專利名稱：硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因及其用途，特別涉及制造香味穩(wěn)定性 優(yōu)異的酒精飲料的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料及其制造方法等。更
具體地說，本發(fā)明涉及通過控制編碼釀造酵母的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白Sul2p的 基因SUL2、特別是啤酒酵母中特征性的non-ScSUL2基因的表達(dá)量，從而控制對 產(chǎn)品香味穩(wěn)定化起作用的亞硫酸鹽生成能力的酵母及使用該酵母的酒精飲料的 制造方法等。
背景技術(shù)：
亞硫酸鹽作為抗氧化作用強的化合物而為人所知，作為抗氧化劑在食品、 飲料、醫(yī)藥品等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用(例如日本特開平06-040907號公報、日本特 開2000-093096號公報等)。酒精飲料中亞硫酸鹽也被作為抗氧化劑利用，例如， 由于對需長時間陳釀的葡萄酒的質(zhì)量保證起重要作用，所以，日本國內(nèi)厚生勞 動省許可添加到殘留濃度為350ppm以下。已知在啤酒釀造中，保質(zhì)期的變化依 賴于產(chǎn)品中含有的亞硫酸鹽濃度，所以增加此物質(zhì)的含量在香味穩(wěn)定性等方面 非常重要。
使產(chǎn)品中亞硫酸鹽含量增大的最簡單的方法是添加亞硫酸鹽，但此時亞硫 酸鹽會被作為食品添加劑對待，在商品開發(fā)的自由度及消費者對食品添加劑所 存在的負(fù)面印象等上會成為問題。
酵母在自身生命活動中可生物合成必需的含硫化合物，亞硫酸鹽作為其中 間代謝產(chǎn)物被生成。因此，通過利用酵母的這種能力，可不由外部添加亞硫酸 鹽而使產(chǎn)品中亞硫酸鹽的含量增加。
使釀造過程中發(fā)酵液中的亞硫酸鹽濃度上升的方法有l(wèi))通過過程控制的方
法和2)通過酵母育種的方法。通過過程控制的方法，是指因釀造過程中亞硫酸 鹽的生成與初期供氧量成反比，所以減少向發(fā)酵液中的供氧量，可使亞硫酸鹽 的生成量增加，同時抑制其氧化。
而通過酵母育種的方法是利用基因操作技術(shù)的方法。酵母硫代謝中的亞硫 酸鹽是生物合成含硫氨基酸、含硫維生素的中間體。從細(xì)胞外吸收的硫酸根離 子經(jīng)3步反應(yīng)，亞硫酸鹽被還原、生成。
在此，MET3基因是編碼催化第1反應(yīng)的酶的基因，MET14基因是編碼催化 第2反應(yīng)的酶的基因。C. Koixh等進(jìn)行了通過使上述2個基因的表達(dá)量增加來提 高酵母的亞硫酸鹽生成能力的嘗試，并證明MET14更有效(C. Korchetal.， Proc. Eur. Brew. Conv. Conger., Lisbon, 201-208， 1991:非專利文獻(xiàn)1)。另外， J. Hansen等進(jìn)行了通過破壞編碼亞硫酸鹽根離子還原酶的MET10基因，防止生 成的亞硫酸鹽根離子還原，從而使亞硫酸鹽生成量增加的嘗試(J. Hansen et al.， Nature Biotech. ， 1587-1591， 1996:非專利文獻(xiàn)2)。
并且，藤村等進(jìn)行了如下嘗試，即通過提高編碼酵母的亞硫酸鹽根離子排 出泵的SSU1基因中、特別是啤酒酵母中特有的non-ScSSUl基因的表達(dá)量，從
而促進(jìn)菌體內(nèi)生成的亞硫酸鹽向菌體外排出，使啤酒中亞硫酸鹽濃度增加(藤 村等、2003年度日本農(nóng)藝化學(xué)會年次大會要旨集、159、 2003:非專利文獻(xiàn)3)。

發(fā)明內(nèi)容
盡管如此，為了改良酵母釀造的酒精飲料的保質(zhì)期和香味穩(wěn)定性，需要新 的方法和原料來提高酵母生成的亞硫酸鹽的量。如上所述，使產(chǎn)品中亞硫酸鹽 含量增大的最簡單的方法是添加外源的或非酵母產(chǎn)生的亞硫酸鹽，但近年來， 消費者更熱衷于希望最低量地使用食品添加劑，即不添加食品添加劑而是使用 天然原料。因此，急需不通過由外部添加亞硫酸鹽而成功地達(dá)到對香味穩(wěn)定性 有效的亞硫酸鹽濃度。但是，上述通過過程控制的方法由于供氧不足會降低酵 母的增殖速度，引起發(fā)酵延遲及品質(zhì)下降，所以未必實用。
另外，有文獻(xiàn)報道了利用基因操作技術(shù)進(jìn)行的酵母育種中，主要以與從硫
酸根離子向亞硫酸鹽根離子的還原反應(yīng)有關(guān)的基因組作為目標(biāo)，其中有達(dá)到親
株10倍以上的亞硫酸鹽濃度的結(jié)果(J. Hansen et al. ， Nature Biotech., 1587-1591， 1996)。但另一方面，也出現(xiàn)了發(fā)酵延遲、不受歡迎的香味成分乙醛 及1一丙醇的增加，所以作為實用酵母還存在著問題。因此，非常希望能有既不 影響發(fā)酵速度和產(chǎn)品質(zhì)量，又能生產(chǎn)充分量的亞硫酸鹽的酵母的育種方法。
本發(fā)明者為解決上述課題不斷銳意研究的結(jié)果，從啤酒酵母中成功地鑒定、 分離了編碼比已知蛋白質(zhì)更奏效的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白的基因。且制備了將所 得基因?qū)虢湍覆⑹蛊浔磉_(dá)的轉(zhuǎn)基因酵母，確認(rèn)了亞硫酸鹽生成量的增加，從 而完成了本發(fā)明。
即本發(fā)明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因、該 基因編碼的蛋白質(zhì)、該基因表達(dá)得到調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)化酵母、通過使用該基因表達(dá)得 到調(diào)節(jié)的酵母控制產(chǎn)品中亞硫酸鹽生成量的方法等。具體地說，本發(fā)明提供如 下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化酵母、使用 該轉(zhuǎn)化酵母的酒精飲料的制造方法等。
(1)多核苷酸，其選自以下(a) (f)組成的組
(a) 多核苷酸，其含有由序列號1中記載的核苷酸序列組成的多核苷酸；
(b) 多核苷酸，其含有編碼由序列號2中記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì) 的多核苷酸；
(C)多核苷酸，其含有編碼由序列號2中記載的氨基酸序列中缺失、取代、
插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成的、且具有硫酸根離子
轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(d) 多核苷酸，其含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60%以上同一
性的氨基酸序列、且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(e) 多核苷酸，其含有與序列號1中記載的核苷酸序列的互補核苷酸序列 組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋 白質(zhì)的多核苷酸；以及
(f) 多核苷酸，其含有與編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核
苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有硫 酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(2) 上述(1)中所述的多核苷酸，其選自以下(g) (i)組成的組
(g) 多核苷酸，其編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或編碼由 序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1 10個氨基酸后組成 的氨基酸序列，其中所述的蛋白質(zhì)具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性；
(h) 多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90%以上同一性 的氨基酸序列、且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；及
(i) 多核苷酸，其與序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸或序列號1 的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具 有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(3) 上述(1)中所述的多核苷酸，其為由序列號1中記載的核苷酸序 列組成的多核苷酸。
(4) 上述(1)中所述的多核苷酸，其編碼由序列號2中記載的氨基酸 序列組成的蛋白質(zhì)。
(5) 上述(1)所述的多核苷酸，其是DNA。
(6) 多核苷酸，其是選自下述(j) (m)中所述的多核苷酸
(j)編碼與上述(5)中所述多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的核苷酸序 列的RNA的多核苷酸；
(k)編碼通過RNAi作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA 的多核苷酸；
(1)編碼具有特異性切割上述(5)中所述多核苷酸(DNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性 的RNA的多核苷酸；以及
(m)編碼通過共抑制作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA 的多核苷酸。
(7) 蛋白質(zhì)，其由上述(1) (5)中任一項所述的多核苷酸編碼。
(8) 載體，其含有上述(1) (5)中任一項所述的多核苷酸。
(8a)上述(8)中所述的載體，其含有具有以下(a) (c)組成要素的表達(dá)
(a) 在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；
(b) 上述(1) (5)中任一項所述的多核苷酸，其與該啟動子以正義方 向或反義方向相連接；以及
(c) 與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的、在酵母中起作用的信號。
(9) 酵母，其中導(dǎo)入了上述(8)中所述的載體。
(10) 上述(9)中所述的酵母，其通過導(dǎo)入上述(8)中所述的載體增強 亞硫酸鹽的生成能力。
(11) 酵母，其通過導(dǎo)入上述(8)中所述的載體或通過破壞與上述(5) 中所述多核苷酸(DNA)有關(guān)的基因，抑制上述(5)中所述的多核苷酸(DNA) 的表達(dá)。
(12) 上述(9)中所述的酵母，其通過使上述(7)中所述蛋白質(zhì)的表達(dá) 量增加，提高亞硫酸鹽生成能力。
(12)中任一項所述的
其釀造的酒精飲料是麥
其釀造的酒精飲料是葡
項所述的方法制造。 其包括使用根據(jù)具有序 列號1核苷酸序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的核苷酸序列而設(shè)計的引物或探針。
(17a)根據(jù)上述(17)中所述的方法，篩選亞硫酸鹽生成能力強的酵母 的方法。
(13) 酒精飲料的制造方法，其使用上述(9) 酵母。
(14) 上述(13)中所述的酒精飲料的制造方法， 芽飲料。
(15) 上述(13)中所述的酒精飲料的制造方法，萄酒。
(16) 酒精飲料，其用上述(13) (15)中任一
(17) 評價被檢酵母的亞硫酸鹽生成能力的方法，
(17b)使用通過上述(17a)中所述方法篩選的酵母制造酒精飲料(例如
啤酒)的方法。
(18) 評價被檢酵母的亞硫酸鹽生成能力的方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母; 和測定具有序列號1核苷酸序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)量。
(18a)篩選亞硫酸鹽生成能力強的酵母的方法，其包括根據(jù)上述(18) 中所述的方法評價被檢酵母；和篩選硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)量高的酵母。
(18b)使用通過上述(18a)中所述方法篩選的酵母制造酒精飲料(例如 啤酒)的方法。
(19) 酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；對上述(7)中所述的 蛋白質(zhì)定量或測定具有序列號1核苷酸序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá) 量；和選擇具有與目的亞硫酸鹽生成能力相應(yīng)的所述蛋白質(zhì)生成量或所述基因 表達(dá)量的被檢酵母。
(20) 上述(19)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被 檢酵母；測定具有序列號1的核苷酸序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因在各酵母 屮的表達(dá)量；選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比，該基因為高表達(dá)或低表達(dá)的被檢酵母。
(21) 上述(19)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被 檢酵母；對各酵母中的上述(7)中所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量；選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相
比，該蛋白質(zhì)的量較多或較少的被檢酵母。
(22) 酒精飲料的制造方法，其包括使用上述(9) (12)中任一項 所述的酵母或使用通過上述(19) (21)中任一項所述的方法選擇的酵母， 進(jìn)行用于酒精飲料制造的發(fā)酵；和調(diào)節(jié)亞硫酸鹽含量。
根據(jù)使用本發(fā)明轉(zhuǎn)化酵母的酒精飲料的制造方法，因其可使產(chǎn)品中具有抗 氧化作用的亞硫酸鹽含量增大，所以可制造出香味穩(wěn)定性優(yōu)異、保質(zhì)期更長的 酒精飲料，其中所述的轉(zhuǎn)化酵母是通過使用可操作地連接于載體上的亞硫酸根 離子轉(zhuǎn)運蛋白多核苷酸而進(jìn)行轉(zhuǎn)化的。


圖1表示使用SUL2基因高表達(dá)株的啤酒試驗釀造中酵母增殖量的經(jīng)時變 化。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示0D660值。
圖2表示使用SUL2基因高表達(dá)株的啤酒試驗釀造中糖消耗量的經(jīng)時變化。 橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w%)。
圖3表示啤酒試驗釀造終止時醪液中的亞硫酸鹽濃度。
具體實施例方式
在以往公知的增強亞硫酸根離子排出泵的表達(dá)量的方法中，由于菌體內(nèi)不 積累剩余的亞硫酸鹽，所以可保持良好的發(fā)酵速度，但基質(zhì)硫酸根離子的吸收 有可能成為限速因素。因此認(rèn)為通過使酵母吸收硫酸根離子的能力增大，可更 高效地生成亞硫酸鹽。本發(fā)明者基于此種設(shè)想，不斷研究，基于用日本特開 2004-283169中公開的方法解讀的啤酒酵母基因組信息，分離、鑒定了編碼啤酒 酵母特有的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白的non-ScSUL2基因。該基因的核苷酸序列如序 列號l所示。由此基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列號2所示。
1.本發(fā)明的多核苷酸
首先，本發(fā)明提供(a)多核苷酸，其含有由序列號l中記載的堿基序列組 成的多核苷酸；及(b)多核苷酸，其含有編碼由序列號2中記載的氨基酸序列 組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。所述多核苷酸為DNA或RNA。
作為本發(fā)明對象的多核苷酸，不只限于編碼來自上述啤酒酵母的硫酸根離 子轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸，還包含編碼與此蛋白質(zhì)具同等功能的蛋白質(zhì)的其他多 核苷酸。作為功能同等的蛋白質(zhì)，例如，可例舉為(c)由序列號2中記載的氨 基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成、 且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，可為由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添
加例如1 100個、1 90個、1 80個、1 70個、1 60個、1 50個、1 40 個、1 39個、1 38個、1 37個、1 36個、1 35個、1 34個、1 33個、1 32個、1 31個、1 30個、1 29個、1 28個、1 27個、1 26個、l 25個、1 24個、1 23個、1 22個、1 21個、1 20個、1 19個、1 18 個、1 17個、1 16個、1 15個、1 14個、1 13個、1 12個、1 11個、 1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個(1 數(shù)個)、1 5個、1 4個、 1 3個、1 2個或1個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運 蛋白活性的蛋白質(zhì)。上述氨基酸殘基的缺失、取代、插入及/或添加的數(shù)量， 一般越少越好。此種蛋白質(zhì)可例舉為(d)具有與序列號2氨基酸序列有約60% 以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、 77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以 上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、9(F。以上、91%以上、92% 以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、 99. 1%以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7% 以上、99.8%以上或99.9%以上同一性的氨基酸序列，且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋 白活性的蛋白質(zhì)。上述同源性的數(shù)值一般越大越好。
硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性，例如可通過Cherest等的方法(Genetics, 145: 627-635,1997)中所述的方法測定。
另外，本發(fā)明也包含(e)多核苷酸，其含有與序列號1中記載的堿基序 列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有硫酸根離 子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有與編碼由序列 號2中記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的互補多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)
條件下雜交，且編碼具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
本文中所述的"在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸"，是指以序列號1中記載 的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸或編碼序列號2中記載的氨基
酸序列的DNA的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或 Southern雜交法等得到的核苷酸，例如DNA。雜交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed. 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997等中所述的方法。
本說明書中所述的"嚴(yán)謹(jǐn)條件"可為低嚴(yán)謹(jǐn)條件、中嚴(yán)謹(jǐn)條件及高嚴(yán)謹(jǐn)條
件中的任一種。"低嚴(yán)謹(jǐn)條件"，例如，為5XSSC、 5XDenhardt溶液、0. 5%SDS、 50%甲酰胺、32。C的條件。"中嚴(yán)謹(jǐn)條件"，例如，為5XSSC、 5XDenhardt溶 液、0. 5%SDS、 50%甲酰胺、42。C的條件。"高嚴(yán)謹(jǐn)條件"，例如，為5XSSC、 5XDenhardt溶液、0. 5%SDS、 50%甲酰胺、50。C的條件。在上述條件下，溫度 越高，越能期待高效地獲得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影響雜交嚴(yán) 謹(jǐn)性的因素可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種 因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過適當(dāng)選擇這些因素，可實現(xiàn)同樣的嚴(yán)謹(jǐn)性。
且雜交中使用市售的試劑盒時，例如，可使用Alkphos Direct Labelling Reagents [Amersham Pharmacia公司制]。此時，根據(jù)試劑盒中附帶的實驗方 法(protocol),與標(biāo)記了的探針一同孵育過夜后，將膜在55t:的條件下，用含 有O. 1% (w/v) SDS的1次洗滌緩沖液洗滌，之后可檢測雜交后的DNA。
此外可雜交的DNA，可為通過FASTA、 BLAST等同源性檢索軟件，使用默認(rèn) 參數(shù)計算時，與編碼序列號2中記載的氨基酸序列的DNA具有約60%以上、約 70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以 上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85% 以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、 93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1% 以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99.4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以 上、99.8%以上或99.9%以上同一性的多核苷酸。
氨基酸序列和核苷酸序列的同一性，可使用根據(jù)Karlin及Altschul的 BLAST算法(Proc. Natl, Acad. Sci. USA 87, 2264-2268， 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873， 1993)決定?；贐LAST算法的BLASTN、 BLASTX 的程序己經(jīng)被開發(fā)出來了 (Altschul SF， et al: J. Mol. Biol. 215: 403， 1990)。使用BLASTN分析核苷酸序列時，參數(shù)例如為score = 100、 wordlength =12。且使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數(shù)例如為score = 50、 wordlength 二3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。 并且，本發(fā)明的多核苷酸包含(j)編碼具有與上述(5)中所述多核苷酸
(DNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的核苷酸序列的RNA的多核苷酸；(k)編碼通過RNAi作 用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA的多核苷酸；(1)編碼具 有特異性切割上述(5)中所述多核苷酸(DNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性的RNA的多核苷 酸；及(m)編碼通過共抑制作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA 的多核苷酸。這些多核苷酸整合進(jìn)載體，進(jìn)而可在導(dǎo)入了其載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中 抑制上述(a) (i)的多核苷酸(DNA)的表達(dá)。因此，這些多核苷酸可適用于優(yōu) 選抑制上述DNA表達(dá)的場合。
本說明書中，"編碼具有DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互補核苷酸序列的RNA的多核苷 酸"，是指所謂的反義DNA。反義技術(shù)作為抑制特定的內(nèi)源性基因表達(dá)的方法而 公知，且在各種文獻(xiàn)中均有記載[例如，參照平島及井上新生化學(xué)實驗講座2 核酸IV基因的復(fù)制和表達(dá)(日本生化學(xué)會編，東京化學(xué)同人)pp. 319-347， 1993等]。反義DNA的序列，優(yōu)選全部或部分與內(nèi)源性基因互補，但只要能有效 抑制基因的表達(dá)，即使不完全互補也可以。轉(zhuǎn)錄的RNA與耙基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物優(yōu) 選具有90%以上，進(jìn)一步優(yōu)選具有95%以上的互補性。反義DNA的長度，至少 為15個堿基以上，優(yōu)選100個堿基以上，進(jìn)一步優(yōu)選500個堿基以上。
本說明書中，"編碼通過RNAi作用抑制咖A表達(dá)的RNA的多核苷酸"，是指 用于通過RNA干擾(RNAi)抑制內(nèi)源性基因表達(dá)的多核苷酸。"RNAi"是指將具 有與靶基因序列同一或類似序列的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時，導(dǎo)入的外源基因及 內(nèi)源性靶基因的表達(dá)均受到抑制的現(xiàn)象。此處使用的RNA，例如可為產(chǎn)生RNA干 擾的21 25堿基長度的雙鏈RNA，例如，ds冊A (double strand RNA)、 siRNA(small interfering RNA)或shRNA(short hairpin RNA)。此禾中RNA可通 過脂質(zhì)體等的傳遞系統(tǒng)傳遞至所需位點局部，或者可以使用生成上述雙鏈RNA 的載體使其局部表達(dá)。此種雙鏈RNA(dsRNA、 siRNA或shRNA)的制備方法、使用 方法等已由許多文獻(xiàn)公開(參照日本特表2002-516062號公報；美國公開專利 第2002/086356A號；Nature Genetics, 24(2)， 180-183， 2000 Feb. ; Genesis, 26(4)， 240-244， 2000 April; Nature, 407:6802， 319-20, 2002 S印.21; Genes
&Dev. ， Vol. 16， (8)， 948—958, 2002 Apr. 15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 99(8)， 5515-5520， 2002 Apr. 16; Science, 296(5567)， 550-553， 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA， 99:9， 6047-6052， 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5)， 497-500， 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5)， 500—505， 2002 May; Nucleic Acids Res. ， 30:10， e46，2002 May 15
本說明書中，"編碼具有特異性切割DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性的RNA的多核苷酸" 一般是指核酶。核酶是指具有催化活性的RNA分子，通過切割靶DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物，阻斷其基因的功能。核酶的設(shè)計可參照各種公知文獻(xiàn)(例如參照FEBSLett. 228: 228， 1988; FEBS Lett. 239: 285， 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059， 1989; Nature 323: 349， 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751， 1991; Protein Eng 3: 733， 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875， 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125， 1991; Biochem Biophys Res Co國n 186: 1271， 1992等)。且"編碼通 過共抑制作用抑制DNA表達(dá)的RNA的多核苷酸"，是指通過"共抑制"阻斷靶DNA 功能的核苷酸。
本說明書中，"共抑制"是指細(xì)胞中通過由轉(zhuǎn)化導(dǎo)入與內(nèi)源性靶基因具有同 一或類似序列的基因，而使導(dǎo)入的外源基因及內(nèi)源性靶基因的表達(dá)均受到抑制 的現(xiàn)象。具有共抑制作用的多核苷酸的設(shè)計可參照種種公知文獻(xiàn)(例如，參照 Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793， 1997、 Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810， 1996等)。
2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)
本發(fā)明也提供由上述多核苷酸(a) (f)中任一多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。本 發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)，是由序列號2中記載的氨基酸序列中缺失、取代、插入及 /或添加1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列組成，且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活 性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，可例舉為由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/
或添加上述數(shù)量的氨基酸殘基的氨基酸序列組成，且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白 活性的蛋白質(zhì)。且此種蛋白質(zhì)，可例舉為具有與序列號2的氨基酸序列有上述 同源性的氨基酸序列，且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，可使用《分子克隆第3版》、《Current Protocols in Molecular Biology》、"Nuc. Acids. Res. ， 10， 6487 (1982) " 、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 79， 6409 (1982)"、 "Gene， 34， 315 (1985)" 、 "Nuc. Acids. Res. ， 13， 4431 (1985)"、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 82， 488 (1985)"等中所述的 定點誘變法獲得。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個以上的氨 基酸殘基，是指在同一序列中任意且1個或多個氨基酸序列的位置上缺失、取 代、插入及/或添加1個或多個氨基酸殘基，缺失、取代、插入及添加中的2 種以上也可同時發(fā)生。以下，舉例表示可相互取代的氨基酸殘基。同-一組中包 含的氨基酸殘基可相互取代。
A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2 —氨 基丁酸、蛋氨酸、鄰甲基絲氨酸(O—methylserine)、叔丁基甘氨酸(t一butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t一butyl alanine)、環(huán)己基丙氨酸(cyclohexyl alanine); B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸(isoglutamic acid)、 2 —氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2 — aminosuberic acid); C組天 冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2， 4一二氨基丁酸、2，
3 — 二氨基丙酸；E組脯氨酸、3 —羥基脯氨酸、4一羥基脯氨酸；F組 絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基 法)等的化學(xué)合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃爾默 (PerkinElmer)公司制、Pharmacia公司制、Protein Technology Instruments 公司制、Synthecell-Vega公司制、PerS印tive公司制、島津制作所公司等制 造的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
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3.本發(fā)明的載體及導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)基因酵母
其次，本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體含有上述(a) (i)中任-一項所述的多核苷酸(DNA)或上述(j) (m)中任一項所述的多核苷酸。 本發(fā)明的載體通常含有一個表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有(a)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟 動子；(b)與該啟動子以正義方向或反義方向連接的上述(a) (i)中任一項所述 的多核苷酸；以及(c)與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的在酵母中起 作用的信號。本發(fā)明中，下述的酒精飲料(例如，啤酒)釀造中，要使上述本 發(fā)明的蛋白質(zhì)高表達(dá)時，則將這些多核苷酸以啟動子的正義方向?qū)?，以促進(jìn) 上述(a) (i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)。在下述的酒精飲料(例 如，啤酒)釀造中，要抑制上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)時，則將這些多核苷酸針 以啟動子的反義方向?qū)?，以抑制上?a) (i)中任一項所述的多核苷酸(DNA) 的表達(dá)。需要抑制上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)時，也可在載體中可表達(dá)地導(dǎo)入上 述(j) (m)中任一項所述的多核苷酸。且在本發(fā)明中，通過破壞上述靶基因 (DNA)，可抑制上述DNA的表達(dá)或上述蛋白質(zhì)的表達(dá)。基因的破壞，可通過向 參與靶基因中基因產(chǎn)物表達(dá)的區(qū)域，例如編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域等的內(nèi)部添加 或缺失一個或多個堿基或使這些區(qū)域的全體缺失來進(jìn)行。此種基因破壞的手法， 可參照公知的文獻(xiàn)(例如，參照Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 76， 4951 (1979)、 Methods in Enzymology, 101， 202(1983)、日本特開平6-253826號公報等)。
導(dǎo)入酵母時使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、 染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，YEp型載體中的YEp24 (J. R. Broach et al. ， Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83， 1983) 、 YCp型載體中的YCp50 (M. D. Rose et al. ， gene, 60， 237， 1987) 、 YIp型載體中的YIp5 (K. Struhl et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USP， 76， 1035， 1979)，上述載體均已為人所知，并可容易地獲得。
用于調(diào)節(jié)酵母中基因表達(dá)的啟動子/終止子，如能在釀造用酵母中起作用， 同時對醪液中的氨基酸濃度、糖濃度、高級醇或酯濃度沒有影響，可任意組合。 例如可利用3 —磷酸甘油醛脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3 —磷酸甘油酸激酶
基因(PGK1)的啟動子等。這些基因己被克隆，例如在M. F. Tuiteetal., EMB0 J.， 1， 603 (1982)中有詳細(xì)記載，通過已知方法即可容易地獲得。
因釀造用酵母不能利用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，所以，轉(zhuǎn)化時使用的選擇性標(biāo)記 可利用氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因(G418D、抗銅基因(CUP1)
(Marin et al. ， Proc. Natl. Acad, Sci. USA， 81， 337 1984)、淺藍(lán)菌素抗 性基因(fas2m， PDR4)(分別為豬腰淳嗣等，生化學(xué)，64， 660， 1992; Hussain et al.， gene， 101， 149， 1991)等。
如上所述構(gòu)建的載體被導(dǎo)入宿主酵母。宿主酵母，為可用于釀造的任意酵 母，例如可為啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可使用如酵 母屬(Saccharomyces)的酵母。在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵 母 (Saccharomyces pastorianus) W34/70等，卡氏酵母 (Saccharomyces
caxlsbergensis) NCYC453、NCYC456等，酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951、 NBRC1952、 NBRC1953、 NBRC1954等。還可以使用威士忌酵母，例如 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) NCYC90等；葡萄酒酵母，例如曰本 釀造協(xié)會的葡萄酒用l號、3號、4號等；清酒酵母，例如日本釀造協(xié)會的清酒 用7號、9號等，但不限于此。本發(fā)明中，優(yōu)選使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母
酵母的轉(zhuǎn)化方法，可利用常用的公知方法。例如，可使用電穿孔法"Meth. Enzym. ， 194， pl82(1990)"、原生質(zhì)球法(Spheroplast法)"Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 p1929 (1978)"、醋酸鋰法"J. Bacteriology, 153， pl63(1983)"、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 p1929 (1978) 、 Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述 的方法，但不限于此。
更具體地說，將宿主酵母置于標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基(例如YEPD培養(yǎng)基 "Genetic Engineering. Vol. 1， Plenum Press, New York, 117 (1979)，，等) 中培養(yǎng)，使OD600nm的值為1 6。將此培養(yǎng)酵母離心分離后收集、洗滌，用濃 度約為1 2M的堿金屬離子、優(yōu)選鋰離子進(jìn)行預(yù)處理。將此細(xì)胞在約3CTC下靜
置約60分鐘后，與將導(dǎo)入的DNA (約l 20u g) —同在約3(TC下靜置約60分 鐘。加入聚乙二醇，優(yōu)選加入約4，000道爾頓的聚乙二醇，使最終濃度約為20 % 50%。在約30。C下靜置約30分鐘后，將此細(xì)胞在約42。C下加熱處理約5 分鐘。優(yōu)選將此細(xì)胞懸浮液用標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基洗滌后，放入預(yù)定量的新鮮 標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在約3(TC下靜置約60分鐘。之后，移植到含有作為選 擇性標(biāo)記使用的抗生素等的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基中，獲得轉(zhuǎn)化體。
此外，關(guān)于一般性的克隆技術(shù)，可參照《分子克隆第3版》、"Methods in Yeast Genitics、 A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor， NY)"等。
4 .本發(fā)明的酒精飲料的制造方法及由該制造方法獲得的酒精飲料
將上述本發(fā)明的載體導(dǎo)入適合釀造所需酒精飲料的酵母中，通過使用該酵 母，可制造所需要的且亞硫酸鹽含量增加、香味增加了的酒精飲料。且通過下 述本發(fā)明的酵母評價方法選擇的酵母也可同樣使用。作為制造對象的酒精飲料 并不限于此，例如可為啤酒、葡萄酒、威士忌、清酒等。
制造上述酒精飲料時，除使用本發(fā)明中所得到的釀造酵母代替親株以外， 可利用公知的手法。因此，原料、制造設(shè)備、制造管理等可與以往方法完全相 同，不會因制造亞硫酸鹽含量增加的酒精飲料而增加成本。即根據(jù)本發(fā)明，可 在使用已有設(shè)施、不增加成本的情況下，制造出香味穩(wěn)定性等優(yōu)異的酒精飲料。
并且，因所述基因高表達(dá)的酵母高效吸收培養(yǎng)基中的硫酸根離子，所以， 即使使用硫源缺乏的原料，例如制造啤酒時使用麥芽比率低的麥芽汁時，也可 進(jìn)行良好的酵母增殖和酒精發(fā)酵。
對于含硫氨基酸合成體系的合成過強的酵母，有時會大量生成、積累以該 途徑的中間代謝物硫化氫為代表的、成為酒精飲料中不受歡迎的不愉快香味的 含硫化合物類。對于此種酵母，通過抑制或破壞該基因的功能，抑制作為起始 物質(zhì)的硫酸根離子的吸收，從而可制造出減少了不愉快香味的酒精飲料。
5.本發(fā)明的酵母的評價方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用根據(jù)具有序列號1核苷酸序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因 的核苷酸序列所設(shè)計的引物或探針，評價被檢酵母的亞硫酸鹽生成能力的方法。
使用引物或探針的評價方法的一般手法為公知，例如，在W 001 / 040514號公 報、日本特開平8 — 205900號公報等中有記載。以下，就此評價方法進(jìn)行簡單 說明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等 公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl30 (1990)]。以所得到的基因組為對象，使用根據(jù)硫酸 根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的核苷酸序列(優(yōu)選0RF序列)所設(shè)計的引物或探針，測 定被檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異性序列。引物或探針的 設(shè)計可使用公知的手法進(jìn)行。
基因或特異性序列的檢測可使用公知的手法進(jìn)行。例如，將含有特異性序 列的一部分或全部的多核苷酸或含有其核苷酸序列的互補核苷酸序列的多核苷 酸作為引物之一使用，另一個引物使用含有此序列的上游或下游序列的一部分 或全部的多核苷酸或含有其核苷酸序列的互補核苷酸序列的多核苷酸，通過PCR 法擴增酵母的核酸，并測定擴增物的有無、擴增物分子量的大小等。用于引物 的多核苷酸的堿基數(shù)通常為10bp以上，優(yōu)選為15 25bp。且夾在兩引物間部分 的堿基數(shù)通常以300 2000bp為宜。
PCR法的反應(yīng)條件無特別限定，例如，可使用變性溫度90 95°C，退火 溫度40 60°C，延伸溫度60 75°C，循環(huán)數(shù)10次以上等的條件。所得到 的反應(yīng)生成物通過使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等進(jìn)行分離，可測定擴增產(chǎn)物的 分子量。根據(jù)此方法，通過擴增產(chǎn)物的分子量是否是含有特異部分的DNA分子 的大小，來預(yù)測、評價該酵母的亞硫酸鹽生成能力。且通過分析擴增物的核苷 酸序列，可進(jìn)一歩更正確地預(yù)測、評價上述性能。
本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號l核苷酸序列的硫酸根 離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)量，評價被檢酵母的亞硫酸鹽生成能力。且硫酸根離 子轉(zhuǎn)運蛋白基因表達(dá)量的測定，可通過培養(yǎng)被檢酵母，對硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白
基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)定量來進(jìn)行。mRNA或蛋白質(zhì)的定量可使用公知的 手法。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量RT-PCR進(jìn)行，蛋白質(zhì)的 定量例如可通過Western印跡法進(jìn)行 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
而且，通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號l堿基序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運 蛋白基因的表達(dá)量，選擇與目的亞硫酸鹽生成能力相應(yīng)的所述基因表達(dá)量的酵 母，從而可選擇適合釀造所需酒精飲料的酵母。也可培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母， 測定各酵母中所述基因的表達(dá)量，比較標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵母的所述基因的表達(dá) 量，以選擇所需的酵母。具體地說，例如，可通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母， 測定具有序列號1堿基序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因在各酵母中的表達(dá)量， 選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比該基因為高表達(dá)的菌株，來選擇適合酒精飲料釀造的酵母。
或者可通過培養(yǎng)被檢酵母，選擇亞硫酸鹽生成能力強的酵母，以選擇適合 釀造所需酒精飲料的被檢酵母。
此時，被檢酵母或標(biāo)準(zhǔn)酵母例如可使用上述導(dǎo)入了本發(fā)明載體的酵母、實 施了突變處理的酵母、自發(fā)突變的酵母等。突變處理，例如可使用紫外線照射、 放射線照射等的物理方法，甲磺酸乙酯(EMS: Ethylmethanesulfonate)、 N-甲 基一N， 一石肖基一N—亞石肖基狐(N_methyl_N， 一nitro—N—nitrosoguanidine)等藥齊[J 處理的化學(xué)方法等的任何方法(例如，參照大島泰治編著、生物化學(xué)實驗法39 酵母分子遺傳學(xué)實驗法、P 67-75、學(xué)會出版中心等)。
且可作為標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母使用的酵母，可例舉釀造時可使用的任意的 酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可例舉為酵母 屬(Saccharomyces)等的酵母，在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵 母 (Saccharomyces pastorianus') W34/70等，卡氏酵母 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453、NCYC456等，酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951、 NBRC1952、 NBRC1953、 NBRC1954等。還可使用威士忌酵母，例如釀 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) NCYC90等；葡萄酒酵母，例如日本釀造
協(xié)會的葡萄酒用l號、3號、4號等；清酒酵母，例如日本釀造協(xié)會的清酒用7 號、9號等，但不限于此。本發(fā)明優(yōu)選使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母
(Saccharomyces pastorianus)。標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母可從上述酵母中以任意
組合選擇。
以下，通過實施例詳細(xì)敘述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實施例。 實施例h SUL2基因的克隆
使用日本特開2004-283169中所述的比較數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了啤酒 酵母基因組中的2種新SUL2基因?；谂cSGD (酵母基因組數(shù)據(jù)庫； http://www.yeastgenome.org/ ) 中公開的酉良酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) SUL2基因的核苷酸序列的同源性，將同源性高(99%)的新發(fā)現(xiàn) 基因定義為ScSUL2，同源性低(80%)的基因定義為non-ScSUL2。基于所得到 的堿基序列信息，設(shè)計用于擴增各自全長基因的引物，以基因組解讀株 Sacchaxomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株的染色體DNA為模板，通 過PCR，獲得含有ScSUL2或non-ScSUL2全長基因的DNA片段(均為約2. 7kb)。 ScSUL2基因的擴增使用引物ScSUL2—for (序列號3) / ScSUL2_rv (序列號 4 )，non-ScSUL2基因的擴增使用non-ScSUL2—for(序列號5 ) / non-ScSUL2—rv (序列號6)。
將如上所述獲得的ScSUL2及non-ScSUL2基因片段，通過TA克隆插入 pCR2. 1-T0P0載體(Invitrogen公司制)。將ScSUL2及non-ScSUL2基因的堿基 序列用Sanger的方法(F. Sanger, Science, 214， 1215， 1981)進(jìn)行分析， 確認(rèn)堿基序列無誤后，將載體分別命名為T0P0/ScSUL2及T0P0/non-ScSUL2。
實施例2: SUL2基因的組成性表達(dá)
由實施例1中所述的質(zhì)粒T0P0/ScSUL2通過限制酶Sacl及Notl處理，制 備含有ScSUL2基因的約2. 7 kb的DNA片段。使其與用限制酶Sacl及Notl處
理后的pUP3GLP2連接，構(gòu)建ScSUL2組成性表達(dá)載體pUP-ScSUL2。并用與此相 同的方式構(gòu)建non-ScSUL2組成性表達(dá)載體pUP-non-ScSUL2。酵母表達(dá)載體 pUP3GLP2，是作為同源重組位點含有乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶基因URA3的YIp 型(染色體整合型)載體，被導(dǎo)入的基因通過3-磷酸甘油醛脫氫酶基因TDH3的 啟動子/終止子而組成性表達(dá)。作為酵母中的選擇性標(biāo)記，抗藥性基因YAP1在 半乳糖激酶基因GAL1的啟動子/終止子的控制下被引入，并在含有半乳糖的培 養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)。且作為大腸桿菌中的選擇性標(biāo)記，包含氨芐青霉素抗性基因 Ampr。
使用由上述方法制備的組成性表達(dá)載體，用日本特開平07-303475中所述 的方法轉(zhuǎn)化5acc力aro,ces / as"f(9".s/ 〃s1 Weihenstephan 34/70株。首先，當(dāng) 生成的亞硫酸鹽在菌體內(nèi)積累時，由于酵母自身受到亞硫酸鹽的傷害而不能正 確評價SUL2基因的作用，所以，使用日本特開2004-283169中所述的方法，獲 得編碼亞硫酸鹽排出泵的non-ScSSUl基因高表達(dá)株，作為TF010。其次，以TF010 為宿主，進(jìn)行為獲得Sc SUL2或non-ScSUL2基因高表達(dá)株的轉(zhuǎn)化，并在含有淺 藍(lán)菌素1.0mg/L的YPGal平板培養(yǎng)基(1%酵母浸膏、2%多聚蛋白胨、2%半乳糖、 2%瓊脂)中選擇淺藍(lán)菌素抗性株。
通過RT-PCR進(jìn)行組成性表達(dá)的確認(rèn)?？俁NA的提取使用脂easy Mini Kit (QIAGEN公司制)，根據(jù)試劑盒中附帶的使用說明進(jìn)行。ScSUL2特異性引物使 用ScSUL2—F2 (序列號:7) / Sc SUL2—R3 (序列號:8)， non-ScSUL2特異性引 物使用non-ScSUL2—F2 (序列號:9) / non-Sc SUL2—R3 (序列號:10)，內(nèi)部標(biāo) 準(zhǔn)使用丙酮酸脫氫酶基因PDA1的特異性引物PDA1—for51 (序列號11) / PDA1—730rv (序列號12)。將PCR產(chǎn)物用0. 8%瓊脂糖電泳展開后，用溴化乙錠 溶液染色，并將各自的SUL2基因的信號值用PDA1基因的信號值標(biāo)準(zhǔn)化。將此 值與親株TF010比較，把表達(dá)量為2倍以上的菌株作為Sc SUL2或non-ScSUL2 高表達(dá)株，分別選擇各2個克隆。
實施例3 :啤酒試驗釀造中亞硫酸鹽生成量的解析
使用親株TFOIO以及實施例2中獲得的ScSUL2高表達(dá)株(2株)、non-ScSUL2 高表達(dá)株(2株)，采用以下條件進(jìn)行發(fā)酵試驗。 麥芽汁浸出物濃度13% 麥芽汁容量 800mL 麥芽汁溶解氧濃度約8ppm 發(fā)酵溫度 15。C恒定
酵母投入量 5g濕酵母菌體/ 800mL麥芽汁提取物
對發(fā)酵醪液經(jīng)時取樣，分析酵母增殖量(0D660)、糖消耗量的經(jīng)時變化， 分別用圖l、圖2表示。發(fā)酵終止時亞硫酸鹽濃度的定量，是在酸性條件下，通 過蒸餾將亞硫酸鹽收集于過氧化氫溶液中后，用堿滴定來進(jìn)行[(財)日本釀造 協(xié)會改訂BCOJ啤酒分析法]，用圖3表示。結(jié)果均用2株的平均值表示。
發(fā)酵終止時的亞硫酸鹽生成量，相對于親株TF010的8ppm， ScSUL2高表達(dá) 株為10卯m， non-ScSUL2高表達(dá)株為18ppm，可見，由于non-ScSUL2高表達(dá)， 亞硫酸鹽生成量顯著增大。且此時，親株與組成性表達(dá)株之間在增殖速度及浸 出物消耗速度上均無差別。
綜上所述，通過使本發(fā)明中公開的啤酒酵母特有的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白組 成性表達(dá)而使亞硫酸鹽生成能力得到強化的酵母，可以在不改變發(fā)酵工序、發(fā) 酵時間的情況下，使作為啤酒等酒精飲料的抗氧化劑起作用的亞硫酸鹽的生成 量特異性增加。由此，可制造出香味穩(wěn)定性優(yōu)異且保質(zhì)期更長(質(zhì)量優(yōu)良)的 酒精飲料。
實施例4:使用低硫源麥芽汁的啤酒試驗釀造
使用由實施例2制備的高表達(dá)載體轉(zhuǎn)化6^cc力aro歷ycespss"7^s/7WsW34/70 株，分別獲得ScSUL2及non-ScSUL2 (單獨)高表達(dá)株。然后，制備麥芽比率為 24%的麥芽汁作為低硫源麥芽汁，使用親株及所得到的高表達(dá)株，在以下條件下 進(jìn)行啤酒試驗釀造。
麥芽汁浸出物濃度13%
麥芽汁容量 2L
麥芽汁溶解氧濃度約8ppm
發(fā)酵溫度 15"C恒定
酵母投入量 10. 5g濕酵母菌體/ 2L麥芽汁
對發(fā)酵醪液經(jīng)時取樣，分析酵母增殖量(0D660)、糖消耗量的經(jīng)時變化。
實施例5: SUL2基因的破壞
按照文獻(xiàn)[Goldstein " s義,yeast. 15 1541 (1999)]的方法，以含有 抗藥性標(biāo)記的質(zhì)粒[pFA6a (W^0，或pAG25 為模板，通過PCR，制
備用于破壞5漢2基因的片段。
用所制備的用于破壞基因的片段轉(zhuǎn)化W34/70株或孢子克隆株W34/70-2株。 轉(zhuǎn)化用日本特開平07-303475中所述的方法進(jìn)行，用于的選擇藥劑的濃度分別 為氨基糖苷類抗生素300 mg/L、諾爾絲菌素(nourseothricin) 50 mg/L。
實施例6:啤酒試驗釀造中的含硫化合物生成量的解析
使用親株及在實施例5中得到的破壞株，在以下條件進(jìn)行啤酒試驗釀造。
麥芽汁浸出物濃度 13%
麥芽汁容量 2L
麥芽汁溶解氧濃度約8ppm
發(fā)酵溫度 15。C恒定
酵母投入量 10. 5g濕酵母菌體/ 2L麥芽汁
對發(fā)酵醪液經(jīng)時取樣，分析酵母增殖量(0D660)、糖消耗量的經(jīng)時變化。 醪液中含硫化合物類的分析使用頂空氣相色譜法進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的酒精飲料制造方法，因產(chǎn)品中具有抗氧化作用的亞硫酸鹽的 含量增加，所以可制造出香味穩(wěn)定性優(yōu)異且保質(zhì)期更長的酒精飲料。而且本發(fā) 明的酵母可更高效地吸收作為硫源的硫酸根離子，所以，即使是含硫氨基酸含
量低的原料，例如發(fā)泡酒(力邵p加s/^)麥芽汁，也可進(jìn)行良好的酒精發(fā)酵。此 外，對于成為不愉快香味的含硫化合物類的生成量高的酵母，通過抑制該基因 的表達(dá)，可制造出香味優(yōu)異的酒精飲料。
本申請要求日本專利申請2005-177821 (2005年6月17日提交)的權(quán)益， 將其以引用的方式納入本文，以用于各種目的。本文中所引用的其它文獻(xiàn)，也 均以引用的方式納入本文，以用于各種目的。
權(quán)利要求
1.多核苷酸，其選自以下(a)～(f)組成的組(a)多核苷酸，其含有由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(c)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成、且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(d)多核苷酸，其含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列、且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(e)多核苷酸，其含有與序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有與編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
2. 權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其選自以下(a) (c)組成的組(a) 多核苷酸，其編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或編碼由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1 10個氨基酸后組成的氨基酸序列，且其中所述蛋白質(zhì)具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性；(b) 多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90%以上同一性的 氨基酸序列、且具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；及(C)多核苷酸，其與序列號1的核苷酸序列或序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋 白質(zhì)的多核苷酸。
3.權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其為由序列號l的核苷酸序列組成的多核苷酸。
4. 權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
5. 權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其是DNA。
6. 多核苷酸，其是選自以下(j) (m)中所述的多核苷酸(j)編碼與權(quán)利要求5中所述多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的核苷酸序 列的RNA的多核苷酸；(k)編碼通過RNAi作用抑制權(quán)利要求5中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA 的多核苷酸；(1)編碼具有特異性切割權(quán)利要求5中所述多核苷酸(DNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性 的RNA的多核苷酸；以及(m)編碼通過共抑制作用抑制權(quán)利要求5中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA 的多核苷酸。
7. 蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1 5中任一項所述的多核苷酸編碼。
8. 載體，其含有權(quán)利要求1 5中任一項所述的多核苷酸。
9.酵母，其中含有權(quán)利要求8中所述的載體。
10. 權(quán)利要求9所述的酵母，其中所述酵母表達(dá)多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)， 且所述蛋白質(zhì)的表達(dá)增加了酵母的亞硫酸鹽。。
11. 酵母，其通過導(dǎo)入權(quán)利要求8中所述的載體或通過破壞與權(quán)利要求5 中所述多核苷酸(DNA)有關(guān)的基因而抑制該酵母中權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)。
12. 表達(dá)權(quán)利要求7所述蛋白質(zhì)的酵母，其中所述蛋白質(zhì)的表達(dá)增加了酵 母的亞硫酸鹽的產(chǎn)生。
13. 酒精飲料的制造方法，其包括在制造酒精飲料的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求 9 12中任一項所述的酵母。
14. 權(quán)利要求13所述的酒精飲料的制造方法，其釀造的酒精飲料是麥芽飲
15. 權(quán)利要求13所述的酒精飲料的制造方法，其釀造的酒精飲料是葡萄酒。
16. 酒精飲料，其用權(quán)利要求13 15中任一項所述的方法制造。
17. 評價被檢酵母的亞硫酸鹽生成能力的方法，其包括使用根據(jù)具有序列號1核苷酸序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的核苷酸序列而設(shè)計的引物或探針。
18. 評價被檢酵母的亞硫酸鹽生成能力的方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母； 和測定具有序列號1核苷酸序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)量。
19. 酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；對權(quán)利要求7中所述的蛋 白質(zhì)進(jìn)行定量，或測定具有序列號l核苷酸序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的 表達(dá)量；和選擇具有與目的亞硫酸鹽生成能力相應(yīng)的所述蛋白質(zhì)生成量或所述 基因表達(dá)量的被檢酵母。
20. 權(quán)利要求19所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵 母；測定具有序列號1的核苷酸序列的硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因在各酵母中的 表達(dá)量；和選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比，該基因為高表達(dá)或低表達(dá)的被檢酵母。
21. 權(quán)利要求19所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵 母；對各酵母中的權(quán)利要求7中所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量；和選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相 比，該蛋白質(zhì)的量較多或較少的被檢酵母。
22. 酒精飲料的制造方法，其包括使用權(quán)利要求9 12中任一項所述的酵母或使用通過權(quán)利要求19 21中任一項所述的方法選擇的酵母進(jìn)行用于酒精 飲料制造的發(fā)酵；以及調(diào)節(jié)亞硫酸鹽的產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白基因及其用途，特別涉及制造香味穩(wěn)定性優(yōu)異的酒精飲料的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料及其制造方法等。更具體地說，本發(fā)明涉及通過提高編碼釀造酵母硫酸根離子轉(zhuǎn)運蛋白Sul2p的基因SUL2、特別是啤酒酵母中特征性的non-ScSUL2基因的表達(dá)量，從而提高對產(chǎn)品香味穩(wěn)定化起作用的亞硫酸鹽生成能力的酵母及使用該酵母的酒精飲料的制造方法等。
文檔編號C12N15/31GK101189338SQ200680019968
公開日2008年5月28日 申請日期2006年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日
發(fā)明者下永朋子, 中尾嘉宏, 兒玉由紀(jì)子 申請人:三得利株式會社