDmut蛋白。Western雜交分析表明融合的20K+CBD^t酶在里氏木霉中是作為穩(wěn)定的融合蛋白產(chǎn)生的。表7從搖瓶培養(yǎng)選擇的20K+CBD自轉(zhuǎn)化體的NCU活性<table>complextableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>RF編號是指所述轉(zhuǎn)化子作為RF菌株的命名為。對菌株RF6084-RF6086,RF6088,RF6090-RF6092和RF6094進(jìn)行發(fā)酵，以獲得供檢測使用的材料(參見實(shí)施例9-11)。實(shí)施例4在里氏木霉中制備融合的20K+CBD接頭缺失蛋白將Melanocarpusalbomyces20K酶融合于里氏木霉CBHI的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域^CBD)，通過向結(jié)構(gòu)域間接頭多肽中引入缺失對其進(jìn)一步修飾。根據(jù)Srisodsuk等，1993的描述設(shè)計(jì)接頭缺失。在成熟多肽中434-444位氨基酸的缺失(突變體AG-444)去除了包括有富含甘氨酸和脯氨酸重復(fù)序列的約三分之一接頭，但卻保留了全部完整的推定的O-糖基化位點(diǎn)。434-460位氨基酸殘基的缺失(突變體AG-460)事實(shí)上去除了所有的接頭(圖12A)。還構(gòu)建了在CBD區(qū)域中具有Y31A—Y32A親合雙突變的其他20K+CBD接頭缺失。進(jìn)行PCR反應(yīng)以向接頭肽中引入缺失并向CBD區(qū)域中引入氨基酸取代。按實(shí)施例3的描述進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除了使用6(TC(i5'C)的退火溫度。分別使用正向引物ACCACCCGCCGCCCAGCC-3'(SEQID.NO:31)和5-TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCCC-TACCCAGTCTCACTACGGCCAGTGC-3'(SEQID.NO:32)來合成AG-444和AG-460的接頭缺失。相對應(yīng)地，使用反向引物5'-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCT-TTACAGG-3(SEQID.NO:33)來擴(kuò)增里氏木霉CBHI的完整CBD區(qū)域。采用反向引物TACAGGCACTGAGAGGCGGCAGGGTTCAGG-3'(SEQID.NO:30)來產(chǎn)生CBD區(qū)域中的Y31AY32A突變。在55.2'C-65.(TC退火溫度范圍的PCR反應(yīng)中，全部引物組合都產(chǎn)生了特定的DNA片段。根據(jù)實(shí)施例3的描述構(gòu)建體表達(dá)質(zhì)粒pALK1893(△G-444缺失)，pALK1896(AG-460缺失)'pALK1899(AG-444缺失，Y31A—Y32A突變)以及pALK1952(AG-460缺失，Y31A—Y32A突變)。融合于后面跟著完整或突變CBD的截?cái)嗟慕宇^肽的20K蛋白的氨基酸序列如圖12B所示。從EcoRI消化后的載體骨架中分離8.3kb的線性表達(dá)盒，并轉(zhuǎn)化到里氏木霉RF5796原生質(zhì)體中。轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體純化，搖瓶培養(yǎng)，活性測定，Southern雜交以及Western雜交分析都根據(jù)實(shí)施例3所述進(jìn)行。表8從搖瓶培養(yǎng)選擇的20K+CBD接頭缺失轉(zhuǎn)化體的NCU活性<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>RF數(shù)字是指所述轉(zhuǎn)化體作為RF菌株的命名。對菌株RF6107、RF6108、RF6110-RF6112和RF6114-RF6116進(jìn)行發(fā)酵，以獲得供檢測應(yīng)用的材料(實(shí)施例9-11)。Western雜交分析表明融合的20K+CBD接頭缺失酶是作為穩(wěn)定的融合蛋白在里氏木霉中產(chǎn)生的。實(shí)施例5在里氏木霉中產(chǎn)生重組的Melanoca卬usalbomyces50K+CBD融合蛋白質(zhì)粒構(gòu)建體被設(shè)計(jì)為將Mela鵬arpusalbomyces50K(Cel7A，AC#AJ515704)編碼序列與里氏木霉CBHI(cel7A，AC#AR088330;Srisodsuk等1993)的接頭區(qū)和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)相連。質(zhì)粒pALK1237(圖4)，是新構(gòu)建體的基礎(chǔ)，其含有在里氏木霉cbhl啟動(dòng)子控制之下的cel7A基因作為精確融合物。首先，向50K編碼序列的C末端附近引入唯一的Nrul限制性位點(diǎn)。其使得成熟50K多肽的氨基酸S393之后任意鈍末端的DNA直接融合(圖13B)。使用引物2—50K_NrulSpel(5'CGGCAC-TAGTTCGCGACCCGATCTCGCCCCAGCGCAGG3';SEQID.NO:25)和50K—Xhol(5'CGCCGAGGGCCGGCTCGAGAGCATCC3';SEQID.NO:26)，用pALK1237為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。所述PCR反應(yīng)含有1xDyNAzymeTMEXT反應(yīng)緩沖液(Finnzymes，芬蘭)，0.25mMdNTPs，0.5pM各種引物，2.0單位DyNAzymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes,芬蘭)，以及約50ng/100jtd的pALK1237模板DNA。PCR擴(kuò)增條件如下96。C起始變性5分鐘，然后是25個(gè)循環(huán)的96°C15秒，56°C或6rC退火60秒，72。C延伸60秒，以及72'C的最終延伸10分鐘。使用Xhol和Spel限制酶消化PCR產(chǎn)物，并從瓊脂糖凝膠中純化。將純化的PCR片段連入質(zhì)粒pALK1237的6.9kbXhol-Spel限制性片段中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-Blue(Stratagene，USA)。從轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒DNA，并通過測序驗(yàn)證了三個(gè)候選物。所選擇的克隆被命名為pALK1703。里氏木霉CBHI接頭+CBD是以PCR擴(kuò)增的，引物為3一BamMly—50(5'TTGG-ATCCGAGTCGCAGCACCGGCAACCCTAGCG3';SEQID.NO:36)禾卩XhoAge(5'TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGC3';SEQID.NO:15)，用pALK492作為模板。PCR反應(yīng)條件如上所述，除了在擴(kuò)增反應(yīng)中的延伸時(shí)間為90秒。使用Mlyl和AgeI酶消化PCR產(chǎn)物，并從瓊脂糖凝膠中純化。將含有PCR片段的接頭+CBD連入質(zhì)粒pALK1703的6.8kbAgel-Nrul限制性片段，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue(Stratagene，USA)。如上所述對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分析，并將適當(dāng)?shù)目寺∶麨閜ALK1704。為了對里氏木霉轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選，可將amdS標(biāo)記基因和里氏木霉cbhl3'側(cè)翼區(qū)域插入載體質(zhì)粒pALK1704。分離pALK424的4.8kbEcoRI-SpeI限制片段(US5,837,515)，并使用Klenow酶補(bǔ)平所述片段的末端。將鈍末端amdS標(biāo)記片段連入經(jīng)Stul消化的pALK17(H并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-Blue(Stratagene，USA)。從轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒DNA，并通過限制酶消化驗(yàn)證所希望的插入方向。將選定的轉(zhuǎn)化體命名為pALK1708。通過EcoRI消化，從pALK1708骨架中分離9.2kb的線性表達(dá)盒(圖13A)，轉(zhuǎn)化到里氏木霉RF5636原生質(zhì)體(得自菌株QM6a;Bailey和Nevalainen，1981)，并以乙酰胺作為唯一氮源篩選轉(zhuǎn)化體。所述宿主菌株缺乏三種主要的內(nèi)源纖維素酶CBHII(Cel6A)，EGI(Cel7B)和EGII(Cel5A)。根據(jù)Penttila等(1987)的描述以及Karhunen等(1993)所述的修改進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體在PD上形成孢子之前，通過其單個(gè)分生孢子在篩選平板上進(jìn)行純化。從搖瓶培養(yǎng)(50ml)的培養(yǎng)物上清液中分析轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的50K+CBD融合蛋白。所述轉(zhuǎn)化體在用pH5.5的5%KH2P04緩沖的復(fù)合纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Joutsjoki等1993)中生長7天。融合蛋白的酶活性測定為，在50°C、pH7.0的50mMHepes緩沖液中，羧甲基纖維素(3%CMC)釋放的還原糖(NCU活性；Bailey和Nevalainen,1981;Haakana等，2004)。所述轉(zhuǎn)化體的活性不同，從2035-3633NCU/ml。使用從純化的Melanocarpusalbomyces50K中性纖維素酶(Haakana等2004)產(chǎn)生的多克隆抗體，通過使用ProtoBlotWesternblotAP系統(tǒng)(Promega)，從培養(yǎng)物上清液中測定50K+CBD蛋白。Western雜交分析表明從里氏木霉中產(chǎn)生的50K+CBD融合蛋白是穩(wěn)定的。用表達(dá)盒作探針，通過Southern雜交，分析選擇的轉(zhuǎn)化體的基因型。還可通過使用單克隆CBHI抗體(CI-261,Aho等，1991)檢測CBHI蛋白的Western雜交，來驗(yàn)證表達(dá)盒對于cbhl基因座可能的靶定。實(shí)施例6在里氏木霉中生產(chǎn)重組Melanocarpusalbomyces50KB+CBD融合蛋白質(zhì)粒構(gòu)建體被設(shè)計(jì)為將Melanocarpusalbomyces50KB(Cel7B，AC#AJ515705)的編碼序列與里氏木霉CBHI(cel7A，AC#AR088330;Srisodsuk等1993)的接頭區(qū)和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)相連。質(zhì)粒pALK1241(圖5)，是新構(gòu)建體的基礎(chǔ)，其含有在里氏木霉cbhl啟動(dòng)子控制之下作為精確融合物的cel7B基因。首先，向50KB編碼序列的C末端附近引入唯一的NruI限制性位點(diǎn)。其可使在成熟50KB多肽的氨基酸S426之后的任意鈍末端DNA直接融合(圖14B)。用引物50KB_NrulXhol(5'TCGTCTCGA-GTCGCGATGGGGCCGAAGCGGATGTTGG3';SEQID.NO:23)和50KB—Sphl(5'GGAGGGCATGCCCAACAGCAGCGAGATCACC3';SEQID.NO:24)，用pALK1241為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。所述PCR反應(yīng)含有1xDyNAzymeEXT反應(yīng)緩沖液(Finnzymes，芬蘭)，0.25mMdNTPs，0.5/xM各種引物，2.0單位DyNAzymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes，芬蘭)，以及約50ng/100pl的pALK1241模板DNA。PCR擴(kuò)增條件如下96°C起始變性5分鐘，然后是25個(gè)循環(huán)的96°C15秒，56。C或60。C退火60秒，72'C延伸60秒，以及72°C的最終延伸5分鐘。使用Xhol和Sphl限制酶消化PCR產(chǎn)物，并從瓊脂糖凝膠中純化。將純化的PCR片段連入質(zhì)粒pALK1241的6.9kbXhol-Sphl限制性片段，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-Blue(Stratagene，USA)。從轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒DNA，并通過測序驗(yàn)證了一個(gè)候選物。所選擇的克隆被命名為pALK1705。里氏木霉CBHI接頭+CBD用PCR擴(kuò)增，引物為3—BamMly—50(5'TTG-GATCCGAGTCGCAGCACCGGCAACCCTAGCG3';SEQID.NO:18)禾卩XhoAge(5，TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGC3';15)，pALK492作為模板。。PCR反應(yīng)條件如上所述，除了在擴(kuò)增反應(yīng)中的延伸時(shí)間為90秒。使用Mlyl和AgeI酶消化所述PCR產(chǎn)物，并從瓊脂糖凝膠中純化。將含有PCR片段的接頭+CBD連入pALK1705的7.2kbAgel-Nml限制性片段，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue(Stratagene，USA)。如上所述對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分析，并將適當(dāng)?shù)目寺∶麨閜ALK1706。為了對里氏木霉轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選，可將amdS標(biāo)記基因和所述里氏木霉cbhl3'側(cè)翼區(qū)域插入載體質(zhì)粒pALK1706。分離pALK424的4.8kbEcoRI-SpeI限制片段(US5,837,515)，并使用Klenow酶補(bǔ)平所述片段的末端。將所述鈍末端amdS標(biāo)記片段連入Stul消化的pALK1706并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-Blue(Stratagene，USA)。從所述轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒DNA，并通過限制酶消化驗(yàn)證所希望的插入方向。將選定的轉(zhuǎn)化體命名為pALK1709。通過EcoRI消化從pALK1709骨架中分離9.2kb的線性表達(dá)盒(圖14A)，轉(zhuǎn)化到里氏木霉RF5636原生質(zhì)體，并以乙酰胺作為唯一氮源篩選轉(zhuǎn)化體。所述宿主菌株缺乏三種主要的內(nèi)源纖維素酶CBHII(Cel6A)，EGI(Cel7B)和EGII(Cel5A)。根據(jù)Penttila等(1987)的描述以及Karhunen等(1993)所述的修改進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體在PD上形成孢子之前，通過單個(gè)分生孢子在篩選平板上對其進(jìn)行純化。從搖瓶培養(yǎng)(50ml)的培養(yǎng)物上清液中分析轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的的50KB+CBD融合蛋白。所述轉(zhuǎn)化體在用pH5.5的5%&11204緩沖的復(fù)合纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Joutsjoki等1993)中生長7天。使用4-甲基傘形基-/3-0-乳糖苷底物測定融合蛋白的纖維二糖水解酶活性^1^活性；vanTilbeurgh等1988)?？墒褂脧募兓腗elanocarpusalbomyces50KB纖維素酶(Haakana等2004)產(chǎn)生的多克隆抗體，通過ProtoBlotWesternblotAP系統(tǒng)(Promega)，從培養(yǎng)物上清液中測定50KB+CBD蛋白。Western雜交分析中沒有檢測到野生型50KB蛋白，表明從里氏木霉中產(chǎn)生的50KB+CBD融合蛋白是穩(wěn)定的。可用表達(dá)盒作為探針，以Southern雜交分析所選擇轉(zhuǎn)化體的基因型。還可通過使用單克隆CBHI抗體(CI-261，Aho等，1991)檢測CBHI蛋白的Western雜交，來驗(yàn)證表達(dá)盒對于cbhl基因座可能的靶定。實(shí)施例7在里氏木霉中生產(chǎn)重組嗜熱子囊菌CBHI+CBD融合蛋白將嗜熱子囊菌CBHI(AC#AF478686,Hong等，2003;SEQID.NO:9)與里氏木霉CBHI(AC#AR088330;Srisodsuk等1993;SEQID.NO:3)的接頭和CBD融合。首先，使用引物5'-TTAAAC--CGGCAACCCTAGCGGC-3'(正向序列，SEQID.NO:34)和5-TATATGCGGCCGCACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGC-TTTACAGGC-3'(反向序列，SEQID.NO:35)，通過PCR合成里氏木霉CBHI接頭和CBD的編碼序列。所述PCR反應(yīng)混合物含有1xDyNAzymeEXT反應(yīng)緩沖液(Finnzymes，芬蘭)，15mMMg2+，0.2mMdNTPs，2juM各種引物，0.6單位DyNAzymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes，芬蘭)，以及約75ng/30/d的pALK492模板。pALK492質(zhì)粒含有里氏木霉cbhl(cel7A)基因。PCR反應(yīng)條件如下98'C起始變性2分鐘，然后是30個(gè)循環(huán)的98。C30秒，68°C(±4°C梯度)退火30秒，72。C延伸30秒，以及72°C的最終延伸IO分鐘。在64°C-68.5°C的退火溫度范圍內(nèi)，在所述PCR反應(yīng)中獲得了特定DNA片段。使用Ndel和Notl限制酶，對還含有嗜熱子囊菌cbhl基因3'-末端核苷酸序列的合成CBD片段進(jìn)行消化，并在電泳之后從瓊脂糖凝膠中分離所述片段。此后，分離的PCR片段與Ndel和Notl消化的含有全長嗜熱子囊菌cbhl基因的pALK1649(圖7)載體片段連接。所得質(zhì)粒被命名為pALK1888，并通過測序?qū)λ鲑|(zhì)粒中的PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行驗(yàn)證。作為融合的結(jié)果，在pALK1888質(zhì)粒中的嗜熱子囊菌CBHI的C-末端部分含有GPIGST的連接點(diǎn)(圖15B)。將SacII和Agel消化的質(zhì)粒pALK1888的插入物與SacII和Agel消化的pALK1694(圖8)載體片段相連，其產(chǎn)生了融合于里氏木霉cbhl(cel7A)啟動(dòng)子(精確融合物)和終止子的嗜熱子囊菌CBHI+CBD。在最后步驟中，加入amdS標(biāo)記片段，如實(shí)施例3所述，以獲得表達(dá)質(zhì)粒pALK1890，用于在里氏木霉中產(chǎn)生重組嗜熱子囊菌CBHI+CBD融合酶。融合于接頭肽后面跟著里氏木霉CBHI的CBD區(qū)域的嗜熱子囊菌CBHI蛋白的氨基酸序列示于圖15B。通過限制酶消化確證表達(dá)質(zhì)粒，并在經(jīng)過N0tl消化之后從載體骨架中分離8.9kb的線性表達(dá)盒(圖15A)，并將其轉(zhuǎn)化到里氏木霉RF5796原生質(zhì)體。根據(jù)Penttila等(1987)的描述以及Karhunen等(1993)所述的修改進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體在PD上形成孢子之前，通過單個(gè)分生孢子在篩選平板上對其進(jìn)行純化。從搖瓶培養(yǎng)(50ml)的培養(yǎng)物上清液分析轉(zhuǎn)化體的嗜熱子囊菌CBHI+CBD生產(chǎn)。所述轉(zhuǎn)化體在用pH5.5的5%KH2P04緩沖的復(fù)合纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Joutsjoki等1993)中生長7天。根據(jù)vanTilbeurgh等1988的描述，使用4-甲基傘形基^-D-乳糖苷(MUL)底物分析纖維二糖水解酶活性。通過使用其中包括了若干基因組的消化產(chǎn)物的Southern雜交，并將表達(dá)盒用作探針，驗(yàn)證所選擇的轉(zhuǎn)化體的基因型。SDS-PAGE分析表明重組嗜熱子囊菌CBHI+CBD酶在里氏木霉中是作為穩(wěn)定融合蛋白產(chǎn)生的。實(shí)施例8融合的20K+CBD蛋白制劑在粗斜紋棉布修整/生物石磨中的性能對按照實(shí)施例2所述用木霉作為宿主產(chǎn)生的20K+CBD融合蛋白，檢測其在粗斜紋棉布的生物石磨中產(chǎn)生與浮石所提供的磨損外觀相似的能力。在粗斜紋棉布修整中有效的商業(yè)化20K制劑用作比較。用ECOSTONEA200a-淀粉酶脫漿之后，具有硫磺底的靛藍(lán)染色的粗斜紋棉布斜紋布制作的英國牛仔褲用作檢測材料。所述織物的經(jīng)紗和諱紗是環(huán)錠紡制的。在表9所述的條件下，用Electrolux'sWascatorFOM71CLS洗衣機(jī)脫水機(jī)進(jìn)行纖維素酶處理。表9用于纖維素酶處理的檢驗(yàn)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>酶的劑量為單位重量織物的中性纖維素酶活性單位(NCU)進(jìn)行酶的給量。在排水之后，通過加入5gNaOH(10分鐘，40'C)將pH提高至11以上，并漂洗三次來滅活纖維素酶。將牛仔褲在轉(zhuǎn)筒中干燥。每次檢驗(yàn)使用兩條牛仔褲。使用L*a*b色空間坐標(biāo)，使用MinoltaCM2500或CM1000分光光度計(jì)，通過測定顏色的反射值評定生物石磨的效果/磨損水平(光源D65/2°)。在脫漿之后(即，在纖維素酶處理之前)和纖維素酶處理之后，測定粗斜紋棉布的正面和反面的顏色(數(shù)據(jù)未顯示)。每個(gè)測定值都是約40次測定的平均值。每次檢驗(yàn)都使用兩條牛仔褲，且最終的結(jié)果是其平均數(shù)。在酶處理之后的亮度或亮度的升高可用來評定磨損效果(性能或生物石磨效果)。結(jié)果示于表10和11，其中粗體被用來強(qiáng)調(diào)類似的磨損水平和相等的劑量。使用20K或不使用任何酶的處理被用作比較。一些制劑(表11)經(jīng)過熱處理(pH6.0，65°C，60-70分鐘)，為了滅活任何殘留的里氏木霉內(nèi)源酶活性和/或?yàn)榱藱z驗(yàn)所述熱處理對于酶穩(wěn)定性的效果。表IO用20K+CBD融合蛋白處理粗斜紋棉布正面的顏色測定<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>!^是指亮度，-M是藍(lán)方向，+1>*是黃方向商業(yè)制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表10和圖16中的結(jié)果表明，與20K菌株相比，本發(fā)明的20K+CBD融合蛋白在粗斜紋棉布處理中的洗滌性能得到了大為改善。使用菌株RF5977，可以使用低至250NCU/g織物的酶劑量，就能夠獲得與使用1500NCU/g劑量的20K所得的磨損水平(光度L"類似。因此，得到6倍更佳的洗滌性能，而對比度也好。同樣，使用菌株RF5978獲得的洗滌性能與使用RF5977所得的類似。對融合蛋白制劑的熱處理似乎有所降低石洗效果，例如使用RF5977，需要500NCU/g織物的劑量才能獲得與使用未經(jīng)熱處理制劑的250NCU/g的劑量相同的磨損水平(表10)。然而，與現(xiàn)有技術(shù)的制劑相比，仍在洗滌性能中獲得了3倍的改善。實(shí)施例9融合的20K+CBD親合突變體蛋白和融合的20K+CBD接頭缺失蛋白制劑在粗斜紋棉布修整/生物石磨中的性能如實(shí)施例3所述用木霉作為宿主產(chǎn)生的融合20K+CBD親合突變體酶，和如實(shí)施例4所述用木霉作為宿主產(chǎn)生的融合20K+CBD接頭缺失蛋白，對其在粗斜紋棉布的生物石磨中的能力進(jìn)行檢驗(yàn)。在粗斜紋棉布修整中有效的商業(yè)化20K制劑用作比較。用于生物石磨的粗斜紋棉布和檢驗(yàn)系統(tǒng)如實(shí)施例8所述。同樣，關(guān)于纖維素酶處理效果的評定也如實(shí)施例8所述。對示例性融合20K+CBD親合突變體蛋白和融合20K+CBD接頭缺失蛋白制劑進(jìn)行生物石磨檢驗(yàn)的結(jié)果如表12所示。具有Y31W氨基酸取代的菌株RF6090表現(xiàn)出了極好的洗滌性能(比20K大約好6倍)和良好的對比度。菌株RF6090與20K的效力比較也能在圖16中明確看出。具有Y31A氨基酸取代的菌株RF6084大約比20K好1.5倍。具有Y32A或Y31A—Y32A氨基酸取代的融合20K+CBDmut蛋白的生物石磨效果比20K低。與20K菌株相比，20K+CBD接頭缺失蛋白在粗斜紋棉布處理中的洗滌性能大為改善并得到了良好的對比度。用菌株RF6108(AG-444)的洗滌性能比20K至少好6倍，用菌株RF6110(AG-460)大約好3倍。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>實(shí)施例1020K+CBD融合蛋白對粗斜紋棉布強(qiáng)度的影響從從用20K+CBD融合蛋白(實(shí)施例8和9)進(jìn)行洗滌檢驗(yàn)所獲得的牛仔褲中選擇磨損水平相似(在纖維素酶處理后L、值為約23或24)的一些，進(jìn)行強(qiáng)度測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SFS-ENISO13937-1，通過Elmendof法，對用20K+CBD融合蛋白處理之后的撕裂強(qiáng)度和對照樣本進(jìn)行了測定。樣本在經(jīng)紗和諱紗方向切取。所得結(jié)果如表13所示。纖維素酶融合蛋白引起了與20K基本上相同或更低的強(qiáng)度損失，即，使用某些制劑，織物的強(qiáng)度能夠保持的更高。在經(jīng)紗和緯紗方向上強(qiáng)度喪失最低是用接頭缺失AG-444的菌株RF6108獲得的。同樣，具有Y31W氨基酸取代的親合突變體RF6090引起的強(qiáng)度喪失比20K低。而菌株RF5977具有與20K相類似的對于織物強(qiáng)度的影響。用熱處理融合蛋白制劑(實(shí)施例8，表ll)洗滌的一些牛仔褲也被選擇進(jìn)行抗撕強(qiáng)度測定。應(yīng)該注意到用某些熱處理制劑，織物的強(qiáng)度改善，但是由于降低了洗滌效果，需要使用更高的劑量來獲得相同的磨損水平。表13用本發(fā)明20K+CBD融合蛋白處理的牛仔褲的撕裂強(qiáng)度測定<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>商業(yè)制劑實(shí)施例11選擇的20K+CBD融合蛋白制劑與現(xiàn)有技術(shù)酶制劑的比較使用其它類型的粗斜紋棉布對實(shí)施例8和9中的最佳20K+CBD融合蛋白進(jìn)行檢驗(yàn)。在粗斜紋棉布修整中有效的20K制劑(Ecostone⑧NP8500)和兩種可商業(yè)獲得的現(xiàn)有技術(shù)制劑，Novozymes的DeniMax399S和Meiji的Mex500，其是在可商業(yè)獲得的最濃縮的固體酶制劑，用作比較。對生物石磨的檢驗(yàn)系統(tǒng)如實(shí)施例8所述。除了粗斜紋棉布裝載量為lkg，因此浴比略高。將5塊由DownUnder粗斜紋棉布斜紋布(BradmillTextilesPty，澳大利亞)制造的粗斜紋棉布("褲腿")在脫漿之后用于每次檢驗(yàn)。所述織物的經(jīng)紗和諱紗是環(huán)錠紡制的。酶按NCU-活性單位給量，因此獲得相似的磨損水平(測定為纖維素酶處理之后粗斜紋棉布正面的亮度)。纖維素酶處理的效果按照實(shí)施例8評定，除了對每個(gè)褲腿進(jìn)行20次顏色檢測。從每次洗滌檢測中選擇兩個(gè)具有類似磨損水平(纖維素酶處理之后L、值為約26)的褲腿進(jìn)行強(qiáng)度檢測。用20K+CBD融合蛋白處理之后的撕裂強(qiáng)度和對照樣本的測定如實(shí)施例10所述。所得結(jié)果如表14和圖17A和17B所示。緯紗的撕裂強(qiáng)度，通常弱于經(jīng)紗，但在使用菌株RF5977、RF6090、RF6108和RF6110的融合蛋白處理之后要高于經(jīng)過20K處理的強(qiáng)度。與DeniMax399S和Mex500相比，用所有融合蛋白菌株都得到了經(jīng)紗和緯紗方向強(qiáng)度顯著提高。同樣，與其他現(xiàn)有技術(shù)的制劑相比，20K菌株對織物強(qiáng)度的損傷更小。表14用本發(fā)明20K+CBD融合蛋白、20K和現(xiàn)有技術(shù)制劑處理粗斜紋棉布的撕裂強(qiáng)度檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>L^是指經(jīng)過纖維素酶處理之后粗斜紋棉布正面的亮度實(shí)施例1220K+CBD制劑在生物修整(防止起球)中的性能檢驗(yàn)了濃縮20K+CBD融合蛋白制劑在生物修整中的性能。將商業(yè)化的富含EGII的酸性纖維素酶制劑(US5，874,293)用于生物修整制品，并將沒有經(jīng)過酶處理的情況用作比較。使用Electrolux'sWascatorFOM71CLS洗衣機(jī)脫水機(jī)在表15所述的條件下進(jìn)行防止起球的處理。兩種100%棉制造的未用過的套衫塊料基于平針織物的織物和具有絨毛表面的螺紋織物用作有填料的檢驗(yàn)材料。樣本先在6(TC用lml/1表面活性劑/濕潤劑(Sandos的SandocleanPCJ和Clariant的ImacolCN)預(yù)洗滌10分鐘并漂洗3次。之后，在存在預(yù)洗滌所用的相同紡織品助劑的條件下，用纖維素酶在60°C處理60分鐘所述棉織品(cottonknits)。在脫水之后，通過使用氫氧化鈉將pH調(diào)至11以上滅活酶(6(TC10分鐘)。然后將針織品的塊料漂洗三次并在滾筒上干燥。表15用于生物修整處理的檢驗(yàn)條件/加工參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>用裸眼和放大鏡對纖維素酶處理的效果進(jìn)行視覺評定。所得結(jié)果如表16所示，拍攝的目標(biāo)放大的數(shù)碼相機(jī)照片如圖18所示。20K+CBD融合蛋白制劑具有優(yōu)秀的生物修整性質(zhì)，導(dǎo)致了起毛的廣泛降低并防止起球，其可以在圖18的照片(攝自螺紋針織樣品)中清楚地看到。未經(jīng)酶處理的對照樣本，特別是螺紋織物套衫，含有密集的表面絨毛和嚴(yán)重的起球。用20L+CBD制劑，相用最少劑量(0.25%織物重量，o.w.f)已經(jīng)獲得了非常清潔的針織物表面，相當(dāng)于125NCU/g織物的中性纖維素酶活性的。這一劑量產(chǎn)生了與幾乎兩倍劑量一樣好的效果。與使用0.63。/。0.W.f.的富含EGII的制劑的劑量比較，這是在生物修整應(yīng)用中該酶濃度的常用劑量，用織物重量的0.5%20K+CBD制劑的劑量，也可以獲得類似的去球效果。同樣，由重組宿主產(chǎn)生的20K+CBD培養(yǎng)基在生物修整中的有效性，體積上至少兩倍有效于通過重組宿主產(chǎn)生的EGII。表16與富含RGII和沒有酶的對照相比，用20K+CBD融合蛋白進(jìn)行生物修整處理的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>a)織物的重量b)+++++極好的去球效果，視覺上非常清潔的表面++++非常好的去球效果，視覺上清潔的表面-密集的表面絨毛和/或嚴(yán)重的起球?qū)嵤├?320K+CBD制劑在去污劑應(yīng)用中的性能可通過使用0-0.5%去污劑制品(標(biāo)準(zhǔn)去污劑ECE98)重量的酶，所述制品中不含任何酶，在家用洗衣機(jī)中通過重復(fù)洗滌循環(huán)來檢驗(yàn)顆?；?0K+CBD融合蛋白制劑的效力。檢驗(yàn)條件如表17所示。裝載量、去污劑劑量以及主要的檢驗(yàn)條件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)EN60456:2003，但另具污漬。在經(jīng)過5，10和15次洗滌之后采集織物樣本。表17檢驗(yàn)20K+CBD制劑性能的檢驗(yàn)設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>加入的人造污物每種類型總共38片(37x37cm)Art.No.101*炭黑/橄欖油弄臟的棉布Art.No.163*麥片粥弄臟的棉布Art.No.112*可可弄臟的棉布檢驗(yàn)紡織品Art.No.224*的抗發(fā)灰Art.No.224*的抗張強(qiáng)度*來自EMPATestmaterialenAG，瑞士在材料224(ISO2267)進(jìn)行和測定為顏色匹配差異的抗發(fā)灰檢驗(yàn)結(jié)果，示于表18和19以及圖19和20。使用Spectraflsh500色度計(jì)(亮度D65/10°)，采用三刺激法測定色差。20K+CBD融合蛋白制劑在三刺激顏色值Y上具有正性作用，因此是抗發(fā)灰的。不同酶濃度的作用幾乎相同。極低的酶濃度(0.10%)就足以抗發(fā)灰。而與含有高出1.8倍中性纖維素酶活性(NCU)的商業(yè)去污劑纖維素酶BIOTOUCHDCC相比，使用20K+CBD融合蛋白就能獲得類似的效果(數(shù)據(jù)未顯示)。材料224洗滌15次之后，也同樣用于根據(jù)ISO13934-1:1999的抗張強(qiáng)度檢測(數(shù)據(jù)未顯示)。沒有任何一個(gè)酶濃度對抗張強(qiáng)度有損傷作用。所有的結(jié)果都處于彼此的離差范圍之內(nèi)(變化±2.5%)。相同的結(jié)果可適用于拉伸直至斷裂負(fù)載。表1820K+CBD融合蛋白在去污劑應(yīng)用中的性能酶洗滌抗發(fā)灰的物品224和原始(未洗滌)物品之間的顏色匹配差異<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>表1920K+CBD融合蛋白在去污劑應(yīng)用中的性能酶洗滌抗發(fā)灰的物品224和未使用酶洗滌之間的顏色匹配差異<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>參考文獻(xiàn)AlioS,VOlkkonen,TJalava,MPaloheimo,RB13hler,M-LNiku-Paavola,EHBamfordandMKorhola.1991.Monoclonalantibodiesagainstcoreandcellulose-bindingdomainsofTrichodermareeseicellobiohydrolasesIandIIandendoglucanaseLEur.J.Biochem.200:643-649.AzevedoMdeO，F(xiàn)elipeMS，Astolfi-FilhoS,RadfordA.1990.Cloning,sequencingandhomologiesofthecbh-1(exoglucanase)geneofHum:icolagriseavar.the'rmoidea.JGenMicrobiol.136:2569-2576.BaileyMJandNevalainenKMH.1981.Induction,isolationandtestingofstableTrichoderniareeseimutantswithimprovedproductionofsolubilizingcellulase.EnzMicrobiolTechnol.3:153-157.HaakanaH,Miettinen-OinonenA，JoutsjokiV，MantylaA,SuominenP,andVehmaa叩eraJ.2004.CloningofcellulasegenesfromMelanocarpusalbomycesandtheirefficientexpressioninTrichodermareesei.EnzMicrobiolTechnol.34:159-167.HenrissatB.(1991)Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Bioche'm.J.280:309-316.HenrissatB.andBairochA.(1993)Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.293:781-788.HongJ，TamakiH,YamamotoKandKumagaiH.2003.CloningofageneencodingthermostablecellobiohydrolasefromThermoascusaurantiacusanditsexpressioninyeast.ApplMicrobiolBiotechnol63:42-50.JoutsjokiVV,TorkkeliTK,andNevalainenKMH.1993.Transforma-tionofTrichodermareeseiwiththeHormoconisresinaeglucoamylaseP(gamP)gene:productionofaheterologousglucoamylasebyTrichodermareesei.Curr.Genet.24:223-228.KarhunenT,AMantyla,KMHNevalainen,andPLSuominen.1993.Highfrequencyone-stepgenereplacementinTrichodermareesei.I.Endoglu-canaseIoverproduction.Mol.Gen.Genet.241:515-522.LaemmliUK.1970.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature227:680-685,LinderM,MattiiienML，KontteliM,LindebergG,StahlbergJ,Dra-kenbergT,ReinikainenT,PetterssonG,AnnilaA.1995.Identificationoffunc-tionallyimportantaminoacidsinthecellulose-bindingdomainofTrichodermareeseicellobiohydrolaseI.ProteinScience4:1056-1064.LowryOH,NJ'Roseborough，ALFairandRJRandall.1951.ProteinmeasurementwiththeFoNnphenolreagent.J，BiolChem193:265-275.MalardierL，DaboussiMJ，JulienJ，RousselF,ScazzocchioCandBrygooY.1989.Cloningofthenitratereductasegene(niaD)ofAspergillusnidulansanditsusefortransformationofFusariumoxyspomm.Gene15:147-156.Miettinen-OinonenA,LondesboroughJ,JoutsjokiV，LanttoRandVehmaanpei'a,J.2004.Threecellulasesfrom'Melanoarpusalbomyceswithapplicationsinthetextileindustry.EnzMicrobiolTechnol.34:332-341.Pen比ila'M,HNevalainen,MRatt6,ESal.minen,andJKnowles.■1987.AversatiletransformationsystemforthecellulolyticfilatnentousfungusTrichodermareesei.Gene61:155-164.SaloheimoA,HenrissatB,HoffrenAM,TelemanO,PenttilaM.1994.Anovel,smallendoglucanasegene，eg/5,fromTrichodermareeseiiso-latedbyexpressioninyeast.MolMicrobiol13:219-228.SambrookJ,EFFritsch,andTManiatis.1989.Molecularcloning,alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,US.SambrookJandDWRussell.2001.Molecularcloning,alaboratory'manual.ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,US.SrisodsukM,ReinikainenT,PenttilaM,TeeriTT.1993.RoleoftheinterdomainlinkerpeptideofTrichodermareeseicel'lobiohydrolaseIinitsinteractionwith,crystallinecellulose.J.Biol.Chem.268:20756-20761.VanTilbeurghH,LoontiesF，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uán)利要求41-44任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞以及從培養(yǎng)基中回收蛋白的步驟。46.酶制劑，其包含如權(quán)利要求l-27任一項(xiàng)所限定的纖維素酶融合蛋白。47.生物石磨的方法，其包括向含有棉線的織物或衣服中加入如權(quán)利要求l-27任一項(xiàng)所限定的纖維素酶融合蛋白或權(quán)利要求46所述的制劑的步驟。48.權(quán)利要求47的方法，其中所述織物或衣服為粗斜紋棉布。49.生物修整的方法，其包括向紡織材料類織物或衣服或紗中加入如權(quán)利要求1-27任一項(xiàng)所限定的纖維素酶融合蛋白或權(quán)利要求46所述的制劑的步驟。50.權(quán)利要求49的方法，其中所述紡織材料是由含有天然纖維素的纖維或含有人造纖維素的纖維制造而成的或是其混合物。51.權(quán)利要求49的方法，其中所述紡織材料是合成纖維和含有纖維素的纖維的摻合物。52.去污劑組合物，其含有如權(quán)利要求l-27任一項(xiàng)所限定的纖維素酶融合蛋白或權(quán)利要求46所述的酶制劑以及助劑，例如表面活化劑，表面活性劑，漂白劑或增效助劑。53.處理含有纖維素纖維的紡織材料的方法，其中所述方法包括將所述紡織材料與權(quán)利要求52所述的去污劑組合物接觸。54.處理木源漿或纖維的方法，其包括向木源性的機(jī)械或化學(xué)衆(zhòng)或次級纖維中加入如權(quán)利要求1-27任一項(xiàng)所限定的纖維素酶融合蛋白或權(quán)利要求46所述制劑的步驟。55.改善動(dòng)物飼料質(zhì)量的方法，其包括用如權(quán)利要求l-27任一項(xiàng)所限定的纖維素酶融合蛋白或權(quán)利要求46所述的制劑處理植物性材全文摘要本發(fā)明提供了新的纖維素酶融合蛋白、纖維素酶融合蛋白制劑以及纖維素酶融合蛋白組合物。本發(fā)明還提供了纖維素酶表達(dá)載體，表達(dá)纖維素酶的宿主細(xì)胞以及制備這些載體和細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了纖維素酶、纖維素酶制劑以及纖維素酶組合物在紡織品、去污劑、紙漿以及造紙業(yè)中的應(yīng)用。文檔編號C12N9/42GK101171333SQ200680014750公開日2008年4月30日申請日期2006年4月25日優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日發(fā)明者亞爾諾·卡利奧,亞里·韋赫曼佩雷,彭蒂·奧亞帕洛,泰爾?！て绽瓕?瑪麗亞·帕洛黑莫,瑪麗卡·阿拉普拉內(nèi)恩,萊納·瓦爾塔卡里申請人:生化酶股份有限公司