專利名稱：：基因修飾的抗體組成物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有比人類IgGl抗體和人類IgG3抗體更高的補體依賴性細胞毒活性的重組抗體組成物(composition)，其中含有人類IgGl抗體的Fc區(qū)域中的CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被含有氨基酸序列的多肽所取代，所述氨基酸序列對應(yīng)于Kabat等中的EU指數(shù)(下文稱為EU指數(shù))指出的人類IgG3抗體的相同位置；編碼包含在重組抗體組成物中的抗體分子或抗體分子的重鏈恒定區(qū)的DNA;可以通過將DNA導(dǎo)入宿主細胞而獲得的轉(zhuǎn)化體；使用轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)重組抗體組成物的方法；以及含有重組抗體組成物作為活性成分的藥物。
背景技術(shù)：
：由于抗體的結(jié)合活性、結(jié)合特異性高和在血液中的高度穩(wěn)定性，已經(jīng)嘗試了將其應(yīng)用于各種人類疾病的診斷、預(yù)防和治療劑(非專利文檔l)。此外，已經(jīng)使用基因重組技術(shù)從非人類的動物抗體制備了人類嵌合抗體或人源化抗體(非專利文檔2到5)。人類嵌合抗體是其可變區(qū)為非人類的動物的抗體、而其恒定區(qū)為人類抗體的抗體。人源化抗體是其中非人類動物的互補性決定區(qū)域(在后文中稱為CDR)被人類抗體的CDR所取代的抗體。人類嵌合抗體和人源化抗體解決了小鼠抗體等所具有的問題，例如非人類動物的抗體免疫原性高、效應(yīng)子功能低以及在血液半衰期短，并且通過使用它們有可能將單克隆抗體應(yīng)用于藥物制劑(非專利文檔6到9)。例如，在美國，已經(jīng)有多個人源化抗體被批準(zhǔn)作為抗體用于癌癥治療的抗體，并上市銷售(非專利文檔IO)。這些人類嵌合抗體和人源化抗體在臨床水平上實際上顯示出了一定程度的效果，但是仍然需要具有更高效果的治療抗體。例如，在單獨施用針對CD20的人類嵌合抗體Rituxan(非專利文檔11)(由IDEC/Roche/Genentech制造)的情況下，已經(jīng)報道，通過三期臨床試驗，其用于復(fù)發(fā)的低惡性非Hodgkin淋巴瘤患者的反應(yīng)率不超過48%(完全緩解6%，部分緩解42%)，其平均反應(yīng)持續(xù)時間是12個月(非專利文檔12)。在組合使用Rituxan和化學(xué)療法(CHOP:環(huán)磷酰胺，多柔比星，長春新堿)的情況下，據(jù)報道通過二期臨床試驗，其用于復(fù)發(fā)的低惡性和濾泡性非Hodgkin淋巴瘤患者的反應(yīng)率是95%(完全緩解55%，部分緩解45%),但是發(fā)現(xiàn)了由CHOP引起的副作用(非專利文檔13)。在單獨施用針對HER2的人源化抗體Herceptin(由Genentech制造)的情況下，據(jù)報道通過三期臨床試驗，其用于轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的反應(yīng)率僅為15%，其平均反應(yīng)持續(xù)時間是9.1個月(非專利文檔14)。人類抗體分子也被稱為免疫球蛋白(在后文中稱為Ig)，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)被分成相應(yīng)的類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。主要被用作治療抗體的人類IgG的抗體分子(在后文中稱為IgG)由兩種分別被稱為重鏈(在后文中稱為H鏈)和輕鏈(在后文中稱為L鏈)的多肽形成。H鏈從N端側(cè)開始，由被稱為H鏈可變區(qū)(在后文中稱為VH)、CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)形成。相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3整體上也被稱為重鏈恒定區(qū)(在后文中稱為CH)，而CH2和CH3結(jié)構(gòu)域在整體上也被稱為Fc區(qū)。L鏈從N端側(cè)開始，由被稱為L鏈可變區(qū)(在后文中稱為VL)和L鏈恒定區(qū)(在后文中稱為CL)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)形成。在IgG抗體H鏈中存在四個亞類，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。相應(yīng)的IgG亞類的H鏈在不包括富于變化性的鉸鏈區(qū)之外的恒定區(qū)中，共同具有大約95。/。的氨基酸序列同源性(圖l)。不管相應(yīng)的IgG亞類中氨基酸序列的高度同源性，它們所具有的生物學(xué)活性的高度是不同的(非專利文檔15)。生物學(xué)活性包括效應(yīng)子功能例如補體依賴性細胞毒活性(在后文中稱為CDC)、抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒活性(在后文中稱為ADCC)和細胞吞噬活性，這些功能在活體中發(fā)揮重要作用，例如排除外來物質(zhì)和病原體。Fq受體家族(在后文中稱為FcyR)被表達在各種白細胞表面，例如自然殺傷細胞(在后文中稱為NK細胞)、單核細胞、巨噬細胞和粒細胞)。FcyR被分類成激活型FcyR包括FcyRI、Fc7RIIa、FcyRIIIa和FcYRIIIb，以及抑制型FqR包括FcyRnb。IgG抗體、特別是人類中的IgGl和IgG3，與這些受體強結(jié)合，并因此誘導(dǎo)出白細胞的ADCC活性和細胞吞噬活性。ADCC活性是一種胞溶反應(yīng)，其中與其抗原結(jié)合的抗體通過Fc部分主要與NK細胞表面的FcyRIIIa結(jié)合，結(jié)果，反應(yīng)通過細胞毒分子產(chǎn)生，例如NK細胞釋放的穿孔素和粒酶(非專利文檔16和17)。ADCC活性的級別一般是按照IgGl〉IgG3>>IgG4^IgG2的次序(非專利文檔18和19)。CDC活性是其中與抗原結(jié)合的抗體激活一組被稱為血清補體系統(tǒng)的血清蛋白的反應(yīng)級聯(lián)、并最終裂解靶細胞的反應(yīng)。在人類IgGl和IgG3中，CDC活性高，級別一般是按照IgG3^IgGl〉>IgG2higG4的次序。補體系統(tǒng)被分類成C1到C9的相應(yīng)成分，它們大部分是酶的前體，通過部分降解表達出酶活性。CDC活性從Cl的成分Clq與靶細胞上抗體的Fc區(qū)結(jié)合開始，每一個后續(xù)的成分被前一個步驟的成分部分降解，從而推進了活化的級聯(lián)，最后，C5到C9在靶細胞的細胞膜上形成了被稱為膜攻擊復(fù)合物的成孔聚合物，從而引起細胞溶解反應(yīng)(非專利文檔16和17)。上述的效應(yīng)子功能的重要性也可以在用于臨床領(lǐng)域的治療抗體的作用機制方面得到認識。上述的Rituxan是IgGl亞類的人類嵌合抗體，它不僅在體外顯示出ADCC活性和CDC活性(非專利文檔21)，而且其臨床效果也己經(jīng)表明Rituxan在患者體內(nèi)實際上行使了效應(yīng)子功能，這是因為在顯示出強烈ADCC活性的基因型的患者中它的治療效果高的事實(非專利文檔22)，在它給藥之后，補體成分被快速從血液中消耗(非專利文檔23)，并且在它給藥之后，復(fù)發(fā)患者的癌細胞中作為抑制CDC活性的因子CD59的表達增加了(非專利文檔24)。Herceptin也是IgGl亞類的人源化抗體，據(jù)報道它在體外具有ADCC活性(非專利文檔25)?；谏厦娴拿枋?，人類IgGl抗體最適合用作治療抗體，因為它們具有較高的ADCC活性和CDC活性，并且還具有比其它亞類更長的在人類血液中的半衰期。為了分析IgG抗體的功能，對于制備其結(jié)構(gòu)域單元在不同IgG亞類之間交換的抗體進行了研究。在1980年代后半期，Morrison等已經(jīng)指出，其重鏈恒定區(qū)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2、CH3、鉸鏈區(qū))在IgGl和lgG4之間、或lgG2和IgG3之間交換的抗體分子，能夠作為重組蛋白表達，并且其中IgG3和IgG4的鉸鏈區(qū)相互交換的抗體沒有表現(xiàn)出原始抗體的相應(yīng)補體固定能力和Fc受體結(jié)合能力的變化(專利文檔l)。隨后，他們研究了這些IgGl與IgG4和IgG2與IgG3結(jié)構(gòu)域交換的抗體，結(jié)果顯示出CH2的C-端側(cè)對于IgGl的CDC活性是重要的，CH2對lgG3的CDC活性是重要的(非專利文檔26)，CH2結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)對于IgGl和IgG3與Fc受體之一FcYRI的結(jié)合是重要的(非專利文檔27)。已經(jīng)知道Clq與抗體分子的Fc區(qū)域結(jié)合。Clq與人類IgGl、IgG2、IgG3和IgG4單體的結(jié)合常數(shù)(Ka)分別為1.2x104、0.64x104、2.9x104和0.44xl041^1(非專利文檔20)。如上所述，在Fc區(qū)域中CH2結(jié)構(gòu)域特別重要(非專利文檔26)，更具體來說，已經(jīng)知道，按照Kabat等的EU指數(shù)的定義(非專利文檔28)，在人類IgGl的情況下，CH2中的Leu235(非專利文檔29)和Asp270、Lys322、Pro329和Pro331(非專利文檔30)是重要的，在人類IgG3的情況下，Gly233、Leu234、Leu235和Gly236(非專利文檔31)和Lys322(非專利文檔32)是重要的。己經(jīng)嘗試了通過用來自其它亞類的氨基酸序列替換具有最高CDC活性的亞類，人類IgG3重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列的一部分，來進一步提高CDC活性。關(guān)于相應(yīng)IgG亞類的鉸鏈區(qū)長度，IgGl有15個氨基酸，IgG2有12個氨基酸，IgG3有62個氨基酸，IgG4有12個氨基酸，所以人類IgG3的結(jié)構(gòu)特征是其鉸鏈區(qū)比其它IgG亞類長(非專利文檔1)。Michaelsen等已經(jīng)指出，其中野生型人類IgG3多肽的鉸鏈區(qū)的62個氨基酸通過刪除N-端側(cè)的3個外顯子被縮短到15個氨基酸的Ig，其CDC活性超過了IgG3和IgGl的CDC活性(非專利文檔33)。此外，Norderhaug等指出，當(dāng)使上述縮短的鉸鏈區(qū)的氨基酸序列接近IgG4鉸鏈區(qū)的氨基酸序列時，CDC活性被進一步提高(非專利文檔34)。此夕卜，Brekke等指出，在鉸鏈區(qū)部分被IgGl的鉸鏈區(qū)部分替換的IgG3，和CH1的N-末端基團被IgGl替換的IgG3中，CDC活性高于IgG3的CDC活性，變得等于或高于IgGl的活性(非專利文檔35)。此外，已經(jīng)嘗試了通過在人類IgG重鏈恒定區(qū)的所有種類氨基酸序列中引入突變，來制備修飾形式的IgG，并增加這些修飾的形式與Clq的結(jié)合活性，用以增加CDC活性。Idusogie等報道，當(dāng)用其它氨基酸替代具有人類IgGl恒定區(qū)和小鼠來源的可變區(qū)的抗CD20嵌合抗體Rituxan的重鏈恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域中EU指數(shù)指出的326位Lys或333位Glu時，通過替換，CDC活性最高被增加了大約2倍(非專利文檔36，專利文檔2)。Idusogie等還指出，當(dāng)EU指數(shù)指出的326位Lys或333位Glu被其它氨基酸替代時，大約為IgGl的CDC活性的幾百分之一的IgG2的CDC活性，被增加到了IgGl的CDC活性的大約1/25(專利文檔3到5)。FcyR依賴性活性例如ADCC活性或細胞吞噬活性和CDC活性對于治療性抗體的治療效果來說都是重要的。但是，因為誘導(dǎo)CDC活性的早期階段的Clq結(jié)合和誘導(dǎo)ADCC活性的早期階段的與FcyR的結(jié)合都由抗體Fc介導(dǎo)，因此有可能當(dāng)CDC活性增加時ADCC活性減小。Idusogie等已經(jīng)報道，CDC活性增強的IgG的Fc氨基酸的導(dǎo)入點突變的突變體顯示出了急劇降低的ADCC活性(非專利文檔36)。此外，己經(jīng)知道具有人類IgG恒定區(qū)的抗體的ADCC活性，通過將復(fù)合類型的N-糖苷連接的糖鏈結(jié)構(gòu)(其示意圖顯示在圖2中)添加到CH2結(jié)構(gòu)域中297位的天冬酰胺上而得到了改變(專利文檔6)。盡管有報道說明抗體的ADCC活性的變化依賴于與抗體結(jié)合的糖鏈中半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺的含量(非專利文檔37到40)，但是最影響ADCC活性的物質(zhì)是在還原末端通過a1，6鍵與N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的巖藻糖。具有其中巖藻糖在還原末端沒有結(jié)合N-乙酰葡萄糖胺的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的IgG抗體，與具有其中在還原末端巖藻糖與N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的IgG抗體相比，顯示出明顯高的ADCC活性(非專利文檔41和42，專利文檔7)。其中ccl,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因被敲除的細胞，已知作為產(chǎn)生具有其中巖藻糖在還原末端沒有結(jié)合N-乙酰葡萄糖胺的復(fù)合類型的N-糖苷連接的糖鏈的抗體組成物的細胞(專利文檔7和8)。因為人類IgG3與其它亞類不同，與蛋白A不具有結(jié)合活性(非專利文檔l)，因此當(dāng)作為藥物生產(chǎn)時，它難以純化。直觀地，已經(jīng)知道IgG分子與蛋白A的結(jié)合在CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的交界處，基于X-射線晶體學(xué)，已經(jīng)建議，包含了CH2的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)(免疫球蛋白折疊)中EU指數(shù)標(biāo)明的252到254位和308到312位以及CH3的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)中433到436位的氨基酸的環(huán)狀基團是重要的(非專利文檔43)。核磁共振方法(NMR方法)進一步顯示出，IgGl的CH2中的Ile253、Ser254、His310和Gin311以及CH3中的His433、His435和His436是重要的(非專利文檔44)。此外，Kim等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人類IgGl重鏈恒定區(qū)中的His435被來自IgG3的Arg取代時，與蛋白A的結(jié)合活性降低了(非專利文檔45)。非專利文檔1:《單克隆抗體原理和應(yīng)用》(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications)，Wiley-Liss,Inc.(1995)非專利文檔2:Nature,m,643(1984)非專利文檔3:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,^i，6851(1984)非專利文檔4:Nature,m，522(1986)非專利文檔5:Nature,巡,323(1988)非專利文檔6:Immunol.Today,li，364(2000)非專利文檔7:Immunol.Today,403(2000)非專利文檔8:Ann,AllergyAsthmaImmunol.,ii，105(1998)非專利文檔9:NatureBiotechnol"J^，1015(1998)非專利文檔10:NatureReviewsCancer,丄，119(2001)非專利文檔11:Curr.Opin.Oncol.,辺，548(1998)非專利文檔12:J.Clin.Oncol"J^，2825(1998)非專利文檔13:J.Clin.Oncol"12,268(1999)非專利文檔14:J.Clin.Oncol"12,2639(1999)非專利文檔15:《單克隆抗體原理和應(yīng)用》(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications)，Wiley-Liss,Inc.(1995)非專利文檔16:ChemicalImmunology,88(1997)非專利文檔17:Immunol.Today,576(1999)非專利文檔18:Nature,Hl，323(1988)非專利文檔19:JournalofExperimentalMedicine,巡，1351(1987)非專利文檔20:Biochemistry,U，5175(1976)非專利文檔21:Oncogene,22，7359(2003)非專利文檔22:Blood，2i，754(2002)非專利文檔23:J.Imimmol.,121，3280(2004)非專利文檔24:J.Clin.Oncol"21,1466(2003)非專利文檔25:CancerImmunol.Immunother.，255(1993)非專利文檔26:JournalofExperimentalMedicine,JJ1,1025(1991)非專利文檔27:JournalofExperimentalMedicine,121，1483(1991)非專利文檔28:《免疫學(xué)重要蛋白的序列》(第五版)(SequenceofProteinsofImmunologicalInterest)，第五版(1991)非專利文檔29:Immunology,巡，319(1995)非專利文檔30:J.Immunol"巡，4178(2000)非專利文檔31:Mol.Immunol"1019(1997)非專利文檔32:Mol.Immunol"H,995(2000)非專利文檔33:Scand.J.Immunol"11,517(1990)非專利文檔34:Eur.J.Immunol"21,2379(1991)非專利文檔35:Mol.Immunol"巡，1419(1993)非專利文檔36:J.Immunol"巡,2571(2001)非專利文檔37:HumanAntibHybrid,^143(1994)非專利文檔38:HumAntibHybrid,6,S2(1995)非專利文檔39:Nat.Biotechnol.，il,176(1999)非專利文檔40:Biotechnol.Bioeng.,2i，288(2001)非專利文檔41:J.Biol.Chem.,222，26733(2002)非專利文檔42:J.Biol.Chem.,逃3466(2003)非專利文檔43:Biochemistry,^，2361(1981)非專利文檔44:FEBSLett.,巡，49(1993)非專利文檔45:Eur.J.Immunol"2i,2819(1999)專利文檔1:EP0327378A1專利文檔2:US2003/0158389A1專利文檔3:WO00/42072專利文檔4:US2004/0132101Al專利文檔5:US2005/0054832Al專利文檔6:WO00/61739專利文檔7:WO02/31140專利文檔8:WO03/8510
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明將要解決的問題需要不具有抗原性、具有增強的效應(yīng)子功能例如CDC活性和ADCC活性、并具有改進的治療效果的抗體。此外，需要能夠作為藥物生產(chǎn)的抗體。解決問題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及下列(1)到(25):(1)比人類IgGl抗體和人類IgG3抗體具有更高的補體依賴性細胞毒活性的重組抗體組成物，其中包含人類IgGl抗體Fc區(qū)域中的CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被包含對應(yīng)于Kabat等中的EU指數(shù)(在后文中稱為EU指數(shù))指示的人類IgG3抗體的同樣位置的氨基酸序列的多肽所取代。(2)根據(jù)(l)的重組抗體組成物，進一步具有與人類IgGl抗體基本相等的與蛋白A的結(jié)合活性。(3)根據(jù)(l)的重組抗體組成物，其中包含要被取代的人類IgGl抗體的Fc區(qū)域中的CH2結(jié)構(gòu)域的多肽，是選自下列1到IO的多肽1.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到340位氨基酸序列的多肽；2.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到356位氨基酸序列的多肽；3.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到358位氨基酸序列的多肽；4.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到384位氨基酸序列的多肽；5.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到392位氨基酸序列的多肽；6.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到397位氨基酸序列的多肽；7.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到422位氨基酸序列的多肽；8.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到434位和436到447位氨基酸序列的多肽；9.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到435位氨基酸序列的多肽；以及10.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到447位氨基酸序列的多肽。(4)根據(jù)(2)的重組抗體組成物，其中要被替換的包含人類IgGl抗體的Fc區(qū)域中的CH2結(jié)構(gòu)域的多肽，是選自下列1到8的多肽1.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到340位氨基酸序列的多肽；2.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到356位氨基酸序列的多肽；3.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到358位氨基酸序列的多肽；4.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到384位氨基酸序列的多肽；5.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到392位氨基酸序列的多肽；6.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到397位氨基酸序列的多肽；7.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到422位氨基酸序列的多肽；以及8.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到434位和436到447位的氨基酸序列的多肽。(5)根據(jù)(1)到(4)任何一項的重組抗體組成物，包括在Fc區(qū)域中具有復(fù)合型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子，其中在組成物所含的與Fc區(qū)域結(jié)合的總的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中，巖藻糖沒有與糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的比率，為20%以上。(6)根據(jù)(1)到(4)任何一項的重組抗體組成物組成物，包括在Fc區(qū)域中具有復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子，其中與抗體的Fc區(qū)域結(jié)合的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈?zhǔn)瞧渲袔r藻糖沒有與糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈。(7)編碼(1)到(4)任何一項描述的重組抗體組成物中包含的抗體分子的DNA。(8)編碼(1)到(4)任何一項描述的重組抗體組成物中包含的抗體分子的重鏈恒定區(qū)的DNA。(9)可以通過將(8)中描述的DNA導(dǎo)入宿主細胞而獲得的轉(zhuǎn)化體。(10)根據(jù)(9)中的轉(zhuǎn)化體，其中宿主細胞是對凝集素具有抗性的細胞，該凝集素識別N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過ct-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)。(11)根據(jù)(9)的轉(zhuǎn)化體，其中當(dāng)編碼抗體分子的基因?qū)胨拗骷毎袝r，宿主細胞能夠產(chǎn)生包含在Fc區(qū)域中具有復(fù)合類型的N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子的抗體組成物，其中在組成物所含的與Fc區(qū)域結(jié)合的總的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中，巖藻糖沒有與糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的比率，為20%以上。(12)根據(jù)(11)的轉(zhuǎn)化體，其中巖藻糖沒有結(jié)合的糖鏈，是復(fù)合型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈。(13)根據(jù)(9)的轉(zhuǎn)化體，其中宿主細胞是其中基因組被修飾使得與細胞內(nèi)糖核苷酸、GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶、和/或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾相關(guān)的酶的活性被降低或缺失的細胞。(14)根據(jù)(9)的轉(zhuǎn)化體，其中宿主細胞是其中在基因組上，所有編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸、GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶、和/或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾相關(guān)的酶的等位基因都被敲除的細胞。(15)根據(jù)(13)或(14)的轉(zhuǎn)化體，其中與細胞內(nèi)糖核苷酸、GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶是選自GDP-甘露糖4,6-脫水酶(GMD)和GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶(Fx)的酶。(16)根據(jù)(15)的轉(zhuǎn)化體，其中GDP-甘露糖4，6-脫水酶是選自下列(a)和(b)的DNA編碼的蛋白(a)包含SEQIDNO:18所顯示的核苷酸序列的DNA;(b)在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:18所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白的DNA。(17)根據(jù)(15)的轉(zhuǎn)化體，其中的GDP-甘露糖4,6-脫水酶是選自下列(a)到(c)的蛋白(a)包含SEQIDNO:19所顯示的氨基酸序列的蛋白；(b)在SEQIDNO:19所顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列組成的、并具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白；(c)與SEQIDNO:19所顯示的氨基酸序列具有80。/。以上的同源性的氨基酸序列組成、并具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白。(18)根據(jù)(15)的轉(zhuǎn)化體，其中GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶是選自下列(a)和(b)的DNA編碼的蛋白(a)包含SEQIDNO:20所顯示的核苷酸序列的DNA;(b)在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:20所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有GDP斗酮-6-脫氧-D-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA。(19)根據(jù)(16)的轉(zhuǎn)化體，其中00-4-酮-6-脫氧-0-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶是選自下列(a)到(c)的蛋白(a)包含SEQIDNO:21所顯示的氨基酸序列的蛋白；(b)在SEQIDNO:21所顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列組成的、并具有GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白；(c)與SEQIDNO:21所顯示的氨基酸序列具有80。/。以上的同源性的氨基酸序列組成、并具有GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白。(20)根據(jù)(13)或(14)的轉(zhuǎn)化體，其中與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過ct-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾相關(guān)的酶是al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。(21)根據(jù)(20)的轉(zhuǎn)化體，其中的al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由選自下列(a)到(d)的DNA編碼的蛋白(a)包含SEQIDNO:22所顯示的核苷酸序列的DNA;(b)包含SEQIDNO:23所顯示的核苷酸序列的DNA;(c)在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:22所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有al，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA;(d)在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:23所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有al，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA。(22)根據(jù)(20)的轉(zhuǎn)化體，其中al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是選自下列(a)到(f)的蛋白(a)包含SEQIDNO:24所顯示的氨基酸序列的蛋白；(b)包含SEQIDNO:25所顯示的氨基酸序列的蛋白；(c)在SEQIDNO:24所顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列組成的、并具有al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(d)在SEQIDNO:25所顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個氮基酸的氨基酸序列組成的、并具有al，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(e)與SEQIDNO:24所顯示的氨基酸序列具有80Q/。以上同源性的氨基酸序列組成、并具有al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(f)與SEQIDNO:25所顯示的氨基酸序列具有80。/。以上同源性的氨基酸序列組成、并具有ocl,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。(23)根據(jù)(9)到(22)任何一項的轉(zhuǎn)化體，其中宿主細胞是選自下列(a)到(i)的細胞(a)來自中華倉鼠卵巢組織的CHO細胞；(b)大鼠骨髓瘤細胞系，YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞；(c)小鼠骨髓瘤細胞系，NS0細胞；(d)小鼠骨髓瘤細胞系，SP2/0-Agl4細胞；O)來自敘利亞倉鼠腎臟組織的BHK細胞；(f)產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞；(g)人類白血病細胞系，Namalwa細胞；(h)胚胎干細胞；W受精的卵細胞。(24)生產(chǎn)重組抗體組成物的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(9)到(23)任何一項描述的轉(zhuǎn)化體，以在培養(yǎng)物中形成和積累抗體組成物；以及從培養(yǎng)物中回收和純化抗體組成物。(25)包含(1)到(6)任何一項描述的重組抗體組成物作為活性成分的藥物。發(fā)明的效果本發(fā)明提供了比人類IgGl抗體和人類IgG3抗體具有更高的補體依賴性細胞毒活性的重組抗體組成物，其中含有人類IgGl抗體的Fc區(qū)域中的CH2結(jié)構(gòu)域的多肽，被含有對應(yīng)于根據(jù)Kabat等中的EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體中同樣位置的氨基酸序列的多肽所取代；編碼重組抗體組成物中包含的抗體分子或抗體分子的重鏈恒定區(qū)的DNA;可以通過將重組載體導(dǎo)入宿主細胞而獲得的轉(zhuǎn)化體；使用轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)重組抗體組成物的方法；以及含有重組抗體組成物作為活性成分的藥物。附圖簡述圖l顯示了相應(yīng)的IgG亞類的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。圖2是示意圖，顯示了與IgG抗體的H鏈中297位的天冬酰胺結(jié)合的復(fù)合類型的N-連接的糖鏈的結(jié)構(gòu)。圖3顯示了質(zhì)粒pKANTEX2B8y3的構(gòu)建步驟。圖4是示意圖，顯示了抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體。圖5顯示了質(zhì)粒pKTX93/1133。圖6顯示了質(zhì)粒pKTX93/3311。圖7顯示了在對Daiidi細胞的競爭性抑制分析中，各種不同的CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、抗CD20人類IgGl嵌合抗體和抗CD20人類IgG3嵌合抗體與抗CD20抗體CD20-IgGl(+F)的結(jié)合活性。橫坐標(biāo)顯示了樣品濃度，縱坐標(biāo)顯示了每個樣品濃度的結(jié)合抑制率。圖中的A和▲在圖A到H中是通用的，顯示了陰性對照抗Her2抗體Herceptin(厶)和抗CCR4抗體KM3060(A)。至于圖中的0和*，在每個圖中對應(yīng)的樣品是不同的，在圖A中顯示了CD20-IgGl(+F)(o)和CD20-IgGl(陽F)()，圖B顯示了CD20-IgG3(+F)(o)和CD20誦IgG3(-F)()，圖C顯示了1133(+F)(o)和1133(-F)()，以及圖D顯示了3311(+F)(o)和3311(-F)()。圖8顯示了抗CD20人類IgGl嵌合抗體、抗CD20人類IgG3嵌合抗體和抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體1133和3311對Daudi細胞的CDC活性。橫坐標(biāo)顯示樣品名稱，縱坐標(biāo)顯示CDC活性。圖顯示的是每個樣品在濃度為0.3ng/ml時的CDC活性。圖9顯示了抗CD20人類IgGl嵌合抗體、抗CD20人類IgG3嵌合抗體和1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體對ST486細胞(A)或Raji細胞(B)的CDC活性。橫坐標(biāo)顯示樣品濃度，縱坐標(biāo)顯示每個樣品濃度下的CDC活性。在圖中，口表示CD20-IgGl(+F),醒表示CD20-IgGl(-F)，A表示CD20-IgG3(+F)，A表示CD20-IgG3(-F)，o表示1133(+F)，表示1133(-F)。圖10顯示了抗CD20人類IgGl嵌合抗體、抗CD20人類IgG3嵌合抗體、1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體和3311型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體對Daudi細胞的ADCC活性。橫坐標(biāo)顯示了樣品濃度，縱坐標(biāo)顯示了每個樣品濃度下的ADCC活性。圖中的0和*在每個圖中對應(yīng)的樣品不同，圖A顯示了CD20-IgGl(+F)(o)和CD20-IgGl(-F)(),圖B顯示了CD20-IgG3(+F)(o)和CD20-IgG3(-F)()，圖C顯示了1133(+F)(o)和1133(-F)()，圖D顯示了3311(+F)(o)和3311(-F)()。圖11顯示了在存在抗原CD20的ELISA中，1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、抗CD20人類IgGl嵌合抗體和抗CD20人類IgG3嵌合抗體與可溶的人類FcYRIIa(纈氨酸型)(A到C)或可溶的人類FcYRIIa(苯丙氨酸型)(D到F)的結(jié)合活性。橫坐標(biāo)顯示了樣品濃度，縱坐標(biāo)顯示了每個樣品濃度下的吸光度。圖A和D顯示了CD20-IgGl(-F)(.)和C簡-IgGl(+F)(o)的結(jié)合活性，圖B和E顯示了CD20-IgG3(-F)()和CD20-IgG3(+F)(o)的結(jié)合活性，圖C和F顯示了1133(-F)("和1133(+F)(o)的結(jié)合活性。圖12是示意圖，顯示了抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體。圖13顯示了質(zhì)粒pKANTEX2B8P。圖14顯示了質(zhì)粒pKANTEX93/1133的限制性酶識別位點Apal和Smal的位置。圖15顯示了質(zhì)粒pKANTEX93/1113。圖16顯示了質(zhì)粒pKANTEX93/1131。圖17顯示了純化的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、抗CD20人類IgGl嵌合抗體CD20-IgGl和抗CD20人類IgG3嵌合抗體CD20-IgG3的SDS-PAGE電泳帶型。蛋白用考馬斯亮藍(CBB)染色。1道對應(yīng)于CD20-IgGl，2道對應(yīng)于CD20-IgG3，3道對應(yīng)于1133，4道對應(yīng)于1113。圖18顯示了1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、人類IgGl抗CD20抗體CD20-IgGl和人類IgG3抗CD20抗體CD20-IgG3對ST486細胞(A)或Raji細胞(B)的CDC活性。橫坐標(biāo)顯示了樣品濃度，縱坐標(biāo)顯示在每個樣品濃度下的細胞毒性比率。在圖中，國表示CD20-IgGl，A表示CD20-IgG3，*表示1133，x表示1113，表示1131。圖19顯示了1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體、抗CD20人類IgGl嵌合抗體CD20-IgGl和抗CD20人類IgG3嵌合抗體CD20-IgG3對Daudi細胞的ADCC活性。橫坐標(biāo)顯示了樣品濃度，縱坐標(biāo)顯示了每個樣品濃度下的細胞毒性比率。在圖中，隱表示CD20-IgGl，A表示CD20-IgG3，*表示1133，x表示1113，令表示1131。圖20顯示了通過ELISA分析測量的抗CD20人類IgGl嵌合抗體CD20-IgGl(-F)和CD20-IgGl(+F)以及1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體1133(-F)和1133(+F)與Fc受體家族FqRI(A)或FcyRIIa(B)的結(jié)合活性的結(jié)果。橫坐標(biāo)顯示了樣品濃度，縱坐標(biāo)顯示了每個樣品濃度的吸光度。圖A顯示了CD20-IgGl(-F)(A)、CD20-IgGl(+F)(A)、1133(-F)()和1133(+F)(o)對FcRI的結(jié)合活性，圖B顯示了它們對FcyRIIa的結(jié)合活性。圖21是示意圖，顯示了通過用人類IgGl序列部分替代1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體的CH3結(jié)構(gòu)域而制備的抗體113A、113B、113C、113D、113E、113F、113G和113H的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。在圖中，□所表示的區(qū)域顯示了IgGl的氨基酸序列，國所表示的區(qū)域顯示了IgG3的氨基酸序列，在lgG3區(qū)域的兩端上方顯示的數(shù)字是對應(yīng)于位于兩端的IgG3氨基酸殘基的位置的EU指數(shù)。圖22顯示了不同抗體的表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建步驟，其中1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體的CH3結(jié)構(gòu)域被人類IgGl序列部分取代。圖23顯示了純化的樣品的SDS-PAGE電泳帶型，其中1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體的CH3結(jié)構(gòu)域被人類IgGl序列部分取代。蛋白用考馬斯亮藍(CBB)進行染色。從左邊開始，道對應(yīng)分子量標(biāo)記物、CD20-IgGl(-F)、1133(-F)、113A(-F)、113B(-F)、113C(-F)、113D(-F)、113E(-F)、113F(-F)、113G(-F)和113H(-F)。圖24顯示了其中1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體的CH3結(jié)構(gòu)域被人類IgGl序列部分取代的不同抗體、1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體和1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體對CD20陽性細胞的CDC活性。橫坐標(biāo)顯示了樣品濃度，縱坐標(biāo)顯示了在每個樣品濃度下的CDC活性。在圖中，*(粗線)表示1133(-F)，o(粗線)表示1131(-F)，《(細線)表示113A(-F)，o(細線)表示113B(-F)，A表示113C(-F)，A表示113D(-F)，令表示113E(-F)，O表示113F(-F)，b表示113G(-F)，口表示113H(-F)。圖25顯示了通過ELISA系統(tǒng)測量的其中1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體的CH3結(jié)構(gòu)域被人類IgGl序列部分取代的不同抗體、抗CD20人類IgGl嵌合抗體CD20-IgGl、抗CD20人類IgG3嵌合抗體CD20-IgG3和1133型、1131型和1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體對蛋白A的結(jié)合活性的結(jié)果。橫坐標(biāo)顯示了樣品濃度，縱坐標(biāo)顯示了在各種樣品濃度下的吸光度。圖25A顯示了CD20-IgGl(-F)0)、CD20-IgG3(-F)(o)、1133(-F)(翻)、1131(-F)(口)和1113(-F)(厶)對蛋白A的結(jié)合活性。圖25B顯示了CD20-IgGl(-F)(*)、1133(-F)(聽)、113A(-F)(o)、113B(-F)(口)、U3C(-F)(+)、113D(-F)(*)、113E(-F)(0)、113F(-F)()、U3G(-F)(iO和113H(-F)(A)對蛋白A的結(jié)合活性。圖26顯示了抗CD20人類IgGl嵌合抗體CD20-IgGl和1133型、1131型和113F型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體對CD20陽性CLL細胞系MEC-1(A)、MEC-2(B)或EHEB(C)的CDC活性。橫坐標(biāo)顯示了樣品濃度，縱坐標(biāo)顯示了在每個樣品濃度下的CDC活性。在圖中，分別是o表示CD20-IgGl，*表示1133，A表示1131,A表示113F。圖27顯示了1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換的抗體的表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建步驟。圖2S顯示了抗Campath人類IgGl抗體的表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建步驟。圖29顯示了1131型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換的抗體的表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建步驟。具體實施例方式抗體分子由被稱為H鏈和L鏈的多肽構(gòu)成。同樣，H鏈從N-末端由可變區(qū)(VH)和CH的區(qū)域構(gòu)成，L鏈從N-末端開始由可變區(qū)(VL)和CL的區(qū)域構(gòu)成。CH進一步由CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。結(jié)構(gòu)域是指構(gòu)成抗體分子中每條多肽的功能性組成單位。另夕卜，CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域合起來被稱為Fc區(qū)域。CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和Fc區(qū)域由Kabat等[《免疫學(xué)重要的蛋白的序列》(第五版)SequenceofProteinsofImmunologicalInterest,5thEdition(1991)]的EU指數(shù)所指示的從N-末端起的氨基酸殘基的位置所定義。具體來說，CHl被定義為EU指數(shù)指示的118到215位的氨基酸序列，鉸鏈區(qū)被定義為EU指數(shù)指示的216到230位的氨基酸序列，CH2被定義為EU指數(shù)指示的231到340位的氨基酸序列，CH3被定義為EU指數(shù)指示的341到447位的氨基酸序列.本發(fā)明的重組抗體組成物可以是任何抗體組成物，只要它是比人類IgGl抗體和人類IgG3抗體具有更高的補體依賴性細胞毒活性的重組抗體組成物，在人類IgGl的重鏈恒定區(qū)中的CH1、鉸鏈區(qū)、CH2禾口CH3結(jié)構(gòu)域被交換到對應(yīng)于IgG3的結(jié)構(gòu)域中(在后文中稱為結(jié)構(gòu)域交換的抗體)的重組抗體組成物中，其中含有人類IgGl抗體的Fc區(qū)域中的CH2結(jié)構(gòu)域的多肽，被含有對應(yīng)于Kabat等的EU指數(shù)指示的人類lgG3抗體中同樣位置的氨基酸序列的多肽所取代。本發(fā)明的重組抗體組成物可以是任何抗體組成物，只要它是具有重鏈恒定區(qū)、具有與靶分子有結(jié)合活性的抗體或重鏈恒定區(qū)、以及具有與靶分子的結(jié)合活性的融合蛋白。與耙分子具有結(jié)合活性的抗體包括人類嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體。具有重鏈恒定區(qū)和與靶分子的結(jié)合活性的融合蛋白包括，在靶分子是配體的情況下是配體的受體與重鏈恒定區(qū)的融合蛋白；在靶分子是受體的情況下，是受體的配體與重鏈恒定區(qū)的融合蛋白；具有與靶分子的結(jié)合活性的抗體或抗體片段與重鏈恒定區(qū)的融合蛋白；等等。人類嵌合抗體是包含非人類動物抗體的VH和VL、以及人類抗體的CH和CL的抗體。非人類的動物可以是任何動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠或兔，只要可以從其制備雜交瘤就行。本發(fā)明的人類嵌合抗體能夠通過從產(chǎn)生多克隆抗體的雜交瘤獲得編碼VH和VL的cDNAs、將它們插入到含有編碼人類抗體的CH和CL的DNA的用于動物細胞的表達載體中從而構(gòu)建人類嵌合抗體表達載體、然后將載體引入動物細胞以表達抗體來產(chǎn)生。任何CH都能用作人類嵌合抗體的CH，只要它屬于人類免疫球蛋白(hlg)，并且優(yōu)選那些屬于hlgG類別的，可以使用屬于hlgG類別的任何一個亞類，例如W、y2、W和Y4。任何CL都可以用作人類嵌合抗體的CL，只要它屬于hlg類別，可以使用那些屬于K類別或人類別的。人源化抗體是其中非人類動物抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列被嫁接到人類抗體的VH和VL的適當(dāng)位置中的抗體。本發(fā)明的人源化抗體能夠通過構(gòu)建編碼其中非人類動物抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列被嫁接到任何人類抗體的VH和VL的FR中的V區(qū)域的cDNA、將它們插入到含有編碼人類抗體的CH和CL的DNA的用于動物細胞的表達載體中從而構(gòu)建人源化抗體表達載體、然后將表達載體引入動物細胞以表達人源化抗體來產(chǎn)生。任何CH都可以用作源化抗體的CH，只要它屬于hlg，優(yōu)選hIgG類別的，并且可以使用屬于hlgG類別的任何一個亞類，例如yl、Y2、Y3和i4。任何CH都可以用作人類CDR嫁接的抗體的CL，只要它屬于hlg類別，可以使用屬于K類別或i類別的。人類抗體本來是在人體中天然存在的抗體，但是它也包括從人類抗體噬菌體文庫或產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因動物中獲得的抗體，它們是在遺傳工程、細胞工程和發(fā)育工程技術(shù)的最新進展的基礎(chǔ)上制備的。在人體中存在的抗體可以通過例如分離人類外周血淋巴細胞、通過用EB病毒等進行感染以使其永生、然后克隆它從而獲得能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細胞、對這樣得到的淋巴細胞進行培養(yǎng)、并從培養(yǎng)物純化抗體來制備。人類抗體噬菌體文庫是通過將編碼從人類B細胞制備的抗體的基因插入到噬菌體基因中，而將抗體片段例如Fab和scFv表達在噬菌體表面上的文庫。表達具有所需抗原結(jié)合活性的抗體片段的噬菌體，可以利用其與固定抗原的底物的結(jié)合活性作為標(biāo)記，從文庫中回收?？贵w片段可以通過遺傳工程技術(shù)進一步轉(zhuǎn)化到含有兩個完整H鏈和兩個完整L鏈的人類抗體分子中。產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因動物是其中人類抗體基因被整合到細胞中的動物。具體來說，產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因動物可以通過將編碼人類抗體的基因?qū)胄∈驟S細胞、將ES細胞移植到其它小鼠的早期胚胎中、然后使其發(fā)育來制備。從產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因動物通過通常在非人類的哺乳動物中進行的雜交瘤制備方法獲得產(chǎn)生人類抗體的雜交瘤、培養(yǎng)獲得的雜交瘤并在培養(yǎng)物中形成和積累人類抗體來制備人類抗體。與靶分子具有結(jié)合活性的抗體片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、雙抗體、dsFv、含有CDR的肽等。Fab是分子量大約50,000并具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中在用蛋白酶木瓜蛋白酶(剪切H鏈第224位的氨基酸殘基)處理IgG獲得的片段中，大約一半的H鏈N-末端側(cè)與全部的L鏈通過二硫鍵(S-S鍵)結(jié)合在一起。用蛋白酶胃蛋白酶(剪切H鏈第224位的氨基酸殘基)處理IgG獲得的片段中，F(xiàn)(ab')2是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，分子量大約為100,000，略微大于其中Fab通過鉸鏈區(qū)的S-S鍵結(jié)合結(jié)合的抗體片段的分子量。Fab'是分子量大約為50,000并具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，通過剪切F(ab')2鉸鏈區(qū)中的S-S鍵而獲得。scFv是VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其中一條鏈VH和一條鏈VL使用具有12個或更多的殘基的適當(dāng)?shù)碾慕宇^(P)連接，它是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。雙抗體是其中具有相同或不同的抗原結(jié)合特異性的scFv形成了二聚體的抗體片段，對于相同的抗原或?qū)Σ煌目乖哂袃煞N特異性抗原結(jié)合活性。dsFv是通過將其中每個VH和VL的一個氨基酸殘基用半胱氨酸殘基取代的多肽，通過半胱氨酸殘基之間的S-S鍵結(jié)合在一起獲得的。含有CDR的肽通過包括至少一個或多個VH或VL的CDR區(qū)域構(gòu)建成的。含有CDR的多個肽可以通過直接結(jié)合或通過適當(dāng)?shù)碾慕宇^來產(chǎn)生。具體來說，本發(fā)明的重組抗體組成物包括其中含有人類IgGl抗體的Fc區(qū)域中的CH2結(jié)構(gòu)域的多肽是選自下列1到IO的多肽的重組組成物1.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到340位氨基酸序列的多肽；2.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到356位氨基酸序列的多肽；3.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到358位氨基酸序列的多肽；4.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到384位氨基酸序列的多肽；5.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到392位氨基酸序列的多肽；6.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到397位氨基酸序列的多肽；7.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到422位氨基酸序列的多肽；8.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到434位和436到447位氨基酸序列的多肽；9.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到435位氨基酸序列的多肽；以及10.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到447位氨基酸序列的多肽.本發(fā)明的重組抗體組成物中CL區(qū)域的氨基酸序列可以是人類抗體的氨基酸序列，或來自非人類的動物的氨基酸序列，但是優(yōu)選為人類抗體的CK或C人氨基酸序列。在本發(fā)明的重組抗體組成物的可變區(qū)中，VH和VL可以是任何人類抗體的氨基酸序列、非人類動物抗體的氨基酸序列或這些氨基酸序列的混合氨基酸序列。具體來說，它們包括了構(gòu)成雜交瘤產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)、構(gòu)成人源化抗體的可變區(qū)、構(gòu)成人類抗體的可變區(qū)等。雜交瘤是通過用抗原免疫非人類的哺乳動物獲得的B細胞和來自小鼠等的骨髓瘤細胞之間進行細胞融合而獲得的細胞，能夠產(chǎn)生具有所需抗原特異性的單克隆抗體。因此，構(gòu)成雜交瘤產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)由非人類動物抗體的氨基酸序列組成。本發(fā)明的重組抗體組成物包括具有任何特異性的抗體，優(yōu)選為識別腫瘤相關(guān)抗原的抗體、識別過敏或炎癥相關(guān)抗原的抗體、識別與心血管疾病相關(guān)抗原的抗體、識別與自身免疫疾病相關(guān)抗原的抗體或識別病毒或細菌感染相關(guān)抗原的抗體。識別腫瘤相關(guān)抗原的抗體包括抗GD2抗體[AnticancerRes.,U,331(1993)]、抗GD3抗體[CancerImmunol.Immunother.，1^，260(1993)]、抗GM2抗體[CancerRes.,M，1511(1994)]、抗HER2抗體[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，M，4285(1992)]、抗CD52抗體[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,4285(1992)]、抗MAGE抗體[BritishJ,Cancer,M,493(2000)]、抗HM1.24抗體[MolecularImmunol.,387(1999)]、抗甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)抗體[Cancer，M，2卯9(2000)]、抗堿性成纖維細胞生長因子抗體、抗成纖維細胞生長因子8抗體[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,^，9911(1989)]、抗堿性成纖維細胞生長因子受體抗體、抗成纖維細胞生長因子8受體抗體[J.Biol.Chem.，^i，16455(1990)]、抗胰島素樣生長因子抗體[J.Neurosci.Res.,迎，647(1995)]、抗胰島素樣生長因子受體抗體[J.Neurosci.Res.,迎，647(1995)]、抗PMSA抗體[丄Urology,巡，2396(1998)]、抗血管內(nèi)皮細胞生長因子抗體[CancerRes.，12，4593(1997)]、抗血管內(nèi)皮細胞生長因子受體抗體[Oncogene，ii,2138(2000)]、抗CD20抗體[Curr.Opin.Oncol.，548(1998)]、抗Her2抗體、抗CD10抗體等。識別過敏或炎癥相關(guān)抗原的抗體包括抗白介素6抗體[Imrmmo1.Rev.,122，5(1992)]、抗白介素6受體抗體[MolecularImmunol.,U，371(1994)]、抗白介素5抗體[Immunol.Rev.,HZ,5(1992)]、抗白介素5受體抗體、抗白介素4抗體[Cytokine，1,562(1991)]、抗白介素4受體抗體[J.Immunol.Meth.,212，41(1998)]、抗腫瘤壞死因子抗體[Hybridoma,ii，183(1994)]、抗腫瘤壞死因子受體抗體[MolecularPharmacol.,237(2000)]、抗CCR4抗體[Nature,璧，776(1999)]、抗趨化因子抗體[Perietal.，J.Immuno.Meth.，jJ4，249-257(1994)]、抗趨化因子受體抗體[J.Exp.Med.，iM，1373(1997)]等。識別與心血管疾病相關(guān)抗原的抗體包括抗GpIIb/IIIa抗體[J.Immunol.,J^l,2968(1994)]、抗血小板源生長因子抗體[Science，m，1129(1991)]、抗血小板源生長因子受體抗體[J.Biol.Chem.,222，17400(1997)]、抗凝血因子抗體[Circulation，巡，1158(2Q00)]等。識別與病毒或細菌感染相關(guān)抗原的抗體包括抗gpl20抗體、抗CD4抗體[J.Rheumatology,21，2065(1998)]、抗CCR5抗體和抗Vero毒素抗體[J.Clin.Microbiol.,H，396(1999)]等。本發(fā)明的重組抗體組成物，通過將含有Fc區(qū)域中CH2結(jié)構(gòu)域的多肽用含有對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體中同樣位置的氨基酸序列的多肽取代，具有了比人類IgGl抗體和人類IgG3抗體更高的CDC活性。此外，本發(fā)明的重組抗體組成物包括具有比人類IgGl抗體和人類IgG3抗體更高的補體依賴性細胞毒活性、并具有與人類IgGl抗體基本上相等的與蛋白A的結(jié)合活性的重組抗體組成物，其中含有人類IgGl抗體Fc區(qū)域中CH2結(jié)構(gòu)域的多肽，被含有對應(yīng)于根據(jù)Kabat等的EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體的同樣位置的氨基酸序列的多肽所取代。具體來說，例子包括其中包含人類IgGl抗體Fc區(qū)域中的CH2結(jié)構(gòu)域的多肽是選自下列1到8的多肽的重組抗體組成物1.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到340位氨基酸序列的多肽；2.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到356位氨基酸序列的多肽；3.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到358位氨基酸序列的多肽；4.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到384位氨基酸序列的多肽；5.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到392位氨基酸序列的多肽；6.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到397位氨基酸序列的多肽；7.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到422位氨基酸序列的多肽；以及8.包含EU指數(shù)指示的IgGl抗體的231到434位和436到447位氨基酸序列的多肽。與蛋白A的結(jié)合活性能夠通過ELISA、表面等離子共振等來測量。具體來說，使抗體組成物與板上的固相蛋白A進行反應(yīng)，然后進一步與識別不同標(biāo)記的抗體的抗體進行反應(yīng)，通過確定與蛋白A結(jié)合的抗體組成物能夠測量出結(jié)合活性。此外，使抗體組成物與結(jié)合到載體例如瓊脂糖上的蛋白A在高pH例如pH大約5到8的條件下進行反應(yīng)，接著清洗，然后通過測定在低pH例如pH約2到5的條件下洗脫的抗體組成物，能夠測量結(jié)合活性。抗體分子中的Fc區(qū)域包含與N-糖苷連接的糖鏈結(jié)合的區(qū)域。因此，每個抗體分子結(jié)合兩條糖鏈。N-糖苷連接的糖鏈包括復(fù)合類型的糖鏈，其中核心結(jié)構(gòu)的非還原末端側(cè)包含一個或多個平行的半乳糖-N-乙酰葡萄糖胺側(cè)鏈(在后文中稱為"Gal-GlcNAc")，而Gal-GlcNAc的非還原末端側(cè)進一步含有唾液酸、對分的N-乙酰葡萄糖胺或其它結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中，復(fù)合類型的N-糖苷連接的糖鏈由下式表示士FucQf1土GaljS1+4GIcNAcS1+2Mana1、+66土GlcNAc^1+4Man31+4GlcNAc/31+化lcNAc3土Gal)S14GlcNAci812ManQf1在本發(fā)明的重組抗體組成物中，在N-糖苷連接的糖鏈的Fc區(qū)域中包含抗體分子的重組抗體組成物，能夠包含具有同樣的糖鏈結(jié)構(gòu)的抗體分子或具有不同糖鏈結(jié)構(gòu)的抗體分子，只要它們具有上述的糖鏈結(jié)構(gòu)就行。也就是說，本發(fā)明的重組抗體組成物是指包含了具有相同或不同的糖鏈結(jié)構(gòu)的重組抗體分子的組成物。此外，在本發(fā)明的重組抗體中，抗體組成物包含了在Fc區(qū)域中具有復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子，其中巖藻糖沒有與糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈在組成物所包含的與Fc區(qū)結(jié)合的總的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中的比率為20%以上，所述抗體組成物的ADCC活性和CDC活性高。在本發(fā)明中，其中沒有結(jié)合巖藻糖的糖鏈可以在還原末端具有任何糖鏈，只要巖藻糖沒有結(jié)合到上式中還原末端的N-乙酰葡萄糖胺上。在本發(fā)明中，巖藻糖沒有結(jié)合到糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺上的情況意味著基本上沒有結(jié)合巖藻糖。其中基本上沒有結(jié)合巖藻糖的抗體組成物具體是指其中巖藻糖基本上檢測不到的抗體組成物，即進行下面第4項中描述的糖鏈分析時，巖藻糖的含量低于檢測限。其中所有糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺沒有結(jié)合巖藻糖的重組抗體組成物ADCC活性最高。在包含在Fc區(qū)具有復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子的組成物中，其所含糖鏈的還原末端的N-乙酰葡萄糖胺沒有結(jié)合巖藻糖的糖鏈的比率，可以通過使用己知的方法例如肼解或酶法消化[BiochemicalExperimentationMethods23-《研究糖蛋白的糖鏈的方法》MethodforStudyingGlycoproteinSugarChain(日本科學(xué)學(xué)會出版社，JapanScientificSocietiesPress),ReikoTakahashi主編(1989)]將糖鏈從抗體分子上釋放、對釋放的糖鏈進行熒光標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記、然后通過層析分離標(biāo)記的糖鏈來測定。還有，被釋放的糖鏈也能通過用HPAED-PAD方法[J.Liq.Chromatogr.,5,1577(1983)]分析它來測定。產(chǎn)生本發(fā)明的重組抗體組成物的轉(zhuǎn)化體可以通過將動物細胞表達載體導(dǎo)入動物細胞來獲得，在該表達載體中插入了編碼抗體分子可變區(qū)和恒定區(qū)的DNA。動物細胞表達載體的構(gòu)建如下。每個上述編碼CH和CL的DNA被導(dǎo)入到用于動物細胞的表達載體以產(chǎn)生動物細胞的表達載體。動物細胞的表達載體包括pAGE107(日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.22979/91;MiyajiH等，Cytotechnology，2,133-140(1990))、pAGE103(MizukamiT.和ItohS.,J.Biochem.，肌1307-1310(1987))、pHSG274(BradyG.等，Gene，22，223-232(1984))、pKCR(O'HareK.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA"^1527-1531(1981))、pSGl降4(MiyajiH.等，Cytotechnology,4，173-180(19卯))等。用于動物細胞表達載體的啟動子和增強子包括SV40早期啟動子和增強子(MizukamiT.和ItohS.,J.Biochem.,巡,1307-1310(1987))、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR啟動子和增強子(KuwanaY.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960-968(1987))、免疫球蛋白H鏈啟動子(MasonJ.O.等，Cell,li,479-487(1985))和增強子(GilliesS.D.等，Cell,U,717-728(1983))等。用于重組抗體組成物的表達的載體可以是其中編碼H鏈和L鏈的基因存在于分開的載體上的類型，或者兩種基因都存在于同樣的載體上的類型(串聯(lián)類型)。根據(jù)構(gòu)建重組抗體組成物表達載體的容易性、導(dǎo)入到動物細胞中的容易性以及抗體的H和L鏈在動物細胞中的表達量之間的平衡，串聯(lián)類型的表達重組抗體組成物的載體更為優(yōu)選(ShitaraK.等，J.Immunol.Methods,巡271-278(1994)))。表達重組抗體組成物的串聯(lián)類型載體包括pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18(BentleyK.J.等,Hybridoma,U，559-567(1998))等。編碼針對不同抗原的抗體的VH和VL的cDNA被克隆到用于表達重組抗體組成物構(gòu)建的載體中編碼CH和CL的DNA的上游，從而構(gòu)建了重組抗體組成物表達載體。將表達載體導(dǎo)入宿主細胞的方法包括電穿孔法(日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.257891-90;MiyajiH.等,Cytotechnology,2，133-140(1990))等。產(chǎn)生本發(fā)明的重組抗體組成物的宿主細胞可以是通常用于生產(chǎn)重組蛋白的任何宿主細胞，例如動物細胞、植物細胞或微生物。生產(chǎn)本發(fā)明的重組抗體組成物的宿主細胞包括來自中華倉鼠卵巢組織的CHO細胞、大鼠骨髓瘤細胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞、小鼠骨髓瘤細胞系NS0細胞、小鼠骨髓瘤SP2/0-Agl4細胞、來自敘利亞倉鼠腎臟組織的BHK細胞、人類白血病細胞系Namalwa細胞、使用骨髓瘤細胞和任何B細胞產(chǎn)生的雜交瘤細胞、通過用抗原免疫使用胚胎干細胞或受精卵細胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人類動物而獲得的B細胞與任何骨髓瘤細胞產(chǎn)生的雜交瘤細胞；用上述骨髓瘤細胞和通過用抗原免疫使用胚胎干細胞或受精卵細胞等產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人類動物而獲得的B細胞產(chǎn)生的雜交瘤細胞。能夠表達具有高ADCC活性和CDC活性的重組抗體組成物的宿主細胞包括對凝集素具有抗性的宿主細胞，該凝集素識別復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中，l-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)，例如能夠產(chǎn)生含有在Fc區(qū)具有復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子的抗體組成物的宿主細胞，其中在組成物所包含的與Fc區(qū)域結(jié)合的總的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中，巖藻糖沒有與糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的比率為20%以上。例子包括其中至少一個下述蛋白的活性被降低或缺失的細胞等(a)與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶蛋白；(b)與糖鏈的修飾相關(guān)的酶蛋白，其中在復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中，l-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合；(c)與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運到高爾基體相關(guān)的蛋白。上述宿主細胞優(yōu)選為宿主細胞中編碼al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因被敲除的宿主細胞(WO02/31140、WO03/85107)。與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶蛋白可以是任何酶，只要它是與作為向糖鏈供應(yīng)的巖藻糖源的細胞內(nèi)糖核苷酸一一GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶。與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶包括對細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖等的合成有影響的酶。細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖通過從頭合成途徑或補救合成途徑供應(yīng)。因此，所有與合成途徑相關(guān)的酶都被包括在與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶中。與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的從頭合成途徑相關(guān)的酶包括GDP-甘露糖4，6-脫水酶(在后文中稱為"GMD")、GDP-酮-6-脫氧甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶、4，6-還原酶(在后文中稱為"Fx")等。與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的補救合成途徑相關(guān)的酶包括GDP-(3-L-巖藻糖焦磷酸化酶(在后文中稱為"GFPP")、巖藻糖激酶等。作為影響細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成的酶，也包括對于與上述細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成途徑有關(guān)的酶活性有影響的酶，以及對于作為酶底物的物質(zhì)結(jié)構(gòu)有影響的酶，GDP-甘露糖4,6-脫水酶包括(a)包含SEQIDNO:18所顯示的核苷酸序列的DNA;(b)在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:18所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白的DNA，等等。GDP-甘露糖4，6-脫水酶包括(a)包含SEQIDNO:19所顯示的氨基酸序列的蛋白；(b)由SEQIDNO:19所顯示的氨基酸序列中一個或多個氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列組成、并具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白(c)由與SEQIDNO:19所顯示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列組成、并具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白；等等。GDP-4—酮-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶包括(a)包含SEQIDNO:20所顯示的核苷酸序列的DNA;(b)在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:20所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA;等等。GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶包括(a)包含SEQIDNO:21所顯示的氨基酸序列的蛋白；(b)由在SEQIDNO:21所顯示的氨基酸序列中一個或多個氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列組成、并具有GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白；(c)由與SEQIDNO:21所顯示的氨基酸序列具有80。/。以上同源性、并具有GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶活性的氨基酸序列組成的蛋白；在復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過cx-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)，與其修飾相關(guān)的酶蛋白包括任何酶，只要它是在復(fù)合類型的N-糖苷連接的糖鏈中，與l-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的反應(yīng)相關(guān)的酶。在復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中，與l-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的反應(yīng)相關(guān)的酶，包括對在復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中的l-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺的結(jié)合反應(yīng)有影響的酶。例子包括al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、a-L-巖藻糖苷酶等。此外，與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺的結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的酶，包括對復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中與l-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺的結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的酶的活性有影響的酶，以及對于作為酶底物的物質(zhì)結(jié)構(gòu)有影響的酶。在本發(fā)明中，al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是被下列(a)、(b)、(c)或(d)的DNA編碼的蛋白(a)包含SEQIDNO:22所顯示的核苷酸序列的DNA;(b)包含SEQIDNO:23所顯示的核苷酸序列的DNA;(c)在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:22所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有cd,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA;(d)在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:23所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有ocl,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA，或(e)包含SEQIDNO:24所顯示的氨基酸序列的蛋白；(f)包含SEQIDNO:25所顯示的氨基酸序列的蛋白；(g)由SEQIDNO:24所顯示的氨基酸序列中一個或多個氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列組成、并具有ctl,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(h)由SEQIDNO:25所顯示的氨基酸序列中一個或多個氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列組成、并具有ocl，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(i)由與SEQIDNO:24所顯示的氨基酸序列具有80。/。以上同源性的氨基酸序列組成、并具有al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(j)由與SEQIDNO:25所顯示的氨基酸序列具有80。/。以上同源性的氨基酸序列組成、并具有al，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；等等。與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖向高爾基體的運輸有關(guān)的蛋白可以是任何蛋白，只要它是與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖向高爾基體的運輸有關(guān)的蛋白，或是對于細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖向高爾基體的運輸?shù)姆磻?yīng)有影響的蛋白。與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖向高爾基體的運輸有關(guān)的蛋白包括GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運蛋白等。此外，對于細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖向高爾基體的運輸?shù)姆磻?yīng)有影響的蛋白包括對于上述與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖向高爾基體的運輸有關(guān)的蛋白的活性有影響或?qū)ζ浔磉_有影響的蛋白。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的氨基酸序列的DNA包括包含SEQIDNO:18或20所顯示的核苷酸序列的DNA;在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:18或20所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的活性的蛋白的DNA;等等。編碼al，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的DNA包括包含SEQIDNO:22或23所顯示的核苷酸序列的DNA;在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:22或23所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有061,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA;等等。獲得其中上述酶活性被降低或缺失的細胞的方法可以是任何方法，只要它是降低或缺失目的酶活性的方法。例子包括(a)耙定編碼酶的基因的基因破壞；(b)導(dǎo)入編碼酶的基因的顯性失活突變體；(c)在酶中導(dǎo)入突變；(d)抑制編碼酶的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯；(e)選擇對凝集素具有抗性的細胞系，該凝集素識別在N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)；作為在N-糖苷連接的糖鏈中識別l-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素來說，可以使用任何能夠識別糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素。具體的例子包括扁豆凝集素LCA(來自兵豆(Lensculinaris)的扁豆凝集素)、豌豆凝集素PSA(來自豌豆(Pisumsativum)的豌豆凝集素)、蠶豆凝集素VFA(來自蠶豆(Viciafaba)的凝集素)、橙黃網(wǎng)孢盤菌(Aleuriaaurantia)凝集素AAL(來自橙黃網(wǎng)孢盤菌的凝集素)等。"對凝集素有抗性的細胞"是指其生長不被有效濃度的凝集素的存在所抑制的細胞。"有效濃度"是高于不允許基因組修飾之前的細胞(在后文中也被稱為親本細胞系)正常生長的濃度，優(yōu)選等于不允許基因組修飾之前的細胞正常生長的濃度、更優(yōu)選2到5倍、更加優(yōu)選10倍、最優(yōu)選20或更多倍于不允許基因組基因修飾之前的細胞正常生長的濃度。不抑制生長的凝集素的有效濃度可以根據(jù)每個細胞系適當(dāng)確定。它通常為10jig/ml至lJ10mg/ml，優(yōu)選為0.5mg/ml至U2.0mg/ml。下面將對生產(chǎn)本發(fā)明的重組抗體組成物的方法進行詳細的解釋。1.生產(chǎn)重組抗體組成物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的重組抗體組成物可以通過，例如，使用在《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning,SecondEdition)、《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法——抗體實驗室手冊》(CurrentProtocolsinMolecularBiology;Antibodies;ALaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratory(1988))(在后文中稱為《抗體》)、《單克隆抗體原理與應(yīng)用》(第三版)(MonoclonalAntibodies:principlesandpractice,ThirdEdition;Acad.Press(1993))(在后文中稱為《單克隆抗體》)、《抗體工程實用方法》(AntibodyEngineering,APracticalApproach;OxfordUniversityPress的IRLPress,1996)(在后文中稱為《抗體工程》)等中描述的方法，以例如下面的方式將其在宿主細胞中表達來獲得。(1)用于表達本發(fā)明的重組抗體組成物的載體的構(gòu)建用于表達本發(fā)明的重組抗體組成物的載體是用于動物細胞的表達載體，其中導(dǎo)入了編碼包含在本發(fā)明抗體組成物中的抗體分子的H鏈和L鏈恒定區(qū)的基因。用于表達重組抗體組成物的載體可以通過將每個編碼重組抗體組成物中包含的抗體分子的H鏈和L鏈恒定區(qū)的基因克隆到動物細胞表達載體中來構(gòu)建。編碼本發(fā)明重組抗體組成物中包含的抗體分子的CH區(qū)域的基因可以通過克隆編碼IgGl和IgG3抗體的恒定區(qū)的基因、然后將編碼相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的基因片段相連接來產(chǎn)生。此外，全部DNA也可以通過使用合成DNA來合成，也能進行利用PCR的合成(《分子克隆》第二版)。此外，可以通過組合這些技術(shù)來生產(chǎn)。動物細胞的表達載體可以是任何載體，只要能夠?qū)氩⒈磉_上述編碼抗體分子的恒定區(qū)的基因。例子包括pKANTEX93[Mol.Immunol.,11,1035(2000)]、pAGE107[Cytotechnology,1,133(19卯)、pAGE103[J.Biochem.，巡，1307(1987)]、pHSG274[Gene,22,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2^,1527(1981)]、pSGl/3d2陽4[Cytotechnology,4，173(1990)]等。用于動物細胞的表達載體的啟動子和增強子包括SV40早期啟動子和增強子(J.Biochem.，皿，1307-1310(1987))、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR(Biochem,Bi叩hys.Res.Commun.，巡,960-968(1987))、免疫球蛋白H鏈啟動子(Cell,41，479-487(1985))和增強子(Cell,H,717-728(1983))等。用于表達本發(fā)明的重組抗體組成物的載體可以是其中編碼抗體的H鏈和L鏈的基因存在于分開的載體上的類型，或者兩種基因都存在于同樣的載體上的類型(串聯(lián)類型)。根據(jù)構(gòu)建用于表達本發(fā)明的重組抗體組成物的載體的容易性、導(dǎo)入到動物細胞中的容易性以及抗體的H和L鏈在動物細胞中的表達量之間的平衡，串聯(lián)類型的表達人源化抗體的載體更為優(yōu)選(J.Immunol.Methods,167,271(1994))。構(gòu)建的用于表達本發(fā)明的重組抗體組成物的載體可以用于在動物細胞中表達人類嵌合抗體和人源化抗體。(2)獲得編碼非人類動物抗體的V區(qū)的cDNA編碼非人類動物的抗體例如小鼠抗體的VH和VL的cDNA可以以下面的方式獲得。cDNA可以通過將從產(chǎn)生任何抗體的雜交瘤細胞提取的mRNA作為探針來合成。合成的cDNA被克隆到載體例如噬菌體或質(zhì)粒中以獲得cDNA文庫。通過使用編碼已知的小鼠抗體的C區(qū)或V區(qū)的cDNA作為探針，從文庫中分離出每個包含編碼H鏈V區(qū)的cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒以及包含編碼L鏈V區(qū)的cDNA的的重組噬菌體或重組質(zhì)粒。在重組噬菌體或重組質(zhì)粒上，所關(guān)注的小鼠抗體的VH和VL的全長核苷酸序列被測定，并從核苷酸序列推算出VH和VL的全長氨基酸序列。產(chǎn)生任何非人類動物來源的抗體的雜交瘤細胞，可以通過用與抗體結(jié)合的抗原免疫非人類動物、從被免疫的動物的抗體產(chǎn)生細胞和根據(jù)已知方法的骨髓瘤細胞[《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning,SecondEdition)、《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法——抗體實驗室手冊》(CurrentProtocolsinMolecularBiology;Antibodies,ALaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratory(1988))(在后文中稱為《抗體》)、《單克隆抗體原理與應(yīng)用》(第三版)(MonoclonalAntibodies:principlesandpractice,ThirdEdition,Acad.Press(1993))(在后文中稱為《單克隆抗體》)、《抗體工程實用方法》(AntibodyEngineering,APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,1996)(在后文中稱為《抗體工程》)制備雜交瘤細胞、篩選克隆的雜交瘤、培養(yǎng)選定的雜交瘤以及從培養(yǎng)上清液純化細胞來獲得。作為非人類的動物來說，可以使用任何動物，只要可以從該動物制備雜交瘤細胞。適合的動物包括小鼠、大鼠、倉鼠和兔。從雜交瘤細胞制備總RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟乙酸銫方法[MethodsinEnzymol.，114，3(1987)]，從總RNA制備mRNA的方法包括固定了寡聚(dT)的纖維素柱方法[《分子克隆，實驗室手冊》MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLab.Press(1989)]。從雜交瘤細胞制備mRNA的試劑盒的例子包括FastTrackmRNA分離試劑盒(Invitrogen制造)禾BQuickPrepmRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)。合成cDNA和制備cDNA文庫的方法包括常規(guī)的方法[《分子克隆，實驗室手冊》MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLab.Press(1989)，《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》附錄1-34,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1-34]，或使用可商購的試齊廿盒的方法，例如用于cDNA合成和質(zhì)粒克隆的Superscript質(zhì)粒系統(tǒng)(GIBCOBRL制造)和ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene制造)。在cDNA文庫的制備中，用于整合使用從雜交瘤細胞提取的mRNA作為模板合成的cDNA的載體可以是任何載體，只要能夠整合cDNA。適合的載體的例子包括ZAPExpress[Strategies,i,58(1992)]、pBluescriptIISK(+)[NucleicAcidsResearch,U,9494(1989)]、人ZAPII(STRATAGENE制造)、入gt10、入gtll[DNACloning:APracticalApproach,!，49(1985)]、LambdaBlueMid(Clontech制造)、入ExCell、pT7T318U(Pharmacia制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.，2，280(1983)]、pUC18[Gene，11,103(1985)]等。作為用于導(dǎo)入用噬菌體或質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫的大腸桿菌來說，可以使用任何大腸桿菌，只要能夠?qū)?、表達和維持cDNA文庫。適合的大腸桿菌的例子包括XL1-BlueMRF'[Strategies,i,81(1992)]、C600[Genetics,!￡，440(1954)],Y1088,Y1090[Science,巡，778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol"巡，1(1983)〗，K802[J,Mol.Biol.，118(1966)]、JM105[Gene,M，275(1985)]等。從cDNA文庫選擇編碼非人類動物來源的抗體的VH和VL的cDNA克隆的方法包括使用放射性同位素或熒光標(biāo)記的探針的克隆雜交或噬菌斑雜交[《分子克隆，實驗室手冊》MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)]。也可以通過制備引物并使用cDNA或cDNA文庫作為模板進行PCR[《分子克隆，實驗室手冊》MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989),《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》附錄1-34，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1-34],來制備編碼VH禾卩VL的cDNA。通過上述方法選出的cDNA的核苷酸序列的測定可以通過用適當(dāng)?shù)南拗菩悦讣羟衏DNA，將片段克隆到質(zhì)粒例如pBluescriptSK(-)(STRATAGENE制造)中，然后通過普遍使用的核苷酸序列分析方法例如Sanger等的雙脫氧方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，24，5463(1977)〗或通過使用核苷酸序列分析儀例如ABIPRISM377DNA測序儀(AppliedBiosystems制造)來分析序列。從測定的核苷酸序列推導(dǎo)VH和VL的全長氨基酸序列，并與己知抗體的VH和VL全長氨基酸序列[《免疫學(xué)重要的蛋白的序列》，美國衛(wèi)生與人類月艮務(wù)部，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,USDept.HealthandHumanServices(1991)]進行比較，通過它可以證實獲得的cDNA編碼的氨基酸序列完全包含了包括分泌信號序列的抗體的VH和VL。此外，當(dāng)抗體可變區(qū)的氨基酸序列或編碼可變區(qū)的DNA的核苷酸序列己知時，可以通過下面的方法獲得DNA。當(dāng)氨基酸序列已知時，可以通過考慮密碼子使用頻率[《免疫學(xué)重要的蛋白的序列》，美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,USDept.HealthandHumanServices(1991)]來設(shè)計編碼可變區(qū)的DNA序列、在設(shè)計的DNA序列的基礎(chǔ)上合成幾條構(gòu)成大約100個核苷酸的合成的DNA、并使用合成的DNA進行PCR來獲得DNA。當(dāng)核苷酸序列已知時，可以通過在核苷酸序列信息的基礎(chǔ)上合成幾條構(gòu)成大約100個核苷酸的合成的DNA并使用合成的DNA進行PCR來獲得DNA。(3)分析來自非人類動物的抗體V區(qū)域的氨基酸序列通過將包含分泌信號序列的抗體的VH和VL的全長氨基酸序列與已知抗體的VH和VL的氨基酸序列[《免疫學(xué)重要的蛋白的序列》，美國衛(wèi)生與人類月艮務(wù)咅卩，SequencesofProteinsofImmunologicalInterestUSDept.HealthandHumanServices(1991)]進行比較，可能可以推斷出分泌信號序列的長度和N-末端氨基酸序列，并進一步了解抗體所屬的亞類。此外，以類似的方式能夠推斷出VH和VL的CDR的氨基酸序列。(4)人類嵌合抗體表達載體通過將編碼非人類動物的抗體的VH和VL的cDNA插入到在上面1(l)中描述的用于表達重組抗體組成物的載體中編碼人類抗體的CH和CL的基因上游的位點中，能夠構(gòu)建人類嵌合抗體表達載體。例如，可以通過將編碼非人類動物的抗體的VH和VL的cDNA，分別與包含非人類動物的抗體的VH和VL的3'-末端核苷酸序列和人類抗體的CH和CL的5'-末端核苷酸序列、并且還在兩個末端都具有適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R別序列的合成的DNA相連接，并將它們插入到在上面1(1)中描述的用于重組抗體組成物的載體中編碼人類抗體的CH和CL的基因上游的位點中以便以適當(dāng)?shù)男问絹肀磉_它們，來構(gòu)建人類嵌合抗體表達載體。(5)構(gòu)建編碼人源化抗體的V區(qū)域的cDNA編碼人源化抗體的VH和VL的cDNA能夠以下面的方式來構(gòu)建。首先，選擇人類抗體VH和VL的FR的氨基酸序列，用于嫁接來自非人類動物抗體VH和VL的CDR。人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列可以是任何來自人類抗體的那些。適合的序列包括在數(shù)據(jù)庫例如蛋白數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank)注冊的人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列，以及對于人類抗體的VH和VL的FR的亞類來說是共同的氨基酸序列[《免疫學(xué)重要的蛋白的序列》，美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,USDept.HealthandHumanServices(1991)]。為了制備具有足夠活性的人源化抗體，優(yōu)選選擇與所需的非人類動物來源抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列具有盡可能高的同源性(至少60%以上)的氨基酸序列。接下來，將所需的非人類動物來源抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列嫁接到選定的人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列中，設(shè)計人源化抗體的VH和VL的氨基酸序列?？紤]到在抗體基因的核苷酸序列中密碼子使用的頻率[《免疫學(xué)重要的蛋白的序列》，美國衛(wèi)生與人類月艮務(wù)部，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,USDept.HealthandHumanServices(1991)]，將設(shè)計的氨基酸序列轉(zhuǎn)化為DNA序列，設(shè)計出編碼人源化抗體VH和VL的氨基酸序列的DNA序列。根據(jù)設(shè)計的DNA序列，合成幾條構(gòu)成大約100個核苷酸的合成的DNA，并使用合成的DNA進行PCR。考慮到PCR的反應(yīng)效率和能夠合成的DNA長度，優(yōu)選為每條H鏈和L鏈設(shè)計4到6條合成的DNAs。通過將適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R別序列導(dǎo)入存在于兩個末端的合成的DNA的5'-末端，能夠容易地進行在上面1(l)中構(gòu)建的用于本發(fā)明重組抗體組成物的表達的載體中的克隆。在PCR后，擴增產(chǎn)物被克隆到質(zhì)粒例如pBluescriptSK(-)(STRATAGENE制造)中，通過在上面1(2)中描述的方法來測定核苷酸序列，以獲得帶有DNA序列的質(zhì)粒，所述DNA編碼所需的人源化抗體的VH和VL的氨基酸序列。(6)修飾人源化抗體的V區(qū)的氨基酸序列已經(jīng)知道，僅僅通過將非人類動物來源的抗體的VH和VL的CDR嫁接到人類抗體的VH和VL的FR中而制備的人源化抗體，與原來的非人類動物來源的抗體相比具有較低的抗體結(jié)合活性[BIO/TECHNOLOGY,2,266(1991)]。這可能是因為在原來的非人類動物來源的抗體的VH和VL中，不僅CDR而且FR中的某些氨基酸殘基也直接或間接地參與了抗原結(jié)合活性，而這些氨基酸殘基通過CDR嫁接被人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸殘基所取代。為了解決這個問題，己經(jīng)嘗試了通過鑒別在人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接涉及與抗原結(jié)合的氨基酸殘基、或通過與CDR中氨基酸殘基的相互作用或維持抗體的三維結(jié)構(gòu)間接涉及與抗原結(jié)合的氨基酸殘基，并將這樣的氨基酸殘基修飾成從原來的非人類動物來源的抗體的氨基酸殘基，從而制備出提高了被降低的抗原結(jié)合活性的人源化抗體[BIO/TECHNOLOGY，2，266(1991)]。在人源化抗體的制備中，最重要的是有效鑒別出FR中與抗原結(jié)合活性相關(guān)的氨基酸殘基。為了有效鑒別，通過X-射線晶體學(xué)[J.Mol.Biol"iU，535(1977)]、計算機建模[ProteinEngineering,1501(1994)]等，已經(jīng)進行了抗體的三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和分析。盡管這些對抗體三維結(jié)構(gòu)的研究提供了許多對人源化抗體的制備有用的信息，但還沒有建立用來制備可以被改造成任何類型抗體的人源化抗體的方法。也就是說，目前仍然需要進行試錯法，例如對每個抗體制備幾種修飾，并檢查每種修飾與抗原結(jié)合活性的關(guān)系。人類抗體的VH和VL的FR中的氨基酸殘基的修飾，可以使用用于修飾的合成的DNA，通過在上面1(5)中描述的PCRs來完成。PCR擴增產(chǎn)物的核苷酸序列通過上面1(2)中描述的方法來測定，以證實所需的修飾己經(jīng)完成。(7)構(gòu)建人源化抗體表達載體人源化抗體表達載體的構(gòu)建，可以通過將在上面1(5)和(6)中構(gòu)建的編碼人源化抗體的VH和VL的cDNA插入到在上面1(1)中描述的用于本發(fā)明重組抗體組成物的表達載體中編碼人類抗體的CH和CL的基因的上游位點中來進行。例如，人源化抗體表達載體的構(gòu)建，可以通過將適合的限制性酶的識別序列導(dǎo)入到用于構(gòu)建上面1(5)和(6)中人源化抗體的VH和VL的合成的DNA中在兩端存在的合成DNA的5'末端上，并將它們插入到在上面1(1)中描述的用于本發(fā)明重組抗體組成物表達的載體中編碼人類抗體的CH和CL的基因的上游位點中來進行，以便以適合的形式來表達它們。(8)人源化抗體的穩(wěn)定生產(chǎn)能夠穩(wěn)定生產(chǎn)人類嵌合抗體或人源化抗體的轉(zhuǎn)化體可以通過將上面1(4)和(7)中描述的人類嵌合抗體或人源化抗體表達載體導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)膭游锛毎衼慝@得。將人源化抗體表達載體導(dǎo)入動物細胞中可以通過電穿孔法[日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.257891/90;Cytotechnology，1,133(1990)]等來進行。作為用于導(dǎo)入人類嵌合抗體或人源化抗體表達載體的動物細胞來說，可以使用任何能夠產(chǎn)生人類嵌合抗體或人源化抗體的動物細胞。動物細胞的例子包括小鼠骨髓瘤細胞系NSO和SP2/0、中華倉鼠卵巢細胞CHO/dhfr-禾口CHO/DG44、大鼠骨髓瘤細胞系YB2/0和IR983F、敘利亞倉鼠腎臟來源的BHK細胞以及人類骨髓瘤細胞系Namalwa。優(yōu)選的是中華倉鼠卵巢細胞CHO/DG44和大鼠骨髓瘤細胞系YB2/0。在導(dǎo)入人類嵌合抗體或人源化抗體表達載體之后，能夠穩(wěn)定生產(chǎn)人類嵌合抗體或人源化抗體的轉(zhuǎn)化體，可以使用含有試劑例如G418硫酸鹽(在后文中稱為G418，SIGMA制造)的用于動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，按照在日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.257891/90中描述的方法進行選擇。用于動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的例子包括RPMI1640培養(yǎng)基(NissuiPharmaceuticalCo.，Ltd.制造)、GIT培養(yǎng)基(NihonPharmaceuticalCo.,Ltd.制造)、EX-CELL302培養(yǎng)基(JRH制造)、IMDM培養(yǎng)基(GIBCOBRL制造)、Hybridoma-SFM培養(yǎng)基(GIBCOBRL制造)、以及通過向這些培養(yǎng)基中添加各種添加劑例如胎牛血清(在后文中稱為FCS)而制備的培養(yǎng)基。通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化體，可以在培養(yǎng)上清液中形成和積累人類嵌合抗體和人源化抗體。在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的人類嵌合抗體和人源化抗體的量和抗原結(jié)合活性可以通過酶聯(lián)免疫吸附分析[在后文中稱為ELISA;《抗體實驗室手冊》第14章Antibodies:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory,Chapter14(1998);《單克隆抗體原理和應(yīng)用》MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPressLimited(1996)]等來測量。轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的人類嵌合抗體或人源化抗體的量，可以利用DHFR基因擴增系統(tǒng)等，按照在日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.257891/90中描述的方法來增加。人類嵌合抗體或人源化抗體可以使用蛋白A柱[《抗體實驗室手冊》第八章，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,Chapter8(1988);《單克隆抗體原理和應(yīng)用》MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPressLimited(1996)]，從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液中純化。此外，也可以使用純化蛋白所普遍使用的純化方法。例如，可以通過凝膠過濾、離子交換層析、超濾等的組合來進行純化。純化的人類嵌合抗體或人源化抗體的H鏈、L鏈或整個抗體分子的分子量可以通過SDS-變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(后文中稱為SDS-PAGE;Nature,680(1970))、Western印跡[《抗體實驗室手冊》，第12章，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,Chapter12(1988);《單克隆抗體原理和應(yīng)用》MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPressLimited(1996)]等來測量。上面顯示的是使用動物細胞作為宿主生產(chǎn)抗體組成物的方法?？贵w組成物也可以使用酵母、昆蟲細胞、植物細胞、動物個體或植物個體通過類似的方法來生產(chǎn)。因此，等宿主細胞能夠表達抗體分子時，本發(fā)明的抗體組成物可以通過將編碼抗體的基因?qū)氡磉_抗體分子的宿主細胞、將細胞進行培養(yǎng)、從培養(yǎng)物中純化所需的抗體組成物來生產(chǎn)。當(dāng)使用酵母作為宿主細胞時，YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等可以用作表達載體。作為啟動子來說，任何能夠在酵母菌株中表達的啟動子都可以使用。適合的啟動子包括糖酵解途徑的基因的啟動子，例如己糖激酶、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal1啟動子、gall0啟動子、熱休克蛋白啟動子、MFocl啟動子和CUP1啟動子。適合的宿主細胞的例子是屬于酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維斯酵母屬(Kluyveromyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)和許旺酵母屬(Schwanniomyces)的微生物，特別是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克魯維斯酵母(Kluyveromyceslactis)、叢生絲孢酵母(Trichosporonpullulans)、Schwanniomycesdluvius等o重組載體的導(dǎo)入可以通過任何用于將DNA導(dǎo)入酵母的方法來進行，例如電穿孑L[MethodsEnzymol.,1M，182(1990)]、原生質(zhì)球方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,M，1929(1978)]、乙酸鋰方法[J.Bacteriology,iH，163(1983)]以及在Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2i,1929(1978)中描述的方法。當(dāng)使用動物細胞作為宿主細胞時，pcDNAI、pcDM8(可以從FunakoshiCo.,Ltd.商購)、pAGE107[日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.22979/91;Cytotechnology，1,133(19卯)]、pAS3-3(日本公布的未經(jīng)審査的專利申請No.227075闊、pCDM8[Nature,塑,840(1987)〗、pcDNAI/Amp(InvitrogenCorp.制造)、pREP4(InvitrogenCorp.制造)、pAGE103[J.Biochemistry,巡，1307(1987)]、pAGE210等可以用作表達載體。作為啟動子來說，任何能夠在動物細胞中表達的啟動子都可以使用。適合的啟動子包括巨細胞病毒(CMV)IE(立即早期)基因的啟動子、SV40早期啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRoc啟動子等。人類CMV的IE基因的增強子可以與啟動子組合使用。適合的宿主細胞的例子是人類來源的Namalwa細胞、猴來源的COS細胞、中華倉鼠來源的CHO細胞、HBT5637(日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.299/88)、大鼠骨髓瘤細胞、小鼠骨髓瘤細胞、來自敘利亞倉鼠腎臟的細胞、胚胎干細胞、受精卵細胞等。當(dāng)使用昆蟲細胞作為宿主細胞時，蛋白可以通過《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)、《桿狀病毒表達載體，實驗室手冊》(BaculovirusExpressionVectors,ALaboratoryManual,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1992))、Bio/Technology,&47(1988)等中描述的方法來表達。也就是說，表達載體和桿狀病毒被共轉(zhuǎn)染到昆蟲細胞中，以便在昆蟲細胞的培養(yǎng)上清液中獲得重組病毒，然后用重組病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，從而可以表達蛋白。用于本方法的基因?qū)胼d體包括pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(InvitrogenCorp.公司產(chǎn)品)等。桿狀病毒的例子是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，它是感染屬于夜蛾科(Barathra)的昆蟲的病毒。昆蟲細胞的例子是草地貪夜蛾(Spod叩terafrugiperda)卵巢細胞Sf9和Sf21[《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)、《桿狀病毒表達載體，實驗室手冊》(BaculovirusExpressionVectors,ALaboratoryManual,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1992)]和粉紋夜蛾(Trichoplusiani)卵巢細胞High5(由InvitrogenCorp.公司生產(chǎn))。上述表達載體和上述桿狀病毒向昆蟲細胞中的共轉(zhuǎn)染以制備重組病毒可以通過磷酸鈣方法(日本公布的未經(jīng)審査的專利申請No.227075/90)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,M，7413(1987)]等來進行。當(dāng)使用植物細胞作為宿主細胞時，可以使用Ti質(zhì)粒、煙草花葉病毒載體等作為表達載體。作為啟動子來說，任何能夠在植物細胞中表達的啟動子都可以使用。適合的啟動子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子、水稻肌動蛋白1啟動子等。適合的宿主細胞的例子是植物的細胞，例如煙草、土豆、西紅柿、胡蘿卜、大豆、油菜、苜蓿、水稻、小麥和大麥。重組載體的導(dǎo)入可以通過將DNA導(dǎo)入植物細胞的任何方法來進行，例如使用土壤桿菌(Agrobacterium)的方法(日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.140885/84和70080/85、WO94/00977)、電穿孔(日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.251887/85)和使用微粒槍(基因槍)的方法(日本專利No.2606856和2517813)。重組載體的導(dǎo)入可以通過任何用于將DNA導(dǎo)入動物細胞的方法來進行，例如電穿孔[Cytotechnology,^133(1990)]、磷酸鈣方法(日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.227075/90)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,M,7413(1987)]、注射方法(《操作小鼠胚胎實驗室手冊》ManipulatingtheMouseEmbryo,ALaboratoryManual)、使用微粒槍(基因槍)的方法(日本專利No.2606856和2517813)、DEAE-右旋糖苷方法[《生物手冊叢書4一一基因轉(zhuǎn)移、表達和分析的方法》BiomanualSeries4-MethodsofGeneTransfer,ExpressionandAnalysis(Yodosha),TakashiYokota和KenichiArai主編(1994)]和病毒載體方法(《操作小鼠胚胎實驗室手冊》ManipulatingtheMouseEmbryo,ALaboratoryManual)。編碼抗體的基因的表達不僅可以通過直接表達、而且可以通過按照《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning,SecondEdition)中描述的方法分泌生產(chǎn)、表達Fc區(qū)域和其它蛋白等的融合蛋白來進行。抗體組成物可以通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述獲得的轉(zhuǎn)化體、使抗體分子在培養(yǎng)基中形成和積累、并從培養(yǎng)基中回收它們來生產(chǎn)。轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)可以通過常規(guī)的培養(yǎng)宿主細胞的方法來進行。為了培養(yǎng)通過使用真核細胞例如酵母作為宿主獲得的轉(zhuǎn)化體，任何天然的培養(yǎng)基和合成的培養(yǎng)基都可以使用，只要它是含有碳源、氮源、無機鹽等可以被所用的宿主同化的物質(zhì)的適合有效培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的土昔養(yǎng)基。作為碳源而言，任何可以被宿主同化的碳源都可以使用。適合的碳源的例子包括碳水化合物例如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它們的糖蜜、淀粉和淀粉水解物；有機酸例如乙酸和丙酸；醇類例如乙醇和丙醇。作為氮源而言，氨，有機或無機酸的銨鹽例如氯化銨、硫酸銨、乙酸銨和磷酸銨，和其它含氮化合物，以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浸液、酪蛋白水解物、大豆餅、大豆餅水解物、以及各種發(fā)酵的微生物細胞及其被消化的產(chǎn)物都可以使用。無機鹽的例子包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。培養(yǎng)通常在需氧條件下進行，例如通過搖動培養(yǎng)或在通氣條件下水下旋動培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度優(yōu)選為15到40°C，培養(yǎng)時間通常為16小時到7天。培養(yǎng)過程中pH被維持在3.0到9.。pH的調(diào)整通過使用有機或無機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等來進行。如果需要，在培養(yǎng)過程中可以加入抗生素例如氨芐青霉素和四環(huán)素。當(dāng)使用可誘導(dǎo)的啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物進行培養(yǎng)時，如果需要，可以在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物。例如，在用使用lac啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物的情況下，可以在培養(yǎng)基中加入異丙基-Z-D-硫代半乳糖吡喃糖苷等；在使用trp啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物的情況下，可以加入吲哚丙烯酸等。為了培養(yǎng)通過使用動物細胞作為宿主獲得的轉(zhuǎn)化體，常用的培養(yǎng)基例如RPMI1640培養(yǎng)基[TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation,，，519(1967)]、Eagle'sMEM培養(yǎng)基[Science,巡，501(1952)]、Dulbecco's修改的MEM培養(yǎng)基[Virology,&396(1959)]、199培養(yǎng)基[ProceedingoftheSocietyfortheBiologicalMedicine,21,1(1950)]和Whitten's培養(yǎng)基[《發(fā)育工程實驗手冊一一轉(zhuǎn)基因小鼠的制備》DevelopmentalEngineeringExperimentationManual-PreparationofTransgenicMice(Kodansha),MotoyaKatsuki主編(1987)]、通過向這些培養(yǎng)基中加入胎牛血清等而制備的培養(yǎng)基可以用作培養(yǎng)基。培養(yǎng)通常在在5%C02存在下，在pH6.0至U8.0、溫度30到40。C的條件下進行1到7天。如果需要，在培養(yǎng)過程中可以向培養(yǎng)基中加入抗生素例如卡那霉素和青霉素。為了培養(yǎng)通過使用昆蟲細胞作為宿主獲得的轉(zhuǎn)化體，常用的培養(yǎng)基例如TNM-FH培養(yǎng)基(Pharmingen,Inc.生產(chǎn))、Sf-900IISFM培養(yǎng)基(LifeTechnologies,Inc.生產(chǎn))、ExCell400禾QExCell405(JRHBiosciences,Inc.生產(chǎn))禾卩Grace's昆蟲培養(yǎng)基[Nature,1^1,788(1962)]可以被用作培養(yǎng)基。培養(yǎng)通常在pH6.0到7.0、溫度25到30°C的條件下進行1到5天。如果需要，在培養(yǎng)過程中可以向培養(yǎng)基中加入抗生素例如慶大霉素。通過使用植物細胞作為宿主獲得的轉(zhuǎn)化體可以以細胞本身的形式或在分化成植物細胞或植物器官后進行培養(yǎng)。為了培養(yǎng)這樣的轉(zhuǎn)化體，常用的培養(yǎng)基例如Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基和White培養(yǎng)基、通過向這些培養(yǎng)基中加入植物激素例如植物生長素和細胞分裂素而制備的培養(yǎng)基等可以用作培養(yǎng)基。培養(yǎng)通常在pH5.0到9.0、溫度20到40°C的條件下進行3到60天。如果需要，在培養(yǎng)過程中可以向培養(yǎng)基中加入抗生素例如卡那霉素和潮霉素。如上所述，通過按照常規(guī)的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)來自動物細胞或植物細胞、并且?guī)в衅渲姓狭司幋a抗體分子的DNA的表達載體的轉(zhuǎn)化體，使抗體組成物形成和積累，并從培養(yǎng)物中回收抗體組成物來生產(chǎn)抗體制劑。編碼抗體的基因的表達不僅可以通過直接表達、而且可以通過按照《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning,SecondEdition)中描述的方法進行分泌生產(chǎn)、融合蛋白表達等來進行。抗體組成物可以通過在宿主細胞中進行細胞內(nèi)表達來生產(chǎn)，可以通過從宿主細胞向細胞外分泌來生產(chǎn)，或者可以在宿主細胞的外膜上生產(chǎn)。所需的生產(chǎn)方法可以通過改變所用的宿主細胞的類型或要生產(chǎn)的抗體分子的結(jié)構(gòu)來改造。當(dāng)抗體組成物在宿主細胞中或宿主細胞外膜上產(chǎn)生時，可能可以通過使用Paulson等的方法[J.Biol.Chem.,巡，17619(1989)]、Lowe等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，M，8227(1989);GenesDevelop"么1288(1990)]、或者在日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.336963/93、WO94/23021等中描述的方法，迫使抗體組成物被分泌到宿主細胞之外。也就是說，可能可以通過將編碼抗體分子的DNA和編碼適合表達的抗體分子的信號肽的DNA插入到表達載體中，將表達載體導(dǎo)入宿主細胞、然后通過使用重組DNA技術(shù)來表達抗體分子，從而迫使所需的抗體分子被分泌到宿主細胞外。通過利用基因擴增系統(tǒng)，使用了二氫葉酸還原酶基因等，按照曰本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.227075/90中描述的方法，增加產(chǎn)生的抗體組成物的量也是可能的。此外，可以使用通過使導(dǎo)入了基因的動物或植物細胞重新分化而構(gòu)建的導(dǎo)入了基因的動物個體(非人類轉(zhuǎn)基因動物)或?qū)肓嘶虻闹参飩€體(轉(zhuǎn)基因植物)來生產(chǎn)抗體組成物。當(dāng)轉(zhuǎn)化體是動物個體或植物個體時，可以通過以常規(guī)的方式飼養(yǎng)或栽培動物或植物，使抗體組成物在其中形成和積累，并從動物個體或植物個體收集抗體組成物來生產(chǎn)抗體組成物。使用動物個體來生產(chǎn)抗體組成物可以通過在通過按照現(xiàn)有的方法導(dǎo)入基因而構(gòu)建的動物中生產(chǎn)所需的抗體組成物來進行。在動物個體的情況下，抗體組成物的生產(chǎn)可以通過，例如，飼養(yǎng)其中導(dǎo)入了編碼抗體分子的DNA的非人類轉(zhuǎn)基因動物，使抗體組成物在動物中形成和積累，并從動物中收集抗體組成物來進行?？贵w組成物形成并積累的位置包括動物的乳汁(日本公布的未經(jīng)審查的專利申請No.309192/88)、蛋等。作為本方法中的啟動子來說，可以使用任何能夠在動物中表達的啟動子。優(yōu)選的啟動子包括哺乳動物腺體細胞特異性啟動子例如a酪蛋白啟動子、(3酪蛋白啟動子、(3乳球蛋白啟動子和乳清酸性蛋白啟動子。使用植物個體生產(chǎn)抗體組成物，可以通過例如按照現(xiàn)有的方法[SoshikiBaiyo(TissueCulture),^(1994);SoshikiBaiyo(TissueCulture)11(1995);TrendsinBiotechnology,U，45(1997)]，栽培導(dǎo)入了編碼抗體分子的DNA的轉(zhuǎn)基因植物，使抗體組成物在植物中形成和積累，并從植物中收集抗體組成物來進行。當(dāng)其中導(dǎo)入了編碼抗體分子的基因的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的抗體組成物以可溶的形式表達在細胞中時，在培養(yǎng)完成后通過離心回收細胞，懸浮在水性緩沖液中，然后使用超聲破碎儀、French壓力破碎儀、MantonGaulin勻漿器、細胞磨(Dynomill)等破碎細胞以獲得無細胞提取液?？贵w組成物純化制劑的獲得可以通過將無細胞提取液離心獲得上清液，然后對上清液實行用于分離和純化酶所常用的方法，例如用溶劑提取、用硫酸銨等進行鹽析、脫鹽、用有機溶劑沉淀、使用樹脂例如二乙基氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖和DIAIONHPA-75(MitsubishiChemicalCorporation生產(chǎn))進行陰離子交換層析、使用樹脂例如S-瓊脂糖FF(Pharmacia生產(chǎn))進行陽離子交換層析、使用樹脂例如丁基瓊脂糖和苯基瓊脂糖進行疏水層析、使用分子篩進行凝膠過濾、親和層析、層析聚焦和電泳例如等電聚焦，這些方法可以單獨或組合使用。當(dāng)抗體組成物作為不溶體表達在細胞中時，細胞類似地回收并破壁，然后離心，將抗體組成物的不溶形式作為沉淀的級份回收?；厥盏目贵w組成物的不溶體用蛋白變性試劑使其溶解。將溶解化的抗體溶液稀釋或透析，由此將抗體組成物復(fù)性以具有正常的三維結(jié)構(gòu)。然后，可以通過與上述相同的分離和純化步驟獲得抗體組成物的純化制劑。當(dāng)抗體組成物被分泌到細胞外時，可以在培養(yǎng)上清液中回收抗體組成物或其衍生物。也就是說，通過與上述相同的方法例如離心處理培養(yǎng)物，以獲得培養(yǎng)上清液?？贵w組成物的純化制劑可以從培養(yǎng)上清液中通過使用與上述相同的分離和純化方法來獲得。2.制備本發(fā)明的重組抗體組成物產(chǎn)生細胞產(chǎn)生在本發(fā)明的重組抗體組成物中具有高ADCC活性和高CDC活性的重組抗體組成物的細胞，可以通過使用下面的技術(shù)制備用于產(chǎn)生本發(fā)明的重組抗體組成物的宿主細胞，然后將上面l(4)和(7)中描述的人類嵌合抗體或人源化抗體表達載體導(dǎo)入宿主細胞中來生產(chǎn)。具體來說，選擇的細胞是其中與結(jié)合在抗體分子的Fc區(qū)域的N-糖苷連接的糖鏈的修飾有關(guān)的酶(即與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶)和/或與復(fù)合類型的N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈修飾有關(guān)的酶被失活的細胞，或通過下面描述的各種人工技術(shù)獲得的細胞可以用作宿主細胞。詳細情況描述如下。(1)耙定編碼酶的基因的基因破壞技術(shù)用于生產(chǎn)產(chǎn)生具有髙ADCC活性的抗體(在后文中稱為高ADCC活性抗體)的細胞的宿主細胞，可以通過基因破壞技術(shù)來制備，該技術(shù)耙定編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的例子包括GDP-甘露糖4，6-脫水酶(在后文中稱為GMD)和GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶(在后文中稱為Fx)。與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的例子包括ocl,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、a-L-巖藻糖苷酶等。本文所用的基因包括DNA和RNA?；蚱茐牡姆椒梢允侨魏文軌蚱茐木幋a酶的基因的方法?？捎玫姆椒òǚ戳x方法、核酶方法、同源重組方法、RNA-DNA寡聚核苷酸方法(在后文中稱為RDO方法)、RNA干擾方法(在后文中稱為RNAi方法)、使用反轉(zhuǎn)錄病毒的方法和使用轉(zhuǎn)座子的方法等。這些方法在下面具體描述。(a)通過反義方法或核酶方法制備用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞可以通過在CellTechnology,U，239(1993)、BIO/TECHNOLOGY，U,1097(1999)、Hum.Mol.Genet"i,1083(1995)、CellTechnology,11，255(1994)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,M,1886(1999)等中描述的反義方法或核酶方法來制備，這些方法以例如下面的方式，靶定的基因編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶。制備cDNA或基因組DNA，其編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶。測定制備的cDNA或基因組DNA的核苷酸序列?；跍y定的DNA序列，設(shè)計適當(dāng)長度的反義基因或核酶，它們包含DNA部分、非翻譯區(qū)和內(nèi)含子，所述DNA部分編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶。為了在細胞中表達反義基因或核酶，通過將制備的DNA的片段或全長插入到適當(dāng)?shù)谋磉_載體中啟動子下游的位點中，制備重組載體。通過將重組載體導(dǎo)入適合表達載體的宿主細胞，可以獲得轉(zhuǎn)化體。用于生產(chǎn)重組抗體組成物的宿主細胞，所述抗體組成物包含在Fc區(qū)域具有復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子、其中本發(fā)明組成物中包含的與Fc區(qū)結(jié)合的總的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺沒有結(jié)合巖藻糖的糖鏈的比率為20%或以上，該宿主細胞可以通過使用與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過CC-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性作為指標(biāo)，選擇轉(zhuǎn)化體來獲得。用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞也可以通過使用細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)，選擇轉(zhuǎn)化體來獲得。作為用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞來說，可以使用任何酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等，只要它具有編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。宿主細胞的例子包括在上面1中描述的那些。可以使用的表達載體是在上述宿主細胞中能夠自主復(fù)制或整合到染色體中、并在適合轉(zhuǎn)錄設(shè)計的反義基因或核酶的位置含有啟動子的表達載體。表達載體的例子包括在上面的1中描述的那些。將基因?qū)氩煌乃拗骷毎梢酝ㄟ^適合將將重組載體導(dǎo)入上面1中描述的不同宿主細胞的方法來進行。使用與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性作為指標(biāo)，選擇轉(zhuǎn)化體可以通過例如下面的方法來進行。篩選轉(zhuǎn)化體的方法其中與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性被缺失的細胞，可以通過使用在日本生物化學(xué)學(xué)會主編的ShinSeikagakuJikkenKoza(《生物化學(xué)實驗新講義》3-糖，糖蛋白NewLecturesonExperimentsinBiochemistry)3-SaccharidesI，Glycoprotein(TokyoKagakuDojin)(1988)、NaoyukiTaniguchi、AkemiSuzuki、KiyoshiFurukawa禾卩KazuyukiSugawara主編的《細胞技術(shù)》(附加版)實驗方法叢書《糖生物學(xué)實驗方法，糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖》(CellTechnology,ExtraEdition,ExperimentalProtocolSeries,GlycobiologyExperimentalProtocol,Glycoprotein,GlycolipidandProteoglycan(Shujunsha)，editedbyNaoyukiTaniguchi,AkemiSuzuki,KiyoshiFurukawaandKazuyukiSugawara(1996))、《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning,SecondEdition)、《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)等中描述的生物化學(xué)方法或基因工程技術(shù)，測定與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性來進行選擇。生物化學(xué)方法的例子是使用酶特異性底物評估酶活性的方法?；蚬こ碳夹g(shù)的例子包括測量編碼酶的基因的mRNA量的Northern分析和RT-PCR。使用細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化體可以通過例如在下面2(5)中描述的方法來進行。使用產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化體，可以通過例如在下面4或5中描述的方法來進行。制備編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過^鍵與還原末端的6-位>^-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的cDNA，可以通過例如下面的方法來進行。cDNA的制備方法從不同的宿主細胞組織或細胞制備總RNA或mRNA。從獲得的總RNA或mRNA制備cDNA文庫。根據(jù)與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的氨基酸序列，制備簡并引物，并且使用制備的cDNA文庫作為模板，通過PCR獲得編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因片段。使用獲得的基因片段作為探針，通過篩選cDNA文庫，可以獲得編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的DNA。作為人類或非人類動物組織或細胞的mRNA來說，可以使用可商購的(例如Ckmtech生產(chǎn)的)，或者可以以下面的方式從人類或非人類動物組織或細胞中制備。從人類或非人類動物組織或細胞中制備總RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟乙酸銫方法[MethodsinEnzymol"154,3(1987)]、酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)方法[AnalyticalBiochemistry,巡，156(1987);ExperimentalMedicine,9,1937(1991)]等。從總RNA中制備作為poly(A)+RNA的mRNA的方法包括固定了寡聚(dT)的纖維素柱的方法(《分子克隆》(第二版)MolecularCloning,SecondEdition)。也可以通過使用可商購的試劑盒，例如FastTrackmRNA分離試劑盒(Invitrogen制造)或QuickPrepmRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)，來制備mRNA。從獲得的人類或非人類動物組織或細胞的mRNA制備cDNA文庫。制備cDNA文庫的方法包括在《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning,SecondEdition)、《分子生物學(xué)當(dāng)前方法，實驗室手冊》(第二版)(CurrentProtocolsinMolecularBiology;ALaboratoryManual,2ndEd.(1989))等中描述的方法，以及使用可商購的試劑盒例如用于cDNA合成和質(zhì)?？寺〉腟uperscript質(zhì)粒系統(tǒng)(LifeTechnologies制造)和ZAP-cDNA合成試劑盒(STRATAGENE制造)的方法。作為用于制備cDNA文庫的克隆載體來說，可以使用任何載體，例如噬菌體載體和質(zhì)粒載體，只要它們能夠在大腸桿菌K12中自主復(fù)制。適合的載體的例子包括ZAPExpress[STRATAGENE制造；Strategies,5，58(1992)]、pBluescriptIISK(+)[NucleicAcidsResearch,12，9494(1989)]、人ZAPII(STRATAGENE制造)、入gt10、入gtl1[《DNA克隆實用方法》DNACloning,APracticalApproach,j[,49(1985)]、入TriplEx(Clontech制造)、入ExCell(Pharmacia制造)、pT7T318U(Pharmacia制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol"1,280(1983)]、pUC18[Gene,M，103(1985)〗等。任何微生物都可以用作制備cDNA文庫的宿主微生物，但是優(yōu)選使用大腸桿菌。適合的宿主微生物的例子是大腸桿菌XL1-BlueMRF[STRATAGENE制造；Strategies,1，81(1992)]、大腸桿菌C600[Genetics:^￡，440(1954)]、大腸桿菌Y1088[Science,221，778(1983)]、大腸桿菌Y1090[Science,巡，778(1983)]、大腸桿菌NM522[J.Mol.Biol.,巡，1(1983)]、大腸桿菌K802[丄Mol.Biol.,i￡118(1966)]、大腸桿菌JM105[Gene，M，275(1985)]等。cDNA文庫本身可以用于下面的分析?；蛘撸瑸榱送ㄟ^降低部分cDNA的比率以有效獲得全長的cDNA，使用由Sugano等[Gene,1M，171(1994);Gene,塑，149(1997);Protein,NucleicAcidandEnzyme,603(1996);ExperimentalMedicine,JJ_，2491(1993);cDNACloning(Yodosha)(1996);MethodsforPreparingGeneLibraries(Yodosha)(1994)]開發(fā)的oligo-cap方法制備的cDNA文庫可以用于下面的分析。根據(jù)酶的氨基酸序列，制備了據(jù)測對編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的5'-末端和3'-末端核苷酸序列有特異性的簡并引物。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因片段，可以通過使用制備的cDNA文庫作為模板的PCR[《PCR方法》PCRProtocols,AcademicPress(1990)]，進行DNA擴增來獲得。通過常用的核苷酸序列分析方法例如Sanger等[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,24,5463(1977)]的雙脫氧方法，或使用核苷酸序列分析儀例如ABIPRISM377DNA測序儀(AppliedBiosystems制造)，來分析核苷酸序列，可以證實獲得的基因片段是編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過ot-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的DNA。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的DNA，可以使用上述的基因片段作為探針，通過克隆雜交或噬菌斑雜交(《分子克隆》(第二版)MolecularCloning,SecondEdition)，從包含在人類或非人類動物組織或細胞中的mRNA合成的cDNA或cDNA文庫中獲得。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的cDNA，也可以使用從包含在人類或非人類動物組織或細胞中的mRNA合成的cDNA或cDNA文庫作為模板，并使用用于獲得編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過ot-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因片段的引物，通過PCR擴增來獲得。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的DNA的核苷酸序列，可以通過常用的核苷酸序列分析方法例如Sanger等[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,24，5463(1977)]的雙脫氧方法或使用核苷酸序列分析儀例如ABIPRISM377DNA測序儀(AppliedBiosystems制造)來確定。通過基于測定的cDNA的核苷酸序列，使用同源性搜索程序例如BLAST進行核苷酸序列數(shù)據(jù)庫例如GenBank、EMBL或DDBJ搜索，可以證實獲得的DNA是核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的基因中，編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。通過上述方法獲得的編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的基因的核苷酸序列的例子，包括SEQIDNO:18或20所顯示的核苷酸序列。通過上述方法獲得的編碼與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因的核苷酸序列的例子，包括SEQIDNO:22或23所顯示的核苷酸序列。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過CC-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的cDNA，也可以通過使用DNA合成儀例如392型DNA合成儀(PerkinElmer制造)，利用亞磷酰胺方法，根據(jù)測定的所需DNA的核苷酸序列通過化學(xué)合成來獲得。制備編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過00-鍵與還原末端的6-位]^-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因組DNA，可以通過例如下面的方法來進行。制備基因組DNA的方法基因組DNA可以通過在《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning,SecondEdition)、《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》等中描述的現(xiàn)有方法來制備。此外，編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型的N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過cx-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因組DNA,也可以使用試劑盒例如基因組DNA文庫篩選系統(tǒng)(GenomicDNALibraryScreeningSystem)(GenomeSystems帝!j造)或UniversalGenomeWalker試劑盒(CLONTECH帝U造)來獲得。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型的N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的DNA的核苷酸序列，可以通過常用的核苷酸分析方法例如Sanger等[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,24,5463(1977)]的雙脫氧方法或使用核苷酸序列分析儀例如ABIPRISM377DNA測序儀(AppliedBiosystems制造)來確定。通過基于測定的基因組DNA的核苷酸序列，使用同源性搜索程序例如BLAST,進行核苷酸序列數(shù)據(jù)庫例如GenBank、EMBL或DDBJ搜索，可以證實獲得的DNA是核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的基因中，編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因組DNA，也可以通過使用DNA合成儀例如392型DNA合成儀(PerkinElmer制造)，利用亞磷酰胺方法，根據(jù)測定的DNA的核苷酸序列通過化學(xué)合成來獲得。通過上述方法獲得的編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的基因組DNA的核苷酸序列的例子，包括SEQIDNO:26、27、28和29所顯示的核苷酸序列。通過上述方法獲得的編碼與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過cc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因組DNA的核苷酸序列的例子是SEQIDNO:30所顯示的核苷酸序列。用于生產(chǎn)本發(fā)明的抗體組成物的宿主細胞，也可以不使用表達載體而直接在宿主細胞中導(dǎo)入反義寡核苷酸或核酶來獲得，所述反義寡核苷酸或核酶的設(shè)計基于編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的核苷酸序列。反義寡核苷酸或核酶可以通過現(xiàn)有的方法或使用DNA合成儀來制備。具體來說，根據(jù)編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的cDNA和基因組DNA的核苷酸序列中，具有對應(yīng)5到150個、優(yōu)選5到60個、更優(yōu)選10到40個連續(xù)的核苷酸序列的寡聚核苷酸的序列信息，可以合成對應(yīng)于與上述寡核苷酸(反義寡聚核苷酸)互補的序列的寡核苷酸或含有寡核苷酸序列的核酶。寡核苷酸包括寡聚RNA和寡核苷酸的衍生物(在后文中稱為寡核苷酸衍生物)。寡核苷酸衍生物包括其中寡核苷酸的磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿崃蝓ユI的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)變?yōu)镹3'-P5'磷酰胺鍵的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的核糖-磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)變?yōu)殡?核酸鍵的寡核苷酸衍生物、其中寡聚核苷酸的尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶所取代的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的尿嘧啶被C-5噻唑基尿嘧啶所取代的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶所取代的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的胞嘧啶被吩噁嗪修飾的胞嘧啶所取代的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的核糖被2，-0-丙基核糖所取代的寡核苷酸衍生物、以及其中寡核苷酸的核糖被2'-甲氧基乙氧基核糖所取代的寡核苷酸衍生物[Ce11Technology,ii,1463(1997)〗。(b)通過同源重組方法制備用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體生產(chǎn)細胞的宿主細胞用于生產(chǎn)本發(fā)明的高ADCC活性抗體生產(chǎn)細胞的宿主細胞，可以通過靶定編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶基因的同源重組方法，通過對染色體上的靶基因進行修飾來制備。染色體上靶基因的修飾可以通過使用在《小鼠胚胎的操作實驗室手冊》(第二版)(ManipulatingtheMouseEmbryo,ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1994))(在后文中稱為《小鼠胚胎的操作實驗室手冊》)、《基因打靶實用方法》(GeneTargeting,APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress(1993))、《生物手冊叢書8——基因打耙》(BiomanualSeries8，GeneTargeting)中的《使用ES細胞制備突變小鼠》(PreparationofMutantMiceUsingESCells,Yodosha(1995))(在后文中稱為《使用ES細胞制備突變小鼠》)等中描述的方法，以例如下面的方式來進行。制備了編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因組DNA?；诨蚪MDNA的核苷酸序列，制備了靶載體，用于被修飾的耙基因(例如與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)基因或啟動子基因)的同源重組。用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體生產(chǎn)細胞的宿主細胞可以通過將制備的耙載體導(dǎo)入宿主細胞、并選擇其中在染色體的靶基因和靶載體之間發(fā)生了同源重組的細胞來制備。作為宿主細胞來說，可以使用任何酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等，只要它具有編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。宿主細胞的例子包括在上面1中描述的那些。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因組DNA，可以通過上面1(1)(a)中描述的制備基因組DNA的方法來制備。通過上述方法獲得的編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的基因組DNA的核苷酸序列的例子，包括SEQIDNOs:26、27、28和29所顯示的核苷酸序列。通過上述方法獲得的編碼與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因組DNA的核苷酸序列的例子，包括SEQIDNO:30所顯示的核苷酸序列。用于染色體上的靶基因的同源重組的靶載體可以按照《基因打靶實用方法》(GeneTargeting,APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress(1993))、《生物手冊叢書8——基因打靶》中的《使用ES細胞制備突變小鼠》(BiomanualSeries8,GeneTargeting,PreparationofMutantMiceUsingESCells,Yodosha(1995))等中描述的方法來制備。靶載體可以是取代型或插入型。將靶載體導(dǎo)入不同宿主細胞可以通過上面1中描述的適合將重組載體導(dǎo)入不同宿主細胞的方法來進行。有效選擇同源重組子的方法包括在《基因打靶實用方法》(GeneTargeting,APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress(1993))、《生物手冊叢書8——基因打靶》中的《使用ES細胞制備突變小鼠》(BiomanualSeries8，GeneTargeting,PreparationofMutantMiceUsingESCells,Yodosha(1995))等中描述的陽性選擇、啟動子選擇、陰性選擇和polyA選擇。從選定的細胞系中選擇所需的同源重組子的方法包括用基因組DNA進行Southern雜交(《分子克隆》(第二版)MolecularCloning,SecondEdition)和PCR[《PCR方法》PCRProtocols,AcademicPress(1990)]。(c)通過RDO方法制備用于高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞用于高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞，可以通過RDO方法，其靶定編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因，以例如下面的方式來制備。通過在上面的l(l)(a)中描述的方法，制備了編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的cDNA或基因組DNA。測定制備的cDNA或基因組DNA的核苷酸序列。根據(jù)測定的DNA序列，設(shè)計并合成了適當(dāng)長度的RDO構(gòu)建物，其中包含編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過ot-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的部分、其非翻譯區(qū)的部分或內(nèi)含子的部分。本發(fā)明的宿主細胞可以通過將合成的RDO導(dǎo)入宿主細胞，然后選出其中在耙酶上(即與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶上)發(fā)生了突變的轉(zhuǎn)化體來獲得。作為宿主細胞來說，任何酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等都可以使用，只要它具有編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。宿主細胞的例子包括在上面1中描述的那些。將RDO導(dǎo)入不同的宿主細胞可以通過上面l中描述的適合將重組載體導(dǎo)入不同宿主細胞的方法來進行。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的cDNA，可以通過上面的2(1)(a)中描述的制備cDNA的方法等來制備。編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因組DNA，可以通過上面2(1)(b)中描述的制備基因組DNA的方法等來制備。在用適當(dāng)?shù)南拗菩悦讣羟蠨NA之后，DNA的核苷酸序列的測定可以通過將DNA片段亞克隆到質(zhì)粒例如pBluescriptSK(-)中(Stratagene制造)，對克隆進行通常用作分析核苷酸序列的方法例如Sanger等[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,14,5463(1977)]的雙脫氧方法等的反應(yīng)，然后通過使用自動核苷酸序列分析儀例如ABIPRISM377DNA測序儀(AppliedBiosystems制造)等分析克隆。RDO可以通過常規(guī)的方法或通過使用DNA合成儀來制備。用于選擇其中通過將RDO引入宿主細胞而在編碼酶的基因上發(fā)生了突變的細胞的方法，包括在《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning,SecondEdition)、《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)等中描述的在染色體基因中直接檢測突變的方法，所述酶即是與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過ct-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶。為了選擇轉(zhuǎn)化體，也可以使用下面的方法上面的2(l)(a)中描述的，使用與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性作為指標(biāo)的方法；在下面2(5)中描述的，使用細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)的方法；以及在下面4或5中描述的，使用產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)的方法。RDO可以按照下列中的描述進行設(shè)計Science,273,1386(1996);NatureMedicine,4,285(1998);Hepatology，H1462(1997);GeneTherapy,5,1960(1999);GeneTherapy,5，1960(1999);J.Mol.Med.,21829(1997);Proc.Natl-Acad.Sci.USA,巡，8774(1999);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,M,8768(1999);Nuc.AcidsRes.,22,1323(1999);Invest.Dermatol.,Hi,1172(1998);NatureBiotech.,1343(1998);NatureBiotech.,18,43(2000);NatureBiotech"1￡，555(2000)等。(d)通過RNAi方法制備用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞，可以通過RNAi方法，以例如下面的方式來制備，所述RNAi方法靶定編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過Ct-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。通過在上面2(1)(a)中描述的方法，制備了編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的cDNA。測定制備的cDNA的核苷酸序列。根據(jù)測定的cDNA序列，設(shè)計了具有適當(dāng)長度的RNAi基因，其包含編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的部分，或非翻譯區(qū)的部分。為了在細胞中表達RNAi基因，通過將制備的cDNA的片段或全長插入到適當(dāng)?shù)谋磉_載體的啟動子下游的位點中，制備重組載體。將重組載體導(dǎo)入適合表達載體的宿主細胞中以獲得轉(zhuǎn)化體。用于制備宿主細胞的宿主細胞，可以通過使用與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過ct-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性、或產(chǎn)生的抗體分子或細胞膜上的糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)，選擇轉(zhuǎn)化體來獲得。作為宿主細胞來說，可以使用任何酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等，只要它具有編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。宿主細胞的例子包括在上面1中描述的那些?？梢允褂玫谋磉_載體是那些能夠在上述宿主細胞中自主復(fù)制或整合到染色體中、并在適合轉(zhuǎn)錄設(shè)計的RNAi基因的位置包含啟動子的表達載體。表達載體的例子包括在上面1中描述的那些。將基因?qū)氩煌拗骷毎梢酝ㄟ^上面1中描述的適合將重組載體導(dǎo)入不同宿主細胞的方法來進行。使用與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的活性、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性作為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化體的方法，包括在上面2(l)(a)中描述的方法。使用細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化體的方法，包括在2(5)中描述的方法。使用產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化體的方法，包括在下面的4或5中描述的方法。制備編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的cDNA的方法，包括在上面的2(1)(a)等中描述的制備cDNA的方法。用于生產(chǎn)本發(fā)明的高CDC活性和高ADCC活性的抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞，也可以不使用表達載體，而直接在宿主細胞中導(dǎo)入RNAi基因來獲得，所述RNAi基因根據(jù)編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過cx-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的核苷酸序列而設(shè)計。RNAi基因可以通過已知的方法或通過使用DNA合成儀來制備。RNAi基因構(gòu)建物可以按照下列中的描述來設(shè)計Nature,l￡i，806(1998);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,￡i,15502(1998);Nature,巡，854(1998);Proc.Natl,Acad.Sci.USA,M，5049(1999);Cell,￡1,1017(1998);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,￡^，1451(1999);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,￡1，13959(1998);NatureCellBiol.，2，70(2000)等。(e)通過使用轉(zhuǎn)座子的方法制備用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞，可以通過使用在NatureGenet.，21,35(2000)等中描述的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，然后使用與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的活性、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性、或產(chǎn)生的抗體分子或細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)，選擇突變來制備。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是通過將外源基因隨機插入到染色體中誘導(dǎo)突變的系統(tǒng)，其中通常將插入到轉(zhuǎn)座子中的外源基因用作載體誘導(dǎo)突變，而用于將基因隨機插入到染色體中的轉(zhuǎn)座酶表達載體被同時導(dǎo)入到細胞中?？梢允褂萌魏无D(zhuǎn)座子，只要它適合于所用的轉(zhuǎn)座子的序列。作為外源基因來說，能夠使用任何基因，只要它能夠在宿主細胞的DNA中誘導(dǎo)突變。作為宿主細胞來說，可以使用任何酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等，只要它具有編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過cc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。宿主細胞的例子包括在上面1中描述的那些。將基因?qū)氩煌拗骷毎梢酝ㄟ^上面1中描述的適合將重組載體導(dǎo)入不同宿主細胞的方法來進行。使用與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性作為指標(biāo)選擇突變的方法，包括在上面2(l)(a)中描述的方法。使用細胞膜上的糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)選擇突變的方法包括在2。)中描述的方法。使用產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)選擇突變的方法，包括在下面的4或5中描述的方法。(2)導(dǎo)入編碼酶的基因的顯性失活突變的技術(shù)用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞，可以通過使用導(dǎo)入耙基因的顯性失活突變的技術(shù)來制備，所述靶基因即為編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的例子包括GMD和Fx。與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的例子包括al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和a-L-巖藻糖苷酶。這些酶具有底物特異性，并催化特定的反應(yīng)。通過破壞這些具有底物特異性和催化活性的酶的活性中心，可以制備它們的顯性失活突變株。顯性失活突變株的制備在下面詳細描述，在靶酶中，使用GMP作為例子。作為來自大腸桿菌的GMP的三維結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果，已經(jīng)揭示4個氨基酸(133位的蘇氨酸、135位的谷氨酸、157位的酪氨酸和161位的賴氨酸)對于酶活性有重要功能(Structure,&2，2000)。也就是說，根據(jù)三維結(jié)構(gòu)信息，用其它氨基酸取代上述的4個氨基酸制備的突變株都顯示出顯著降低的酶活性。另一方面，在突變株與GMD的輔酶NADP或底物GDP-甘露糖的結(jié)合能力方面，幾乎沒有觀察到變化。因此，顯性失活突變株可以通過取代4個負責(zé)GMD的酶活性的氨基酸來進行制備。在制備來自大腸桿菌的GMD的顯性失活突變株的結(jié)果基礎(chǔ)上，顯性失活的突變株可以通過使用氨基酸序列信息，進行同源性比較和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測來制備。例如，在來自CHO細胞的GMD的情況下(SEQIDNO:19)，可以通過用其它氨基酸取代155位的蘇氨酸、157位的谷氨酸、179位的酪氨酸和183位的賴氨酸來制備顯性失活突變株。制備這樣帶有導(dǎo)入的氨基酸取代的基因，可以通過在《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning,SecondEdition)、《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)等中描述的位點定向誘變方法來進行。用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞，可以按照在《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning,SecondEdition)、《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)、《小鼠胚胎的操作》(第二版)(ManipulatingtheMouseEmbryo,SecondEdition)等中描述的基因?qū)敕椒?，使用編碼上述制備的靶酶的顯性失活突變體的基因(在后文中簡稱顯性失活突變體基因)，以例如下面的方式來制備。制備了編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的顯性失活突變基因。根據(jù)制備的顯性失活突變基因的全長DNA，按照需要制備適合長度的含有編碼蛋白的區(qū)域的DNA片段。通過將DNA片段或全長DNA插入到適當(dāng)?shù)谋磉_載體的啟動子下游的位點中，制備了重組載體。將重組載體導(dǎo)入適合表達載體的宿主細胞中以獲得轉(zhuǎn)化體。用于制備高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞，可以通過使用與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性、或產(chǎn)生的抗體分子或細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)，選擇轉(zhuǎn)化體來獲得。作為宿主細胞來說，可以使用任何酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等，只要它具有編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因。宿主細胞的例子包括上面1中描述的那些?？梢允褂玫谋磉_載體是那些能夠在上述的宿主細胞中自主復(fù)制或整合到染色體中、并在適合于轉(zhuǎn)錄編碼所需的顯性失活突變體的DNA的位置包含啟動子的表達載體。表達載體的例子包括在上面的1中描述的那些。將基因　導(dǎo)入不同宿主細胞可以通過上面1中描述的適合將重組載體導(dǎo)入不同宿主細胞的方法來進行。使用與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的活性、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性作為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化體的方法，包括在上面的2(l)(a)中描述的方法。使用細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化體的方法，包括在下面的2(5)中描述的方法。使用產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化體的方法，包括在下面的4或5中描述的方法。(3)在酶中導(dǎo)入突變的技術(shù)用于高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞，可以通過將突變導(dǎo)入編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過cx-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的基因中，然后選擇其中在酶中發(fā)生了突變的所需細胞系來制備。與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的例子包括GMD和Fx等。與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的例子包括al，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和a-L-巖藻糖苷酶等。將突變導(dǎo)入酶的方法包括1)使用與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的活性、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性作為指標(biāo)，從通過使親本細胞系進行誘變或通過自發(fā)突變而獲得的突變株中選擇所需細胞株的方法；2)使用產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)，從通過使親本細胞系進行誘變或通過自發(fā)突變而獲得的突變株中選擇所需細胞系的方法；以及3)使用細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)作為指標(biāo)，從通過使親本細胞系進行誘變或通過自發(fā)突變而獲得的突變株中選擇所需細胞系的方法。誘變可以通過能夠在親本細胞系的細胞的DNA中誘導(dǎo)點突變、缺失突變或移碼突變的任何方法來進行。適合的方法包括使用乙基亞硝基脲、亞硝基胍、苯并芘或吖啶類染料和輻射進行處理。各種烷基化試劑和致癌劑也可以用作誘變劑。誘變劑可以通過在日本組織培養(yǎng)聯(lián)合會主編的《組織培養(yǎng)技術(shù)》(第三版)(SoshikiBaiyonoGijutsu(TissueCultureTechniques),ThirdEdition(AsakuraShoten)，editedbyTheJapaneseTissueCultureAssociation(1996))、NatureGenet.,24,314(2000)等中描述的方法作用于細胞。通過自發(fā)突變產(chǎn)生突變體的例子包括通過在不用任何特別的誘變處理的通常細胞培養(yǎng)條件下，進行連續(xù)傳代培養(yǎng)而獲得的自發(fā)突變體。測量與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的活性、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過cc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性的方法，包括在上面的l(l)(a)中描述的方法中。測定產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，包括在下面4或5中描述的方法。測定細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，包括在上面的2(5)中描述的方法。(4)抑制編碼酶的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的技術(shù)用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞，可以通過使用反義RNA/DNA技術(shù)[BioscienceandIndustry,322(1992);Chemistry,払681(1991);Biotechnology,2,358(1992);TrendsinBiotechnology,辺，87(1992);TrendsinBiotechnology,邊，152(1992);CellTechnology,1463(1997)]、三重螺旋技術(shù)[TrendsinBiotechnology,iQ，132(1992)]等，抑制耙基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯來制備，所述靶基因即編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的靶基因。與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的例子包括GMD和Fx等。與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過OC-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的例子包括al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、a-L-巖藻糖苷酶等。測量與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的活性、或與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的活性的方法，包括在上面的2(l)(a)中描述的方法。測定細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的方法包括在上面的2(5)中描述的方法。測定產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，包括在下面4或5中描述的方法。(5)選擇對識別其中N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素具有抗性的細胞系的技術(shù)用于生產(chǎn)高ADCC活性抗體產(chǎn)生細胞的宿主細胞，可以通過選擇對凝集素具有抗性的細胞系來制備，所述凝集素識別其中N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)。對識別其中N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素具有抗性的細胞系的篩選，可以通過例如在SomaticCellMol.Genet"U,51(1986)等中描述的使用凝集素的方法來進行。作為凝集素來說，可以使用任何凝集素，只要它能夠識別其中N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)。具體的例子包括扁豆凝集素LCA(來自兵豆的扁豆凝集素)、豌豆凝集素PSA(來自豌豆的豌豆凝集素)、蠶豆凝集素VFA(來自蠶豆的凝集素)、橙黃網(wǎng)孢盤菌凝集素AAL(來自橙黃網(wǎng)孢盤菌的凝集素)。具體來說，對識別其中N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過ct-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素具有抗性的細胞系，可以通過將細胞在含有濃度為1pg/ml到1mg/ml的上述凝集素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天到2周、優(yōu)選1天到1周，將存活的細胞傳代培養(yǎng)或挑取菌落并將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中，然后使用含有凝集素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)來選擇。3.評價抗體組成物的性純化的抗體組成物的蛋白量、抗體結(jié)合活性或細胞毒活性可以使用在《單克隆抗體》(MonoclonalAntibodies)、《抗體工程》(AntibodyEngineering)等中描述的已知方法來測量。具體來說，當(dāng)抗體組成物是人類嵌合抗體或人源化抗體時，與抗原的結(jié)合活性或與抗原陽性的培養(yǎng)細胞系的結(jié)合活性可以通過ELISA、熒光抗體技術(shù)[CancerImmunol.Immunother.，M，373(1993)]等來測量。對抗原陽性的培養(yǎng)細胞系的細胞毒性活性可以通過測量CDC活性、ADCC活性等[CancerImmunol.Immunother.，1^，373(1993)]來評估。測量ADCC活性的方法包括其中將用放射性同位素、熒光物質(zhì)、染料等標(biāo)記的靶細胞與抗體和效應(yīng)器細胞相接觸、然后測量從受傷的耙細胞釋放出的標(biāo)記物質(zhì)的活性的方法；其中將靶細胞與抗體和效應(yīng)器細胞相接觸、然后測量從受傷的靶細胞釋放出的酶的生物學(xué)活性的方法。測量CDC活性的方法包括其中將用放射性同位素、熒光物質(zhì)、染料等標(biāo)記的靶細胞與抗體和生物樣本例如含有補體成分的血清相接觸、然后測量從受傷的靶細胞釋放出的標(biāo)記物質(zhì)的活性的方法；其中將靶細胞與抗體和生物樣本例如含有補體成分的血清相接觸、然后測量從受傷的靶細胞釋放出的酶的生物活性的方法?？贵w組成物在人類中的安全性和治療效果可以使用與人類相對接近的物種、例如獼猴的適合的動物模型來進行評估。4.抗體組成物中糖鏈的分析在不同細胞中表達的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)可以按照分析糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的常用方法來進行分析。例如，與IgG分子結(jié)合的糖鏈由中性糖例如半乳糖、甘露糖和巖藻糖，氨基糖例如N-乙酰葡萄糖胺，和酸性糖例如唾液酸組成，并可以通過例如糖組成分析和使用二維糖鏈作圖的糖鏈結(jié)構(gòu)分析的技術(shù)來進行分析。(1)中性糖和氨基糖成分的分析抗體組成物的糖鏈成分可以通過用三氟乙酸等對糖鏈進行酸水解以釋放出中性糖或氨基糖、并分析成分的比率來進行分析。具體來說，分析可以通過使用Dionex制造的碳水化合物分析裝置的方法來進行。BioLC是通過HPAEC-PAD(高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測)來分析糖成分的裝置[J.Liq.Chromatogr.,《，1577(1983)]。組成比率也可以通過使用2-氨基吡啶的熒光標(biāo)記方法來分析。具體來說，組成比率可以按照已知的方法[Agric.Biol.Chem.,55(1),283-284(1991)]，通過2-氨基吡啶化來熒光標(biāo)記酸水解的樣品，然后通過HPLC分析組成來進行分析。(2)糖鏈結(jié)構(gòu)的分析抗體組成物的糖鏈結(jié)構(gòu)可以通過二維糖鏈作圖[Anal.Biochem.,171'73(1988);ReikoTakahashi編著的SeibutsukagakuJikkenho(生化試驗方法，BiochemicalExperimentationMethods)23-TotanpakushitsuTosaKenkyuho(對糖蛋白糖鏈的研究方法，MethodsofStudiesonGlycoproteinSugarChains),GakkaiShuppanCenter(1989)]來進行分析。二維糖鏈作圖是通過例如分別以糖鏈在反相色譜中的滯留時間或洗脫位置作為X軸、糖鏈在正相色譜中的滯留時間或洗脫位置作為Y軸來作圖，然后將它們與已知的糖鏈的結(jié)果進行比較，而推導(dǎo)出糖鏈結(jié)構(gòu)的方法。具體來說，通過抗體的肼解將糖鏈從抗體上釋放，然后用2-氨基吡啶(在后文中稱為PA)進行熒光標(biāo)記[J.Biochem.，2i，197(1984)]。在通過凝膠過濾分離出過量的PA處理試劑后，對糖鏈進行反相色譜。然后，對每個分部分離的糖鏈峰進行正相色譜。通過將獲得的結(jié)果在二維糖鏈圖上進行作圖，然后將它們與糖鏈標(biāo)準(zhǔn)品(TakaraShuzoCo.,Ltd.制造)的點或文獻[Anal.Biochem.，m，73(1988)]中的點進行比較，可以推導(dǎo)出糖鏈結(jié)構(gòu)。通過二維糖鏈作圖推導(dǎo)出的結(jié)構(gòu)可以通過對每個糖鏈進行質(zhì)譜分析例如MALDI-TOF-MS來證實。5.測定抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)的方法抗體組成物包含的抗體分子具有不同的與抗體Fc區(qū)結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的抗體組成物中，其中巖藻糖沒有與還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈在與Fc區(qū)域結(jié)合的總的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中的比率為20%以上的抗體組成物顯示出高的ADCC活性。這樣的抗體組成物可以使用上面4中描述的分析抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)的的方法來測定。此外，也可以通過使用凝集素的免疫分析來測定。使用凝集素通過免疫分析來測定抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)，可以按照在文獻[《單克隆抗體原理和應(yīng)用》MonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications,Wiley-Liss,Inc.(1995);《酶法免疫分析第三版EnzymeImmunoassay,3rdEd"IgakuShoin(1987);《酶法抗體技術(shù)》修訂版EnzymeAntibodyTechnique,RevisedEdition,GakusaiKikaku(1985傳]中描述的免疫分析，例如Western染色、RIA(放射性免疫分析)、VIA(病毒免疫分子)、EIA(酶法免疫分析)、FIA(熒光免疫分析)和MIA(金屬免疫分析)，以例如下面的方式來進行。將識別構(gòu)成抗體組成物的抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素進行標(biāo)記，將標(biāo)記的凝集素與樣品抗體組成物進行反應(yīng)，然后測量標(biāo)記的凝集素與抗體分子的復(fù)合物的量?？捎糜跍y定抗體分子的糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素的例子包括WGA(來自T.vulgaris的小麥胚芽凝集素)、ConA(來自矮生刀豆(C.ensiformis)的伴刀豆球蛋白A)、RIC(來自蓖麻(R.communis)的毒素)、L-PHA(來自P.vulgaris的白細胞凝集素)、LCA(來自扁豆的扁豆凝集素)、PSA(來自豌豆的豌豆凝集素)、AAL(來自橙黃網(wǎng)孢盤菌凝集素、BPL(洋紫荊(Bauhiniapurpurea)凝集素)、DSL(曼陀羅(Daturastramonium)凝集素)、DBA(雙花扁豆(Dolichosbifloru)凝集素)、EBL(接骨木凝集素)、ECL(雞冠刺桐(Erythrinacristagalli)凝集素)、EEL(歐洲衛(wèi)矛(Euonymuseuropaeu)凝集素)、GNL(雪滴花(Galanthusnivalis)凝集素)、GSL(Griffoniashnplicifolia的凝集素)、HPA(勃艮第蝸牛(Helixpomatia)凝集素)、HHL(朱頂紅(Hippeastrum)的雜交凝集素)、木菠蘿凝集素(Jacalin)、LTL(翅莢百脈根(Lotustetragonolobus)凝集素)、LEL(番茄(Lycopersiconesculentum)湊走集素)、MAL(朝鮮槐(Maackiaamurensis)凝集素)、MPL(橙桑(Maclurapomifera)凝集素)、NPL(喇叭水仙(Narcissuspseudonarcissus)凝集素)、PNA(花生凝集素)、E-PHA(菜豆(Phaseolusvulgaris)血球凝集素)、PTL(四棱豆(Psophocarpustetragonolobus)凝集素)、RCA(蓖麻(Ricinuscommunis)凝集素)、STL(馬鈴薯(Sola皿mtuberosum)凝集素)、SJA(槐(Sophorajaponica)凝集素)、SBA(大豆凝集素)、UEA(荊豆(Ulexeuropaeus)凝集素)、VVL(毛葉苕子(Viciavillosa)凝集素)和WFA(多花紫藤(Wisteriafloribunda)凝集素)。優(yōu)選使用特異性識別其中巖藻糖與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素。這樣的凝集素的例子包括扁豆凝集素LCA(來自扁豆的扁豆凝集素)、豌豆凝集素PSA(來自豌豆的豌豆凝集素)、蠶豆凝集素VFA(來自蠶豆的凝集素)和橙黃網(wǎng)孢盤菌凝集素AAL(來自橙黃網(wǎng)孢盤菌的凝集素)。6.本發(fā)明的重組抗體組成物的利用因為本發(fā)明的重組抗體組成物具有比IgGl抗體和IgG3抗體更高的CDC活性，它在治療效果方面比常規(guī)的抗體組成物具有更優(yōu)秀的性質(zhì)。另外，在本發(fā)明的重組抗體組成物中，重組抗體組成物含有在Fc區(qū)具有復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子，其中巖藻糖沒有與糖鏈的還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈在組成物中包含的與Fc區(qū)結(jié)合的總的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中的比率為20%或以上，因為該重組抗體組成物比IgGl抗體和IgG3抗體具有更高的CDC活性和更高的ADCC活性，它在治療效果方面比常規(guī)的抗體組成物具有更優(yōu)秀的性質(zhì)。此外，在本發(fā)明的重組抗體組成物中，更優(yōu)選的是包含在Fc區(qū)具有復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子、其中巖藻糖沒有與糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈在組成物包含的與Fc區(qū)結(jié)合的總的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中的比率為100%的重組抗體組成物。包含本發(fā)明重組抗體組成物的藥物可以作為治療藥劑單獨給藥。但是，它優(yōu)選通過在制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知的任意方法，與一種或多種可藥用的載體相混合，并作為藥物組合物提供。理想的是通過對治療最為有效的途徑施用藥物。適合的給藥途徑包括口服給藥和腸胃外給藥，例如口腔內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉給藥和靜脈給藥。在抗體制劑的情況下，優(yōu)選為靜脈給藥。藥物可以采用噴霧、膠囊、片劑、顆粒、糖漿、乳劑、栓劑、注射液、軟膏、貼劑等形式。適合口服給藥的制劑包括乳劑、糖漿、膠囊、片劑、粉末和顆粒。液體制劑例如乳劑和糖槳可以使用水、糖(例如蔗糖、山梨醇和果糖)、二醇(例如聚乙二醇和丙二醇)、油(例如芝麻油、橄欖油和大豆油)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸)、香料(例如草莓香料和薄荷)等作為添加劑來制備。膠囊、片劑、粉末、顆粒等可以使用賦形劑(例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇)、崩解劑(例如淀粉和藻酸鈉)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂和滑石)、粘合劑(例如聚乙烯醇、羥基丙基纖維素和明膠)、表面活性劑(例如脂肪酸酯)、增塑劑(例如甘油)等作為添加劑來制備。適合腸胃外給藥的藥物制劑包括注射劑、栓劑和噴霧劑。注射劑可以使用包括鹽溶液、葡萄糖溶液或其混合物等的載體來制備。也可能按照常規(guī)的方法將抗體組成物冷凍干燥并向其中加入氯化鈉來制備粉末注射劑。栓劑可以使用載體例如可可脂、氫化脂肪和羧酸來制備?？贵w組成物本身可以以噴霧劑的形式使用，或噴霧劑可以使用不剌激接受者的口腔或氣道粘膜、并能夠?qū)⒖贵w組成物作為細顆粒分散以便于其吸收的載體來制備。適合的載體包括乳糖和甘油。也可以根據(jù)抗體組成物和所用的載體的性質(zhì)，制備氣溶膠、干粉等。在制備這些腸胃外制劑中，也可以加入上面提到的用于口服制劑的添加劑。劑量和給藥頻率將根據(jù)所需的治療效果、給藥途徑、治療時間、患者的年齡、體重等而變化。但是，對于成年人來說，活性成分的適合劑量一般為每天10pg/kg到20mg/kg。抗體組成物對不同腫瘤細胞的抗腫瘤效果可以通過體外測試?yán)鏑DC活性測量和ADCC活性測量以及體內(nèi)測試?yán)缭趯嶒瀯游?例如小鼠)中使用腫瘤系統(tǒng)的抗腫瘤實驗來檢測。CDC活性和ADCC活性測量以及抗腫瘤實驗可以按照在文獻[CancerImmunologyImmunotherapy,近373(1993);CancerResearch,M，1511(1994)等]中描述的方法來進行。本發(fā)明在下面基于實施例進行描述；但是本發(fā)明并不受其限制。實施例1使用動物細胞制備抗CD20人類IgGl嵌合抗體、抗CD20人類IgG3嵌合抗體和抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體1.生產(chǎn)抗CD20人類IgG3嵌合抗體表達載體從來自人類淋巴結(jié)的polyA+RNA(BDBiosciencesClontech制造)，使用cDNA合成試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech制造)按照隨附的說明書，合成cDNA。使用100ngcDNA作為模板，并使用包含SEQIDNO:l和2中顯示的氨基酸序列的KODplus(TOYOBO制造)和人類IgG恒定區(qū)特異性合成DNA引物(FASMAC制造)，按照KODplus隨附的說明書進行PCR。PCR使用GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(AppliedBiosystems制造)進行，在94°C熱變性1分鐘之后，進行94。C15秒、62。C30秒和68。C90秒的反應(yīng)組成的30個循環(huán)。在進一步進行68°C7分鐘的反應(yīng)之后，在其中加入2.5U的TaqDNA聚合酶(TakaraShuzo制造)，令在68°C反應(yīng)7分鐘以在3'-末端加上腺苷酸。使用1%瓊脂糖凝膠對反應(yīng)溶液進行電泳，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(Qiagen制造)回收被認為是IgG3重鏈恒定區(qū)基因的大約1.1kbp的擴增片段。通過加入LigationHigh溶液(TOYOBO帝U造)進行與質(zhì)粒pCRII-TOPO載體(Invitrogen制造)的連接反應(yīng)，并使用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(TOYOBO生產(chǎn))。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體克隆制備各質(zhì)粒DNA，使用BigDyeTerminatorCycle測序試劑盒v3.1(AppliedBiosystems生產(chǎn))按照隨附的說明書進行反應(yīng)，然后以同一公司的DNA測序儀ABIPRISM3700DNA分析儀分析插入到質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列，以證實該序列是編碼通常所了解的人類IgG3重鏈恒定區(qū)的相同氨基酸序列(GenBank登記號AAH33178)的核苷酸序列。從上述其中插入了人類IgG3重鏈恒定區(qū)基因的質(zhì)粒中，通過用限制性酶Apal和Nrul(都由TakaraShuzo生產(chǎn))進行處理，純化IgG3重鏈恒定區(qū)中1.13kbp的基因片段。用于抗CD20人類IgGl嵌合抗體(在WO03/055993A1中有描述)的穩(wěn)定的動物細胞表達載體pKANTEX2B8P,其包含與抗CD20人類IgGl嵌合抗體Rituxan的小鼠來源的可變區(qū)相同的可變區(qū)、人類K型輕鏈恒定區(qū)和人類IgGl重鏈恒定區(qū)，將其用Apal和Nrul進行消化。通過剪切IgGl恒定區(qū)基因、純化剩下的大約12.6kbp的片段，并使用LigationHigh溶液將它與上述IgG3恒定區(qū)基因片段相連接，構(gòu)建抗CD20人類IgG3嵌合抗體的表達載體pKANTEX2B8y3(圖3)。pKANTEX2B8y3編碼的抗CD20人類IgG3嵌合抗體的可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列與pKANTEX2B8P編碼的抗CD20人類IgGl嵌合抗體的可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列一致。2.抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體表達載體的生產(chǎn)按照下面的步驟制備與CD20結(jié)合的結(jié)構(gòu)域交換的抗體，所述抗體其中可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列與pKANTEX2B8P編碼的抗CD20人類IgGl嵌合抗體的可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列一致，而重鏈恒定區(qū)由人類IgGl抗體或人類IgG3抗體的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。具有的重鏈恒定區(qū)中CH1和鉸鏈區(qū)由人類IgGl抗體的氨基酸序列構(gòu)成、Fc區(qū)(CH2和CH3)由人類IgG3抗體的氨基酸序列構(gòu)成的抗CD20嵌合抗體被稱為1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體，而具有的重鏈恒定區(qū)中CH1和鉸鏈區(qū)由人類IgG3抗體的氨基酸序列構(gòu)成、Fc區(qū)由人類IgGl抗體的氨基酸序列構(gòu)成的抗CD20嵌合抗體被稱為3311型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體。作為使用氨基酸序列數(shù)據(jù)庫進行搜索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)域交換的抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列是新的氨基酸序列。各種設(shè)計的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體的每個結(jié)構(gòu)域所來自的亞類、以及重鏈恒定區(qū)的相應(yīng)的氨基酸序列顯示在表1中。此外，1133型的氨基酸序列被顯示在SEQIDN0:16中。每個抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體的示意圖顯示在圖4中。表1結(jié)構(gòu)名稱CH1鉸鏈區(qū)CH2CH31133IgGlIgGlIgG3IgG33311IgG3IgG3IgGlIgGl(1)構(gòu)建編碼1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體的表達載體圖5中顯示的編碼1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體的表達載體按照下面的方式構(gòu)建。使用限制性酶Apal(TakaraShuzo生產(chǎn))和BmgBI(NewEnglandBiolabs生產(chǎn))，從抗CD20人類IgGl嵌合抗體的表達載體pKANTEX2B8P中剪切并純化編碼人類IgGl抗體的CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)和Fc區(qū)5'-末端的一部分(其中人類IgGl抗體和人類IgG3抗體之間氨基酸序列相同的部分)的大約430bp的DNA片段。另一方面，通過用限制性酶進行類似的處理，從本實施例條目1描述的抗CD20人類IgG3嵌合抗體的表達載體pKANTEX2B8y3中剪切并純化大約13kbp的DNA片段。在混合了這些純化的DNA制備物之后，使用LigationHigh溶液(TOYOBO制造)進行連接反應(yīng)，并用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-BLUEMRF'(Stratagene制造)。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體克隆制備各個質(zhì)粒DNA，并使用BigDyeTerminatorCycle測序試劑盒v3.1(AppliedBiosystems生產(chǎn))按照隨附的說明書進行反應(yīng)，然后使用同一公司的DNA測序儀ABIPRISM3700DNA分析儀分析插入到質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列，以證實獲得了圖5中顯示的質(zhì)粒pKTX93/1133。(2)構(gòu)建編碼3311型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體圖6中顯示的編碼3311型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體按照下面的方式構(gòu)建。使用限制性酶Apal(TakaraShuzo生產(chǎn))和BmgBI(NewEnglandBiolabs生產(chǎn))，從本實施例條目l描述的人類IgG3嵌合抗體表達載體pKANTEX2B外3中，剪切并純化編碼人類IgG3抗體的CHI結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)和Fc區(qū)5'-末端的一部分(其中人類IgGl抗體和人類IgG3抗體之間氨基酸序列相同的部分)的大約570bp的DNA片段。另一方面，通過用限制性酶進行類似的處理，從IgGl抗CD20抗體的表達載體pKANTEX2B8P中剪切并純化了大約13kbp的DNA片段。在混合了這些純化的DNA制備物之后，使用LigationHigh溶液(TOYOBO制造)進行連接反應(yīng)，用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-BLUEMRF'(Stratagene制造)。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體克隆制備各質(zhì)粒DNA，使用BigDyeTerminatorCycle測序試劑盒v3.1(AppliedBiosystems生產(chǎn))按照隨附的說明書進行反應(yīng)，然后使用同一公司的DNA測序儀ABIPRISM3700DNA分析儀分析插入到質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列，以證實獲得了圖6中顯示的質(zhì)粒pKTX93/3311。3.不同的抗CD20嵌合抗體和不同的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體在動物細胞中的穩(wěn)定表達按照下面的方式制備用于穩(wěn)定生產(chǎn)抗CD20人類IgG3嵌合抗體或抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的細胞，其中在本實施例條目1和2中制備的抗CD20人類IgG3嵌合抗體的表達載體pKANTEX2B8y3和抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體pKTX93/1133和pKTX93/3311，被轉(zhuǎn)入到作為宿主細胞的CHO/DG44細胞[SomaticCellMol.Genet"U,555(1986)]和其中al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因被敲除的CHO/DG44細胞(在后文中稱為CHO/FUT8;)中[Biotechnol.Bioeng.,虹614(2004)]。CHO/DG44細胞是重組蛋白生產(chǎn)中廣泛使用的宿主細胞。CHO/FUT8;是其中CHO/DG44細胞的FUT8在基因組上被敲除的宿主細胞。此外，抗CD20人類IgGl嵌合抗體的表達載體pKANTEX2B8P被單獨導(dǎo)入CHO/FUT8一細胞中，并且以同樣的方式制備了能夠穩(wěn)定生產(chǎn)抗CD20人類IgGl嵌合抗體的細胞。在將8每種表達載體質(zhì)粒通過電穿孔方法[Cytotechnology，i，133(1990)]導(dǎo)入1.6x106個CHO/DG44細胞或CHO/FUT8;細胞中后，將細胞懸浮在40mlIMDM-(IO)[含有10%透析過的胎牛血清(dFBS)的IMDM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL生產(chǎn))]中，以100pl/孔的量分配到96孔微孔板(SumitomoBakelite制造)中。在5%C02的培養(yǎng)箱中于37°C培養(yǎng)24小時后，將細胞在含有濃度為500pg/ml的G418的IMDM-(10)中培養(yǎng)1到2周。培養(yǎng)結(jié)束后，從每個孔回收培養(yǎng)上清液，通過在后面本實施例條目4中描述的ELISA方法，測量在培養(yǎng)上清液中抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體的量。對于在培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)了抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達的孔中的轉(zhuǎn)化體，為了使用dhfr基因擴增系統(tǒng)增加抗體的表達量，將細胞懸浮在含有濃度為500|ig/ml的G418和濃度為50nM氨甲蝶呤(作為dhfr基因產(chǎn)物的二氫葉酸還原酶的抑制劑，在后文中稱為MTX，SIGMA生產(chǎn))的IMDM-(10)培養(yǎng)基中，在5%C02的培養(yǎng)箱中于37°C培養(yǎng)大約1周，從而獲得對50nM的MTX具有抗性的轉(zhuǎn)化體。然后，將MTX濃度逐漸升高到100nM，然后升高到200nM，最后獲得能夠在含有濃度為500(ig/ml的G418和200nM的MTX的IMDM-(10)培養(yǎng)基中增殖、并還能夠以高水平表達相應(yīng)的表達載體編碼的抗體的轉(zhuǎn)化體。4.測量培養(yǎng)上清液中抗的體濃度(ELISA)用磷酸鹽緩沖鹽水(在后文中稱為PBS;Proliantlnc制造)，將山羊抗人igG(H&L)抗體(AmericanQualex制造)稀釋到1fig/ml，以50(il/孔的量分配到用于ELISA的96孔板中(Greiner制造)，使之在室溫放置1小時以吸附。在反應(yīng)后，用PBS洗板，向其中加入100p1/孔的含有1%牛血清白蛋白(后文中稱為BSA)的PBS(在后文中稱為1。/。BSA-PBS)，在室溫反應(yīng)1小時以阻斷剩余的活性基團。在除去1%BSA-PBS之后，量加入50nl/孔的待測培養(yǎng)上清液，在室溫反應(yīng)2小時。反應(yīng)后，每個孔用含有0.05%Tween20的PBS(在后文中稱為Tween-PBS)清洗，然后加入50jil/孔的用PBS稀釋500倍的過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG(Fc)抗體溶液(AmericanQualex生產(chǎn))作為第二抗體溶液，使之在室溫反應(yīng)l小時。在用Tween-PBS清洗之后，加入50jli1/孔的ABTS底物溶液[將0.55g2，2，-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)銨鹽溶解在1升0.1M檸檬酸鹽緩沖液(pH4.2)中并在使用前加入1id/ml過氧化氫而制備]進行顯色，測量在415nm處的吸光度(在后文中稱為OD415)。5.純化各種抗CD20嵌合抗體和各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換的抗體將每個能夠表達在本實施例條目3中獲得的各種抗CD20抗體的轉(zhuǎn)化體懸浮在含有200nMMTX的IMDM-FCS(10)中，使密度達到lx105個細胞/ml，然后以100ml的量分配到三個燒瓶中(Nalgemmc制造)，在5%(302的培養(yǎng)箱中于37。C培養(yǎng)2天。從每個燒瓶中除去培養(yǎng)上清液，燒瓶的內(nèi)部用50mlPBS清洗，然后在搖瓶中加入100mlEXCELL301培養(yǎng)基(JRHBiosciences生產(chǎn))，在5%C02培養(yǎng)箱中于37。C繼續(xù)培養(yǎng)5天。回收該培養(yǎng)上清液，以3000rpm和4。C下離心5分鐘，然后回收上清液，使用0.22fimPES膜(Iwaki生產(chǎn))進行過濾除菌。從這樣的無菌培養(yǎng)上清液中使用裝填有Prosep-A(蛋白A,Millipore制造)或Prosep-G(蛋白G，Millipore制造))的柱子，'按照隨附的說明書純化各種抗CD20抗體。IgGl抗CD20抗體用蛋白A純化，但是因為IgG3抗CD20抗體不用蛋白A純化，所以使用蛋白G進行了純化。對于結(jié)構(gòu)域交換的抗體來說，3311型用蛋白A純化。另一方面，1133型用蛋白A純化，但是也可以用蛋白G純化。每種抗體的表達載體和宿主細胞、純化的抗體樣品的名稱和氨基酸序列對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)，顯示在表2中。就此而論，在表中，在樣品名稱的末尾具有(+F)的樣品表示使用CHO/DG44作為宿主細胞產(chǎn)生的抗體樣品，其它的樣品表示從CHO/FUT8;產(chǎn)生的抗體樣品。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>在表中，+表示巖藻糖與結(jié)合到？0區(qū)上的糖鏈結(jié)合，-F表示巖藻糖不與結(jié)合到Fc區(qū)上的糖鏈結(jié)合。6.評價SDS-PAGE純化的各種抗CD20嵌合抗體樣品和各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體樣品的純化程度為了評估在本實施例條目5中獲得的各種抗CD20抗體的純化樣品的純化程度，按照常規(guī)已知的方法[Nature,222,680(1970)]，使用大約lpg每種不同的抗CD20抗體的純化樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(在后文中稱為SDS-PAGE)。作為電泳程度的比較性對照，對于抗CD20人類IgGl嵌合抗體Rituxan(從Genentech購買)進行了同樣的操作。在后文中，Rituxan被稱為CD20-IgGl(+F)。結(jié)果，1133(+F)和1133(-F)顯示出與人類IgGl抗體CD20-IgGl(+F)相似的電泳帶型，而3311(+F)和3311(-F)顯示出與人類IgG3抗體CD20-IgG3(+F)相似的電泳帶型。在CD20-IgGl(+F)、CD20-IgGl(-F)、1133(+F)和1133(-F)的情況下，在大約50千道爾頓(在后文中稱為kDa)處發(fā)現(xiàn)了H鏈的條帶，在大約24kDa處發(fā)現(xiàn)了L鏈的條帶，在CD20-IgG3(+F)、CD20-IgG3(-F)、3311(+F)和331l(-F)的情況下，在大約54kDa處發(fā)現(xiàn)了H鏈的條帶，在大約24kDa處發(fā)現(xiàn)了L鏈的條帶，這樣證實了每個制備的抗CD20抗體由所需的H鏈和L鏈構(gòu)成。基于上面的結(jié)果，證實了在本實施例條目5中獲得的相應(yīng)的抗CD20抗體的純化樣品中，包含了充分比率的由H鏈和L鏈構(gòu)成的各種所需的IgG分子。實施例2各種抗CD20嵌合抗體和各種結(jié)構(gòu)域交換抗體的活性評價以下面的方式，對實施例1條目5中獲得的各種抗CD20抗體的純化樣品進行不同活性的比較。1.各種抗CD20抗體與CD20陽性細胞的結(jié)合活性在含有生物素化Rituxan的競爭性抑制系統(tǒng)中，使用流式細胞儀，通過熒光抗體技術(shù)測量了在實施例1中獲得的各種抗CD20抗體與CD20陽性細胞的結(jié)合活性。使用了抗Her2人類IgGl抗體Herceptin[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,絲，4285(1992)](從Genentech購買)和抗CCR4人類IgGl抗體KM3060[CancerRes"M,2127(2004)]作為陰性對照。將CD20陽性的Burkitt淋巴瘤來源的細胞系Daudi細胞(ATCC:CCL-213)以每個孔5xl05個細胞分配到96孔U底板中(Falcon制造)，然后在其中加入50pl/孔的FACS緩沖液，其中含有10jig/ml或l|_ig/ml在實施例1條目5中獲得的相應(yīng)的CD20抗體，或陰性對照抗Her2抗體Herceptin[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,4285(1992)]和抗CCR4抗體KM3060(WO02/31140)，并含有0.5pg/ml生物素標(biāo)記的抗CD20嵌合抗體Rituxan[通過使用EZ-連接的Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce制造)對Rituxan進行生物素化而制備]。在陰暗處于4°C反應(yīng)60分鐘之后，用FACS緩沖液清洗細胞兩次，然后在其中以50pl/孔的量加入用FACS緩沖液稀釋200倍的PE標(biāo)記的鏈霉親和素。在陰暗處于4°C反應(yīng)60分鐘之后，用FACS緩沖液清洗細胞兩次，并懸浮在1mlFACS緩沖液中，然后使用流式細胞儀EPICS-XL(Coulter制造)測量熒光強度。結(jié)果顯示在圖7中。陰性對照抗Her2抗體Herceptin和抗CCR4抗體KM3060不抑制生物素標(biāo)記的抗CD20嵌合抗體Rituxan與CD20陽性細胞Daudi的結(jié)合，但是所有的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體、抗CD20人類IgGl嵌合抗體和抗CD20人類IgG3嵌合抗體都濃度依賴性地抑制結(jié)合，并且程度基本上是相同的?；谶@些結(jié)果，顯示出抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的抗原結(jié)合是CD20特異性的，并且抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的結(jié)合活性與抗CD20人類IgGl嵌合抗體的結(jié)合活性相似。2.測量各種抗CD20抗體對Daudi細胞的CDC活性使用CD20陽性的Daudi細胞，測量實施例1條目5中獲得的各種抗CD20抗體的純化樣品的體外CDC活性。反應(yīng)在96孔平底板(SumitomoBakelite制造)中進行，含有5xl04個Daudi細胞并含有0.3嗎/ml各個抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體、抗CD20人類IgGl嵌合抗體或抗CD20人類IgG3嵌合抗體的人類補體稀釋培養(yǎng)基[用含有10%FBS(JRH制造)的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCOBRL制造)將人類補體(SIGMA制造)稀釋6倍而制備]，以150^的量分配到相應(yīng)的反應(yīng)孔中。此外，在不誘導(dǎo)CDC的情況下，制備了不含抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的反應(yīng)孔(0%反應(yīng)孔)作為對照，在誘導(dǎo)CDC的情況下，制備了不含有Daudi細胞的反應(yīng)孔(100%反應(yīng)孔)作為對照。在5%(302的氣氛下，于37。C培養(yǎng)2小時之后，在相應(yīng)的反應(yīng)孔中加入15|ilWST-1試劑(ROCHE制造)，在5%C02的氣氛下于37°C反應(yīng)4小時。在反應(yīng)完成后，測量每個孔的OD450，使用下式從每個孔的吸光度計算出CDC活性(％):CDC活性(％)=100x{1-(反應(yīng)孔吸光度-100%反應(yīng)孔吸光度)/(0%反應(yīng)孔吸光度-100%反應(yīng)孔吸光度"結(jié)果顯示在圖8中。如圖8所示，抗CD20人類IgG3嵌合抗體CD20-IgG3(+F)和CD20-IgG3(-F)的CDC活性高于抗CD20人類IgGl嵌合抗體CD20-IgGl(+F)和CD20-IgGl(-F)，由此證實了IgG3的CDC活性高于IgGl。但是，1133(+F)型和1133(-F)型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體顯示出顯著高于抗CD20人類IgG3嵌合抗體CDC活性的CDC活性。另一方面，抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體3311(+F)和3311(-F)的CDC活性低。此外，在所有的抗CD20抗體中，使用CHO/DG44作為宿主細胞產(chǎn)生的抗體樣品和使用CHO/FUT8;作為宿主細胞產(chǎn)生的抗體樣品顯示出幾乎相同的CDC活性，無論與抗體結(jié)合的糖鏈中巖藻糖的含量，1133型的活性都增加。此外，當(dāng)抗體濃度增加到l嗎/ml時，上述各種抗體的CDC活性在量上的趨勢沒有變化。3.1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的CDC活性測量為了進一步對本實施例條目2中顯示出特別高CDC活性的1133(+F)型和1133(-F)型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的CDC活性進行完整的評估，用本實施例條目2中相同的方式，使用CD20陽性的Burkitt淋巴瘤來源的細胞系ST486細胞(ATCC:CRL-1647)或Burkitt淋巴瘤來源的細胞系Raji細胞(ATCC:CCL-86)進行了CDC活性的測量。結(jié)果顯示在圖9中。正如圖9所示，在每個ST486細胞系(圖9A)和Raji細胞系(圖9B)中，抗CD20人類IgG3嵌合抗體CD20-IgG3(+F)和CD20-IgG3(-F)的CDC活性略高于抗CD20人類IgGl嵌合抗體CD20-IgGl(+F)和CD20-IgGl(-F)的CDC活性，而1133(+F)型和1133(-F)型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體顯示出明顯超過它們的CDC活性。此外，在所有這些抗CD20抗體中，以CHO/DG44作為宿主細胞產(chǎn)生的抗體樣品和以CH0/FUT8;作為宿主細胞產(chǎn)生的抗體樣品顯示出幾乎相同的CDC活性。4.各種抗CD20抗體對CD20陽性細胞系的ADCC活性的評估以下面的方式，使用CD20陽性Daudi細胞作為耙細胞，對實施例1條目5中獲得的各種抗CD20抗體的純化樣品的體外ADCC活性進行了測量。在測量中使用了Cytotox96試劑盒(Promega制造)。(1)制備人類效應(yīng)器細胞懸浮液從健康的志愿者中收集50ml外周血，與0.2tnl肝素鈉(TakedaPharmaceutical制造)輕輕混合。使用Lymphoprep(DaiichiPureChemicals制造)按照隨附的說明書從中分離出單核細胞級份，然后用RPMI1640培養(yǎng)基離心清洗一次，用10%FBS-RPMI1640培養(yǎng)基離心清洗一次，將細胞用作效應(yīng)器細胞。(2)測量ADCC活性反應(yīng)在96孔平底板(SumitomoBakelite制造)中進行，含有2xl05個效應(yīng)器細胞和lxlO"個Daudi細胞或ST486細胞、并含有不同濃度的每種抗CD20抗體的10%FBS-RPMI1640培養(yǎng)基，每個反應(yīng)孔分配200nl。此外，分別制備了下述的孔作為計算ADCC活性所必需的主觀孔不含效應(yīng)器細胞、耙細胞和抗體的培養(yǎng)基孔；只含有效應(yīng)器細胞的效應(yīng)器孔；只含有靶細胞的耙孔；含有效應(yīng)器細胞和耙細胞但不含抗體的NK孔；只含有耙細胞的100%反應(yīng)孔，并且在反應(yīng)開始后3小時15分時加入20pl試劑盒中隨附的裂解緩沖液；以及不含效應(yīng)器細胞、靶細胞和抗體的100%反應(yīng)對照孔，并且在反應(yīng)開始后3小時15分時加入20pl試劑盒中隨附的裂解緩沖液。每個反應(yīng)孔在5%C02氣氛下于37。C反應(yīng)4小時之后，將反應(yīng)板離心以從每個孔回收50^上清液?？字械纳锨逡罕环謩e轉(zhuǎn)移到U型底96孔板(SumitomoBakelite制造)的孔中，在每個孔中加入50pl顯色底物溶液(通過將1安培瓶試劑盒隨附的底物溶解在12ml試劑盒隨附的分析緩沖液中而制備)。顯色反應(yīng)在37°C下進行30分鐘，在每個孔中加入50試劑盒隨附的反應(yīng)終止溶液，然后測量OD450，使用下式從每個孔的吸光度計算出ADCC活性(％)ADCC活性(％)=100x(S-E-T)/(Max-T)S-樣品反應(yīng)孔吸光度-培養(yǎng)基孔吸光度E-效應(yīng)器孔吸光度-培養(yǎng)基孔吸光度T-耙孔吸光度-培養(yǎng)基孔吸光度Max=100%反應(yīng)孔-100%反應(yīng)對照孔結(jié)果顯示在圖10中。如圖10所示，在所有抗CD20抗體中，從CHO/FUT8;產(chǎn)生的抗體樣品顯示出比從CHO/DG44產(chǎn)生的抗體樣品更高的ADCC活性。從這個結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，同樣在本實施例中制備的所有抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的情況下，與其中與抗體Fc結(jié)合的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中還原末端存在的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合了巖藻糖的抗體組成物相比，其中與抗體Fc結(jié)合的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中還原末端存在的N-乙酰葡萄糖胺沒有結(jié)合巖藻糖的抗體組成物增加了ADCC活性。此外，也證實了抗CD20人類IgGl嵌合抗體顯示出比抗CD20人類IgG3嵌合抗體更高的ADCC活性，也就是說，IgG的ADCC活性高于IgGl。此外，1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體維持了與抗CD20人類IgGl嵌合抗體的水平相似的高ADCC活性。另外，發(fā)現(xiàn)與抗CD20人類IgG3嵌合抗體的情況相似，3311型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的ADCC活性低。5.測量各種抗CD20抗體與重組Fcy受體IIIa(后文中稱為FcyRIIIa)的結(jié)合活性為了分析本實施例條目4中證實的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的ADCC活性增強機制，按照常規(guī)的已知方法[CHn.CancerRes.,邊，6248(2004)]，測量了抗CD20人類IgGl嵌合抗體CD20-IgGl(-F)和CD20-IgGl(+F)、抗CD20人類IgG3嵌合抗體CD20-IgG3(-F)和CD20-IgG3(+F)、以及1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體U33(-F)和1133(+F)與在NK細胞表面上表達的Fc受體家族FcyRIIIa的結(jié)合活性。結(jié)果顯示在圖11中。如圖11所示，CH0/FUT8々—產(chǎn)生的抗體樣品顯示出比CHO/DG44產(chǎn)生的抗體樣品更高的與FqRnia的結(jié)合活性?；谶@個結(jié)果，證實了由于除去巖藻糖而導(dǎo)致的抗體的ADCC活性的增加，是由于增加了Fc區(qū)對Fc受體的活性而引起的，所述巖藻糖與復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的還原末端中存在的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合，所述復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈添加到1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的Fc上。根據(jù)上述，具有與抗CD20人類IgGl嵌合抗體Rituxan同樣可變區(qū)的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，其中H鏈的CH1結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域是人類IgGl抗體的氨基酸序列、Fc區(qū)域是人類IgG3抗體的氨基酸序列，該抗體具有超過抗CD20人類IgGl嵌合抗體和抗CD20人類IgG3嵌合抗體的CDC活性，也具有基本上等于抗CD20人類IgGl嵌合抗體的ADCC活性。此外，顯示出通過減少與Fc結(jié)合的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的還原末端中存在的N-乙酰葡萄糖胺所結(jié)合的巖藻糖含量，增加了Fc與Fc受體的結(jié)合活性，并將ADCC活性提高到類似于抗CD20人類IgGl嵌合抗體的情況。根據(jù)上面獲得的結(jié)果，將每個制備的相應(yīng)抗體和結(jié)構(gòu)域交換抗體的結(jié)構(gòu)和活性之間的關(guān)系概述在表3中。在表中，為了對活性進行分級，將八0<:(:活性和€0(:活性表示為++++、+++、++和+。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>基于上面的結(jié)果，顯示出具有其中人類IgGl抗體的Fc區(qū)被人類IgG3抗體的Fc區(qū)取代的重鏈恒定區(qū)的抗體分子，CDC活性高于人類IgGl抗體和人類IgG3抗體，并維持了與人類IgGl抗體基本上相等的高ADCC活性。實施例3使用動物細胞生產(chǎn)1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體和1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體1.生產(chǎn)1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體和1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體在實施例2中，通過用人類IgG抗體的Fc區(qū)取代抗CD20人類IgGl嵌合抗體的Fc區(qū)(CH2和CH3)而制備'的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，顯示出比抗CD20人類IgGl嵌合抗體更高的CDC活性。接下來，為了個別研究構(gòu)成Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域在CDC活性中的參與性，制備了下列兩個抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體。在下面的實施例中，具有其中CH1、鉸鏈區(qū)和CH3由來自人類IgGl抗體的氨基酸序列構(gòu)成、CH2由來自人類IgG3抗體的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈恒定區(qū)的抗CD20嵌合抗體，被稱為1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，并且具有其中CH1、鉸鏈區(qū)和CH2由來自人類IgGl抗體的氨基酸序列構(gòu)成、CH3結(jié)構(gòu)域由來自人類IgG3抗體的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈恒定區(qū)的抗CD20嵌合抗體，被稱為1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體。在每種情況下，可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列與pKANTEX2B8P編碼的抗CD20人類IgGl嵌合抗體的可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列相同。1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體和1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和氨基酸序列被顯示在表4中。此外，1131型的氨基酸序列被顯示在SEQIDNO:31中。因為尚未知道任何制備這些抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的例子，它們二者都是新結(jié)構(gòu)。此外，每個結(jié)構(gòu)域交換抗體的示意圖顯示在圖12中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>(1)構(gòu)建包含編碼1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體按照下面的方式，構(gòu)建編碼1U3型抗CD20嵌合抗體的表達載體，其中可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列與pKANTEX2B8P編碼的抗CD20人類IgGl嵌合抗體的可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列相同，并且它具有的重鏈恒定區(qū)中CH1、鉸鏈區(qū)和CH2由來自人類IgG3抗體的氨基酸序列構(gòu)成，CH3結(jié)構(gòu)域由來自人類IgGl抗體的氨基酸序列構(gòu)成。從圖13顯示的抗CD20人類IgGl嵌合抗體的表達載體pKANTEX2B8P，用限制性酶Apal(TakaraShuzo制造)和Smal(TakaraShuzo制造)剪切并純化編碼人類IgGl的CHI結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域的大約700bp的DNA片段。另一方面，通過用限制性酶在圖14中顯示的和在實施例l條目2(2)中描述的U33型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體pKANTEX93/1133上，進行同樣的處理，剪切并純化大約13kbp的DNA片段。在將這些純化的DNA制備物混合后，使用LigationHigh溶液(TOYOBO制造)進行連接反應(yīng)，使用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-BLUEMRF'(Stratagene制造)。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體克隆制備各質(zhì)粒DNA，并使用BigDyeTerminatorCycle測序試劑盒v3.1(AppliedBiosystems生產(chǎn))按照隨附的說明書進行反應(yīng)，然后使用同一公司的DNA測序儀ABIPRISM3700DNA分析儀分析插入到每個質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列，以證實獲得了圖15中顯示的質(zhì)粒pKTX93/1113。(2)構(gòu)建包含編碼1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體1131的核苷酸序列的表達載體按照下面的方式，構(gòu)建編碼圖16所示的、與人類CD20特異性反應(yīng)的1113型結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體，其中CH的CH2結(jié)構(gòu)域是人類IgG3的氨基酸序列，CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域是人類IgGl的氨基酸序列。從圖14顯示的和在實施例1條目2(2)中描述的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體pKANTEX93/1133中，用限制性酶Apal(TakaraShuzo制造)禾nSmal(TakaraShuzo制造)剪切并純化編碼人類IgGl的CHI結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域和人類IgG3的CH2結(jié)構(gòu)域的大約700bp的DNA片段。另一方面，在圖13顯示的抗CD20人類IgGl嵌合抗體的表達載體pKANTEX2B8P上進行相同的限制性酶處理，剪切并純化了大約13kbp的DNA片段。在將這些純化的DNA制備物混合后，使用LigationHigh溶液(TOYOBO制造)進行連接反應(yīng)，使用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-BLUEMRF'(Stratagene制造)。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體克隆制備各質(zhì)粒DNA，并使用BigDyeTerminatorCycle測序試劑盒v3.1(AppliedBiosystems生產(chǎn))按照隨附的說明書進行反應(yīng)，然后使用同一公司的DNA測序儀ABIPRISM3700DNA分析儀，分析插入到每個質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列，以證實獲得了圖16顯示的質(zhì)粒pKTX93/1131。2.1113型和1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體在動物細胞中的穩(wěn)定表達按照與實施例1條目3中相同的方式，制備穩(wěn)定地生產(chǎn)抗CD20抗體結(jié)構(gòu)域交換抗體的細胞。在本實施例的條目1中制備的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體被導(dǎo)入實施例1條目3中作為宿主細胞描述的CHO/FUT8一。3.抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化按照與實施例1條目5中相同的方式，培養(yǎng)并純化在本實施例條目2中獲得的、能夠表達1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體或1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的轉(zhuǎn)化體。1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體使用Prosep-G柱進行純化。此外，當(dāng)使用Prosep-A柱純化1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體、1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體時，只有1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體能夠被純化。每個結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體和宿主細胞以及純化抗體的名稱顯示在表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>4.通過SDS-PAGE評價純化的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化程度為了測量在本實施例條目3中獲得的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化樣品的純化程度，按照與實施例1條目6中相同的方法進行SDS-PAGE。作為電泳的比較性對照，對于實施例1條目5中制備的相應(yīng)的CD20-IgGl型、CD20-IgG3型和1133型純化樣品也進行了同樣的操作。結(jié)果顯示在圖17中。1113型和1131型分別顯示出與CD20-IgGl型和1133型相似的電泳帶型。從構(gòu)成1113型和1131型的H鏈和L鏈的氨基酸序列推導(dǎo)的分子量彼此相同，H鏈為大約50kDa，L鏈為大約24kDa。因為這些分子量與CD20-IgGl型和1133型的H鏈和L鏈相似，電泳圖案也與其相似，證實了1113型和1131型由所需的H鏈和L鏈構(gòu)成。此外，從構(gòu)成CD20-IgG3型的L鏈的氨基酸序列推導(dǎo)的分子量為大約24kDa，與CD20-IgGl型的相似，但是構(gòu)成CD20-IgG3型的H鏈為大約54kDa，比CD20-IgGl型的H鏈的大，所以CD20-IgG3型的L鏈出現(xiàn)在與CD20-IgGl型的L鏈相似的位置，但是CD20-IgG3型的H鏈的條帶比CD20-IgGl型的H鏈的條帶位于髙分子量一側(cè)。根據(jù)上面的結(jié)果，證實了在本實施例條目3中獲得的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化樣品中，包含了充分比率的分別由H鏈和L鏈構(gòu)成的所需的IgG分子。實施例41131型和1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的活性評價按照下面的方法，對于在實施例3條目3中獲得的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化樣品，進行各種活性的比較。1.1113型和1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的CDC活性為了評價在CD20陽性細胞系中，實施例1條目5中獲得的CD20-IgGl型抗CD20人類IgGl嵌合抗體、CD20-IgG3型抗CD20人類IgG3嵌合抗體和1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體以及實施例3條目3中獲得的1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的體外CDC活性，使用CD20陽性ST486細胞或Raji細胞，按照與實施例2條目2中相同的方法進行試驗。結(jié)果顯示在圖18中。如圖18所示，在每個ST486細胞系(圖18A)和Raji細胞系(圖18B)中，CD20-IgG3(-F)的CDC活性比CD20-IgGl(-F)的CDC活性高，而U33(-F)的CDC活性比CD20-IgG3(-F)的CDC活性高。此外，1113(-F)和1131(-F)的CDC活性比CD20-IgG3(-F)的CDC活性高。另外，1131(-F)的CDC活性也比1113(-F)的CDC活性高。根據(jù)這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)來自IgG3的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域都對用IgG3的Fc替換IgGl的Fc所影響的CDC活性的增加有貢獻。此外，從上述的結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，在CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域之間，CH2結(jié)構(gòu)域的貢獻更大。2.評價CD20陽性細胞系的ADCC活性使用CD陽性Daudi細胞作為靶細胞，按照與實施例2條目5中相同的步驟，測定實施例l條目5中獲得的抗CD20人類IgGl嵌合抗體CD20-IgGl、抗CD20人類IgG3嵌合抗體CD20-IgG3和1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體以及在實施例3條目3中獲得的1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的體外ADCC活性。在測量中使用了Cytotox96試劑盒(Promega生產(chǎn))。結(jié)果顯示在圖19中。如圖19所示，1113(-F)和1131(-F)也顯示出與CD20-IgGl(-F)和1133(-F)相當(dāng)?shù)腁DCC活性，這些結(jié)果顯示，ADCC活性與IgGl基本上相等，即使是在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的CH2結(jié)構(gòu)域和/或CH3結(jié)構(gòu)域與人類IgG3進行結(jié)構(gòu)域交換的情況下。根據(jù)上述，證實了與抗CD20人類IgGl嵌合抗體具有同樣的可變區(qū)的1113型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，其中只有重鏈恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域含有來自人類IgG3抗體的氨基酸序列，而其它結(jié)構(gòu)域含有來自人類IgGl抗體的氨基酸序列，所述抗體具有超過抗CD20人類IgG3嵌合抗體的CDC活性和等于抗CD20人類IgGl嵌合抗體的ADCC活性。根據(jù)上面獲得的結(jié)果，每個制備的抗體和結(jié)構(gòu)域交換抗體的結(jié)構(gòu)和活性之間的相關(guān)性概述在表6中。在表中，為了顯示活性的高度，將八00:活性和€0(:活性表示為++++、+++、++和+。此外，對于與蛋白A的結(jié)合活性來說，與蛋白A具有結(jié)合活性的用+表示，沒有活性的用-表示。表6ADCCCDC蛋白A結(jié)構(gòu)名稱CH1鉸鏈區(qū)CH2CH3活性活性妙A(yù)5口1=1IgGl(-F)IgGlIgGlIgGlIgGl+++++IgG3(-F)IgG3IgG3IgG3IgG3++++-1133(+F)/1133(-F)IgGlIgGlIgG3IgG3++/++++++++-1113(-F)IgGlIgGlIgGlIgG3++++++-im(-F)IgGlIgGlIgG3IgGl++++++++根據(jù)上述，發(fā)現(xiàn)具有的重鏈恒定區(qū)中人類IgGl抗體重鏈恒定區(qū)中的CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列交換的抗體分子U133型結(jié)構(gòu)域交換抗體)的高CDC活性的大部分，在具有的重鏈恒定區(qū)中只有人類IgGl抗體重鏈恒定區(qū)中的CH2結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列交換的抗體分子(1131型結(jié)構(gòu)域交換抗體)中也得到了維持。此外，顯示出具有的重鏈恒定區(qū)中只有人類IgGl抗體重鏈恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列所取代的抗體分子(1131型結(jié)構(gòu)域交換抗體)，維持了與人類IgGl抗體相當(dāng)?shù)母逜DCC活性，并且當(dāng)在與Fc結(jié)合的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的還原末端存在的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的巖藻糖被移除時，ADCC活性被進一步提高。實施例5測量抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體與各種重組Fcy受體的結(jié)合活性按照常用的已知方法[Clin.CancerRes"辺，6248(2004)]，測量抗CD20人類IgGl嵌合抗體CD20-IgGl(-F)和CD20-IgGl(+F)和1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體1133(-F)和1133(+F)與Fc受體家族FqRI和FcyRIIa的結(jié)合活性。結(jié)果顯示在圖20中。如圖20所示，1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體顯示出與它們與FcyRI還有FqRIIa的結(jié)合活性與IgGl抗CD20抗體具有類似水平。該結(jié)果顯示出用IgG3抗體的氨基酸序列取代IgGl抗體的CH2和CH3，不影響它們與Fc受體家族FcyRI和FqRIIa的結(jié)合活性。此外，如圖20所示，不論是否存在與Fc結(jié)合的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的還原末端存在的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的巖藻糖，1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體和IgGl抗CD20抗體的每個抗體都顯示出相似的結(jié)合活性。上述結(jié)果顯示出，與Fc結(jié)合的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的還原末端中存在的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的巖藻糖的存在與否，不影響對Fc受體家族FcyRI和FcyRIIa的結(jié)合活性，并且該活性與IgGl的活性相當(dāng)。實施例6使用動物細胞，生產(chǎn)其中含有人類IgGl抗體CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指標(biāo)指示的人類IgG3抗體的多肽取代的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體1.構(gòu)建其中整個CH2結(jié)構(gòu)域和部分CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列取代的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體正如實施例4條目1中所看到的那樣，發(fā)現(xiàn)用來自IgG3抗體的氨基酸序列取代CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域二者，對人類IgGl抗體的CDC活性的增強都有極大的貢獻。另一方面，正如在實施例l條目5中看到的那樣，1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體和1U3型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體與人類IgG3抗體的情況相同，都不與蛋白A結(jié)合，但是1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體與人類IgGl抗體的情況相同，與蛋白A結(jié)合，這個事實表明含有來自人類IgGl抗體的氨基酸序列的CH3結(jié)構(gòu)域?qū)εc蛋白A的結(jié)合有貢獻。當(dāng)抗體作為藥物生產(chǎn)時，從容易純化抗體的觀點來看，重要的是抗體與蛋白A有結(jié)合活性。因此，通過用來自人類IgG3抗體的CH2結(jié)構(gòu)域完全取代來自人類IgGl抗體的CH2結(jié)構(gòu)域、并用來自人類IgG3抗體的CH3結(jié)構(gòu)域部分取代IgGl的CH3結(jié)構(gòu)域，純化了具有與1133型相當(dāng)?shù)腃DC活性并還具有與蛋白A的結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)域交換抗體。在本實施例中設(shè)計的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的示意圖被顯示在圖21中。因為這些結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列是未知的，它們中的每個都是新結(jié)構(gòu)。IgG抗體的CH2結(jié)構(gòu)域含有EU指數(shù)指示的231到340位的氨基酸殘基，其CH3結(jié)構(gòu)域含有EU指數(shù)指示的341到447位的氨基酸殘基。113A型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，是其中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體中231位到356位的多肽所取代的結(jié)構(gòu)域交換抗體。113B型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，是其中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到358位的多肽所取代的結(jié)構(gòu)域交換抗體。113C型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，是其中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到384位的多肽所取代的結(jié)構(gòu)域交換抗體。113D型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，是其中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到392位的多肽所取代的結(jié)構(gòu)域交換抗體。113E型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，是其中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到397位的多肽所取代的結(jié)構(gòu)域交換抗體。113F型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，是其中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到422位的多肽所取代的結(jié)構(gòu)域交換抗體。113G型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，是其中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到434位和436到447位的多肽所取代的結(jié)構(gòu)域交換抗體。113H型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，是其中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到435位的多肽所取代的結(jié)構(gòu)域交換抗體。這些不同的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體通過下面的步驟制備。每個這些抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體，都可以這樣生產(chǎn)制備編碼每個結(jié)構(gòu)域交換抗體的CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的DNA片段，用實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體pKTX93/1133的核苷酸序列替換它，所述核苷酸序列編碼其CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。替換編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，可以使用位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的5'末端側(cè)的限制性酶識別序列Bspl407I和位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的3'末端側(cè)的限制性酶識別序列Nrul來進行。(1)構(gòu)建包含編碼113A型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體通過下面顯示的步驟(圖22)，構(gòu)建了包含113A型結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體，在該抗體中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到356位的多肽所取代。113A型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列顯示在SEQIDNO:33中。首先，設(shè)計了SEQIDNO:34所顯示的核苷酸序列。序列是基于實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體上，位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的5'末端側(cè)的限制性酶識別序列Bspl4071到位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的3'末端側(cè)的限制性酶識別序列NruI的序列來設(shè)計的，并且在核苷酸編碼的氨基酸序列中，EU指數(shù)指示的N-末端側(cè)到356位的氨基酸序列是基于來自人類IgG3抗體的氨基酸序列，而在EU指數(shù)指示的357到447位的氨基酸序列是基于來自人類IgGl抗體的氨基酸序列。接下來，設(shè)計了SEQIDNO:35和36顯示的每個核苷酸序列。SEQIDNO:35和36所顯示的核苷酸序列分別是用于通過PCR來擴增由SEQIDNO:34所顯示的核苷酸序列組成的DNA片段的有義引物和反義引物。制備了SEQIDNO:35和36所顯示的核苷酸序列的合成的各寡聚DNA(FASMAC生產(chǎn))，使用實施例條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒作為模板，進行PCR。制備PCR的反應(yīng)溶液，使得兩種合成的寡聚DNA中每一個的終濃度為0.5^M，并使用DNA熱循環(huán)儀GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(AppliedBiosystems制造)進行PCR,條件為94°C加熱4分鐘，然后進行3步反應(yīng)組成的25個循環(huán)94。C30秒，55。C30秒和74。C60秒。在PCR完成后，將反應(yīng)溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN制造)回收大約300bp的PCR產(chǎn)物。將這樣回收的PCR產(chǎn)物用限制性酶Bspl407I(TakaraShuzo制造)和限制性酶NruI(TakaraShuzo制造)消化，然后將反應(yīng)溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN制造)剪切和純化大約300bp的DNA片段。另一方面，用同樣的處理方法，使用限制性酶從實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒上剪切并純化大約13kbp的DNA片段。在混合了這些純化的DNA片段之后，通過加入LigationHigh溶液(TOYOBO制造)進行連接反應(yīng)，用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-BLUEMRF'(Stratagene制造)。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體克隆制備各質(zhì)粒DNA，使用BigDyeTerminatorCycle測序試劑盒v3.1(AppliedBiosystems生產(chǎn))按照隨附的說明書進行反應(yīng)，然后使用同一公司的DNA測序儀ABIPRISM3700DNA分析儀，分析插入到每個質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列，以證實獲得了113A型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒pKTX93/113A。(2)構(gòu)建包含編碼113B型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體通過下面顯示的步驟(圖22)構(gòu)建包含113B型結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體，在該抗體中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中含有CH2結(jié)構(gòu)域的多肽，被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體中231到358位的多肽所取代。113B型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列顯示在SEQIDNO:37中。首先，設(shè)計了SEQIDNO:38所顯示的核苷酸序列。序列是基于實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體上，位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的5'末端側(cè)的限制性酶識別序列Bspl4071到位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的3'末端側(cè)的限制性酶識別序列Nrul的序列來設(shè)計的，并且在核苷酸序列編碼的氨基酸序列中，EU指數(shù)指示的N-末端側(cè)到358位的氨基酸序列是基于來自人類IgG3抗體的氨基酸序列，而在EU指數(shù)指示的359到447位的氨基酸序列是基于來自人類IgGl抗體的氨基酸序列。接下來，設(shè)計了SEQIDNO:39中顯示的核苷酸序列。SEQIDNO:39所顯示的核苷酸序列是用于通過PCR擴增含有SEQIDNO:38所顯示的核苷酸序列的DNA片段的有義引物的核苷酸序列，并與含有SEQIDNO:36顯示的核苷酸序列的反義引物組合使用。制備了SEQIDNO:39和36所顯示的核苷酸序列的每個合成的寡聚DNA(FASMAC生產(chǎn))，使用實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒作為模板，進行PCR。此后，使用與本條目(l)相同的方法，制備113B型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體表達載體質(zhì)粒pKTX93/113B。(3)構(gòu)建包含編碼113C型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體通過下面顯示的步驟(圖22)，構(gòu)建包含113C型結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體，在該抗體中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到384位的多肽所取代。113C型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列顯示在SEQIDNO:40中。首先，設(shè)計了SEQIDNO:41所顯示的核苷酸序列。序列是基于在實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體上，位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的5'末端側(cè)的限制性酶識別序列Bspl4071到位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的3'末端側(cè)的限制性酶識別序列Nrul的序列來設(shè)計的，并且在核苷酸序列編碼的氨基酸序列中，EU指數(shù)指示的N-末端側(cè)到384位的氨基酸序列是基于來自人類IgG3抗體的氨基酸序列，而在EU指數(shù)指示的385到447位的氨基酸序列是基于來自人類IgGl抗體的氨基酸序列。接下來，設(shè)計了SEQIDNO:42和43中顯示的每個核苷酸序列。SEQIDNO:42和43中所顯示的核苷酸序列是合成的寡聚DNA的核苷酸序列，用于通過PCR擴增含有SEQIDNO:41所顯示的核苷酸序列的DNA片段。SEQIDNO:42顯示的核苷酸序列的3'-末端一側(cè)和SEQIDNO:43顯示的核苷酸序列的5'-末端一側(cè)被設(shè)計成使得其中其大約20bp象互補序列一樣互相重疊，以便當(dāng)PCR進行時能夠引起退火。制備了SEQIDNO:42和43所顯示的核苷酸序列的每個合成的寡聚DNA(FASMAC生產(chǎn))，并進行PCR。制備PCR反應(yīng)溶液，使得兩種合成的寡聚DNA中每一個的終濃度為0.2(iM，使用DNA熱循環(huán)儀GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(AppliedBiosystems制造)進行PCR，條件為94。C加熱4分鐘，然后進行25個循環(huán)的3步反應(yīng)94。C30秒，55。C30秒和68。C60秒。此后，使用與本條目(1)中相同的方法，制備113C型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體表達載體質(zhì)粒pKTX93/113C。(4)構(gòu)建包含編碼113D型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體通過下面顯示的步驟(圖22)，構(gòu)建包含113D型結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體，在該抗體中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到392位的多肽所取代。113D型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列顯示在SEQIDNO:44中。首先，設(shè)計了SEQIDNO:45所顯示的核苷酸序列。序列是基于實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體上，位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的5'末端側(cè)的限制性酶識別序列Bspl4071到位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的3'末端側(cè)的限制性酶識別序列Nrul的序列來設(shè)計的，并且在核苷酸序列編碼的氨基酸序列中，EU指數(shù)指示的N-末端側(cè)到392位的氨基酸序列是基于來自人類IgG3抗體的氨基酸序列，而EU指數(shù)指示的393到447位的氨基酸序列是基于來自人類IgGl抗體的氨基酸序列。接下來，設(shè)計了SEQIDNO:46顯示的核苷酸序列。SEQIDNO:46所顯示的核苷酸序列是合成的寡聚DNA的核苷酸序列，用于通過PCR擴增含有SEQIDNO:45所顯示的核苷酸序列的DNA片段，其與含有SEQIDNO:43所顯示的核苷酸序列的合成寡聚DNA組合使用。SEQIDNO:46顯示的核苷酸序列的3'-末端側(cè)和SEQIDNO:43顯示的核苷酸序列的5'-末端側(cè)被設(shè)計成使得其大約20bp互相重疊，以便當(dāng)PCR進行時能夠引起退火。制備了SEQIDNOs:46和43所顯示的核苷酸序列的每個合成的寡聚DNA(FASMAC生產(chǎn))，并進行PCR。此后，使用與本條目(3)中相同的方法，制備113D型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒，pKTX93/113D。(5)構(gòu)建包含編碼113E型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體通過下面顯示的步驟(圖22)，構(gòu)建包含113E型結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體，在該抗體中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到397位的多肽所取代。113E型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列顯示在SEQIDNO:47中。首先，設(shè)計了SEQIDNO:48所顯示的核苷酸序列。序列是基于實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體上，位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的5'末端側(cè)的限制性酶識別序列Bspl407I到位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的3，末端側(cè)的限制性酶識別序列Nrul的序列來設(shè)計的，并且在核苷酸序列編碼的氨基酸序列中，EU指數(shù)指示的N-末端側(cè)到397位的氨基酸序列是基于來自人類IgG3抗體的氨基酸序列，而EU指數(shù)指示的398到447位的氨基酸序列是基于來自人類IgGl抗體的氨基酸序列。接下來，設(shè)計了SEQIDNO:49顯示的核苷酸序列。SEQIDNO:49所顯示的核苷酸序列是合成的寡聚DNA的核苷酸序列，用于通過PCR擴增含有SEQIDNO:48所顯示的核苷酸序列的DNA片段，其與含有SEQIDNO:43所顯示的核苷酸序列的合成寡聚DNA組合使用。SEQIDNO:49顯示的核苷酸序列的3'-末端側(cè)和SEQIDNO:43顯示的核苷酸序列的5'-末端側(cè)被設(shè)計成使得其大約20bp互相重疊，以便當(dāng)PCR進行時能夠引起退火。制備SEQIDNO:49和43所顯示的核苷酸序列的每個合成的寡聚DNA(FASMAC生產(chǎn))，并進行PCR。此后，使用與本條目(3)中相同的方法，制備了113E型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒，pKTX93/113E。(6)構(gòu)建包含編碼113F型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體通過下面顯示的步驟(圖22),構(gòu)建包含113F型結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體，在該抗體中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231到422位的多肽所取代。113F型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列顯示在SEQIDNO:50中。首先，設(shè)計了SEQIDNO:51所顯示的核苷酸序列。序列是基于實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體上，位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的5'末端側(cè)的限制性酶識別序列Bspl407I到位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的3'末端側(cè)的限制性酶識別序列Nrul的序列來設(shè)計的，并且在核苷酸序列編碼的氨基酸序列中，EU指數(shù)指示的N-末端側(cè)到422位的氨基酸序列是基于來自人類IgG3抗體的氨基酸序列，而EU指數(shù)指示的423到447位的氨基酸序列是基于來自人類IgGl抗體的氨基酸序列。制備了SEQIDNO:39和36所顯示的核苷酸序列的每個合成的寡聚DNA(FASMAC生產(chǎn))，并使用在實施例1條目1中制備的抗CD20人類IgG3嵌合抗體的表達載體質(zhì)粒pKANTEX2B8y3作為模板進行PCR。此后，使用與本條目(1)中相同的方法，制備113F型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒，pKTX93/113F。(7)構(gòu)建包含編碼113H型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體通過下面顯示的步驟(圖22)，構(gòu)建包含113H型結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體，在該抗體中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到435位的多肽所取代。113H型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列顯示在SEQIDNO:52中。首先，設(shè)計了SEQIDNO:53所顯示的核苷酸序列。序列是基于實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體上，位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的5'末端側(cè)的限制性酶識別序列Bspl407I到位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的3'末端側(cè)的限制性酶識別序列Nrul的序列來設(shè)計的，并且在核苷酸序列編碼的氨基酸序列中，EU指數(shù)指示的N-末端側(cè)到435位的氨基酸序列是基于來自人類IgG3抗體的氨基酸序列，而EU指數(shù)指示的436到447位的氨基酸序列是基于來自人類IgGl抗體的氨基酸序列。接下來，設(shè)計了SEQIDNO:54顯示的核苷酸序列。SEQIDNO:54所顯示的核苷酸序列是反義引物的核苷酸序列，用于通過PCR擴增含有SEQIDNO:53所顯示的核苷酸序列的DNA片段，其與含有SEQIDNO:39所顯示的核苷酸序列的有義引物組合使用。制備SEQIDNO:39和54所顯示的核苷酸序列的每個合成的寡聚DNA(FASMAC生產(chǎn))，并使用在實施例1條目1中制備的抗CD20人類IgG3嵌合抗體的表達載體質(zhì)粒pKANTEX2B8丫3作為模板，進行PCR。此后，使用與本條目(1)中相同的方法，制備113H型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒pKTX93/113H。(8)構(gòu)建包含編碼113G型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體通過下面顯示的步驟(圖22)，構(gòu)建包含113G型結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體，在該抗體中在抗CD20人類IgGl嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)中包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被對應(yīng)于EU指數(shù)指示的人類IgG3抗體231位到434位的多肽所取代。113G型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列顯示在SEQIDNO:55中。首先，設(shè)計了SEQIDNO:56所顯示的核苷酸序列。序列是基于實施例2條目2中制備的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體上，位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的5'末端側(cè)的限制性酶識別序列Bspl407I到位于編碼重鏈CH3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的3'末端側(cè)的限制性酶識別序列Nrul的序列來設(shè)計的，并且在核苷酸序列編碼的氨基酸序列中，EU指數(shù)指示的N-末端側(cè)到434位的氨基酸序列是基于來自人類IgG3抗體的氨基酸序列，EU指數(shù)指示的435位的氨基酸序列是基于來自人類IgGl抗體的氨基酸序列,而EU指數(shù)指示的436到447位的氨基酸序列是基于來自人類IgG3抗體的氨基酸序列。接下來，設(shè)計了SEQIDNO:57顯示的核苷酸序列。SEQIDNO:57所顯示的核苷酸序列是反義引物的核苷酸序列，用于通過PCR擴增含有SEQIDNO:56所顯示的核苷酸序列的DNA片段，其與含有SEQIDNO:39所顯示的核苷酸序列的有義引物組合使用。制備SEQIDNO:39和56所顯示的核苷酸序列的每個合成的寡聚DNA(FASMAC生產(chǎn))，并使用在實施例1條目1中制備的抗CD20人類IgG3嵌合抗體的表達載體質(zhì)粒pKANTEX2B8y3作為模板，進行PCR。此后，使用與本條目(1)中相同的方法，制備113G型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒，pKTX93/113G。2.其中整個CH2結(jié)構(gòu)域和部分CH3結(jié)構(gòu)域的被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列取代的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體在動物細胞中的穩(wěn)定表達按照與實施例1條目3中相同的方法，通過將在本實施例條目1中制備的其中整個CH2結(jié)構(gòu)域和部分CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列所取代的每個抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體導(dǎo)入在實施例1條目3中描述的宿主細胞CHO/FUT8;，制備能夠穩(wěn)定生產(chǎn)每種其中整個CH2結(jié)構(gòu)域和部分CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列所取代的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的細胞。3.其中整個CH2結(jié)構(gòu)域和部分CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列所取代的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化按照與實施例1條目5中相同的方式，將在本實施例條目2中獲得的每個轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)和純化，所述轉(zhuǎn)化體能夠表達其中整個CH2結(jié)構(gòu)域和部分CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列所取代的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體。在純化中使用了Prosep-G柱。每個修飾的抗體的對應(yīng)表達載體、宿主細胞、純化的抗體的名稱和重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列顯示在表7中。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>4.通過SDS-PAGE評價各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化程度為了評價本實施例條目3中獲得的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化樣品的純化程度，按照與實施例1條目6中相同的方法進行了SDS-PAGE。作為電泳的比較性對照，對實施例1條目5中制備的純化樣品CD20-IgGl(-F)和1133(-F)也迸行了同樣的操作。結(jié)果顯示在圖23中。在本實施例條目3中獲得的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的每個純化的樣品顯示出與CD20-IgGl(-F)和1133(-F)相似的電泳帶型。從構(gòu)成每個不同的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的H鏈和L鏈的氨基酸序列推導(dǎo)的分子量彼此相似，即H鏈?zhǔn)谴蠹s50千道爾頓(在后文中稱為kDa)、L鏈?zhǔn)谴蠹s24kDa。因為這些分子量與CD20-IgGl(-F)和1133(-F)的H鏈和L鏈的分子量相似并且它們的電泳帶型也與其相似，這就證實了每個不同的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體由所需的H鏈和L鏈構(gòu)成。根據(jù)上面的結(jié)果，證實了在本實施例條目3中獲得的各種不同抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化樣品中，包含了充分比率的相應(yīng)由H鏈和L鏈構(gòu)成的所需IgG分子。實施例7其中整個CH2結(jié)構(gòu)域和部分CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列所取代的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的活性評價-按照下面的方法對實施例6條目3中獲得的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化樣品的各種活性進行了比較。1.測量其中整個CH2結(jié)構(gòu)域和部分CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列所取代的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的CDC活性對實施例6條目3中獲得的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體、實施例1條目5中獲得的1133型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體和實施例3條目3中獲得的1131型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的純化樣品，測量了導(dǎo)入人類CD20基因的細胞系CD20/EL4-A[Clin.CancerRes"U,2327(2005)]的體外CDC活性。反應(yīng)在96孔平底板(SumitomoBakelite制造)中進行，每個反應(yīng)孔分配150pl含有5xl04個靶細胞并含有不同濃度(0.1|ig/ml到30(ig/ml)的每種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的人類補體稀釋培養(yǎng)基。然后，按照與實施例2條目2中相同的方法進行測試°結(jié)果顯示在圖24中。所有各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體都顯示出與1131(-F)相似或更高的CDC活性，具體來說，113E(-F)、113F(-F)、113G(-F)和113H(-F)顯示出比1131(-F)明顯高的CDC活性。2.測量其中整個CH2結(jié)構(gòu)域和部分CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的氨基酸序列所取代的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體與蛋白A的結(jié)合活性通過下面描述的步驟，對實施例6條目3中獲得的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體、實施例1條目5中獲得的CD20-IgGl(-F)、CD20-IgG3(-F)和113(-F)以及在實施例3條目3中獲得的1131(-F)和1113(-F)與蛋白A的結(jié)合活性進行了測量。將山羊抗人k鏈抗體(Sigma-Aldrich制造)用PBS稀釋到濃度為5|ig/ml，以50pl/孔分配到用于ELISA的96孔板中(Greiner制造)，然后在室溫放置1小時以進行吸附。在反應(yīng)和隨后用PBS進行清洗后，在其中加入100jil/孔的1%BSA-PBS，在室溫反應(yīng)1小時以阻斷剩余的活性基團。在除去1%BSA-PBS后，向其中加入50pl/孔不同濃度(0.01i!g/ml到10pg/ml)的每種待測抗體，使之在室溫反應(yīng)2小時。在反應(yīng)和隨后用Tween-PBS清洗每個孔之后，加入50|11/孔用PBS稀釋5000倍的過氧化物酶標(biāo)記的蛋白A溶液(AmershamBioscience制造)，使之在37°C反應(yīng)2小時。在用Tween-PBS清洗后，加入50ji1/孔的ABTS底物溶液顯色，然后測量OD415。結(jié)果顯示在圖25中。首先，與CD20-IgGl(-F)、CD20-IgG3(-F)、1133(-F)、1131(-F)和1113(-F)比較與蛋白A的結(jié)合活性(圖25A)。如圖25A所示，CD20-IgGl(-F)和1131(-F)二者都顯示出依賴于濃度的與蛋白A的結(jié)合活性，并且活性水平彼此相當(dāng)。另一方面，在CD20-IgG3(-F)、1133(-F)和1113(-F)的情況下，在測量的濃度范圍內(nèi)(10嗎/ml以下)沒有發(fā)現(xiàn)與蛋白A的結(jié)合活性。接下來，將各種不同抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體與蛋白A的結(jié)合活性與CD20-IgGl(-F)和1131(-F)的進行了比較。如圖25B所示，1133(-F)和113H(-F)沒有顯示出與蛋白A的結(jié)合活性，但是113A(-F)、113B(-F)、113C(-F)、113D(-F)、113E(-F)、113F(-F)和113G(-F)顯示出了與IgGl相當(dāng)?shù)呐c蛋白A結(jié)合的活性。各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的CDC活性和蛋白A結(jié)合活性的級別顯示在表8中。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>在其中IgGl抗體的CH2和CH3被IgG3的氨基酸序列所取代的1133型結(jié)構(gòu)域交換抗體中，它的CDC活性增加了，但是與蛋白A的結(jié)合活性缺失了。另一方面，在其中只有IgGl抗體的CH2被IgG3的氨基酸序列取代的1131型抗體中，它維持了與蛋白A的結(jié)合活性，但是CDC活性的增加率降低了。對于在本實施例中制備的各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體來說，其中整個CH2結(jié)構(gòu)域和部分CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的相應(yīng)氨基酸序列所取代，除了113H(-F)之外它們都具有與IgGl相比更高的CDC活性和與蛋白A的結(jié)合活性。此外，來自人類IgG3抗體的氨基酸序列占總CH3結(jié)構(gòu)域的比率相對高的113E(-F)、113F(-F)和113G(-F)，顯示出比1131(-F)更高的CDC活性，并具有與人類lgGl相似的與蛋白A的結(jié)合活性。在具有與人類IgGl抗體相似的與蛋白A的結(jié)合活性的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體中，113F(-F)顯示出了特別高的CDC活性?；谏厦娴慕Y(jié)果，發(fā)現(xiàn)在其中IgGl抗體的整個CH2結(jié)構(gòu)域被來自IgG3抗體的CH2結(jié)構(gòu)域所取代和部分CH3結(jié)構(gòu)域被來自人類IgG3抗體的CH3結(jié)構(gòu)域所取代的抗體中，CDC活性被增加到高于其中只有來自IgGl抗體的CH2結(jié)構(gòu)域被來自IgG3抗體的CH2結(jié)構(gòu)域所取代的抗體的水平，并且它們可以維持與人類IgGl抗體相似的與蛋白A結(jié)合的活性。實施例8評價各種抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體對慢性淋巴細胞性白血病(CLL)細胞的CDC活性使用在實施例1條目5中獲得的CD20-IgGl(-F)、在實施例1條目5中獲得的1131(-F)、在實施例3條目3中獲得的1131(-F)和在實施例6條目3中獲得的113F(-F)，測量了對CD20陽性的CLL細胞系MEC-1(DSMZ:ACC497)、MEC-2(DSMZ:ACC500)和EHEB(DSMZ:ACC67)的體外CDC活性。反應(yīng)在96孔平底板(SumitomoBakelite制造)中進行，每個反應(yīng)孔分配150fil含有5x104個靶細胞并含有不同濃度(0.04jig/ml到100ng/ml)的每種抗CD20抗體的人類補體稀釋培養(yǎng)基。然后，按照與實施例2條目2中相同的方法進行測試。結(jié)構(gòu)顯示在圖26中。與CD20-IgGl相比，1133(-F)、1131(-F)禾口113F(-F)對所有CD20陽性CLL細胞系MEC-1(圖26A)、MEC-2(圖26B)和EHEB(圖26C)的CDC活性都明顯增加了。上述結(jié)果表明含有每種這些抗體作為活性成分的藥物都對CLL的治療有效。實施例9制備抗Campath人類IgGl抗體、1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體1.構(gòu)建抗Campath人類IgGl抗體、1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體在實施例4條目1中進行的抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體1131(-F)和1113(-F)的CDC活性的比較中，1131(-F)和1113(-F)都顯示出比IgGl更高的CDC活性，尤其是1131(-F)顯示出比1113(-F)更高的CDC活性，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)CH2結(jié)構(gòu)域是IgG3時，對增加CDC活性的貢獻大。為了證實類似的CDC活性的增加也可以在針對其它抗原的抗體中發(fā)現(xiàn)，制備了人類IgGl、1133型和1131型人源化抗Campath抗體Campath-1H，以比較它們的CDC活性。(1)構(gòu)建包含編碼1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體按照下面顯示的步驟(圖27)，構(gòu)建包含特異性識別人類Campath抗原(CD52)的1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體的核苷酸序列的表達載體，其中在重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中，CHI和鉸鏈區(qū)是人類IgGl的氨基酸序列，CH2和CH3是人類IgG3的氨基酸序列。首先，從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫獲得人源化抗Campath抗體Campath-lH的重鏈可變區(qū)(登記號S79311)和輕鏈可變區(qū)(登記號S79307)的氨基酸序列和核苷酸序列。人源化抗Campath抗體Campath-lH的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列及其核苷酸序列分別顯示在SEQIDNO:58和59中，人源化抗Campath抗體Campath-1H的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列及其核苷酸序列分別顯示在SEQIDNO:60和61中。根據(jù)序列信息，設(shè)計了SEQIDNO:62顯示的1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體的重鏈的氨基酸序列，其含有人源化抗Campath抗體Campath-1H的重鏈可變區(qū)和1133型重鏈恒定區(qū)的序列，以及SEQIDNO:63顯示的抗Campath抗體的輕鏈的氨基酸序列，其含有人源化抗Campath抗體Campath-1H的輕鏈可變區(qū)和人源化抗體的輕鏈恒定區(qū)的序列。接下來，設(shè)計了SEQIDNO:64所顯示的核苷酸序列。該序列是其中在SEQIDNO:59所顯示的人源化抗Campath抗體Campath-IH的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列的5'-末端側(cè)添加了限制性酶Notl識別序列、并在其3'-末端側(cè)添加了限制性酶Apal識別序列的核苷酸序列。此外，根據(jù)SEQIDNO:64所顯示的核苷酸序列，設(shè)計了SEQIDNO:65、66、67和68所顯示的核苷酸序列。這些序列是通過將SEQIDNO:64所顯示的核苷酸序列分成4個部分設(shè)計成的核苷酸序列，使得互相鄰接的序列具有大約20bp的重疊序列，并且有義鏈和反義鏈互相交錯。事實上，制備了SEQIDNO:65、66、67和68所顯示的核苷酸序列的每個合成的寡聚DNA(FASMAC制造)，并使用它們進行了PCR。制備PCR反應(yīng)溶液，使得分別位于兩端的兩種合成的寡聚DNA的終濃度為0.5pM，另外兩種位于它們內(nèi)部的合成的寡聚DNA的終濃度為0.1|iM，然后使用DNA熱循環(huán)儀GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(AppliedBiosystems制造)進行PCR，條件為94。C加熱4分鐘，然后進行25個循環(huán)的3步反應(yīng)94。C30秒，50°C30秒和68°C60秒。在PCR完成后，將反應(yīng)溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN制造)回收大約480bp的PCR產(chǎn)物。將這樣回收的PCR產(chǎn)物用限制性酶NotI(TakaraShuzo制造)和Apal(TakaraShuzo制造)消化，然后將反應(yīng)溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN制造)剪切和純化大約450bp的DNA片段。另一方面，用同樣的限制性酶處理實施例2條目2中制備的U33型抗CD20結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒，剪切并純化了大約13kbp的DNA片段。在混合這些純化的DNA片段之后，通過加入LigationHigh溶液(TOYOBO制造)進行連接反應(yīng)，用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-BLUEMRF'(Stratagene制造)。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體克隆制備了各質(zhì)粒DNA，并使用BigDyeTerminatorCycle測序試劑盒v3.1(AppliedBiosystems生產(chǎn))按照隨附的說明書進行反應(yīng)，然后使用同一公司的DNA測序儀ABIPRISM3700DNA分析儀，分析插入到每個質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列，以證實獲得了其中重鏈可變區(qū)被編碼人源化抗Campath抗體Campath-1H的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列所取代的1133型表達載體質(zhì)粒。接下來，設(shè)計了SEQIDNO:69所顯示的核苷酸序列。該序列是其中在SEQIDNO:61所顯示的人源化抗Campath抗體Campath-1H的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的5'-末端區(qū)添加了限制性酶EcoRI限制的識別序列、在其3'-末端區(qū)添加了限制性酶BsiWI所限制的識別序列的核苷酸序列。此外，根據(jù)SEQIDNO:69所顯示的核苷酸序列，設(shè)計了SEQIDNO:70、71、72和73所顯示的核苷酸序列。這些序列是通過將SEQIDNO:69所顯示的核苷酸序列分成4個部分而設(shè)計成的核苷酸序列，使得互相鄰接的序列具有大約20bp的重疊序列、并且有義鏈和反義鏈互相交錯。通過使用這些核苷酸序列所顯示的4種合成的寡聚DNA片段進行PCR，它們通過互相鄰接的序列的相互重疊序列相連接，擴增具有SEQIDNO:69所顯示的核苷酸序列的DNA片段。。事實上，制備了SEQIDNO:70、71、72和73所顯示的核苷酸序列的每個合成的寡聚DNA片段(FASMAC制造)，并使用它們進行了PCR。制備PCR反應(yīng)溶液，使得分別位于兩端的兩種合成的寡聚DNA的終濃度為0.5jliM，另外兩種位于它們內(nèi)部的合成的寡聚DNA的終濃度為0.1jiM，使用DNA熱循環(huán)儀GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(AppliedBiosystems制造)進行PCR，條件為94°C加熱4分鐘，然后進行25個循環(huán)的3步反應(yīng)94。C30秒，50°C30秒和68。C60秒。在PCR反應(yīng)完成后，將反應(yīng)溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN制造)回收大約420bp的PCR產(chǎn)物。將這樣回收的PCR產(chǎn)物用限制性酶EcoRI(TakaraShuzo制造)和BsiWI(TakaraShuzo制造)消化，然后將反應(yīng)溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN制造)剪切并純化大約400bp的DNA片段。另一方面，用同樣的限制性酶處理本條目中制備的、其中重鏈可變區(qū)被編碼人源化抗Campath抗體Campath-1H的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列所取代的1133型表達載體質(zhì)粒，剪切并純化了大約13kbp的DNA片段。在混合了這些純化的DNA片段之后，通過加入LigationHigh溶液(TOYOBO制造)進行連接反應(yīng)，用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-BLUEMRF(Stratagene制造)。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體克隆制備了各質(zhì)粒DNA，使用BigDyeTerminatorCycle測序試劑盒v3.1(AppliedBiosystems生產(chǎn))按照隨附的說明書進行反應(yīng)，然后使用同一公司的DNA測序儀ABIPRISM3700DNA分析儀，分析插入到每個質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列，以證實獲得了1133型抗Campath抗體的表達載體質(zhì)粒，pKTX93/CampathlH-l133。(2)構(gòu)建包含編碼人類IgG抗Campath抗體的核苷酸序列的表達載體通過下面描述的步驟(圖28)，構(gòu)建了包含特異性識別人類Campath抗原(CD52)的抗Campath人類IgGl抗體的核苷酸序列的表達載體，其中該抗體的重鏈恒定區(qū)是人類IgGl的氨基酸序列。將本條目中制備的1133型抗Campath抗體的表達載體質(zhì)粒pKTX93/CampathlH-1133用限制性酶EcoRI(TakaraShuzo制造)和Apal(TakaraShuzo制造)進行消化，然后將反應(yīng)溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN制造)剪切并純化大約3,300bp的被的DNA片段。另一方面，用同樣的限制性酶處理抗CD20人類IgGl嵌合抗體的表達載體質(zhì)粒pKANTEX2B8P，剪切并純化了大約10kbp的DNA片段。在混合了這些純化的DNA片段之后，通過加入LigationHigh溶液(TOYOBO制造)進行了連接反應(yīng)，用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-BLUEMRF'(Stratagene制造)。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體克隆制備了各質(zhì)粒DNA，并使用BigDyeTerminatorCycle測序試劑盒v3.1(AppliedBiosystems生產(chǎn))按照隨附的說明書進行反應(yīng)，然后使用同一公司的DNA測序儀ABIPRISM3700DNA分析儀，分析插入到每個質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列，以證實獲得了抗Campath人類IgGl抗體的表達載體質(zhì)粒pKTX93/CampathlH-IgGl。(3)構(gòu)建包含編碼1133型抗Campath抗體的核苷酸序列的表達載體通過下面描述的步驟(圖29),構(gòu)建了包含特異性識別人類Campath抗原(CD52)的人類1133型抗Campath抗體的核苷酸序列的表達載體，其中在該抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中，CHI和鉸鏈區(qū)是人類IgGl的氨基酸序列，CH2是人類IgG3的氨基酸序列，CH3是人類IgGl的氨基酸序列。將本條目中制備的1133型抗Campath抗體的表達載體質(zhì)粒pKTX93/CampathlH-1133用限制性酶EcoRI(TakaraShuzo制造)和Apal(TakaraShuzo制造)進行消化，然后將反應(yīng)溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN制造)剪切和純化大約3,300bp的DNA片段。另一方面，用同樣的限制性酶處理實施例3條目1中制備的1133型抗CD20抗體的表達載體質(zhì)粒pKTX93/1131，剪切并純化了大約10kbp的DNA片段。在混合了這些純化的DNA片段之后，通過加入LigationHigh溶液(TOYOBO制造)進行了連接反應(yīng)，用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-BLUEMRF(Stratagene制造)。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體克隆制備了各質(zhì)粒DNA，使用BigDyeTerminatorCycle測序試劑盒v3.1(AppliedBiosystems生產(chǎn))按照隨附的說明書進行反應(yīng)，然后使用同一公司的DNA測序儀ABIPRISM3700DNA分析儀，分析插入到每個質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列，以證實獲得了1133型抗Campat結(jié)構(gòu)域交換抗體的表達載體質(zhì)粒pKTX93/CampathlH-l131。2.在動物細胞中穩(wěn)定表達抗Campath人類IgGl抗體、1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體將在本實施例條目1中制備的抗Campath人類IgGl抗體、1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體的各表達載體，導(dǎo)入在實施例1條目3中描述的宿主細胞CHO/FUT8一，并且按照與實施例1條目3中相同的方法，制備了能夠穩(wěn)定生產(chǎn)抗Campath人類IgGl抗體、1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體或1131型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體的細胞。3.純化抗Campath人類IgGl抗體、1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體對在本實施例條目2中獲得的能夠表達抗Campath人類IgGl抗體、1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體或1131型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體的各轉(zhuǎn)化體，按照與實施例1條目5中相同的方法進行培養(yǎng)和純化。每個修飾抗體的對應(yīng)的表達載體、宿主細胞和純化的抗體的名稱顯示在表9中。表9_表達載體_宿主細胞純化的抗體(名稱)pKTX93/Campat固-IgGlMs705CampathlH-IgGlpKTX93/CampathlH-1133Ms705CampathlH-1133pKTX93/CampathlH-1131Ms7Q5CampathlH-11314.通過SDS-PAGE評價各種抗Campath抗體的純化程度為了評價在本實施例條目3中獲得的各種修飾抗體的純化樣品的純化程度，按照與實施例1條目6中相同的方法進行了SDS-PAGE，由此證實了在本實施例條目3中獲得的每種純化的修飾抗體中，包含了足夠比率的由相應(yīng)的H鏈和L鏈構(gòu)成的所需IgG分子。實施例10測量抗Campath人類IgGl抗體、1133型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體和1131型抗Campath結(jié)構(gòu)域交換抗體的CDC活性使用在實施例9條目3中獲得的各種抗Campath抗體CampathlH-IgGl、CampathlH-1133和Campath1H-1131的純化樣品，測量了它們對Campath抗原陽性的CLL細胞系MEC-l、MEC-2和EHEB的體外CDC活性。當(dāng)按照與實施例8中相同的方法進行測試時，對于所有的細胞系MEC-l、MEC-2和EHEB來說，CampathlH-1133和Campath1H-1131顯示出了比CampathlH-IgG更高的CDC活性。工業(yè)實用性本發(fā)明提供了比人類IgGl抗體和人類IgG3抗體具有更高的補體依賴性細胞毒活性的重組抗體組成物，其中包含人類IgGl抗體的Fc區(qū)中的CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被包含對應(yīng)于Kabat等的EU指數(shù)指明的人類IgG3抗體相同位置的氨基酸序列的多肽所取代；編碼包含在重組組成物中的抗體分子或抗體分子的重鏈恒定區(qū)的DNA;可以通過將DNA導(dǎo)入宿主細胞而獲得的轉(zhuǎn)化體；使用轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)重組抗體組成物的方法；以及包含重組抗體組成物作為活性成分的藥物。序列表中的自lSEQIDNO:l-SEGIDNO:2-SEQIDNO:4-SEQIDNO:5-SEQIDNO:6-l文本(freetext)人工序列的描述:人工序列的描述:人工序列的描述:人工序列的描述:人工序列的描述:合成的DNA合成的DNA合成的DNA合成的DNA合成的DNASEQIDNO:7-SEQIDNO:8-SEQIDNO:9-SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12SEQIDNO:13SEQIDNO:14SEQIDNO:15SEQIDNO:16SEQIDNO:l'7SEQIDNO:31SEQIDNO:32SEQIDNO:33SEQIDNO:34SEQIDNO:35SEQIDNO:36SEQIDNO:37SEQIDNO:38SEQIDNO:39SEQIDNO:40SEQIDNO:41SEQIDNO:42SEQIDNO:43SEQIDNO:44SEQIDNO:45SEQIDNO:46SEQIDNO:47SEQIDNO:48SEQIDNO:49人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的肽人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的肽人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的肽人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的肽人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的肽人工序列的描述合成的DNA人工序列的描述合成的DNA.人工序列的描述合成的DNA.人工序列的描述合成的肽.人工序列的描述合成的DNA.人工序列的描述合成的DNA.人工序列的描述合成的肽.人工序列的描述合成的肽-人工序列的描述合成的DNASEQIDNO50-人工序列的描述:合成的肽SEQIDNO51-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO52-人工序列的描述:合成的肽SEQIDNO53-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO54-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO55-人工序列的描述:合成的肽SEQIDNO56-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO57-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO58-人工序列的描述:合成的肽SEQIDNO59-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO60-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO61-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO62-人工序列的描述:合成的肽SEQIDNO63-人工序列的描述:合成的肽SEQIDNO64-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO65-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO66-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO67-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO68曙人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO69-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO70-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO71-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO.72-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO:73-人工序列的描述:合成的DNASEQIDNO:74-人工序列的描述:合成的肽SEQIDNO:75-人工序列的描述:合成的肽權(quán)利要求1.具有比人類IgG1抗體和人類IgG3抗體更高的補體依賴性細胞毒活性的重組抗體組成物，其中包含人類IgG1抗體的Fc區(qū)中CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被包含對應(yīng)于由Kabat等的EU指數(shù)(在后文中稱為EU指數(shù))所示的人類IgG3抗體的相同位置的氨基酸序列的多肽所替換。2.權(quán)利要求1的重組抗體組成物，進一步具有與蛋白A的結(jié)合活性，該結(jié)合活性基本上與人類IgGl抗體的結(jié)合活性相等。3.權(quán)利要求1的重組抗體組成物，其中要被替換的包含人類IgGl抗體的Fc區(qū)中的CH2結(jié)構(gòu)域的多肽是選自下列(1)到(10)的多肽(1)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到340位氨基酸序列的多肽；(2)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到356位氨基酸序列的多肽；(3)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到358位氨基酸序列的多肽；(4)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到384位氨基酸序列的多肽；(5)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到392位氨基酸序列的多肽；(6)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到397位氨基酸序列的多肽；(7)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到422位氨基酸序列的多肽；(8)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到434位和436到447位氨基酸序列的多肽；(9)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到435位氨基酸序列的多肽；以及(10)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到447位氨基酸序列的多肽。4.權(quán)利要求2的重組抗體組成物，其中要被替換的包含人類IgGl抗體的Fc區(qū)中CH2結(jié)構(gòu)域的多肽選自下列(1)到(8)的多肽(1)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到340位氨基酸序列的多肽；(2)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到356位氨基酸序列的多肽；(3)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到358位氨基酸序列的多肽；(4)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到384位氨基酸序列的多肽；(5)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到392位氨基酸序列的多肽；(6)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到397位氨基酸序列的多肽；(7)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到422位氨基酸序列的多肽；以及(8)包含EU指數(shù)所示的IgGl抗體的231到434位和436到447位的氨基酸序列的多肽。5.權(quán)利要求1到4任何一個的重組抗體組成物，包含在Fc區(qū)中具有復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子，其中在組成物所含的與Fc區(qū)結(jié)合的總的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中，巖藻糖沒有與糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的比率為20%以上。6.權(quán)利要求1到4任何一個的重組抗體組成物，包含在Fc區(qū)中具有復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子，其中與抗體的Fc區(qū)結(jié)合的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈?zhǔn)瞧渲械膸r藻糖沒有與糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈。7.DNA，編碼權(quán)利要求1到4任何一個所述的重組抗體組成物中包含的抗體分子。8.DNA，編碼權(quán)利要求1到4任何一個所述的重組抗體組成物中包含的抗體分子的重鏈恒定區(qū)。9.通過將權(quán)利要求8所述的DNA導(dǎo)入宿主細胞而獲得的轉(zhuǎn)化體。10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化體，其中宿主細胞是對凝集素具有抗性的細胞，所述凝集素識別在N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)。11.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化體，其中當(dāng)編碼抗體分子的基因?qū)胨拗骷毎袝r，宿主細胞能夠產(chǎn)生包含在Fc區(qū)中具有復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈的抗體分子的抗體組成物，其中在組成物所含的與Fc區(qū)域結(jié)合的總的復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中，巖藻糖沒有與糖鏈還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的比率為20%以上。12.權(quán)利要求ll的轉(zhuǎn)化體，其中沒有結(jié)合巖藻糖的糖鏈?zhǔn)窃趶?fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過oc-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈。13.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化體，其中宿主細胞是其中基因組被修飾的細胞，使得與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶、和/或與在復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾相關(guān)的酶的活性降低或缺失。14.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化體，其中宿主細胞是基因組上所有的等位基因被敲除的細胞，所述等位基因編碼與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶、和/或與在復(fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中1-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合的糖鏈的修飾相關(guān)的酶。15.權(quán)利要求13或14的轉(zhuǎn)化體，其中與細胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶是選自00-甘露糖4,6-脫水酶(01^0)和00-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶(Fx)的酶。16.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)化體，其中GDP-甘露糖4,6-脫水酶是由選自下列(a)和(b)的DNA編碼的蛋白(a)包含SEQIDNO:18所顯示的核苷酸序列的DNA;(b)在嚴(yán)緊條件下與由SEQIDNO:18所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白的DNA。17.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)化體，其中GDP-甘露糖4，6-脫水酶是選自下列(a)到(c)的蛋白(a)包含SEQIDNO:19所顯示的氨基酸序列的蛋白；(b)由在SEQIDNO:19所顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成、并具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白；(c)由與SEQIDNO:19所顯示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列組成、并具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白。18.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)化體，其中00-4-酮-6-脫氧-0-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶是由選自下列(a)和(b)的DNA編碼的蛋白(a)包含SEQIDNO:20所顯示的核苷酸序列的DNA;(b)在嚴(yán)緊條件下與由SEQIDNO:20所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA。19.權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)化體，其中00-4-酮-6-脫氧-0-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶是選自下列(a)到(c)的蛋白(a)包含SEQIDNO:21所顯示的氨基酸序列的蛋白；(b)由在SEQIDNO:21所顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成、并具有GDP-4-酮-6-脫氧-0-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白；(c)由與SEQIDNO:21所顯示的氨基酸序列具有80。/。以上同源性的氨基酸序列組成、并具有GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白。20.權(quán)利要求13或14的轉(zhuǎn)化體，其中與糖鏈修飾相關(guān)的酶是0^，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，所述糖鏈?zhǔn)窃趶?fù)合類型N-糖苷連接的糖鏈中l(wèi)-位巖藻糖通過a-鍵與還原末端的6-位N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合。21.權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)化體，其中的ocl,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由選自下列(a)到(d)的DNA編碼的蛋白(a)包含SEQIDNO:22所顯示的核苷酸序列的DNA;(b)包含SEQIDNO:23所顯示的核苷酸序列的DNA;(c)在嚴(yán)緊條件下與由SEQIDNO:22所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有cd,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA;(d)在嚴(yán)緊條件下與由SEQIDNO:23所顯示的核苷酸序列組成的DNA雜交、并且編碼具有ccl，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA。22.權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)化體，其中的ocl,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是選自下列(a)到(f)的蛋白(a)包含SEQIDNO:24所顯示的氨基酸序列的蛋白；(b)包含SEQIDNO:25所顯示的氨基酸序列的蛋白；(c)由在SEQIDNO:24所顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成、并具有cd,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(d)由在SEQIDNO:25所顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成、并具有al,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(e)由與SEQIDNO:24所顯示的氨基酸序列具有80。/。以上同源性的氨基酸序列組成、并具有al，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(f)由與SEQIDNO:25所顯示的氨基酸序列具有80。/。以上同源性的氨基酸序列組成、并具有al，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。23.權(quán)利要求9到22任何一個的轉(zhuǎn)化體，其中宿主細胞是選自下列(a)到(i)的細胞(a)來自中華倉鼠卵巢組織的CHO細胞；(b)大鼠骨髓瘤細胞系，YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;(c)小鼠骨髓瘤細胞系，NS0細胞；(d)小鼠骨髓瘤細胞系，SP2/0-Agl4細胞；(e)來自敘利亞倉鼠腎臟組織的BHK細胞；(f)產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞；(g)人類白血病細胞系，Namalwa細胞；(h)胚胎干細胞；(i)受精卵細胞。24.生產(chǎn)重組抗體組成物的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求9到23任何一個所述的轉(zhuǎn)化體，以在培養(yǎng)物中形成和積累抗體組成物；以及從培養(yǎng)物中回收和純化抗體組成物。25.包含權(quán)利要求1到6任何一個所述的重組抗體組成物作為活性成分的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及具有比人類IgG1抗體和人類IgG3抗體更高的補體依賴性細胞毒活性的重組抗體組成物，其中包含人類IgG1抗體的Fc區(qū)中CH2結(jié)構(gòu)域的多肽被包含對應(yīng)于Kabat等的EU指數(shù)指明的人類IgG3抗體相同位置的氨基酸序列的多肽所取代；編碼包含在重組抗體組成物中的抗體分子或抗體分子的重鏈恒定區(qū)的DNA；可以通過將重組載體導(dǎo)入宿主細胞而獲得的轉(zhuǎn)化體；使用轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)重組抗體組成物的方法；以及包含重組抗體組成物作為活性成分的藥物。文檔編號C12P21/08GK101287765SQ20068003323公開日2008年10月15日申請日期2006年7月21日優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日發(fā)明者丹羽倫平,夏目曉人,設(shè)樂研也申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社