專利名稱：：用于測(cè)量血漿和組織鞘磷脂和磷脂酰膽堿的酶促方法用于測(cè)量血漿和組織鞘磷脂和磷脂酖膽堿的膝冗方法
背景技術(shù)：
：除了膽固醇和甘油三酯之外，脂蛋白還包含磷脂，其中磷脂酰膽堿(PC)和鞘磷脂(SM)是兩種主要成分，前者占約70%的總磷脂，后者占約20%的總磷脂。在人病例對(duì)照研究中顯示出，血漿SM和SM/PC比率均是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。一段時(shí)間內(nèi)眾所周知的是，SM在人類和動(dòng)物模型的動(dòng)脈粥樣化中積累。由人動(dòng)脈粥樣硬化病灶提取的低密度脂蛋白(LDL)在SM中大大多于來(lái)自血漿的LDL。apoE基因敲除(apoEKO)小鼠中血漿SM水平高于野生型小鼠中血漿SM水平的4倍，這可以部分解釋為何這些動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化增加。來(lái)自高膽固醇血癥兔子的VLDL中的SM/PC比率要高5倍。近來(lái)，已經(jīng)證實(shí)，給apoE基因敲除小鼠施用多球殼菌素(myriocin)(一種SM合成抑制劑)可顯著地降低SM，增加PC，并且因此降低血漿中SM/PC比率，明顯減少動(dòng)脈粥樣硬化損傷面積。這些數(shù)據(jù)表明，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中，SM可能起到促進(jìn)作用，而PC則可能起到預(yù)防作用。對(duì)它們的測(cè)量可以提供對(duì)人類以及多種小鼠模型中動(dòng)脈粥樣化形成的新視點(diǎn)。盡管兩種磷脂的重要性都非常明顯，但是還沒有用于其測(cè)量的簡(jiǎn)單、快速、靈敏并且高通量的方法。傳統(tǒng)上，血漿SM和PC通過(guò)脂類提取、薄層層析和在分離的SM或PC點(diǎn)上測(cè)定磷酸鹽來(lái)測(cè)量。此方法耗時(shí)且不靈敏。由此，需要一種測(cè)量SM和PC的新方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于測(cè)量血漿和組織鞘磷脂和磷脂酰膽堿的方法，所述方法包括1)利用細(xì)菌鞘磷脂酶(SMase)催化鞘磷脂水解成磷酸膽堿和n-SL^鞘氨醇；2)利用堿性磷酸酶從步驟l)產(chǎn)生的磷B堿得到膽堿；3)通過(guò)添加^5^氧化酶產(chǎn)生過(guò)氧化氫；和4)添加過(guò)氧化氫并且利用DAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲IL^苯胺，鈉鹽)、4-Jl^安替比林和過(guò)氧化物酶，產(chǎn)生藍(lán)色至紫色染色，優(yōu)選最佳吸收為595nm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括l)利用細(xì)菌磷脂酶D催化磷脂酰膽堿水解成膽堿和磷脂酸；2)通過(guò)添加膽堿氧化酶產(chǎn)生過(guò)氧化氫；和3)添加過(guò)氧化氫并且利用DAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二曱氧基苯胺鈉鹽)、4-氨基安替比林和過(guò)氧化物酶，得到藍(lán)色至紫色染色，優(yōu)選最佳吸收為595nm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)結(jié)合上述兩種方法來(lái)同時(shí)測(cè)量磷脂酰膽堿和鞘磷脂。具體實(shí)施例方式傳統(tǒng)上，通過(guò)4個(gè)步驟測(cè)量SM和PC:1)脂類提??；2)薄層層析(TLC);3)從TLC板上相應(yīng)的點(diǎn)提取SM和PC，和4)在各個(gè)提取物中定量磷酸鹽。整個(gè)過(guò)程耗時(shí)且不靈敏。盡管存在測(cè)量包含膽堿的總磷脂(PC+SM)的簡(jiǎn)單方法(WakoPureChemical),卻沒有相應(yīng)的方法用于直接測(cè)量SM和PC。本發(fā)明涉及兩種快速、特異性和靈敏的用于血漿SM和PC測(cè)量的測(cè)試法。本發(fā)明涉及兩種快速、特異性和靈敏的用于鞘磷脂(SM)和磷脂酰膽堿(PC)的酶促測(cè)量法。(SM)和(PC)是血漿脂蛋白上的兩種主要磷脂。它們的濃度傳統(tǒng)上通過(guò)脂類提取、薄層層析和在分離的SM或PC點(diǎn)上測(cè)定磷酸鹽來(lái)測(cè)量。在本發(fā)明的方法中，將血漿與細(xì)菌鞘磷脂酶(用于SM測(cè)量)或細(xì)菌磷脂酶D(用于PC測(cè)量)、堿性磷酸酶、膽堿氧化酶、過(guò)氧化物酶、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二曱氧基苯胺和4-氨基安替比林一起培養(yǎng)，優(yōu)選約45分鐘。產(chǎn)生最佳吸收在595nm的藍(lán)色染色。PC水平不影響SM測(cè)量，或者SM水平不影響PC測(cè)量。SM測(cè)量的線性范圍為約0.5至約5jig,PC測(cè)量的線性范圍為約2.5至約20ng。測(cè)試法的批間變異系數(shù)對(duì)于SM為約1.7±0.05%，對(duì)于PC為約3.1±0.13%?？蓪⑦@兩種方法進(jìn)行^"正以適應(yīng)自動(dòng)化，并且可以適用于大規(guī)模、高通量的測(cè)試法。利用鞘磷脂酶和砩脂酶D使我們的測(cè)試法具有特異性。然而，并非所有的市售酶都可用。一些磷脂酶D可能被鞘磷脂酶活性污染，或者一些鞘磷脂酶可能被磷脂酶D活性污染。優(yōu)選將來(lái)自BIOMOLInternational的磷脂酶D用在本發(fā)明的方法或測(cè)試法中。術(shù)語(yǔ)"測(cè)試法"和"方法"在本文中具有相同的含義并且在本文中可互換使用。從Sigma-Aldrich可得到的鞘磷脂酶可以用在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選S-8889。所有從Sigma-Aldrich可得到的堿性磷酸酶、膽堿氧化酶和過(guò)氧化物酶可以用在本發(fā)明的所有方法中。在本發(fā)明方法的最后一步中，即將11202轉(zhuǎn)化成可讀化合物的步驟中，可以選擇某些試劑。例如，苯酚可以用來(lái)產(chǎn)生最佳吸收為505nm的紅色奎寧顏料，TOOS(3-(N-乙基-3-甲基苯胺)-2-羥基丙磺酸)可以用來(lái)產(chǎn)生最佳吸收為550nm的紫色顏料。然而，溶血血漿可以顯著影響兩種波長(zhǎng)下的吸收。利用DAOS可以有效地避免溶血的影響(圖4)。本文描述的用于血漿SM和PC測(cè)量的新方法是簡(jiǎn)單、快速、特異性的、靈敏并且可以高通量進(jìn)行。它們適合用于大規(guī)模臨床樣品測(cè)量或者藥物篩選，并且可以適合組織SM和PC測(cè)量。為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明，給出下面的實(shí)施例。材料和方法試劑鞘磷脂酶、堿性磷酸酶、膽堿氧化酶、過(guò)氧化物酶和4-氨基安替比林以及標(biāo)準(zhǔn)SM和標(biāo)準(zhǔn)PC購(gòu)自Sigma-Aldrich。磷脂酶D購(gòu)自BIOMOLInternational,DAOS(N-乙基-N-(2畫羥基-3-碌丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，鈉鹽)購(gòu)自DojindoMolecularTechnologies,Inc.。SM測(cè)量血漿SM水平的酶促測(cè)量有4步(圖1A):1)細(xì)菌鞘磷脂酶將SM水解成磷酸膽堿和n-?；拾贝?；2)利用堿性磷酸酶從磷酸膽堿得到膽堿；3)利用膽堿在通過(guò)膽堿氧化酶催化的反應(yīng)中產(chǎn)生過(guò)氧化氫；和4)將過(guò)氧化氫與DAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，鈉鹽)、4-氨基安替比林和作為催化劑的過(guò)氧化物酶一起使用，以產(chǎn)生最佳吸收為595nm的藍(lán)色至紫色染色。反應(yīng)緩沖液是pH8的含有5mg/dl氯化鈣的0.05MTris-HCl。50ml反應(yīng)緩沖液中的酶濃度如下鞘磷脂酶25U、堿性磷酸酶500U、膽堿氧化酶25U和過(guò)氧化物酶1000U。DAOS濃度為0.73mM,4-氨基安替比林濃度為0.73mM。向添加了酶的100fil反應(yīng)緩沖液中加入5jil血漿，在37°C培養(yǎng)45分鐘，在分光光度讀板儀上于595nm測(cè)量吸收。標(biāo)準(zhǔn)SM溶液(50mg/dl)制備將5mgSM溶解在10ml2%TritonX-100乙醇溶液中。PC測(cè)量血漿PC水平的酶促測(cè)量有3步(圖2B):1)細(xì)菌磷脂酶D(PC特異性，與SM不反應(yīng))將PC水解成膽堿和磷脂酸；2)利用膽堿在通過(guò)膽堿氧化酶催化的反應(yīng)中產(chǎn)生過(guò)氧化氫；和3)將過(guò)氧化氫與DAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺，鈉鹽)、4-氨基安替比林和作為催化劑的過(guò)氧化物酶一起使用，以得到最佳吸收為595nm的藍(lán)色至紫色染色。反應(yīng)緩沖液是pH7的含有5mg/dl氯化鉀的0.05MTris-HC1。50ml反應(yīng)緩沖液中的酶濃度如下罅脂酶D6000U(在測(cè)量時(shí)添加)、膽堿氧化酶25U、過(guò)氧化物酶1000U。DAOS濃度為0.73mM，4-氨基安替比林濃度為0.73mM。向添加了酶的100^1反應(yīng)緩沖液中加入5nl血漿，在37。C培養(yǎng)45分鐘，在595nm領(lǐng)'J量吸收。標(biāo)準(zhǔn)SM溶'液(100mg/dl)制備將10mgPC溶解在10ml2%TritonX-100乙醇溶液中。總磷脂測(cè)量通過(guò)酶方法(WakoPureChemical)測(cè)量血漿中包含膽堿的總磷脂(PC+SM)。結(jié)果利用新型4步或3步方法(圖1)進(jìn)行血漿SM或PC水平的酶促測(cè)量。如圖2所示，SM測(cè)量的線性范圍是0.5至5[ig，PC測(cè)量的線性范圍是2.5至20(圖2)。在不同量的混合血漿中測(cè)量SM和PC濃度，發(fā)現(xiàn)對(duì)于兩種測(cè)試法的線性范圍是2.5pl至10Ml(圖3)。由于除了第一步以外，兩種方法非常近似(圖1)，因此可能兩種測(cè)量法會(huì)互相干擾。為研究SM方法的特異性，使用標(biāo)準(zhǔn)PC作為底物，反之亦然，在兩種方法中不存在交叉測(cè)量(圖4A和4B)。在采血過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。由于血漿SM濃度明顯低于膽固醇和PC,溶血的血漿可能明顯千擾測(cè)試法的吸收讀數(shù)。為研究此效應(yīng)，采用IOjliI低、中和高溶血的血漿樣品，并且在37。C與不含鞘磷脂酶的SM測(cè)試溶液一起培養(yǎng)45分鐘，在595nm測(cè)量吸收。發(fā)現(xiàn)溶血不干擾SM測(cè)試法(圖5)。方法的再現(xiàn)性在一種樣品中測(cè)量SM和PC20次。SM測(cè)試法的測(cè)試間變異系數(shù)為1.7±0.05%，PC測(cè)試法的各測(cè)試間變異系數(shù)為3.1±0.13%。為了驗(yàn)證此新型SM和PC測(cè)試法，利用市售試劑盒(WakoPureChemical)測(cè)量小鼠血漿中包含膽堿的總磷脂(PC+SM)水平，并將這些結(jié)果與通過(guò)本發(fā)明的方法測(cè)量的通過(guò)添加SM和PC濃度而得到的結(jié)果進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)兩種方法非常相關(guān)(r=0.91，11=7)(圖6)。另外，小鼠血漿SM濃度為38±10mg/dl,PC濃度為150±21mg/dl，PC/SM比率為3.9(表1)。所有這些結(jié)果與通過(guò)傳統(tǒng)方法得到的結(jié)果是可比的(7)。表1.用于血漿SM和PC測(cè)量的新方法與測(cè)量包含膽堿的總磷脂(PC+SM)的市售試劑盒的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*通過(guò)新方法測(cè)量。**通過(guò)市售試劑盒(WakoPureChemical)測(cè)量。SM，鞘磷脂；PC，磷脂酰膽堿。值為平均值土SD，n=7。SM測(cè)量方法的修正為了提高SM測(cè)量方法的靈敏度并且避免溶血的影響，在反應(yīng)的最后步驟中用DAOS代替苯酚，在595mn具有最大吸收。這種改變不僅提高了方法的靈敏度(可以檢測(cè)到小于10mg/dl的SM)，而且避免了溶血的影響。用于SM和PC測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用標(biāo)準(zhǔn)SM的標(biāo)準(zhǔn)曲線(0.35至3.5pg)對(duì)于SM測(cè)量方法是線性的。釆用標(biāo)準(zhǔn)PC的標(biāo)準(zhǔn)曲線(6至24嗎)對(duì)于PC測(cè)量方法是線性的。測(cè)試法中血漿SM的線性范圍是10至120mg/dl。測(cè)試法中血漿PC的線性范圍是10至250mg/dl。方法的再現(xiàn)性利用新方法，對(duì)一個(gè)樣品測(cè)量SM和PC20次。SM測(cè)試法的各測(cè)試間變異系數(shù)為1.7±0.05%，PC測(cè)試法的各測(cè)試間變異系數(shù)為3.1±0.13%。圖1.SM和PC測(cè)量的方案。A.鞘磷脂酶催化SM水解成磷酸膽堿，堿性磷酸酶在第二步中催化，在該步驟中磷酸膽堿產(chǎn)生膽堿。下一個(gè)步驟是通過(guò)膽堿氧化酶催化的膽堿的氧化。此反應(yīng)產(chǎn)生2個(gè)過(guò)氧化氫。最后的步驟由過(guò)氧化物酶催化，產(chǎn)生可以測(cè)量的紫色至藍(lán)色染色。B.磷脂酶D催化PC水解成膽堿和磷脂酸。其余反應(yīng)與SM測(cè)量類似。圖2.SM和PC測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用鹽水將不同量的SM或PC標(biāo)準(zhǔn)溶液補(bǔ)充至20nl，與100pi反應(yīng)緩沖液在37°C培養(yǎng)45分鐘，在595nm測(cè)量吸收。A.SM的標(biāo)準(zhǔn)曲線。B.PC的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3.血漿SM和PC測(cè)量的線性范圍。使用混合的小鼠血漿。用鹽水將不同量的血漿補(bǔ)充至20pl，與100nl反應(yīng)緩沖液在37。C培養(yǎng)45分鐘，在595nm測(cè)量吸收。A.SM測(cè)量的血漿線性范圍.B.PC測(cè)量的血漿線性范圍。圖4.SM和PC測(cè)量的特異性。A.SM方法中使用不同的PC濃度。B.PC方法中使用不同的SM濃度。圖5.在595nm時(shí)溶血對(duì)OD讀數(shù)的影響。將10jil低、中和高溶血的血漿樣品與100[il不含鞘磷脂酶的SM測(cè)試溶液在37。C一起培養(yǎng)45分鐘，在595nm測(cè)量它們的吸收。BKG:背景；LOW:低溶血；MED:中度溶血；HIGH:高溶血。圖6.用于血漿SM和PC測(cè)量的新方法與測(cè)量包含膽喊的總磷脂的市售測(cè)試盒(Wako)的比較，r=0.91，n=17。權(quán)利要求1.用于測(cè)量血漿和組織鞘磷脂和磷脂酰膽堿的方法，所述方法包括1)利用細(xì)菌鞘磷脂酶催化鞘磷脂水解為磷酸膽堿和n-酰基鞘氨醇；2)利用堿性磷酸酶從步驟1)產(chǎn)生的磷酸膽堿生成膽堿；3)通過(guò)添加膽堿氧化酶生成過(guò)氧化氫；和4)添加過(guò)氧化氫并且利用DAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，鈉鹽)、4-氨基安替比林和過(guò)氧化物酶，產(chǎn)生藍(lán)色至紫色染色。2.用于測(cè)量血漿和組織鞘磷脂和磷脂酰膽堿的方法，所述方法包括1)利用細(xì)菌磷脂酶D催化磷脂酰膽堿水解成膽堿和磷脂酸；2)通過(guò)添加膽堿氧化酶生成過(guò)氧化氫；和3)添加過(guò)氧化氫并且利用DAOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，鈉鹽)、4-氨基安替比林和過(guò)氧化物酶，產(chǎn)生藍(lán)色至紫色染色。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括在步驟1中利用細(xì)菌磷脂酶D催化磷脂酰膽堿水解成膽堿和磷脂酸。全文摘要本發(fā)明涉及用于測(cè)量鞘磷脂和磷脂酰膽堿的方法，所述方法包括將鞘磷脂和磷脂酰膽堿與細(xì)菌鞘磷脂酶和細(xì)菌磷脂酶D、堿性磷酸酶、膽堿氧化酶、過(guò)氧化物酶、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺和4-氨基安替比林一起孵育，優(yōu)選約45分鐘。產(chǎn)生藍(lán)色染色。文檔編號(hào)C12Q1/28GK101356283SQ200680046632公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2006年12月13日優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日發(fā)明者江賢成,穆罕默德·禮薩·霍賈提申請(qǐng)人:紐約州立大學(xué)研究基金會(huì)