專利名稱：：新的纖維素酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的纖維素酶、編碼該酶的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生這種酶的方法。本發(fā)明還涉及含該纖維素酵的載體和宿主細胞及其在生產(chǎn)簡單糖和葡萄糖方面的用途。
背景技術(shù)：
：纖維素是自然界最豐富的可再生的能源。將未經(jīng)任何化學(xué)處理的纖維素生物轉(zhuǎn)化成簡單糖或葡萄糖，作為發(fā)酵碳源生產(chǎn)酒精，是最理想和有效利用天然纖維素資源的方法之一。通常認為，生物轉(zhuǎn)化纖維素生成葡萄糖至少需要三種不同的酶的協(xié)同作用(l)葡聚糖內(nèi)切酶(Endo-l，4-p-D-glucanase，E.C.3.2丄4，也稱之為纖維素內(nèi)切酶)。它作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解p-l，4-糖苷鍵生成帶非還原端的較短的寡聚糖，(2)葡聚糖外切酶(Exo-l，4-P-D-glucanase，E.C.3.2丄91)，它作用于纖維素分子的非還原末端水解P-l，4-糖苷鍵產(chǎn)生纖維二糖，(3)(3-葡萄糖苷酶(p-D-glucosidase，E.C.3.2丄21)，它將纖維二糖水解為葡萄糖。目前，研究較為集中的是真菌和細菌的纖維素酶系。絲狀真菌中的李氏木霉(T./"ee化z')和綠色木霉(T.wWde)以及熱纖梭菌(C.Aenwoce〃w/n)和ce〃"/omwjos^n/等物種的纖維素酶系較復(fù)雜，有多種亞類的內(nèi)切酶，外切酶及葡萄糖苷酶[ThomasM.Wood,股ochemical.SocietyTransactions.1992,20,46-53]，例如綠色木霉有6種亞型的內(nèi)切酶[Beldman，G.etalEur.J.股ochem.1985,146:301-308]。熱纖梭菌的纖維素酶需要同多個蛋白質(zhì)形成分子量巨大的纖維體(Cellulosome)才能起催化反應(yīng)[FelixC.RandL.G丄jiungdahl，Annu.Rev.Microbiol.1993,47:791-819]，顯然這樣復(fù)雜的酶系必然會給研究和應(yīng)用帶來極大的困難。另一方面，純化的單一組分的內(nèi)切酶和外切酶要么不能水解未經(jīng)化學(xué)處理的天然纖維素生成簡單糖，要么水解活力極低，如李氏木霉(T.A"ee^0的纖維素酶系統(tǒng)中至少需14類纖維素酶的協(xié)同作用才能水解將未經(jīng)化學(xué)處理的植物纖維。傳統(tǒng)的觀點認為動物沒有自己的纖維素酶系，需依賴共生菌的纖維素酶將纖維素水解成單糖，供生命活動需要。但是90年代末發(fā)現(xiàn)了白蟻和小龍蝦內(nèi)在的纖維素內(nèi)切酶[Hirofiimi，W.Gaku,T，nathan,LNature,1998，394:330-33l;KerenA.B.etal"Gene，1999,239,317-324]。此外，在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)了12種內(nèi)切酶基因[delCompillo，Curr.Top.Dev.Boil.1999,46:39-61]。動物纖維素酶可能成為新的應(yīng)用研究的熱點。在地球上每年由固定CO2的光合作用就能形成100億噸以是上的干植物物質(zhì)，其中這些物質(zhì)的組成一半以上是由纖維素，其次是半纖維素(主要由木聚糖所構(gòu)成)。如果再加上人類活動所造成的廢棄的纖維素，如稻草，麥秸等，其存在量則要以天文數(shù)字來計算。如何釆用生物技術(shù)綜合利用植物干物質(zhì)或廢棄的纖維素的問題上，纖維素酶起著關(guān)鍵作用。有效地將這些天然的纖維素轉(zhuǎn)化為簡單糖是纖維素作為再生能源的關(guān)鍵。目前的纖維素酶還遠不能適應(yīng)將植物纖維素轉(zhuǎn)化為簡單糖作為再生能源的需求。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)不同來源的具有能高效率水解纖維素的新的纖維素酶，以及新的生產(chǎn)葡萄糖的工藝。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種新的纖維素酶以及其片段、類似物和衍生物，及其編碼序列。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)纖維素酶的方法以及其用途。本發(fā)明的另一目的是提供新的生產(chǎn)簡單糖和葡萄糖的工藝。本發(fā)明一方面提供一種分離的纖維素酶，該纖維素酶選自(a)具有SEQIDNO:2第1-713位氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:4第l-723位氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:6第l-722位氨基酸序列的多肽；(d)具有SEQIDNO:8、9、10、11或12所述多核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽；(e)將SEQIDNO:2、4、6的氨基酸序列或(d)的氨基酸序列經(jīng)過1-10個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有纖維素酶功能的由(a)、(b)、(c)或(d)衍生的多肽。在一個優(yōu)選實施例中，所述纖維素酶的氨基酸序列為SEQIDNO:2、4或6所示的氨基酸序列。本發(fā)明另一方面涉及一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自(a)編碼本發(fā)明分離的纖維素酶的多核苷酸；(b)在嚴(yán)格條件下與(a)所述多核苷酸序列雜交且編碼具有纖維素酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。在一個優(yōu)選的實施例中，所述纖維素酶選自((a)具有SEQIDNO:2第1-713位氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:4第l-723位氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:6第l-722位氨基酸序列的多肽；(d)具有SEQIDNO:8、9、10、11或12所述多核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽；(e)將SEQIDNO:2、4、6的氨基酸序列或(d)的氨基酸序列經(jīng)過l-10個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有纖維素酶功能的由(a)、(b)、(c)或(d)衍生的多肽。在另一優(yōu)選實施例中，所述的多核苷酸選自下組(i)具有SEQIDNO:1中1-2142位的核苷酸序列；(ii)具有SEQIDNO:3中1-2172位的核苷酸序列；(iii)具有SEQIDNO:5中卜2169位的核苷酸序列；(iv)具有SEQIDNO:8中1-2172位的核苷酸序列；(v)具有SEQIDNO:9中1-2172位的核苷酸序列；(vi)具有SEQIDNO:10中l(wèi)-2169位的核苷酸序歹ij;(vii)具有SEQIDNO:11中1-2169位的核苷酸序列；或(viii)具有SEQIDNO:12中1-2169位的核苷酸序列；在另一方面，本發(fā)明涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸序列的重組表達載體。在另一方面，本發(fā)明涉及一種含有本發(fā)明重組載體的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在又一方面，本發(fā)明涉及一種制備本發(fā)明纖維素酶的方法，該方法包含(a)在適合表達所述纖維素酶的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明所述的宿主細胞；和(b)從培養(yǎng)物中分離出所述的纖維素酶。又一方面，本發(fā)明涉及所述的纖維素酶用于生產(chǎn)簡單糖的工藝，所述的簡單糖是纖維二糖、葡萄糖及其混合物中的用途。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)簡單糖的方法，該方法包括步驟(a)用本發(fā)明所述的纖維素酶或宿主細胞處理纖維素，從而產(chǎn)生簡單糖；(b)分離出所述的簡單糖，所述的簡單糖包括纖維二糖、葡萄糖及其混合物。所述的纖維素材料是未經(jīng)任何化學(xué)預(yù)處理的纖維素材料。本發(fā)明還涉及一種提高本發(fā)明纖維素酶的酶活力的方法，該方法包括用含N03-、HS03—、S042—、S2032—、Mn2+、06115073-或￡0丁八的溶液處理所述纖維素酶，從而提高其酶活力。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示從軟體動物福壽螺(^^"http://0^^0^")的胃液中分離純化到的纖維素酶的組份的SDS-PAGE結(jié)果。圖中，泳道"M"表示分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括兔磷酸化酶B(97.4kD)、牛血清白蛋白(66.2kD)、兔肌動蛋白(43.0kD)、牛碳酸酐酶(31.0kD)和胰蛋白酶抑制劑(20.1kD)。泳道1為純化的纖維素酶EG65。圖2A顯示EG65在15。C在不同pH中培養(yǎng)不同時間所得的相對活力(％)。圖2B顯示RG65在5(TC在不同pH中培養(yǎng)15分鐘的相對活力(Q/。)。圖3顯示在5(TC測量的純化的EG65在不同時間的相對酶活性。圖4顯示甲醇酵母表達載體pPIC9K，共9276個核苷酸，其中，5'AOXl啟動子片段第l-948核苷酸堿基；5'AOXl引物位點第855-875位堿基；a-因子分泌信號第949-1218位堿基；a-因子引物位點第1152-1172位堿基；多克隆位點第1216-1241位堿基3'AOXl引物位點第1327-1347位堿基；3'AOXl轉(zhuǎn)錄終止(TT):第1253-1286位堿基；HIS4ORF:第4514-1980位堿基；卡那霉素抗性基因(Kanamycin):第5743-4928位堿基；3'AOXl片段第6122-6879位堿基；pBR322起點第7961-7288位堿基；氨芐青霉素抗性基因(Ampicillin):第8966-8106位堿基。圖5顯示用引物Fl和Rl擴增得到的cDNA片段及其預(yù)測的氨基酸序列。圖6顯示eg65-a、eg65-b、eg65-c的圖譜及測序策略。圖7顯示EG65-a、EG65-b、EG65-c蛋白的同源性比較。圖8顯示EG-65a的氨基酸序列與其它纖維素酶的氨基酸序列的比較結(jié)果。其中，Termite.1:家白蟻(Coptotoroes/0/7nosa"MS，BAB40697);Termite.2:達爾文澳白蟻(Mw她/w51c/a簡'm'，/s，CAD54729);Crayfish:鰲蟲下(C7zera;n:,dr/cflr!'wfl加，AA061672);Acray;ye。"EG65-a;Haliotis:自鮑魚(7/a//0^cfoow，BAC67186)。圖9顯示EG65-a、EG65-b和EG65-c的結(jié)構(gòu)域。途中，"Glyco—hydro—9"表示糖苷水解酶第9家族。圖10A-10F顯示采用NetNGlyc1.0進行的EG65-a、EG65-b和EG65-c的0-糖基化和N-糖基化預(yù)測，其中圖10A-10C分別顯示EG65-a、EG65-b和EG65-c的0-糖基化預(yù)測位點，而圖10D-10F分別顯示EG65-a、EG65-b和EG65-c的N-糖基化預(yù)測位點。圖llA-llC分別顯示EG65-a、EG65-b和EG65-c的SignalP-NN預(yù)測結(jié)果。圖中，較淺曲線代表S分值(Sscore),較深曲線代表C分值(Cscore),豎線(I)代表Y分值(Yscore)。圖IIA顯示，在EG65-a中在位置16和17之間存在最有可能的解離位點VLS-SV;圖11B顯示，在EG65-b中在位置16和17之間存在最有可能的解離位點GFG-SI;圖11C顯示在EG65-c中在位置16和17之間存在最有可能的解離位點SFA-IT。圖12顯示純化的重組酶的SDS-PAGE分析。圖中泳道l為EG65-b-16;泳道2為EG65-b-18;泳道3為EG65-a-137;泳道4為EG65-c-147;M為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括兔磷酸化酶B(97.4kD)、牛血清白蛋白(66.2kD)、兔肌動蛋白(43.0kD)、牛碳酸酐酶(31.0kD)。左面的凝膠(10。/。SDS-PAGE)用考馬斯亮藍G-250染色，而右面的凝膠(10o/。SDS-PAGE)用硝酸銀染色。圖13A和圖13B顯示重組酶EG65-b-16(命)和EG65-b-148(0)的最適pH(圖13A)和最適溫度(圖13B)。圖14A-14D顯示EG65-a-137和EG65-c-147的最適pH和最適溫度。其中，圖14A和14C分別顯示EG65-a-137的最適溫度和最適pH，圖14B和14D分別顯示EG65-c-147的最適溫度和最適pH。圖15A和15B分別顯示重組酶EG65-b-l6(命)和EG65-b-148(0)的溫度穩(wěn)定性。圖16A和16B分別顯示重組酶EG65-b-16(令)和EG65-b-148(0)的pH穩(wěn)定性。圖17A顯示純化的EG65的雙向凝膠電泳。其中，橫向顯示IPG條帶，pH3-10，L=24cm;縱向為12.5。/oSDS-PAGE，260X200Xlmm。圖17B顯示用MALDI-TOF多肽質(zhì)量指紋圖譜進行分析所得結(jié)果。圖18A和18B分別顯示EG65-bl、b2、b3的氨基酸序列比較，和EG65-cl、c2、c3、c4的氨基酸序列比較。圖19顯示純化的EG65的雙向凝膠電泳。其中，橫向顯示IPG條帶，pH3-10，L=24cm;縱向為12.5。/。SDS-PAGE,260X200Xlmm。具體實施方式如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，"分離的纖維素酶蛋白或多肽"是指纖維素酶基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化該纖維素酶?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的帶。本發(fā)明的纖維素酶可以是重組的、天然的、合成的，優(yōu)選是重組的。本發(fā)明的纖維素酶可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括該纖維素酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的天然纖維素酶相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語"福壽螺纖維素酶"指具有纖維素酶活性的SEQIDNO:2第l-713位氨基酸序列、SEQIDNO:4第1-723位氨基酸序列或SEQIDNO:6第l-722位氨基酸序列的多肽，以及具有SEQIDNO:8、9、10、11或12編碼的氨基酸序列的多肽；該術(shù)語還包括SEQIDNO:2、4、6序列以及SEQIDNO:8、9、10、11或12編碼的氨基酸序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-50個，較佳地l-30個，更佳地l-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括福壽螺纖維素酶的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與福壽螺纖維素酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含福壽螺纖維素酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了福壽螺纖維素酶的可溶性片段。通常，該片段具有福壽螺纖維素酶序列的至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供福壽螺纖維素酶或多肽的類似物。這些類似物與天然福壽螺纖維素酶的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，"福壽螺纖維素酶的保守性變異多肽"指與SEQIDNO:2、4、6的氨基酸序列以及SEQIDNO:8、9、10、11或12編碼的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表A進行氨基酸替換而產(chǎn)生。表A最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val;Leu;lieValArg(R)Lys;Gin;AsnLysAsn(N)Gin;His;Lys;ArgGinAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro;AlaAlaHis冊Asn;Gin;Lys;ArgArgHe(I)Leu;Val;Met;Ala;PheLeuLeu(L)lie;Val;Met;Ala;PhelieLys(K)Arg;Gin;AsnArgMet(M)Leu;Phe;lieLeuPhe(F)Leu;Val;lie;Ala;TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTip(W)Tyr;PheTyrTyr(Y)Tip;Phe;Thr;SerPheVal(V)lie;Leu;Met;Phe;AlaLeu本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO:l所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO:2、4、6或SEQIDNO:8-12所編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO:l、3、5、8-12所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼福壽螺纖維素酶成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列+各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)+非編碼序列。術(shù)語"編碼福壽螺纖維素酶的多核苷酸"可以是包括僅編碼福壽螺纖維素酶的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴(yán)格條件"是指(l)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50。/o(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42X:等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽具有纖維素酶活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼福壽螺纖維素酶的多聚核苷酸。本發(fā)明的福壽螺纖維素酶核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用按常規(guī)方法所制備的福壽螺cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，己經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或纖維素酶編碼序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science,1984;224:1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的纖維素酶。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼纖維素酶的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，纖維素酶多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語"重組表達載體"指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg,etal.Gene,1987，56:125)?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含纖維素酶編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，etal.MolecularCloning,aLaboratoryManual,coldSpringHarborLaboratory.NewYork,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；人噬菌體Pl后幼子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、以及新霉素抗性，或用于大腸桿菌的四環(huán)素、卡那霉素或氨節(jié)青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞。較佳地是大腸桿菌。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。本發(fā)明的酶還包括固定在固相載體上的固定化酶。本領(lǐng)域熟知的各種固定化酶技術(shù)都可用于制備本發(fā)明的固定化的纖維素酶。此外，本發(fā)明提供了纖維素酶、其編碼序列、載體或宿主細胞的用途，它們被用于生產(chǎn)簡單糖，尤其是葡萄糖的工藝。所述的簡單糖包括纖維二糖、簡單戊糖、葡萄糖及其混合物。本發(fā)明的生產(chǎn)簡單糖的工藝包括步驟(a)用本發(fā)明上述的纖維素酶或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞處理纖維素材料，從而產(chǎn)生簡單糖；(b)分離出所述的簡單糖。本發(fā)明酶可直接產(chǎn)生纖維二糖、簡單戊糖等簡單糖。優(yōu)選的工藝還包括加入其他酶，例如P-葡萄糖苷酶(可將纖維二糖水解為葡萄糖)，這樣就可直接產(chǎn)生葡萄糖。一種代表性的工藝包括步驟(a)將用機械鉸碎稻草與含0.1M氯化鈉的0.05MpH5.2醋酸緩沖液按20-30。/?；旌?按重量/體積)在45。C預(yù)熱10-15分鐘。(1>)然后加入0.05-0.2%纖維素酶和P-葡萄糖苷酶，緩慢攪動，在45'C水浴反應(yīng)12-24小時，收集自然沉降的90%上清部分。蒸干得到葡萄糖粗品。(c)沉淀部分補加含0.1M氯化鈉的0.05MpH5.2醋酸緩沖液至原體積，緩慢攪動在45r水浴反應(yīng)24小時，收集自然沉降的90%上清部分。蒸干得到葡萄糖粗品。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例l:福壽螺EG65的分離純化1.材料和試劑福壽螺廣泛分布在中國福建、廣東，廣西，浙江，江蘇等省。將從福建廈門購得的福壽螺作為實驗材料。實驗中，層析介質(zhì)DEAE-SepharoseCL-6B，DEAE-SepharosefastflowDEAE-SephadexA-50，Phenyl-SepharoseCL-4B購自PharmaciaAB(Sweden)公司，Bio-gelP-100購自Bio-Rad(USA)公司。電泳試劑丙稀酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)購自PharmaciaAB(Sweden)公司，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自上海西巴斯公司。測活試齊[JpNPC、Sigmacell101、木聚糖(xylanfrombirchwoodoroatspelt)、CMC-Na(中等粘度),淀粉(frompotato)購自Sigma公司；P-水楊素、AvicelpH101購自Fluka公司。糖蛋白熒光染料熒光酰肼(dansylglycylhydtazide，DNS-GLY-NHNH2)由上海生化細胞所劉望夷教授饋贈。其余試劑為國產(chǎn)試劑分析純。2.分離純化1)硫銨分級沉淀取18g福壽螺的胃，用剪刀將螺胃剪粹，在4。C用24ml(l:1.5,w/v)緩沖液A(10mMNa2HP04-NaH2P04pH6.8—lOOmMNaCl，ImMEDTA)抽提30分鐘，抽提液12000rpm離心15分鐘后上清加入(NH4)2S04至55。/。飽和度，4'C靜置過夜。2)離子交換柱層析將靜置過夜的上清離心，沉淀對緩沖液A(自配，10mMNa2HP04-NaH2P04pH6.8—100mMNaCl,lmMEDTA)進行透析，透析后的酶液離心，上清為用A預(yù)先平衡好的DEAE-SephadexA-50柱(2.6X16cm)的上樣液，收集用A洗滌下來的有CMC-Na活性的組份。CMC-Na水解活力測定取適量的酶加入到50。C預(yù)熱10min的200ull%(w/v)CMC-Na(lOOmMNaAC-HAC，pH5.2-100mMNaCl)中，混勻，50。C反應(yīng)10分鐘后，加入0,5mlDNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5min顯色，冷水浴冷卻，再補入0.5ml二次蒸餾水，混勻后測定540nm處光吸收值(此測活方法被定義為標(biāo)準(zhǔn)方法)。水解CMC-Na的活力單位定義為在上述條件下，每分鐘水解生成lymol葡萄糖還原當(dāng)量所需要的酶量為一個單位(Unit)。3)凝膠過濾柱層析UltrafilterPM10超濾管(pall)濃縮后上Bio-gelP-100柱(2.7X92cm，預(yù)先用A平衡好)，收集下來的具有CMC-Na活性的組份。4)疏水相互作用層析在收集得到的活性組份中加入(NH4)2SO4至0.5M,上疏水柱Phenyl-sepharoseCL-4B柱(1.0X6.0cm)，經(jīng)柱平衡緩沖液B(自配，lOmMNa2HP04-NaH2P04pH6.8~0.5M(NH4)2SO4,100mMNaCl，lmMEDTA)洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，用0.5-0M(NH4)2SCX^B緩沖液梯度洗脫，收集活性具有CMC-Na活性的組份。5)離子交換柱層析用UltrafilterPM10超濾管更換緩沖液為C(自配，50mMTris-HClpH8.0),上柱DEAE-sepharosefastflow柱(l.OX6.0cm,預(yù)先用C平衡好),平衡洗脫除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，用含0-0.2MNaCl的溶液洗脫，收集純酶，并用UltrafilterPM10超濾管濃縮以備下面實驗用。3.結(jié)果通過硫銨分級沉淀、離子交換(2次)、凝膠過濾以及疏水相互作用等一系列的柱層析，從軟體動物福壽螺的胃液中分離純化到了纖維素酶的組份，該組份在SDS-PAGE上顯示的分子量為65kDa(圖l)，命名為EG65。EG65對CMC-Na的相對活力為13.3IU/mg。下表顯示了對福壽螺胃液進行分離純化所得結(jié)果。純化步驟總蛋白總活性相對活力純化系數(shù)產(chǎn)率(mg)(u)(U/mg)傲(%)粗抽提物663.72414.43.641100硫銨分級分離410.51722.64.201.1571,3DEAES印hadexA-50100.4557.25.551.5223.1Bio-gelP-10014.980.115.381.483.32PhenylSepharoseCL-4B5.9851.248.572.352.12DEAESepharosefastflow1.013.3013.33.650.55實施例2:EG65的活性測定1.活性測定方法(1)糖蛋白鑒定選用熒光酰肼(DNS-Gly-NHNH2)特異標(biāo)記糖蛋白上的糖鏈，根據(jù)W.Y.Liu，R.Q.Jiang在"Thefluorescentlabelingofglycoproteinsonsodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegel"(Bioorg.Chem.22(1994)29-35)中公開的方法鑒定糖蛋白。(2)最適pH、最適溫度以及pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性測定1)最適pH:取適量的EG65加入到的不同pH值的200pl、溶解在pH3.6-7.2100mMQH807(檸檬酸)/Na2HPCV2H20的濃度為l%(w/v)的CMC-Na中按標(biāo)準(zhǔn)方法測活。2)最適溫度在25°C到70'C范圍內(nèi)按標(biāo)準(zhǔn)方法測活。3)pH穩(wěn)定性將EG65酶于pH2.7-9.7的廣泛pH緩沖液中50。C保溫15min或者50。C保溫不同時間后按標(biāo)準(zhǔn)方法測活。4)溫度穩(wěn)定性將EG65在pH4.6的廣泛pH緩沖液中5(TC保溫不同的時間按標(biāo)準(zhǔn)方法測活。(3)金屬離子、陰離子以及螯合劑對酶活性的影響金屬離子、陰離子以及螯合劑加入到酶溶液中，然后按標(biāo)準(zhǔn)方法測活。(4)結(jié)合實驗取一定量的酶加入到1.0ml不溶性的微晶纖維素AvicelpH101(50mMNaAC-HAC,pH5.2)中，于4t:放置并不時搖動，上清中活性按標(biāo)準(zhǔn)方法測定。離心后的沉淀用NaAC-HAC溶液洗滌三次，每次lml，盡量將上清去干凈，洗滌后的沉淀用1'SDS上樣緩沖液重懸，沸水浴2-3min后，用15。/。的SDS-PAGE分析。2.結(jié)果(1)糖蛋白分析實驗表明，EG65為糖蛋白。(2)pH和溫度對酶活性的影響(2.l)最適pH和最適溫度EG65水解CMC-Na的最適溫度和最適pH分別為50-55'C，5.5-6.5。(2.2)pH穩(wěn)定性實驗表明，EG65在不同pH條件下15X:保溫100h之后仍沒有明顯的活力下降(圖2A)，然而，5(TC保溫15min之后，活力有很明顯的變化處于pH4.6的酶活力達到最高；pH5.6時達到相對最高活力的93。/。；在pH4.6-5.6范圍之外，酶水解CMC-Na的活力就明顯下降，到pH2.7和pH7.5時，酶基本失活(圖2B)。(2.3)EG65的溫度穩(wěn)定性測定是將pH4.6的酶溶液在50'C保溫不同的時間后測殘留的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EG65具有很高的溫度穩(wěn)定性，5(TC保溫3h，保留有>70%的活力(圖3)。(2.4)不同結(jié)構(gòu)的多糖，如CMC-Na、pNPC、樺樹木聚糖(birchwoodxylan)、燕麥木聚糖(oatspeltxylan)、P-水楊素、Sigmacell101以及淀粉等分別作為EG65的底物來檢測其底物特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EG65對CMC-Na有很特異的催化活性，對pNPC、P-水楊素和淀粉均無水解能力(見下表)。這些實驗表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>上標(biāo)"a"表示分別使用樺樹木聚糖和燕麥木聚糖。(2.5)將金屬離子、陰離子以及螯合劑加入到酶溶液中使其終濃度為10mM，然后再在、2+標(biāo)準(zhǔn)條件下測其相對活力。從實驗結(jié)果可以看出，Na+、Li+、NH4+、Mg'Br—、r、Ac-和CO,等離子的存在對酶活力的變化沒有明顯的影響,f、cr、so42CaNO2+:2+HSChS2032—、Mn2+、C6H50,和EDTA的存在可以提髙酶的活力。下表列出了實驗結(jié)陰離子或螯合劑相對活力金屬離子相對活力NaF102.1LiCl108.4NaCl101.9KC1119.2NaBr106.9NH4C195.6Nal101.5MgCl2103.4NaAC106.3CaCl289.8NaN03118.7NiCl2110.1NaHS03122.5MnCl2121.9Na2C03106.6NiS04114.8Na2S04119.0MgS04100.1Na2S203135.2EDTA124.4檸檬酸三鈉114.8上表中，在標(biāo)準(zhǔn)條件下沒有加入所述試劑所測得的相對活力為IOO。實施例3:EG65的基因及其相關(guān)基因的克隆和表達1.材料、試劑和方法(1)材料和試劑3-環(huán)己氨基-l-丙磺酸(CAPS)轉(zhuǎn)膜緩沖液購自Amresco公司；V8蛋白水解酶購自Pierce公司；二硫蘇糖醇(DTT)購自Sigma公司；PVDF膜購自Millipore公司；Trizo鵬自上海生工(力口拿大BioBasicInc.進口分裝)；反轉(zhuǎn)錄試劑購自Promega公司；福壽螺胃組織cDNA文庫由本實驗室構(gòu)建；限制性內(nèi)切酶、PCR所用的酶(TaqE、PyrobestE、La-TaqE等)以及載體pMD18-TVector購自Takara公司；膠回收試劑盒、麗春紅購自上海華舜生物工程有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自博大泰克；IPTG購自BBI公司；X-gal購自Takara公司；E.coli培養(yǎng)所用蛋白胨(Tryptone)、酵母抽提物(YeastExtract)購自O(shè)xoid公司；甲醇酵母尸.培養(yǎng)所用蛋白胨(BactoTMP印tone)、酵母基本氮源(YeastNitrogenBaseW/Oaminoacid)購自B&D公司(原Difco公司產(chǎn)品)；D-山梨醇、生物素、瓊脂糖等都是國產(chǎn)分析純；PCR儀為PTC-150Mini輪rTM;蛋白測序儀為491型蛋白測序儀；酵母電轉(zhuǎn)化儀為Bio-Rad公司MicroPulser電轉(zhuǎn)化儀。試劑配方包括YPD:1%酵母抽提物，2。/。蛋白胨(peptone)，2%葡萄糖；滅菌。RBD平板:1M山梨醇，2%葡萄糖，1.34%YNB，0.005%氨基酸，4乂10-5%生物素，2%瓊脂糖滅菌。BMGY(或BMMY):1%酵母抽提物，2°/。蛋白胨(peptone)，lOOmM磷酸鉀，pH6.0，1.34。/。YNB，4xl0-5。/。生物素，1%甘油或者0.5%甲醇；滅菌。需要注意的是2%葡萄糖，lOOmM磷酸鉀，pH6.0要單獨滅菌；1.34。/。YNB,0.005。/。氨基酸，4xl0-5。/。生物素過濾除菌；0.5°/。甲醇要在使用前加。其它試劑同實施例l。(2)方法(2.l)N-端及中間部分氨基酸序列測定EG65純酶和用V8蛋白酶水解產(chǎn)生的14kD片段，分別經(jīng)IO%SDS-PAGE電泳之后，通過半干法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，麗春紅顯色之后用自動測序儀通過Edman降解法進行N-端序列測定。(2.2)福壽螺胃組織總RNA分離及反轉(zhuǎn)錄取新鮮福壽螺胃組織100mg，用Trizol試劑按照GIBCOBRL的總RNA分離Protocol抽提胃組織的總RNA，利用oligodT-15作為引物反轉(zhuǎn)錄，得到福壽螺胃組織cDNA第一鏈，-20'C保存，作為PCR反應(yīng)的模板。(2.3)福壽螺EG65基因(eg65-a、eg65-6、eg65-c)cDNA的克隆1)核心序列的確定根據(jù)EG65N-端氨基酸序列以及對糖苷水解酶第九家族的保守序列并對鮑魚[K.Suzuki，T.Ojima,K.Nishita,PurificationandcDNAcloningofacellulasefromabalone//a"orisofccusZia""a!'，Eur丄Biochem.270(2003)771-778]、鰲蟲下葡聚糖內(nèi)切酶的序列[K.A.Byrne，S.A.Lehnert,S.E.Johnson,S.S.Moore,IsolationofacDNAencodingaputativecellulaseintheredclawcrayfishCheraxquadricarinatus,Gene.239(1999)317—324]作比較選取一段保守序列(DAGDHVKFG)，設(shè)計兼并引物F1(041016-F1)，Rl(041105r)，以cDNA為模板，94。C,5min;94。C，lmin;48。C，45s;72。C,lminl0s;35輪;72。C，10minPCR擴增,測序。2)3'-RACE，即尾部序列的確定a.根據(jù)糖苷水解酶第九家族的保守序列并對鮑魚、鰲奸葡聚糖內(nèi)切酶的序列作比較選取一段保守序列(HNEVACDYN),設(shè)計兼并引物F2(041105F4);另選取福壽螺胃組織cDNA文庫載體上的一段序列，設(shè)計特異性引物入C(040428-2),以福壽螺胃組織cDNA文庫為模板，94。C，5min;94°C,lmin;58°C,45s;72。C，lmin30s;30輪；72。C,10minPCR擴增，測序。b.根據(jù)核心序列，設(shè)計引物F3(041213-f4)和cDNA文庫的特異性引物入C，以福壽螺胃組織cDNA文庫為模板，94。C,4min;94。C，30s;52。C，30s;72°C，lminl0s,5輪；94。C,30s;57。C，30s;72°C，lminl0s，25輪；72。C,10minPCR擴增，測序。3)5'-RACE，即前半部分序列的確定根據(jù)核心序列，設(shè)計引物R2(041127-r),另選取福壽螺胃組織cDNA文庫載體臂上的特異的一段序列，設(shè)計特異性引物入N，以福壽螺胃組織cDNA文庫為模板，94°C，5min;94。C,lmin;62。C,45s;72。C，2minl0s，30輪;72。C,10minPCR擴增，測序。4)通拉，即全基因序列的確定a.根據(jù)前半部分序列以及尾部序列(a),分別設(shè)計引物F4(0412133041-f2)，F(xiàn)5(0412133042-fl)以及R3(1822rl)，以福壽螺胃組織cDNA文庫為模板，94°C,5min;94。C，30s;60。C,30s;72°C,2min30s，30輪;72。C，10minPCR擴增，測序，得到兩段DNA序列，分別為eg65-a和eg65-Z)的cDNA全長序列。b.根據(jù)前半部分序列以及由尾部序列(b)設(shè)計的引物設(shè)計的引物F6(0412133042-fi)以及R4(50113166)，以福壽螺胃組織cDNA文庫為模板，94°C，5min;94°C，30s;60°C，30s;72°C，2min30s，30輪；72°C，10minPCR擴增，測序，得到eg(55-c的cDNA全長。上述PCR擴增得到的片段經(jīng)膠回收試劑盒純化之后與pMD18-T載體16"C連接4h，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH12S。挑克隆，菌體PCR以及酶切鑒定之后，測序。經(jīng)測序驗證序列正確的含質(zhì)粒的甘油菌于-7(TC待用。所使用到的引物序列如下引物寡核苷酸序列"*"表示包括豐余部分(R^AG;Y=CT;N=ATCG),1=次黃嘌呤(2.4)eg65-a,eg65-6以及eg65-c在甲醇酵母(尸Zc/n'fl;^ton力中的表達1)表達質(zhì)粒的構(gòu)建以上述含eg65-a、eg(15-6、eg65-ccDNA全長的質(zhì)粒為模板,分別以Fex(-16a)即Fex(-160923),Rex;Fex(-137a)即Fex(-1370923)，Rex;Fex(-16b)，Rex;Fex(-148b)，Rex;Fex(-16c)即Fex(-16F2A)，Rex1即Rex(-1470121F2B)和Fex(-147c)即Fex(-1470121F2A),Rex1為引物，擴增eg65-a,eg65-b，eg65-c的開放閱讀框。所得產(chǎn)物通過EcoRI和NotI酶切位點接入P.;^to/^表達載體pPIC9K(圖4)，轉(zhuǎn)化￡.DH12S感受態(tài)細胞，構(gòu)建表達質(zhì)粒。挑選陽性克隆，測定插入片段DNA序列，篩選包含正確序列的克隆。2)尸./^to/^表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化表達質(zhì)粒線性化用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提相當(dāng)于3-4個小抽量的/3/7^to/^表達質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶SacI酶切線性化后，無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌兩次，晾干后以10"1TE溶解，以備轉(zhuǎn)化。甲醇酵母GS115感受態(tài)的制備將GS115菌株接種于2mlYPD培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)1220小時，以1:100比例接種于100mlYPD培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)至OD600=1.31.5。4。C，1500g離心10min，沉淀用預(yù)冷的無菌水懸浮洗滌2次，4'C，1500g離心10min，再用預(yù)冷的1MD-山梨醇懸浮洗滌沉淀2次，4°C，1500g離心10min后，所得GS115重懸于0.3ml預(yù)冷的lMD-山梨醇中，冰上放置待用。電轉(zhuǎn)每管取GS115感受態(tài)80n1，分別加入5-20yg線性化的DNA(于5-10ulTE中)，小心混勻，加入電轉(zhuǎn)化杯(電極間距0.2cm)，冰浴5分鐘后，使用MicroPulserTM電轉(zhuǎn)化儀(Bio-Rad)轉(zhuǎn)化。電極化后的細胞加200lU冰冷的lMD-山梨醇，混勻后鋪于RDB平板，3(TC倒置培養(yǎng)35天。3)eg(55-a、eg65-6以及eg65-c在尸.pa^o/is中的表達挑取單克隆于2mlYPD培養(yǎng)基中，30'C過夜培養(yǎng)，一部分保存甘油菌，一部分以l:500比例接種于25mlBMGY培養(yǎng)基中，30。C培養(yǎng)至OD60(N2-6。1500g離心10min，收集下來的菌體重懸于100mlBMMY培養(yǎng)基中，30'C誘導(dǎo)表達4天，每天補加甲醇至終濃度0.5%。然后4。C，15000g離心15分鐘，收集培養(yǎng)基上清待分離純化用。17GTICCIGAYGGIAAYGGNTTYCC(SEQIDNO:13)CACAACGAGGTRGCCTGCGACTACAA(SEQIDNO:14)GCGCTCGGGCAAACTTCCGGCCAACAA(SEQIDNO:15)ATGTTCTCGCTAGTCTTGTGGGCGGGGC(SEQIDNO:16)ATGTTCTCGCTGGTCCTGTGGGCGGTGC(SEQIDNO:17)ATGTTCTCGTTAGTCGTGTGGGCGGCGC(SEQIDNO:18)CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTT(SEQIDNO:19)CYRAAYTTNACRTGRTCNCCNGCRTC(SEQIDNO:20)TTGACCACCCAGCCCATGACGGT(SEQIDNO:21)GCTCAAGGGGCTGCCCCATGGTA(SEQIDNO:22)CATTCAGAATGACTGCAAACTATGTAGC(SEQIDNO:23)ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC(SEQIDNO:24)FFFFFFXRRRR<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(2.5)重組蛋白EG65-a，EG65-b以及EG65-c的純化(M柱純化)離心后的培養(yǎng)基上清，用1MTris調(diào)pH至7.5-8.0后，上Ni柱，先用20mMTris-HCl，0.5MNaCl，pH7.5的結(jié)合緩沖液洗脫，然后再20mMTris-HCl，0.5MNaCl，20mM咪唑，pH7.5的洗滌緩沖液洗脫，最后用含20mMTris-HCl,0.5MNaCl，200mM咪唑，pH7.5的洗脫緩沖液洗脫。洗脫下來的組份實施例l的"CMC-Na水解活力測定"方法，50°C，2h測活并且經(jīng)SDS-PAGE分析之后，收集對應(yīng)于SDS-PAGE上顯示均一的活性組份，對50mMNaAC-HAC，pH5.2緩沖液透析之后，用UltrafilterPM10超濾管濃縮以備下面性質(zhì)分析用。(2.6)性質(zhì)分析1)最適溫度、最適pH最適pH:在pH2.5-7.5，100mMC6H807(檸檬酸)/Na2HPCV2H20的l。/。CMC-Na中進行；最適溫度在20'C到70'C范圍內(nèi)測定；方法與實施例l的"CMC-Na水解活力測定"相同，只是酶反應(yīng)的時間長短不同。2)底物特異性不同的底物CMC-Na(l。/。,中等粘度)、0.9mg/mlpNPC、Sigmacell101(1%)、AvicelpH101(l%)、樺樹木聚糖(1%)、燕麥木聚糖(1%)、淀粉(0.5%)、卩-水楊素(0.5%)分別按照實施例l所述方法測活，不同的是酶反應(yīng)的時間。3)溫度以及pH對酶穩(wěn)定性的影響溫度穩(wěn)定性酶在50。C保溫不同的時間或者在不同溫度保溫lh后，50°C，30min按標(biāo)準(zhǔn)方法測活。pH穩(wěn)定性酶于不同pH值的廣泛pH緩沖液中5(TC保溫15min或者3(TC保溫20h之后，50°C，30min按標(biāo)準(zhǔn)方法測活。(2.7)福壽螺卵巢組織基因組DNA抽提取新鮮福壽螺卵巢組織lOOmg，用Trizol試劑按照GIBCOBRL的總DNA分離Protocol抽提得到卵巢組織的總DNA。(2.8)福壽螺eg(55-fl、eg65-6以及eg(55-c的基因組片段擴增選取引物F5和R2，以福壽螺卵巢基因組DNA為模板，選用La-Taq擴增系統(tǒng)，94°C，5min;94°C，lmin;55°C，45s;72°C，7min，30輪；72°C，lOmin，PCR擴增得到的片段膠回收后與pMD18-T載體16'C連接4h，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH12S。挑克隆，菌體PCR以及酶切鑒定之后，測序。2.結(jié)果(1)EG65N-端及其中間部分氨基酸序列測定EG65經(jīng)Edman降解法測定得到N-末端序歹U為VSVPDGNGFPATTRVAN。用V8蛋白水解酶對EG65進行酶解，選取酶解產(chǎn)生的14kD肽段測其N-末端序列，結(jié)果顯示的順序為AQRSGALPAN。這段序列與來自鮑魚(BAC67186，//a//o&cfocw)164173區(qū)域的序列具有90。/。的同源性(見K.Suzuki等，同上)；與鼻白蟻(BAA33708,iV麵,"eA"畫滅畫go冊h)的3342區(qū)域(G.Tokuda，N.Lo，H.Watanabe,M.Slaytor,T.Matsumoto,H.Noda,Metazoancellulasegenesfromtermites:intron/exonstructuresandsitesofexpression,BiochimBiophysActa.1447(1999)146—159)以及鰲蟲下(AAD38027，C/ierax《Mac/n'can'"WM"的5362區(qū)域(K.A.Byrne等，同上)分別具有80%和70%的同源性，并且對比的這三個葡聚糖內(nèi)切酶均屬于糖苷水解酶第九家族。(2)福壽螺eg65-a、eg65-6以及eg65-ccDNA的克隆1)核心序列的克隆根據(jù)N-端氨基酸序列VPDGNGFP以及對第九家族保守序列，尤其是對鮑魚，鰲蝦葡聚糖內(nèi)切酶等序列分析得到的序列DAGDHVKFG，分別設(shè)計兼并引物F1和R1,PCR擴增，經(jīng)測序得到一段552bp的序列(圖5)，即核心序列，其中包括EG65經(jīng)V8蛋白水解酶水解產(chǎn)生的14kD肽段的N-末端序列。2)5'-RACE和3'-RACE在PCR擴增核心序列的同時，根據(jù)第九家族保守序列，尤其是對鮑魚，鰲蝦葡聚糖內(nèi)切酶的序列分析得到的另一段保守序列HNEVACDYN，設(shè)計引物F2與根據(jù)cDNA文庫載體序列設(shè)計的引物入C進行PCR擴增，測序后得到一段尾部序列(a);然后如圖6所示，設(shè)計特異性的引物R2，F(xiàn)3，分別與根據(jù)cDNA文庫載體序列設(shè)計的引物入N和入C進行PCR擴增，經(jīng)測序分別得到3段(記為al，bl,cl)不同的且具有較高同源性的前半部分序列和l段尾部序列(b)。3)全長cDNA的克隆根據(jù)5'-RACE得到的3段前半部分序列分別設(shè)計引物F4，F(xiàn)5和F6;另外根據(jù)3'-RACE得到的2段序列設(shè)計引物R3和R4。F4與R3，F(xiàn)5與R3，F(xiàn)6與R4分別進行PCR擴增，得到的PCR片段測序后，分別得至U3個不同的基因"^eg65-a、eg65-6和eg65-c(SEQIDNO:1、3和5)。(3)EG65-a、EG65-b和EG65-c的蛋白序列分析l)序列相似性分析eg65-a、eg65-6和eg65-c的開放閱讀框分別編碼713、723和722個氨基酸，利用ClustalW序列分析軟件(http:〃www.ebi.ac.uk/elustalw/)對這三個序列進行分析，結(jié)果顯示它們相互之間的同源性分別達到89%，88%和87%(見下表和圖7)。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>將得到的EG65-a、EG65-b和EG65-c用保守結(jié)構(gòu)域搜索軟件(ConservedDomainSearch,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析，發(fā)現(xiàn)它們均與糖苷水解酶第9家族催化結(jié)構(gòu)域有相當(dāng)高的序列相似性，因此歸屬于糖苷水解酶第9家族(GHF9)。將EG65-a的氨基酸序列與糖苷水解酶第10家族的其它成員比較發(fā)現(xiàn)，來自福壽螺的葡聚糖內(nèi)切酶與另一種軟體動物鮑魚的同源性可以達到49c/。(見K.Suzuki等，同上)，與兩種不同來源的白蟻(NakashimaK，WatanabeH,SaitohH，TokudaG,AzumaJI.Dualcellulose-digestingsystemofthewood-feedingtermite,CoptotermesformosanusShiraki.InsectBiochemMolBiol.2002M;32(7):777-84;LiL,FrohlichJ,PfeifferP,KonigH.Termitegutsymbioticarchaezoaarebecominglivingmetabolicfossils.EukaryotCell.2003Oct;2(5):1091-8)以及鰲蟲下(K.A.Byrne等，同上)的同源性分別達52%，51%以及46%(見下表和圖8)。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>另外，EG65-c除含有一個明顯第9家族催化結(jié)構(gòu)域外，還含有一個屬纖維素酶第n家族的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD);而EG65-a,EG65-b則不含明顯的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖9)。2)糖基化分析分別用0-糖基化預(yù)測軟件NetOGlyc3.1Server(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)以及N-糖基化預(yù)測軟件NetNGlyc1.0Server對EG65-a、EG65-b和EG65-c的糖基化情況作了分析圖10A-10F)，結(jié)果表明EG65-a125位的Thr;EG65-b125，130，131,139，140，146，150位的Thr以及EG65-c130，139，145位的Thr均為可能的0-糖基化位點。另夕卜，EG65-a序列中N-糖基化的可能性:183，232位Asn大于97，154，188，190，211，246，251，266，305，373，469，472，667位Asn，其中251和472位Asn位于Asn-XAA-Ser/Thr序列中。同樣，EG65-b:37，194，243，277位Asn〉79，83，165，199,211,222，257，262，479，482，677位Asn，其中262和482位于Asn-XAA-Ser/Thr序列中。EG65-c:200，210位Asn>82，164，198，220，276，382，478，481，676位Asn;其中481位于Asn-XAA-Ser/Thr序列中。3)信號肽分析從全長cDNA對應(yīng)的蛋白序列和分泌到福壽螺胃液中的蛋白，即成熟蛋白N-末端測序得到的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，EG65-a較其相應(yīng)的成熟蛋白EG65多了137個氨基酸殘基。而EG65-b和EG65-c蛋白相對應(yīng)的成熟蛋白N-末端序列可能分別為LTVPDGNGFPAT和LSVPDGNGFPAT(分別與蛋白測序得到的N-末端序列VSVPDGNGFPAT相比較之后推測)，這樣，EG65-b和EG65-c分別較成熟蛋白多了148和147個氨基酸殘基。但蛋白質(zhì)信號肽的長度一般為20-30aa，為了確定這3個蛋白的信號肽，用SignalP3.0Server信號肽序列預(yù)測軟件對EG65-a，EG65-b和EG65-c可能的信號肽剪切位點作了預(yù)測(圖llA-llC)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們最可能的剪切位點均在第16和17位氨基酸殘基之間。這也說明了這3蛋白很有可能在分泌到胞外之后又進一步被剪切掉了100多個氨基酸殘基。(4)EG65-a、EG65-b和EG65-c在甲醇酵母中的表達及純化由上面的信號肽預(yù)測軟件分析我們可以知道，這3個蛋白N-端都含有16個氨基酸的信號肽，因此我們對每個蛋白質(zhì)設(shè)計兩條正向引物，一條反向引物，一對引物PCR得到的是去掉N-端16個信號肽序列的開放閱讀框，另一對PCR得到的是成熟蛋白對應(yīng)的序列；另外，為了純化重組蛋白的方便，我們在設(shè)計正向引物的同時，引入了6個His的密碼子。分別構(gòu)建表達質(zhì)粒，經(jīng)測序正確之后，電轉(zhuǎn)到甲醇酵母GS115中，然后甲醇誘導(dǎo)表達。將誘導(dǎo)表達所得到的蛋白分別對應(yīng)的命名為EG65-a-16，EG65-a-137;EG65-b-16,EG65-b-148;EG65-c-16，EG65-c-147。用不含插入基因的質(zhì)粒pPIC9K為對照組，發(fā)現(xiàn)甲醇誘導(dǎo)4天時，上清中葡聚糖內(nèi)切酶的活力達到最高，因此取誘導(dǎo)4天的培養(yǎng)基4。C，15000g，15min離心后的上清用lMTris調(diào)pH后過Ni柱來純化蛋白，純化結(jié)果見圖12。其中EG65-b-16和EG65-b-148重組蛋白的活力相對最高且水解底物CMC-Na的相對活力相當(dāng)，分別為6.67IU/mg和6.45IU/mg。對于EG65-a-16，EG65-a-137和EG65-c-16,EG65-c-147這兩組重組蛋白，分別是EG65-a-137和EG65-C-147的活力要高于EG65-a.16和EG65-C-16。而EG65-a-16和EG65-C-16只表現(xiàn)出極其微弱的水解CMC-Na的活力。另夕卜，雖然是在甲醇酵母中誘導(dǎo)表達的，但是從SDS-PAGE電泳圖上我們可以看出，重組蛋白并沒有發(fā)生很嚴(yán)重的糖基化現(xiàn)象。(5)性質(zhì)分析l)最適溫度和最適pHa.EG65-b-16和EG65-b-148以CMC-Na為底物，從圖13A和13B可以看出，EG65-b-16和EG65-b-148的最適反應(yīng)溫度和最適pH曲線走勢相似。其最適溫度均為50'C，與從福壽螺胃液中得到的組織酶EG65的最適溫度相似。當(dāng)溫度高于50'C或者低于5(TC時，酶的活力很快下降(圖13A)。其最適pH均在pH5.5-6.5之間，在此范圍之外，酶的活力明顯下降，并且在pH2.5-4.5之間，酶的活力很弱，其相對活力均〈20。/。(圖13B)。b.EG65-a-137和EG65-c-147EG65-a-137的最適溫度為50。C，當(dāng)溫度升高5。C到55"時，EG65-a-137的活力迅速下降至<20%。而EG65-e-147的最適溫度則為40'C，當(dāng)溫度升高時，酶的活力迅速下降，到5(TC時，酶的活力下降至18%左右，當(dāng)溫度升高至7(TC，EG65-c-147幾乎完全喪失活力(圖14A,B)。EG65-a-137和EG65-c-147的最適pH見圖14C、D，它們的最適pH分別為5.5-6.5和5.5。在此范圍之外，活力很快下降。2)底物特異性不同結(jié)構(gòu)的多糖，如CMC-Na、pNPC、樺樹木聚糖、燕麥木聚糖、e-水楊素、Sigmacell101、AvicelpH101以及淀粉等作為底物來檢測6種不同的重組酶的底物特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們與從福壽螺胃液中得到的組織酶EG65相似，除CMC-Na之外，對其它底物均無水解活性。而對葡聚糖內(nèi)切酶的底物CMC-Na而言，EG65-b-16和EG65-b-148的水解活力最高且相對活力相當(dāng)，EG65-a-137和EG65-c-147的水解活力次之，而EG65-a-137和EG65-c-147對應(yīng)的只去掉16個氨基酸殘基，即信號肽的重組蛋白EG65-a-16和EG65-c-16，僅僅能檢測到極其微弱的水解CMC-Na的能力。因此它們屬于典型的葡聚糖內(nèi)切酶。3)溫度和pH對EG65-b-16和EG65-b-148穩(wěn)定性的影響將酶溶液在5(TC保溫不同的時間后測殘留的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種酶隨保溫時間的變化，相對酶活力的變化趨勢相同。但相對而言，EG65-b-16較EG65-b-148稍稍穩(wěn)定一些。5(TC保溫180min之后，EG65-b-16還殘留約60%的活性，而EG65-b-148則只剩余約35%的活性(圖15A)。但是，將酶在不同溫度保溫lh之后，發(fā)現(xiàn)這兩種均在20-40。C的范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，當(dāng)溫度高于4(TC時，酶的活力迅速下降，當(dāng)溫度升到6(TC時，酶的活力基本為0;同樣，我們從圖15B中可以看出，EG65-b-16較EG65-b-148的熱穩(wěn)定性要稍稍好一些。pH穩(wěn)定性實驗表明，5(TC保溫15min之后，活力有很明顯的變化在pH5.5-6.5范圍之間，EG65-b-16和EG65-b-148的酶活力達到最高；在此范圍之外，酶水解CMC-Na的活力就明顯下降，至lJpH3.5禾卩pH7.5時，這兩個酶基本失活(圖16A)。但EG65-b-16和EG65-b-148在不同pH條件下30'C保溫20h之后，從圖16B可以看出，兩者的穩(wěn)定pH范圍均很廣，最穩(wěn)定pH均為pH9.5，但是EG65-b-148在此條件下的pH穩(wěn)定性較EG65-b-16好。EG65-b-148在pH4.5-10.5仍保留有>70%的活力，而EG65-b-16達到〉70。/。相對活力的pH范圍為pH7.5-10.5。(6)eg65-c對應(yīng)的福壽螺基因組片段的擴增為了進一步驗證從福壽螺胃組織cDNA文庫中得到的eg(55-a、eg65-6和eg(55-c三個基因來源于福壽螺自身，我們以F5和R2為引物，用福壽螺卵巢抽提出的基因組DNA為模板，PCR擴增，測序，得到一段長約1.6kb的片段(SEQIDNO:7)，Blast之后發(fā)現(xiàn)，這段序列是包含4個內(nèi)含子的eg65-c的部分基因組序列，內(nèi)含子的剪切位置分別在176bp，296bp,370bp和442bp之后。上述實驗進一步驗證了這三個基因是來源于福壽螺本身，而非其體內(nèi)的腸道微生物所產(chǎn)生。實施例4:EG65蛋白的多態(tài)性分析本實施例討論福壽螺纖維素酶的多態(tài)性，分析引起其多態(tài)性的可能的原因。1.材料、試劑和方法(1)材料試劑雙向凝膠電泳系統(tǒng)購自AmershamBiosciences;凝膠掃描成像系統(tǒng)(D2000Uniscansc咖er)購自TsinghuaUniscan;脫色搖床(TY-20型)購自西巴斯；Voyager-DESTRMALDI-TOF質(zhì)譜儀購自PerSeptiveBiosystems,Framinham,MA;胰蛋白酶(sequencing-grademodifiedtrypsin)購自Promega;葡聚糖內(nèi)切酶為實施例l所得；EG65-b-148為實施例3所得；其它試劑和材料見實施例1和3。(2)方法(2.l)雙向凝膠電泳雙向電泳的方法主要根據(jù)AmershamBiosciences的儀器使用手冊(T.Berkelman,T.Stenstedt,2-Delectrophoresis:usingimmobilizedpHgradients;principlesandmethods,Uppsala,Sweden:AmershamBiosciences.(1998))和G6rg等改進的方法(A.G6rg,C.Obermaier,G.Boguth,A.Harder,B.Scheibe,R.Wildgruber,W.Weiss,Thecurrentstateoftwo-dimensionalelectrophoresiswithimmobilizedpHgradients,Electro-phoresis.21(2000)1037-1053)。IPG-IEF在IPGphor等電聚焦系統(tǒng)上進行。等電聚焦后，IPG膠條在15ml的平衡液中平衡兩次，每次15min(G6rg等，同上)。SDS-PAGE在EttanDALTtwelve系統(tǒng)上進行。雙向電泳后，分析型的電泳凝膠利用Yan等改進的硝酸銀染色方法進行染色(J.X.Yan，R.Wait,T.Berkelman,R.A.Harry,J.A.Westbrook,C.H.Wheeler,M.J.Dunn,Amodifiedsilverstainingprotocolforvisualizationofproteinscompatiblewithmatrix-assistedlaserdesorption/ionizationandelectrosprayionizationmassspectrometry,Electophoresis.21(2000)3666~3672)，制備型的電泳凝膠利用Neuhoff等的考馬斯亮藍染色方法進行染色(V.Neuhoff，N.Arold，D.Taube，W.Ehrhardt，ImprovedstainingofproteinsinpolyacrylamidegelsincludingisoelectricfocusinggelswithclearbackgroundatnanogramsensitivityusingCoomassieBrilliantBlueG-250andR-250,Electrophoresis.9(1988)255—262)。(2.2)MALDI-TOF多肽質(zhì)量指紋圖譜分析用來進行MALDI多肽質(zhì)量指紋圖譜分析的蛋白質(zhì)取自考馬斯亮藍G250染色24小時的制備型凝膠。用切點儀(TheGelCompany,USA)切取目標(biāo)蛋白質(zhì)點，每個膠片被切成lmm3得膠塊然后放到0.65ml硅烷化的EP管中，膠內(nèi)酶解的方法是根據(jù)Shevchenko等(A.Shevchenko,M.Wilm,O.Vorm，M.Mann,Massspectrometricsequencingofproteinssilver-stainedpolyacrylamidegels,AnalChem.68(1996)850~858)的方法進行。胰蛋白酶酶解的樣品用Voyager-DESTRMALDI-TOF質(zhì)譜儀在延滯抽提線性正向模式下進行分析。(2.3)eg<55-W、62、W以及eg(55-c/、c入c3、"基因的克隆(eg65-W即eg65-6，eg<55-c/即eg65-c)方法與實施例3所述的方法相同。通拉時F4、F5、F6分別與R3和R4組成引物對，以福壽螺胃組織cDNA文庫為模板，94°C，5min;94°C，30s;60°C，30s;72°C，2min30s，30輪;72°C，lOminPCR擴增，測序，得到eg65-W、W、W以及eg65-c/、c2、d、"基因。2.結(jié)果(1)EG65蛋白的多態(tài)性為了證明福壽螺胃液中的葡聚糖內(nèi)切酶是否也具有蛋白多態(tài)性，取SDS-PAGE上顯示一條帶的EG65進行雙向凝膠電泳，結(jié)果呈現(xiàn)的是分子量相似而等電點不同的一串點(圖17A)，這表明EG65至少在等電點不同方面具有蛋白多態(tài)性。為了進一步驗證這些點是否屬于不同翻譯后修飾的同一個核心蛋白，隨機取雙向電泳凝膠上的6個點用MALDI-TOF多肽質(zhì)量指紋圖譜進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這六個點的多肽質(zhì)量指紋圖譜很相似，這暗示了這些點很可能是屬于同一個核心蛋白或者是同源性很高，即氨基酸序列幾乎相同的多個蛋白(圖17B)，如整聯(lián)蛋白e-3(Integrinbeta3)的多態(tài)性只表現(xiàn)在第33位氨基酸是Leu還是Pro(VijayanKV,LiuY，SunW,ItoM,BrayPF.ThePro33isoformofintegrinbeta3enhancesoutside-insignalinginhumanplateletsbyregulatingtheactivationofserine/threoninephosphatases.JBiolChem.2005Apr11),因此不會對這兩種異構(gòu)體的多肽質(zhì)量指紋圖譜造成太大的差別一樣。(2)eg65-W、W、W以及eg65-c/、c2、c3、"基因序列以及蛋白序列分析以F4，F(xiàn)5，F(xiàn)6與R3或R4為引物，分別從福壽螺胃組織cDNA文庫中得到了同源性很高的eg(55-a(SEQIDNO:1)、eg65-W(SEQIDNO:3)、62(SEQIDNO:8)、W(SEQIDNO:9)以及eg65-c/(SEQIDNO:5)、c2(SEQIDNO:10)、c3(SEQIDNO:11)、"(SEQIDNO:12)三組基因。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，除這三組蛋白之間具有很高的同源性之外，eg65-b和eg65-c這兩組蛋白編碼的氨基酸序列相互之間的同源性可高達98y。以上(圖18A、B)。與EG65葡聚糖內(nèi)切酶的N-末端序列相比較發(fā)現(xiàn)，這三組蛋白可能具有相同或極其相似的成熟蛋白N-末端。另外，用蛋白質(zhì)初級結(jié)構(gòu)分析軟件ProtPar咖(http:〃www.expasy.ch/tools/protparam.html)予頁觀!J了eg65-a,eg65-W、62、63以及eg65-"、c2、d、c4l碼的成熟蛋白的分子量以及對應(yīng)的理論等電點的大小(見下表)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些成熟蛋白的分子量極其相似，而等電點卻不同，這與組織酶EG65進行雙向凝膠電泳得到的結(jié)果很相似，另外，這也與能夠與組織酶EG65的多肽質(zhì)量指紋圖譜相對應(yīng)。從而進一步證明了這種蛋白多態(tài)性的原因可能是由于蛋白序列的微觀不同造成的。采用ProtParam獲得的分子量和理論pI預(yù)測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>為了證明真核生物中翻譯后修飾很容易引起蛋白的多態(tài)性，將含有eg(15-6-WS基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到甲醇酵母尸.戸加r/s之后表達出的重組蛋白EG65-b-148經(jīng)Ni柱純化，SDS-PAGE上顯示的是像"雙眼皮"樣的挨得很近的兩條帶(見實施例3)，雙向凝膠電泳圖上呈現(xiàn)的是分子量很相近的而等電點不同的一串點(圖19)，這充分證明了EG65-b-148存在蛋白多態(tài)性，并且造成這種多態(tài)性的原因是翻譯后修飾的不同。軟體動物福壽螺體內(nèi)含有大量的翻譯后修飾系統(tǒng)，并且組織酶EG65經(jīng)熒光酰肼染色之后發(fā)現(xiàn)是一個糖蛋白(見實施例2)，并且雙向電泳圖譜上呈現(xiàn)的也是一串點(圖17A)，因此造成福壽螺纖維素酶多態(tài)性的另一個原因可能是翻譯后修飾。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表aio>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院浙江理工大學(xué)〈120〉新的纖維素酶及其應(yīng)用<130〉065777<腸32<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211>2142<212>DNA<213〉福壽螺(AmpuUariacrossean)<400>1atgttctcgctagtcttgtgggcggggctcccgctcctggtcttgagcagcgtcactgta60cccgtcaccasccattggccgggtggattccaggcaaaagtctgtttcactatcgacaaa120gagatgacttcUgggtcgtcgatcttgtcttcgatcaccctgtggacacactgagcctg180tggacggccgatgcgaagagcaccagcgcagacaagacgaaatggacgctgaccagcaag240acgtgg肪ctcccaggagcatgtgggagatgagctgtgcatcgatatcaatggccaaggt300agcggtgatgactggcgtgttgtaaaagccaccctggaaggagcagc卿tggcgggtca360taccaagtcgttax:aagcgcccctctcccaccaggtgtctctgcagctccagtgtctgtc420cccgacggaaacggtttccccgcc3ccaccagagtcgccaacgtcagggacgggctgtcg480gagcagtggctgaccttcaccatcaccggccccaccgtcatgggctgggtggtcaagttc540cgctgcaacaagccagtcacc犯cctc幼cgtggcagatgccgacgccctC3gCC3C犯C600gccgacatgacggagtggctgctggtgaacaacgacaacaagatcgccctcaaggcggga660accttggagatgaagattgaagtcaagctggtgaatgtccacgactcagcccctcagtgc720tcggcgatcctcatcaacatgggggtagataactacacctgcggcgagct780gccaactccagigtacaactacgacgaccttctgtacaaatccatcttgttctscgaggcg840cagcgctcgggcaaacttccggcc肌caaccgcatcccctggcgaggcgactccgccctc900aacgaccacggcaatgccggcgaggacttgactggcggctggtacgacgcgggagacttc960gtcaagttcaacttccccatggcctggtcaacggccgtcttgacctggggCttgCtgC3g1020ttcaaggacgcctaccaggccgcaggtcagctggagtggatgtacgagagcatcaagtgg誦ccgctggactacctgctcaagtgtcacgtgtctgacaacgtgctgtacgtgcaggtgggt1140g3tgg3ggtgtggaccacggatcatgggggagacccgaggacatgaagatggccagaccc1200gccttcaagatcgacgccagcaaacccggatctgaagttgccatggaaacagcagctgcc1260ttcgcggctggacatttggcttttaaagaaaaagatccgtcatactcagccaaactgctg1320caacatgccaagtcgctgtggcagttcgctgtcacacacaagggcaagtacagtgacagt腦gtgtcagctgctgccggctactacaattccgccaacgtcacggacgagttgtgctggggg1440tcgctgtggttgtacaaggccaccaaggaacccaagtacctggaggaggccctcaagcac1500tatgatgcttctcccgactggggcatgtcctgggacgatgtcttcatcggcaatcaggtg1560tcgctgtacgggaggccaagtacaaagcagctgtagagggcaccttcaag1620gagtggttccCtggtggg3Ctgtcccctacacccctaagggtctggcgt3cagactgcag1680tggggcgccctacggtacgcatccaacatggctatggccgcgctgatggctgc柳agcgmoggtatccacccggacgagt3tcgccactgggccatgtgtcagatccactacgccctgggg1800gacactggccgcagctttgtcgtgggttttggcaaaaatccacccgtcagtcctcaccac1860cgctctagctcctgccccaacctacctgtgcggtgtaacatgaactacctccacctggac1920accccc犯cactcacatgctgtgcggggcgctggtgggtggccccgat.agctcggatggt1980tacaagg3cagccgcgagaactacgtcaacaacgaggtggcctgcgactacaacgccggc2040ttccagacagccgtggccggtcttcgctcgctgctgatcagacacctgcatcccgagcag2100犯gggcggcgccacgtgtccctaccatggggcagcccctt2142<210〉2<211〉713<212〉〈213〉福壽螺(Ampullariacrossean)<400〉2MetPheSerLeuLeuTrpAlaGlyLeuProLeuLeuValLeuSer151015SerValThrValProValThrAsnHisTrpProGlyGlyPheGinAla202530LysVaiCysPheThrlieAspLysGluMetThrSerTrpValValAsp354045LeuValPheAspHisProVaiAspThrLeuSerLeuTrpThrAlaAsp505560AlaLysSerThrSerAlaAspLysThrLysTrpThrLeuThrSerlys65707580ThrTrpAsnSerGinGiuHisValGlyAspGluLeuCyslieAsplie859095AsnGlyGinGlySerGlyAspAspTrpArgValValLysAlaThrLeu100105110GluGlyAlaAlaAspGlyGlySerTyrGinValValThrSerAlaPro115120125LeuProProGlyValSerAlaAlaProValSerValProAspGlyAsn<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>atgttctcgccccgtcaacagacat.gagt.ttggacggccagagtggaacggacggagatacaccaagttagctgaacctcaccagagtcgggccccaccgcacgtggcagctggtgaatggataactacagtcctgtacaaaccgcatccacaggcgggtacggccatctctgg叫tggatctgatgacgagacccgaggtccgaagUgaaagatccgcgtcacacacagtcaacgtcacccaagtacctgggacgatgtacaaagcagacccctaagggctatggccggccatgtgtcggc^a貼tccggtgt.aacactggtgggtg犯cgaggtggctgttgctasgcagcccctttggtcctgtg3CC3CtgggCcctgggtcatcagtggagcatcgcgcctgtttacaagtgcagcctacagcccaacgtcagtcatgggctgatgccgacgcacaagatcgctccaagactccctgcggcgaggtatgacgctgaactggggtgtacgagagtgctgtacgtccatggaaaccatactcagcagggcaagtacagacgagtttggaggaggctcttcatcggctgtggaggggtctggcgtacgctgatggcagatccactacacccgtcagtgaactacctgccccgatagcctgcgactaggaacctgcaggcggtgctaccgctcttgggctttggcaggggtggattccaggctagagtctgctttaaccatctggctUcgatcaacctgtacagaccaccagcgcggacaagaaggaatggtcgcttgtcggggacgagctgtgcaUgacctcatgatcacagccaccctggagggagcggaaggaccccgcaccacagtcaacctccctccaggcccattgactgtccccgacggaaacggtttggctgaccttacaagccagttgacggagtgcatcactgtacatcgacaagccttgatgtggactaacaaggggtcacggcggtggtcaagcctcagccaccctcaaggcgagcccctcaggctacccaacgttctac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