專利名稱：：Dha、epa或dha衍生的epa用于治療細(xì)胞氧化損傷相關(guān)疾病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種富含二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)或DHA衍生的EPA的酸用于制備一種藥物的用途，所述藥物用于治療與氧化損傷相關(guān)的病變。
背景技術(shù)：
：co-3脂肪酸是維持細(xì)胞功能完整性所必需的，并且通常是人類健康所必需的。二十二碳六烯酸(22:6n-3，DHA)——魚油和海藻中的一種重要的co-3組分一一主要存在于腦中，以及視網(wǎng)膜的光感受器和突觸中。富含DHA的飲食最初由肝臟代謝，然后經(jīng)由血液中脂蛋白進(jìn)行分布以滿足各個器官的需要。給予DHA會導(dǎo)致其在組織水平上的濃度增加，還會導(dǎo)致與其代謝相關(guān)的co-3二十碳五烯酸(EPA)濃度的增加，而給予EPA僅會在細(xì)胞水平上增加其自身濃度并降低DHA濃度。通常，將DHA摻入到細(xì)胞膜的磷脂中，這會影響細(xì)胞膜的組成和功能、影響活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生、影響膜脂質(zhì)的氧化、影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控、影響類花生酸的生物合成并且影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，DHA涉及與記憶相關(guān)的學(xué)習(xí)能力的發(fā)育、涉及膜的應(yīng)激功能、涉及感光細(xì)胞的生物發(fā)生并且涉及依賴于激酶蛋白(quinaseprotein)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。一種潛在飲食療法的基礎(chǔ)是^"正co-3脂肪酸的最適濃度以防止某種疾病的發(fā)生或發(fā)展，例如炎性疾病、腫瘤病變、心血管疾病、抑郁和神經(jīng)障礙。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，腦和視網(wǎng)膜都顯示出不同尋常的保留DHA的能力，甚至是在較長期食用缺乏co-3脂肪酸的飲食的情況下。幾項研究已經(jīng)描述了DHA對神經(jīng)元的保護(hù)作用，其中DHA以非常高的濃度存在。例如，DHA涉及保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免遭由細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的死亡。最近已經(jīng)證明了DHA(發(fā)現(xiàn)DHA在年長大鼠海馬內(nèi)含量會有所下降)能夠保護(hù)所述細(xì)胞的原代培養(yǎng)物抵御谷氨酸鹽產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。在視網(wǎng)膜的光感受器中，還已經(jīng)證明了DHA可調(diào)節(jié)Bel-2家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的水平。視網(wǎng)膜光感受器的外部區(qū)段含有視紫紅質(zhì)，并且具有比其他任何類型細(xì)胞都要高的DHA含量。DHA集中于光感受器節(jié)段外膜(segmentdisc'soutermembrane)的磷脂中。在降低最佳DHA濃度的情況下，觀察到了視網(wǎng)膜功能障礙。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)在DHA的吸收、貯留和轉(zhuǎn)運中起到了非常積極的作用。光感受器和RPE細(xì)胞中高含量的DHA主要以如下生理特性與膜中的結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)，其生理特性是有助于調(diào)節(jié)受體、離子通道、載體等，同時DHA似乎還可調(diào)節(jié)磷酯酰絲氨酸的濃度。目前尚不清楚這些作用完全是由DHA自身介導(dǎo)的還是由任何代謝衍生物介導(dǎo)的。已經(jīng)在視網(wǎng)膜中鑒別出了某些DHA衍生物。盡管涉及所述衍生物合成的酶還沒有被準(zhǔn)確鑒別出來，但是最近的一些研究結(jié)果表明A2磷脂酶(PLA2)和脂氧合酶(LOX)先后參與了所述合成過程。PLl將DHA從膜磷脂上釋放出來，LOX將DHA轉(zhuǎn)化成其代謝活性衍生物?；钚匝醮?ROS)是在行使正常細(xì)胞功能的過程中產(chǎn)生的。ROS包括超氧陰離子、過氧化氫和oxydril自由基。它們的高化學(xué)反應(yīng)性導(dǎo)致了蛋白、DM或脂質(zhì)的氧化。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氬酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)是主要的抗氧化物酶，這些酶可抵御由于ROS的存在所導(dǎo)致的分子和細(xì)胞損傷。氧化應(yīng)激激活了許多代謝通道；其中一些是細(xì)胞保護(hù)性的，而另一些會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。最近的研究表明ROS的產(chǎn)生與降解之間的不平衡在許多疾病的發(fā)病機(jī)制中是一個顯著的危險因素，這種不平衡在某些情況下與所述抗氧化系統(tǒng)衰退相關(guān)。DHA是ROS的靶標(biāo)，所述ROS會對光感受器細(xì)胞和RPE造成損傷。光誘發(fā)的視網(wǎng)膜變性會促進(jìn)光感受器中的DHA喪失。例如，當(dāng)RPE細(xì)胞損傷或死亡時，光感受器功能就會退化，因為RPE細(xì)胞是光感受器存活所必需的。因此，氧化應(yīng)激作用下的RPE細(xì)胞死亡會導(dǎo)致視力退化，特別是當(dāng)黃斑細(xì)胞受到影響時，因為黃斑細(xì)胞決定了視力敏度。許多視網(wǎng)膜變性(例如與年齡相關(guān)的黃斑變性和與眼底黃色斑點癥相關(guān)的黃斑變性)的病理生理學(xué)涉及會導(dǎo)致RPE細(xì)胞凋亡的氧化應(yīng)激。事實上，RPE細(xì)胞凋亡似乎是所觀察到的與年齡相關(guān)的黃斑變性的主要因素。這類研究表明所述細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展出了高度有效的抗氧化機(jī)制(利用高含量的DHA)以保護(hù)它們自己并且顯示出顯著的適應(yīng)能力。此外，自由基和衰老之間的關(guān)系已被十分普遍地接受了，所根據(jù)的證據(jù)是無氧呼吸過程中產(chǎn)生的自由基會導(dǎo)致氧化損傷，所述氧化損傷會積累并導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)機(jī)制的逐漸喪失、對基因表達(dá)模式的干擾以及細(xì)胞功能的喪失，導(dǎo)致衰老和死亡。氧化劑的產(chǎn)生、抗氧化劑的保護(hù)作用和對氧化損傷的修復(fù)之間存在相互聯(lián)系。已經(jīng)進(jìn)行了許多研究來確定抗氧化劑防護(hù)是否會隨年齡增長而下降。這些研究包括對其主要組分的分析S0D、CAT、GPx酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性或表達(dá)，以及具有抗氧化劑特性的低分子量化合物的濃度。例如，黑腹果蠅("ro^7j3力//3邁e/a"oga^er)體內(nèi)S0D和CAT的過表達(dá)會將預(yù)期壽命增加30%并且降低蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致的損傷。在上下文中，在體外和體內(nèi)將表皮組織暴露于UV線之下會產(chǎn)生自由基以及其他活性氧簇，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激，已經(jīng)證明這會明顯促進(jìn)衰老。使皮膚過多暴露于紫外線輻射之下會導(dǎo)致急性或慢性損傷。在急性情況下，會產(chǎn)生紅斑或燒傷，而慢性的過度暴露會增加患皮膚癌和衰老的風(fēng)險。此外，已知表皮細(xì)胞會通過增加各種蛋白的表達(dá)來對急性或慢性氧化應(yīng)激起反應(yīng)，所述蛋白例如維持細(xì)胞完整性和抵抗氧化損傷所涉及的酶。在本領(lǐng)域中，已經(jīng)公知端粒是位于真核染色體末端的非編碼的DNA區(qū)域。這些端粒由高度保守的DNA序列、重復(fù)的串聯(lián)(TTAGGh和相關(guān)蛋白構(gòu)成，并且具有一種特別結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)可妨礙與其他染色體末端的連接以防止端粒融合。這些端粒在保持染色體完整性、保護(hù)編碼DM免遭酶的作用及其降解、幫助保持染色體穩(wěn)定性方面起到必不可少的作用。與半保留復(fù)制的編碼序列相反，所述端粒在連續(xù)的細(xì)胞分裂過程中逐漸喪失了其重復(fù)序列。現(xiàn)今，認(rèn)為需要一個盡可能小的端粒長度來保持端粒功能，當(dāng)這些端粒達(dá)到臨界大小時，它們難以在有絲分裂過程中分裂，從而導(dǎo)致端粒聯(lián)合(TAS)和染色體的不穩(wěn)定性。所述染色體的不穩(wěn)定性將伴隨著產(chǎn)生誤差的概率的增加，所述誤差能夠?qū)е嘛@著的遺傳改變。由于具有多個雙鍵，所述co-3脂肪酸被認(rèn)為在氧化應(yīng)激過程中是自由基產(chǎn)生和傳播的分子靶標(biāo)，所述氧化應(yīng)激過程與脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生相關(guān)。然而，w-3脂肪酸飲食補(bǔ)充物在各種氧化應(yīng)激敏感性研究中卻獲得了矛盾的結(jié)果。在人體內(nèi)進(jìn)行的一些研究已經(jīng)證實對LDL的氧化作用增加，而另一些研究則未發(fā)現(xiàn)這類作用。在用動物進(jìn)4亍的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用co-3脂肪酸的處理會導(dǎo)致對LDL的氧化作用的敏感性增加或降低。另一方面，已經(jīng)在用富含魚油飲食喂養(yǎng)3個月的小鼠肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗氧化劑防御系統(tǒng)中所涉及基因的過表達(dá)。此外，用膠質(zhì)源性細(xì)胞系進(jìn)行的各種體外研究已經(jīng)證實富含co-3月旨肪酸的膜對氧化損傷更加敏感。給這些細(xì)胞長期補(bǔ)充高濃度DHA會導(dǎo)致培養(yǎng)基中脂質(zhì)過氧化物的水平升高以及細(xì)胞死亡的百分比增加，所迷細(xì)胞死亡是由于暴露于過氧化氫所誘導(dǎo)的凋亡導(dǎo)致的。然而，還已經(jīng)證實了羊膜內(nèi)給予二十二碳六烯酸乙酯可降低大鼠胎兒大腦中的脂質(zhì)過氧化作用。認(rèn)為這種反應(yīng)是由于通過活化抗氧化酶實現(xiàn)的自由基螯合作用所導(dǎo)致的。腦抗氧化能力的增加對于抗氧化應(yīng)激的主要內(nèi)源防御(primaryendogenousdefence)很重要，因為腦內(nèi)的多不飽和月旨肪酸含量相對較高而抗氧化酶含量相對較低。這些矛盾的結(jié)果表明基于脂肪酸的氧化作用會隨雙鍵數(shù)目而增加的前提的假說并不適用于體內(nèi)，因為其他可能的機(jī)制可能會降低氧化損傷，例如膜蛋白和膜脂質(zhì)中co-3脂肪酸的三維結(jié)構(gòu)使得雙鍵對ROS的攻擊較不敏感；對促氧化酶(例如PU2)的抑制或者對抗氧化酶的較高表達(dá)。另一方面，將體育鍛煉和自由基的產(chǎn)生聯(lián)系起來的想法起源于80年代早期，因為在對含氧量低的組織進(jìn)行的缺血-再灌注事件中觀察到了對膜脂質(zhì)的損傷(參見Lovlinetal.，萬w./.^;/.^ci/A戶Am'oA1987，56(3)313-6)。同時，在大鼠肌細(xì)胞內(nèi)(參見LewH.Etal.尸i^JZe",1985;185(2):262-6，SenCKetal.，/.^(^7.1994;77(5):2177-87)和人血液內(nèi)(參見MacPhailDbetal.,FreeRadicResCommun1993;18(3):177-81，GohilK.etal.J.Appl.Physiol.1988Jan;64(1):115-9)觀察到GSSH/GSH比例的增加。自由基還會影響到DNA，并且劇烈的體育鍛煉會增加對DNA的損傷，這可以由8-0xQdG的增加來證實。力竭性體育運動(跑馬拉松)會導(dǎo)致對DNA的損傷(這在試驗后一段時間內(nèi)很明顯)并且還會導(dǎo)致對免疫活性細(xì)胞的損傷(這可以與進(jìn)行這類試驗后的運動員體內(nèi)免疫力下降聯(lián)系起來)。然而，其他作者并沒有觀察到在持續(xù)游泳90分鐘、持續(xù)跑步60分鐘或通過劃船進(jìn)行力竭性運動之后的任何作用(除了極小的損傷之外)。同時，對受過訓(xùn)練的和未受過訓(xùn)練的運動者進(jìn)行的研究并沒有發(fā)現(xiàn)二者的8-0X0-dG尿分泌有任何差異，即使是在那些發(fā)現(xiàn)了這樣一種損傷的研究中也沒有發(fā)現(xiàn)差異，認(rèn)為這種損傷是所述運動的后續(xù)反應(yīng)所帶來的，而并不是因劇烈運動對DNA的作用產(chǎn)生的。劇烈體育鍛煉產(chǎn)生氧化應(yīng)激這一事件是本領(lǐng)域所公知的，但是其根源尚未得到完全確認(rèn)。使用n-3脂肪酸進(jìn)行的運動繢效相關(guān)的研究集中于抗炎性作用上，事實上，最初的測定試圖發(fā)現(xiàn)這些營養(yǎng)物可能通過減少劇烈體育鍛煉導(dǎo)致的支氣管收縮來改善肺泡-毛細(xì)血管吸收的作用。在這一點上，Mickleborough證明了在給予3.2gEPA和2.2gDHA的方案之后，它們通過減少優(yōu)秀運動員體內(nèi)的TNF-oc和IL-1P減少了促炎性細(xì)胞因子，同時支氣管收縮也減少。Walser將n-3脂肪酸的血管效應(yīng)與表明了對體育鍛煉不耐受的人體內(nèi)陽性作用聯(lián)系起來。另一方面，vanHouten等研究了n-3脂肪酸的高攝取與在患冠狀動脈綜合征后進(jìn)^f亍心臟康復(fù)治療的患者的良好恢復(fù)相關(guān)聯(lián)。在對運動績效進(jìn)行的分析研究中，缺少陽性結(jié)果的原因是僅對患者而非健康人群進(jìn)行了評估并且研究的是血管效應(yīng)和抗炎性作用。同時，基于下述理論構(gòu)想進(jìn)行了研究當(dāng)使血漿內(nèi)游離脂肪酸濃度高于lmmol/L(發(fā)生在糖原耗盡時)時，能夠進(jìn)行的色氨酸轉(zhuǎn)運可使其隨后續(xù)5-羥色胺(在長時間運動中的一種與所謂"中樞疲勞"有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì))的增加而增加。另一方面，已知n-3脂肪酸可能會通過上調(diào)脂肪酸氧化來減少血漿內(nèi)游離脂肪酸的量，所述脂肪酸氧化是通過激活轉(zhuǎn)錄核因子PPARa來實現(xiàn)的。然而，這些測定并不成功，因為Huffman(2004)通過使用4gn-3脂肪酸(500g含300mgEPA和200邁gDHA的膠嚢)的劑量方案對兩種性別跑步者進(jìn)行的研究并沒有發(fā)現(xiàn)游離TRP有任何減少也沒有發(fā)現(xiàn)運動知覺減少，也沒有發(fā)現(xiàn)在績效方面有任何統(tǒng)計學(xué)意義上的繢效增加，盡管在服用了n-3脂肪酸的受試者中存在改善績效的統(tǒng)計學(xué)趨勢，使得對于作者來說存在下述懸而未決的可能性即導(dǎo)致所述研究的統(tǒng)計檢定力降低的原因是所研究的受試者的數(shù)量較少(5名男性和5名女性)。另一項后續(xù)研究使用玉米油作為安慰劑，并且評估了n-3脂肪酸對績效的作用，該研究沒有發(fā)現(xiàn)任何顯著性差異。Raastad每天給予足球運動員1.6gEPA和1.04gDHA并持續(xù)數(shù)周，在他們體內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)任何的改善(參見Raastadetal.ScandJ.MedSciSports1997;7(1):25-31)。另一方面，已知游離脂肪酸會干擾肌肉對葡萄糖的利用，因為其在胞內(nèi)水平上的類似物乙酰輔酶A會在線粒體內(nèi)抑制丙酮酸脫氬酶(通過產(chǎn)物抑制)，還會刺激糖原分解和糖原生成作用，在空腹期間導(dǎo)致平穩(wěn)的高血糖，事實上，在空腹期間連續(xù)給予多不飽和脂肪酸有助于可能通過在肝臟水平激活葡萄糖-6-磷酸酶來維持血糖。還已知肌肉中一種脂肪酸組合物可以改變胰島素敏感性，表明質(zhì)膜中高含量的多不飽和脂肪酸可提高胰島素的敏感性而高含量的飽和脂肪酸會產(chǎn)生相反的效果。體育鍛煉會提高葡萄糖吸收、毛細(xì)血管灌流、糖原合成率和胰島素敏感性。在肌肉收縮過程中，溫度、胞內(nèi)pH、ATP/ADP比例、Ca—胞內(nèi)濃度以及其他代謝產(chǎn)物會發(fā)生變化，它們可作為鍛煉時的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的信使。在這一點上，Ca—會調(diào)節(jié)大量的胞內(nèi)蛋白，包括鈣調(diào)蛋白激酶、蛋白激酶C(PKC)和神經(jīng)鈣蛋白，所述胞內(nèi)蛋白是胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要介質(zhì)。在有氧鍛煉過程中，乙酰輔酶A羧化酶會被AMP激酶(AMPK)所失活，這會導(dǎo)致丙二酰輔酶A水平下降，從而去除了對肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的抑制，導(dǎo)致線粒體內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運的增加(因此促進(jìn)了脂肪酸氧化)。AMPK的激活作用可能包括刺激GLUT4和己糖激酶以及多種線粒體酶的表達(dá)。然而，令人吃驚的是，AMPK激活并不是鍛煉增加骨骼肌對葡萄糖應(yīng)答的唯一途徑(不依賴于胰島素)。參見MoraandPessin,J.Biol.Chem.2000;275(21):16323-16328，該文獻(xiàn)顯示在增加肌肉內(nèi)葡萄糖應(yīng)答的過程中，確實存在數(shù)種可激活GLUT4和那些可通過體育鍛煉來激活的因子的轉(zhuǎn)錄因子如MEF2A和MEF2D。肌內(nèi)脂質(zhì)的增加在肥胖狀態(tài)下和體育訓(xùn)練過程中較常見，但是結(jié)果是對于肥胖人群來說肌內(nèi)脂質(zhì)的增加與胰島素抵抗有關(guān)，而在運動員體內(nèi)高活性的肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶會使得脂肪酸經(jīng)歷p氧化。存在確鑿的證據(jù)證明富含n-3脂肪酸的飲食^~—甚至伴隨著糖血癥和血胰島素血癥(insulinaemia)(胰島素抵抗的信號)的增加——會在胰島素受體水平上起作用以維持GLUT-4蛋白的易位水平，這已經(jīng)特別地使用DHA證實過了(參見JaescchkeH.Proc.SocExpBiol.Med1995;209:104-11)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及出乎意料的發(fā)現(xiàn)給予的二十二碳六烯酸(本文中也稱為DHA)或二十碳五烯酸(EPA)或DHA衍生的EPA——無論是游離形式或是結(jié)合到甘油三酯中等等一一可作為細(xì)胞抗氧化劑。通過這種方式并且考慮到DHA和EPA之間的代謝關(guān)聯(lián)(DHA可逆轉(zhuǎn)為EPA),此前所觀察到并公開的關(guān)于給予DHA的所有作用一定適用于DHA/EPA的混合體系或者甚至適用于EPA的單組分體系，盡管EPA并沒有被特別指出。因此，本發(fā)明的一個目的是使用二十二碳六烯酸制備一種用于治療細(xì)胞氧化損傷的藥物組合物。本發(fā)明的另一個目的是使用位于甘油主鏈的一個特定位點上的二十二碳六烯酸(DHA)用于治療細(xì)胞氧化損傷，其中甘油酯的其余兩個位點在它們的組成上也是特定的。本發(fā)明的另一個目的是使用二十二碳六烯酸(DHA)制備一種用于在DNA水平治療細(xì)胞氧化損傷的組合物。具體而言，二十二碳六烯酸適用于在端?？s短的自然過程中作為保護(hù)劑以及在治療細(xì)胞氧化損傷的過程中作為過早性衰老的抑制劑。本發(fā)明的一個目的是使用二十二碳六烯酸制備一種用于治療細(xì)胞衰老和遺傳疾病的組合物以及一種用于治療唐氏綜合征的組合物，其中所述遺傳疾病與線粒體呼吸鏈障礙有關(guān)。本發(fā)明的另一個目的是使用二十二碳六烯酸(DHA)制備一種用于治療與體育鍛煉相關(guān)的細(xì)胞氧化損傷的組合物。具體而言，二十二碳六烯酸適用于作為運動績效增強(qiáng)劑以及在體育運動過程中作為血糖水平調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的另一個目的是使用二十二碳六烯酸制備一種用于增強(qiáng)運動繢效的組合物以及一種用于在體育鍛煉后維持血糖水平的組合物，所述維持主要是通過給予食品、乳制品或者利用人們進(jìn)行體育鍛煉時通常使用的任何合適的給予形式來實現(xiàn)。在本發(fā)明中，短語"細(xì)胞氧化損傷"是指任何涉及內(nèi)源或外源的細(xì)胞氧化劑種類的產(chǎn)生和降解之間失衡的過程。令人吃驚的是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)DHA能夠抑制活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生，不管是涉及過氧化物的依賴性誘導(dǎo)還是涉及超氧化物的依賴性誘導(dǎo)。更具體地說，DHA減少了超氧陰離子的產(chǎn)生以及在氧化級聯(lián)中產(chǎn)生的所有衍生種類，例如棒其明顯地減少了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。此外，發(fā)現(xiàn)抗氧化酶活性增加，這表明細(xì)胞通過誘導(dǎo)抗氧化劑(主要是酶)的表達(dá)以及通過抑制促氧化劑(例如A2磷脂酶)的表達(dá)來實現(xiàn)細(xì)胞適應(yīng)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述二十二碳六烯酸摻入甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂、乙酯或游離脂肪酸中。優(yōu)選地，所述二十二碳六烯酸形成甘油三酯的形式。在本發(fā)明中，"二十二碳六烯酸摻入甘油酯中"是指甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和磷脂的三個酯化位點中至少有一個被二十二碳六烯酸酯化，且任選地其余酯化位點中至少有一個還被一種選自下列的酸酯化短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸和磷酸。優(yōu)選地，所述甘油為甘油三酯。選擇甘油三酯作為DHA的化學(xué)構(gòu)造是根據(jù)從一項研究中獲得的數(shù)據(jù)，所述研究比較了四種分別為乙酯、磷脂、游離脂肪酸和甘油三酯形式的co-3脂肪酸在口服后的生物利用度，研究數(shù)據(jù)表明再酯化的甘油三酯的生物可用度高于其他制品。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，發(fā)現(xiàn)所述二十二碳六烯酸占總脂肪酸的重量百分?jǐn)?shù)為20-100%、優(yōu)選地占總脂肪酸的40-100%,并且更優(yōu)選地，所述二十二碳六烯酸占總脂肪酸的重量百分?jǐn)?shù)為66-100%。在另一個優(yōu)選地實施方案中，所述二十二碳六烯酸通過酯鍵結(jié)合到甘油的至少一個特定位點上(結(jié)構(gòu)化脂質(zhì))，以制備一種用于治療細(xì)胞氧化損傷的藥物組合物。這類甘油還可包括至少一種脂肪酸和/或一種磷酸以使得所述二十二碳六烯酸可以結(jié)合到選自sn-l、sn-2和sn-3的位點上；還可任選地包括至少一種選自短鏈和/或中鏈脂肪酸和磷酸的酸，并且當(dāng)結(jié)合到sn-2位上時，所述甘油還可任選地包括至少一種選自脂肪酸和磷酸的酸。在這一點上，當(dāng)任選地提及該術(shù)語時，應(yīng)該理解的是結(jié)合到選自sn-l、sn-2和sn-3的位點上的二十二碳六烯酸可能還包括或可能不包括至少一種選自短鏈和/或中鏈脂肪酸和磷酸的酸；或者另外應(yīng)該理解的是結(jié)合到sn-2位上的二十二碳六烯酸可能還包括或可能不包括至少一種選自長鏈脂肪酸和磚酸的酸。令人驚奇的是，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與使用二十二碳六烯酸制備一種用于治療細(xì)胞氧化損傷的藥物組合物的療效相比，使用結(jié)構(gòu)化甘油會使療效產(chǎn)生出乎意料的增加至少兩倍或者甚至三倍，所述結(jié)構(gòu)化甘油中已經(jīng)選定了二十二碳六烯酸的位置和結(jié)合到甘油上的其余化合物組成。所述一般性定義涉及含有位于甘油主鏈中特定位置上的脂肪酸的脂肪。與體內(nèi)脂肪酸生物分布相似，所述長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)優(yōu)選地位于甘油的sn-2位并且考慮到腸道吸收過程，利用脂肪酶將甘油三酯水解為游離脂肪酸、甘油二酯和甘油一酯，由此所述游離脂肪酸和sn-2甘油一酯可被腸道上皮細(xì)胞(稱為腸上皮細(xì)胞)直接吸收。使用經(jīng)由酯鍵結(jié)合到甘油主鏈特定位置上的二十二碳六烯酸可產(chǎn)生增加的生物活性；在占脂肪酸總量的摩爾百分?jǐn)?shù)相同的條件下可產(chǎn)生增加的抗氧化保護(hù)作用；以及對可使甘油酯內(nèi)二十二碳六烯酸產(chǎn)生抗氧化作用的給藥劑量的依賴性降低。有利的是，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用結(jié)合到甘油的選自sn-l、sn-2和sn-3的位點上的二十二碳六烯酸——所述甘油任選地還包括至少一種選自短鏈和/或中鏈脂肪酸和磷酸的酸一一可產(chǎn)生增加的生物活性；在占脂肪酸總量的摩爾百分?jǐn)?shù)相同的條件下可產(chǎn)生增加的抗氧化保護(hù)作用；以及對可使甘油內(nèi)二十二碳六烯酸產(chǎn)生抗氧化作用的給藥劑量的依賴性降低。還有利的是，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用結(jié)合到甘油的sn-2位上的二十二碳六烯酸一一所述甘油任選地還包括至少一種選自長鏈脂肪酸和磷酸的酸一一也可產(chǎn)生增加的生物活性；在占脂肪酸總量的摩爾百分?jǐn)?shù)相同的條件下可產(chǎn)生增加的抗氧化保護(hù)作用；以及對可使甘油酯內(nèi)二十二碳六烯酸產(chǎn)生抗氧化作用的給藥劑量的依賴性降^f氐。優(yōu)選地，與二十二碳六烯酸一起存在于甘油中的酸為短鏈脂肪酸(C1-C8)或中鏈脂肪酸(C9-C14)或磷酸，因為這些酸不具有功能活性而僅具有能量活性，因此這些酸不會與二十二碳六烯酸竟?fàn)?。因此，更?yōu)選地，本發(fā)明涉及使用結(jié)合到甘油中的二十二碳六烯酸，其中sn-l和sn-3位之一是游離的或者是被中鏈脂肪酸(C9-C14)或短鏈脂肪酸(C1-C8)或磷酸所占據(jù)，并且其中sn-2位被功能性DHA所占據(jù)。因此，可使DHA實現(xiàn)較高的增長，因為這樣的DHA可被腸道細(xì)胞更有效地吸收。因此，合成結(jié)構(gòu)化甘油酯可提高其抗氧化作用，其中當(dāng)二十二碳六烯酸未與其他脂肪酸竟?fàn)帟r它可以結(jié)合到甘油的任一位置上而當(dāng)DHA與至少一種脂肪酸竟?fàn)帟r它會結(jié)合到甘油酯的sn-2位上；因此合成結(jié)構(gòu)化甘油酯是制備一種用于治療氧化性細(xì)胞損傷的組合物的優(yōu)選方式。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可更好地制備富含本發(fā)明的含DHA的組合物的細(xì)胞以對抗新的氧化應(yīng)激形式，并且因此使由此產(chǎn)生的有害作用最小。即生物膜中存在的DHA會誘導(dǎo)對氧化應(yīng)激的細(xì)胞適應(yīng)性應(yīng)答。適應(yīng)性應(yīng)答為一種當(dāng)與有毒試劑(低于致死濃度)接觸時可引起細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞現(xiàn)象，所述細(xì)胞應(yīng)答隨后會保護(hù)所述細(xì)胞免遭處于致死濃度的相同有毒試劑的有害作用，或者換言之，適應(yīng)性應(yīng)答是一種通過與低濃度的試劑接觸而產(chǎn)生有益效應(yīng)，所述試劑在高濃度時是有害的。給予DHA具有下列實質(zhì)性優(yōu)點a)增加細(xì)胞抗氧化活性；b)所給予的劑量不具有細(xì)胞毒性；c)所給予的劑量不會對細(xì)胞抗氧化狀態(tài)造成明顯改變；d)適應(yīng)性細(xì)胞抗氧化活性。由于上述全部原因，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案涉及^f吏用二十二碳六烯酸制備一種用于治療與細(xì)胞氧化性損傷相關(guān)的疾病的藥物組合物，所述疾病為神經(jīng)變性疾病，優(yōu)選地選自下列疾病多發(fā)性硬_化、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化和肌肉萎縮癥等等。在本發(fā)明的另一個實施方案中，與氧化損傷相關(guān)的疾病為眼部疾病，優(yōu)選地為一種選自色素性視網(wǎng)膜變性(pigmentaryretinosis)、黃斑變性和白內(nèi)障等等的疾病。在另一個實施方案中，與氧化損傷相關(guān)的疾病為缺血性疾病，特別是心肌梗塞、腦梗塞等。在本發(fā)明的另一個實施方案中，與氧化損傷相關(guān)的疾病為炎性病變，優(yōu)選地選自關(guān)節(jié)炎、血管炎、腎小球腎炎和紅斑狼瘡等等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，與氧化損傷相關(guān)的疾病為動脈粥樣硬化。本發(fā)明的另一方面為使用DHA作為在端?？s短的自然過程中的保護(hù)劑并且使用DHA作為過早性衰老的抑制劑。產(chǎn)生端粒聯(lián)合(TAS)的機(jī)制仍舊是未知的，但是本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為端粒聯(lián)合與端粒酶的酶活性不足有關(guān)，所述端粒酶合成端粒特有的DNA重復(fù)序列，從而穩(wěn)定端粒長度。端粒酶在胎兒細(xì)胞中非常活躍，但是在成人組織細(xì)胞中沒有過多的活性。TAS很少存在于正常細(xì)胞中，但是在病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)觀察到了TAS。已經(jīng)觀察到體外端粒重復(fù)的數(shù)目以及體內(nèi)細(xì)胞衰老的功能逐漸下降，這與衰老過程中端粒酶活性的抑制有關(guān)。類似地，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)研究了來自于一直健康的人的成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的端粒長度，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在所述成纖維細(xì)胞的體外增殖過程中存在端?？s短且端粒長度與供體年齡之間存在負(fù)相關(guān)性。盡管隨著細(xì)胞復(fù)制自然會發(fā)生端粒縮短，但是當(dāng)在DM中誘導(dǎo)氧化損傷時觀察到了過早性衰老和端粒破損。端粒對氧化損傷更加敏感并且與基因組的其它部分相比對端粒破損的修復(fù)效率較低。這會積累端粒損傷，所述損傷會在DNA復(fù)制過程中使端?？s短更快，降低了細(xì)胞復(fù)制的預(yù)期壽命?；钚匝醮?R0S)——特別是超氧陰離子、過氧化氫和oxidril自由基一一在某些細(xì)胞類型的復(fù)制過程中會加速端粒的缺失，盡管他們不論是否使端?？s減，都會誘導(dǎo)過早性衰老。令人驚奇的是，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用二十二碳六烯酸在DNA水平上治療細(xì)胞氧化損傷可減緩端粒的縮減速率并且因此會抑制細(xì)胞衰老。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)在超過20種人類成纖維細(xì)胞林中發(fā)現(xiàn)了端?？s減速率和細(xì)胞抗氧化能力之間存在負(fù)相關(guān)性。這些過早衰老的成纖維細(xì)胞的大多數(shù)細(xì)胞參數(shù)與正常衰老的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞參數(shù)相同(形態(tài)學(xué)、脂褐素的積累和基因表達(dá)的變化)。具有較低抗氧化防護(hù)的成纖維細(xì)胞縮減其端粒的速率更快，反之亦然。在具有較低抗氧化防護(hù)的細(xì)胞中端?？s減速率更快。此外，自由基清除劑會減緩端粒的縮減速率。這些數(shù)據(jù)與人成纖維細(xì)胞中端?？s減速率數(shù)據(jù)一致，所述數(shù)據(jù)證實了抗氧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的重要作用。這些數(shù)據(jù)證實端粒長度主要由氧化應(yīng)激和細(xì)胞抗氧化防護(hù)能力之間的關(guān)系決定。因此，與年齡相關(guān)的端粒長度是細(xì)胞整個生命周期所經(jīng)歷的氧化損傷歷史的累積量度。對于線粒體呼吸鏈障礙相關(guān)的遺傳疾病和唐氏綜合征，已經(jīng)證實了氧化應(yīng)激與端?？s減速率之間的關(guān)系。因此，DNA中的氧化細(xì)胞損傷與端?？s減之間的現(xiàn)有關(guān)系以及其在細(xì)胞衰老中的作用使得可以使用二十二碳六烯酸作為在端?？s短的自然過程中的強(qiáng)保護(hù)劑并且使用二十二碳六烯酸作為過早性衰老的抑制劑。另一方面，與基于化學(xué)合成和其后的純化過程(色諉分離、分子蒸餾等)的其他方法相比，使用酶來生產(chǎn)富含w-3脂肪酸的油具有多種優(yōu)勢。前者需要極端的pH和高溫條件，所述條件可以通過氧化作用、順反異構(gòu)化或雙鍵遷移來部分地破壞所有順式co-3PUFA的全部雙鍵。酶法合成所用的溫和條件(溫度低于50°C、pH6-8且較少的化學(xué)試劑)提供了一種合成選擇，保留了co-3PUFA的原始結(jié)構(gòu)同時增加了?；视王サ慕Y(jié)構(gòu)選擇性，從營養(yǎng)學(xué)的觀點來看所述結(jié)構(gòu)是最有利的化學(xué)結(jié)構(gòu)。含有DHA的藥物組合物可以以油或乳劑的形式存在，所迷組合物可通過口服、舌下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、局部、皮下或直腸途徑來給藥，或者道入口的嗅覺器官相接觸來給藥。因此，、可通過微i劑的-噴::噴霧k霧化或者通過吸入來進(jìn)行給藥。任選地，所述藥物組合物還包括另一種活性成分。類似地，所述含有DHA的藥物組合物可#_用在食品工業(yè)中以使食品(例如乳制品，如酸乳酪、乳等)中富含天然抗氧化劑例如DHA。因此，在本發(fā)明的另一個實施方案中，將所述藥物組合物給予已經(jīng)接受了對抗與氧化損傷相關(guān)疾病療法的患者。本發(fā)明的另一個目的是使用DHA作為運動績效增強(qiáng)劑以及在體育運動過程中作為血糖水平調(diào)節(jié)劑。通過這種方式，本發(fā)明的發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)在體育鍛煉過程中使用所述二十二碳六烯酸會使運動績效增加，同時在進(jìn)行這類體育鍛煉之后(未給予碳水化合物)維持血糖水平(糖血)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"業(yè)余運動員"或"非竟賽運動員，，是指任何以零散方式和非專業(yè)方式進(jìn)行體育鍛煉的人。且短語"竟賽運動員"或"受過訓(xùn)練的運動員"是指任何以正規(guī)方式和/或?qū)I(yè)水平進(jìn)行體育鍛煉的人。類似地，術(shù)語"體育鍛煉"和"體育運動"可等價的互換使用，術(shù)語"運動員"用于指男性和女性。運動績效為了評價運動績效，存在幾種可驗證這類運動績效提高的參數(shù)。在進(jìn)行有氧運動的運動員體內(nèi)，當(dāng)在UV2(無氧閾)時的最大氧耗百分?jǐn)?shù)。/。V0^增加時認(rèn)為績效增加，因為在賽季期間受過良好訓(xùn)練的運動員體內(nèi)的V02max很難增加。在該閾值時的V02,百分?jǐn)?shù)的細(xì)微變化是直接與績效增加相關(guān)的數(shù)據(jù)。發(fā)明人已經(jīng)證實當(dāng)將基礎(chǔ)的三角運動試驗(triangularefforttrial)與用DHA處理4個月后進(jìn)行的試驗比較時，通氣閾值2時的氧耗量(V02)的增加的絕對值(p<0.019)和相對于體重的相對值(p<0.036)均具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。竟賽自行車運動員(p〈0.047)和非竟賽自行車運動員中均顯示出該參數(shù)的增加，后者的該參數(shù)的差異不具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(圖24)。另一個與運動績效增加有關(guān)的參數(shù)是心搏頻率的增加，其中設(shè)定了運動試驗的UV2;因為如果在該無氧閾時心搏頻率增加，則認(rèn)為該運動員能夠略增加以較高強(qiáng)度保持有氧代謝的能力。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)觀察到，當(dāng)將在基礎(chǔ)試驗中得到的心搏頻率與在服用DHA4個月后的三角試驗中得到的心搏頻率進(jìn)行比較時在UV2時的心搏頻率有所增加(p-0.082)。在具有高竟賽水平的自行車運動員小組中顯著地證明了這些數(shù)據(jù)(p〈0.017)(圖25)。在這一點上，達(dá)到在統(tǒng)計學(xué)上顯著的UV2所需的時間增加(圖26)。最終，如果運動員經(jīng)受過有氧訓(xùn)練則達(dá)到相同運動水平時的心搏頻率較低。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)在運動員消耗2000ml02/分鐘時將兩個試驗在該點的上述數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時，被給予DHA的自行車運動員的心搏頻率以統(tǒng)計學(xué)顯著性(p<0.043)方式下降(圖27)。由這些研究可以總結(jié)出在持續(xù)服用DHA4個月的運動員體內(nèi)已經(jīng)觀察到在UV2時絕對和相對氧耗量均增加(分別為p<0.008和p<0.015)、對應(yīng)于UV2的負(fù)荷增加(p〈0.063)并且當(dāng)運動員的氧耗量為2000ml/分鐘時心搏頻率下降(p〈0.062)。所有這些參數(shù)都表明在以2.1gDHA/24小時(6粒藥物含量為70重量％的500mg膠嚢)的劑量(分為每日3次)服用4個月后，運動績效增加。示出的所述量為本發(fā)明的示例性且非限制性的量。在運動試驗之后，還分析了幾項與氧化損傷相關(guān)的生物化學(xué)變量。1.血漿總抗氧化能力(PTAC)。當(dāng)進(jìn)行矩形運動時，PTAA的增加是全面的且具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(p〈0.05)。當(dāng)考慮全部自行車運動員或僅考慮竟賽自行車運動員時，在給予DHA3周后的運動員體內(nèi)上述增加較高，而對于業(yè)余運動員，基礎(chǔ)試驗與服用DHA3周后進(jìn)行的試驗之間沒有任何差異(圖28)。2.丙二酰二醛(MDA)MDA是將脂質(zhì)過氧化物與硫代巴比土酸反應(yīng)后獲得的主要產(chǎn)物，所述脂質(zhì)過氧化物是通過氧化應(yīng)激產(chǎn)生的。結(jié)果表明當(dāng)進(jìn)行所有運動試驗時對血漿脂質(zhì)的氧化損傷都有顯著增加(p<0.035)。在攝取DHA3周后，進(jìn)行運動試驗時對脂質(zhì)的氧化損傷比開始時低(p〈0.05)。受過訓(xùn)練的運動員體內(nèi)的這種差異比業(yè)余運動員體內(nèi)的差異大得多(圖29)。3.8-氧-7，8-二氫-2，-脫氧鳥普(8-oxodG)。8-oxodG是一種氧化應(yīng)激生物標(biāo)記。當(dāng)進(jìn)行矩形運動試驗時對DNA的氧化損傷增加(p<0.011)。這種氧化損傷在給予DHA3周后會下降(p〈0.035)。非竟賽自行車運動員內(nèi)的氧化應(yīng)激下降比竟賽自行車運動員體內(nèi)的氧化應(yīng)激下降更明顯，但是這種差異不具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(圖30)。血糖研究為研究血糖水平，用自行車矩形運動試驗，維持最大負(fù)荷等于75%V02max所對應(yīng)的速率并且維持斜率常數(shù)為2%，所述V02max是按照進(jìn)行最大矩形運動試驗計算的。試驗時間為90分鐘且試驗過程中耗水量無限制。由于未攝取含糖類飲料，所以預(yù)計會出現(xiàn)低血糖。與預(yù)期的一樣，在第一次運動試驗中第二次取樣的樣品(試驗結(jié)束20分鐘后的樣本與試驗開始前2Q分鐘的起始樣本比較)中出現(xiàn)低血糖。然而，DHA給藥4個月后獲得的數(shù)據(jù)表明血糖的維持量具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，這在先前并未被觀察到過并且這代表了本研究中一項驚人的發(fā)現(xiàn)。通常，在矩形運動試驗過程中可觀察到血糖水平呈統(tǒng)計學(xué)顯著性下降(p〈0.0009)。然而，該行為會隨著所要分析的運動員類型不同而不同(p<0.003):對于通常的竟賽自行車運動員來說，試驗過程中血糖的下.降沒有顯著變化，但是對于業(yè)余自行車運動員來說，基礎(chǔ)試驗過程中血糖的下降比通常的竟賽自行車運動員體內(nèi)血糖的下降要高；并且服用DHA3周或4個月后，所述下降基本消失(圖.31、32和33)。在以75%V02max進(jìn)行90分鐘且不飲用含糖類飲料的運動試驗中，正常血糖量的存在代表了這樣一項發(fā)現(xiàn)，所述發(fā)現(xiàn)將體育運動過程中的DHA行為與所觀察到的和上文提到的涉及增加胰島素敏感性的行為聯(lián)系在一起。在這一點上，繼1997年的關(guān)于AMPK(AMP激活的蛋白激酶)的出版物(Winder和Hardie)之后,Goodyear和Kahn(1998)推斷胰島素或者鍛煉所導(dǎo)致的骨骼肌內(nèi)葡萄糖應(yīng)答的分子機(jī)制是不同的，所述1997年的出版物公開了下述事實在鍛煉過程中IIa型纖維中AMPK含量較高，認(rèn)為AMPK具有抑制乙酰輔酶A羧化酶和促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運等功能的多效作用。這可能解釋了下述發(fā)現(xiàn)，即運動員體內(nèi)的升糖反應(yīng)(glycemicresponse)與根據(jù)對靜態(tài)人群進(jìn)行的研究所預(yù)計的升糖反應(yīng)不同。根據(jù)上述關(guān)于DHA對運動績效和血糖的作用的研究，可以推斷出下述結(jié)論1)已經(jīng)證明持續(xù)攝取DHA超過3周可使竟賽自行車運動員和業(yè)余自行車運動員二者體內(nèi)的血漿總抗氧化能力(PTAC)以全面且具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(p〈0.05)的方式增加。對脂質(zhì)的氧化損傷也較低(p〈0.05)(受過訓(xùn)練的運動員體內(nèi)的差異比業(yè)余自行車運動員體內(nèi)的差異要大)。最終，已經(jīng)證明了在攝取DHA3周后對DNA的損傷下降(p〈0.035),所述損傷是利用尿標(biāo)記物(8-oxodG)測得的。2)已經(jīng)證明持續(xù)攝取DHA4個月后，運動績效更高(在UV2時的負(fù)荷、心搏頻率以及V02max的百分?jǐn)?shù)均增加)。在攝取DHA4個月后以75%V02max進(jìn)行90分鐘運動試驗中還觀察到具有統(tǒng)計學(xué)顯箸性的正常血糖這兩種效應(yīng)(運動績效的增強(qiáng)和長期鍛煉期間血糖量正常)之間的關(guān)聯(lián)既非預(yù)期的也非本領(lǐng)域中已知的。此外，應(yīng)該可以推斷出這種效應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)是所需要的并且是目前尚未發(fā)現(xiàn)的增進(jìn)機(jī)能的輔助手段。本發(fā)明的另一個目的是使用二十二碳六烯酸制備一種通過任何合適給藥方法用于增強(qiáng)運動績效并且在體育鍛煉之后維持正常血糖水平的組合物。應(yīng)該考慮歐盟食品科學(xué)委員會推薦的下述用于在體育鍛煉過程中飲用的飲料組合物的組分(參見http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out64_en.pdf)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在這一點上，含有糖類的目的在于維持血糖量以避免快速消耗肌糖原和肝糖原。應(yīng)該考慮到是糖類濃度產(chǎn)生的滲透壓的增加會導(dǎo)致胃排空減少的缺陷，同時會伴有許多運動員不希望有的胃滿的感覺。因此，通過加入DHA來制備具有較低濃度糖類的飲料在增強(qiáng)運動績效方面具有不容置疑的強(qiáng)大優(yōu)勢。因此，本發(fā)明的另一方面涉及一種含有DHA的藥物組合物，所述組合物可被用在食品工業(yè)中以使食品(例如乳制品，如酸乳酪、乳等)中富含天然抗氧劑如DHA;或者所述組合物可被制成合適的給藥方式，選自用在體育鍛煉之前、期間和之后的任何特征的飲料；補(bǔ)充能量的棒；增進(jìn)機(jī)能的棒；用作食物的固體和制品；飲食補(bǔ)充物和多維生素制品(例如，膠嚢、片劑、丸劑、凍干形式，或者任何合適的給藥形式)；增進(jìn)機(jī)能的輔助手段；帶有用于皮膚吸收的納米微嚢劑的紡織品，以及其他任何合適的給藥方法。圖1.包皮細(xì)胞(foreskincell)培養(yǎng)基中DHA濃度對R0S的胞內(nèi)產(chǎn)生過程的影響。實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70%)的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。(A)使用DHR123對細(xì)胞進(jìn)行R0S檢測，所述細(xì)胞用40或60mMAAPH處理過180分鐘。所述數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均值。(B)使用CDCFDA對細(xì)胞進(jìn)行ROS檢測，所述細(xì)胞用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系處理過180分鐘。為進(jìn)行比較，加入用100iiM維生素E(對照)獲得的數(shù)據(jù)。所述數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均值。圖2.包皮細(xì)胞培養(yǎng)基中DHA占甘油三酯的比例對ROS的胞內(nèi)產(chǎn)生過程的相應(yīng)影響。(A)實驗前，在存在每種甘油三酯的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。X軸上的濃度為可使用DHA含量為70重量％的甘油三酯獲得的濃度的等效值。使用DHR123對細(xì)胞進(jìn)行ROS檢測，所述細(xì)胞用40mMAAPH處理過180分鐘。所述數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均值。(B)油中DHA濃度分別為20°/。、50/和70%時抗氧化保護(hù)作用的圖示。圖3.DHA濃度對包皮細(xì)胞中TBARS的產(chǎn)生的影響。以所示濃度進(jìn)行實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70%)的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。使用40mMAAPH誘導(dǎo)氧化應(yīng)激6小時并且等待24小時。所述數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均值。圖4.包皮細(xì)胞培養(yǎng)基中DHA濃度對超氧陰離子的產(chǎn)生的影響。實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70%)的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。在用40mMAAPH進(jìn)行細(xì)胞氧化誘導(dǎo)后立即利用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行超氧陰離子檢測，并且在一些實驗中還存在10mMTyron或0.1875UA/jLi1的外源SOD。所述數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗。圖5A.包皮細(xì)胞培養(yǎng)基中DHA濃度對SOD活性的影響。以0.5nM(A)、5jiM(B)和50uM(C)的DHA濃度進(jìn)行實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70%)的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。通過分析魯米諾所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光的降低來間接分析S0D活性，魯米諾所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光的降低是內(nèi)源S0D活性所導(dǎo)致的。使用可立即生成超氧陰離子的0.1mM黃噤呤/0.05U/邁l黃噪呤氧化酶體系進(jìn)行氧化誘導(dǎo)。所述數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗。圖5B.包皮細(xì)胞培養(yǎng)基中DHA濃度對SOD活性的影響。實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70%)的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。評估未誘導(dǎo)細(xì)胞系統(tǒng)或用4QmMAAPH誘導(dǎo)的細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)的SOD活性。所述數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗。圖6.包皮細(xì)胞培養(yǎng)基中DHA濃度對GPx活性的影響。實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70%)的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。評估未誘導(dǎo)細(xì)胞系統(tǒng)或用40mMAAPH誘導(dǎo)的細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)的GPx活性。所述數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗。圖7.ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)基中DHA濃度對ROS的胞內(nèi)產(chǎn)生的影響。實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70W的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。使用DHR123(A)或CDCFDA(B)對細(xì)胞進(jìn)行ROS檢測，所述細(xì)胞用40或60mMAAPH處理過180分鐘。所述數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均值。圖8.ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)基中甘油三酯中DHA濃度對ROS的胞內(nèi)產(chǎn)生的相應(yīng)影響。實驗前，在存在每種甘油三酯的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。X軸上的濃度為可使用DHA含量為70重量％的甘油三酯獲得的濃度的等效值。使用DHR123對細(xì)胞進(jìn)行ROS檢測，所述細(xì)胞用40mMAAPH處理過180分鐘。所述數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均值。(B)油中DHA濃度分別為20%、50%和70%時抗氧化保護(hù)作用的圖示。圖9.DHA濃度對ARPE-19細(xì)胞中TBARS的產(chǎn)生的影響。以所示濃度進(jìn)行實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70%)的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。使用40mMAAPH誘導(dǎo)氧化應(yīng)激6小時并且等待24小時。所述數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均值。圖10.ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)基中DHA濃度對超氧陰離子的產(chǎn)生的影響。實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70%)的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。在用40mMAAPH進(jìn)行細(xì)胞氧化誘導(dǎo)后立即利用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行超氧陰離子檢測。所迷數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗。圖11.ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)基中DHA濃度對GPx活性的影響。實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70%)的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。評估未誘導(dǎo)細(xì)胞系統(tǒng)或用40mMAAPH誘導(dǎo)的細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)的GPx活性。所述數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗。圖12.ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)基中DHA濃度對SOD活性的影響。實驗前，在存在甘油三酯(其中DHA占總脂肪酸重量的70W的條件下將所述細(xì)胞培養(yǎng)3天。評估未誘導(dǎo)細(xì)胞系統(tǒng)或用40mMAAPH誘導(dǎo)的細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)的S0D活性。所述數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗。圖13.通過化學(xué)合成(A和C)或酶法合成(B和D)獲得的DHA濃度對ARPE-19細(xì)胞(A和B)或包皮細(xì)胞(C和D)內(nèi)抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)的影響。圖14.通過化學(xué)合成獲得的油的純化程度對ARPE-19細(xì)胞內(nèi)由DHA誘導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)的影響。圖15.化學(xué)結(jié)構(gòu)對ARPE-19細(xì)胞內(nèi)由DHA誘導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)的影響。圖16.DHA濃度對ARPE-19細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽胞內(nèi)濃度的影響。存在BS0的影響。圖17.重新合成的谷胱甘肽對ARPE-19細(xì)胞內(nèi)由DHA誘導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)的影響。圖18.DHA濃度對包皮細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽胞內(nèi)濃度的影響。存在BSO的影響。圖19.通過化學(xué)合成獲得的油的純化程度對ARPE-19細(xì)胞內(nèi)由EPA誘導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)的影響。DHA的比較研究。圖20.EPA濃度對包皮細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)的影響。DHA的比較研究。圖21.EPA濃度對包皮細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽胞內(nèi)濃度的影響。存在BSO的影響。圖22為比較柱狀圖，示出了不同劑量的結(jié)構(gòu)化甘油三酯和非結(jié)構(gòu)化甘油三酯中DHA百分比對細(xì)胞保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)的影響。當(dāng)將非結(jié)構(gòu)化的甘油三酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)(甘油三酯)與其中sn-1和sn-3位已經(jīng)被正辛酸(結(jié)構(gòu)化的)所置換的相同結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較時(二者均通過酶學(xué)方法實現(xiàn)且DHA含量的起始水平為20%和70%)，所述圖22示出了上述添加物所實現(xiàn)的驚人效果。從圖中可以看出，濃度相同時，結(jié)合到甘油酯(結(jié)構(gòu)化的)——特別是甘油三酯一一sn-2位上的二十二碳六烯酸的保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)比含非結(jié)構(gòu)DHA的甘油酯的保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)高3倍。在圖22中，保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)說明了對照細(xì)胞與相對于對照細(xì)胞用DHA處理過的細(xì)胞的活性氧簇的胞內(nèi)濃度差異間的關(guān)系，兩種細(xì)胞均經(jīng)受了以百分?jǐn)?shù)形式表示的相同的氧化應(yīng)激。換言之，保護(hù)作用百分?jǐn)?shù)的存在說明與對照細(xì)胞相比，在處理過的細(xì)胞內(nèi)活性氧簇胞內(nèi)生成的降>[氐程度具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。圖23為比較圖，示出了在加入或未加入DHA的氧化應(yīng)激條件下培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞內(nèi)的端粒平均長度與細(xì)胞群的傳代數(shù)間的關(guān)系。所述圖23示出了在存在DHA的氧化應(yīng)激條件下進(jìn)行觀察時，上述添加物所實現(xiàn)的驚人效果，與對照或無DHA的情況相比存在DHA時端?？s短指數(shù)較低。圖24為示出了在基礎(chǔ)水平和服用DHA4個月后，竟賽、非竟賽和全體自行車運動員在"通氣閾值2"(UV2)時的絕對氧耗量的圖。圖25為示出了在基礎(chǔ)水平和服用DHA4個月后，竟賽、非竟賽和全體自行車運動員在UV2時的心搏頻率的圖。圖26為示出了在基礎(chǔ)水平和服用DHA4個月后，竟賽、非竟賽和全體自行車運動員達(dá)到UV2所需時間的圖。圖27為示出了在基礎(chǔ)水平和服用DHA4個月后，竟賽、非竟賽和全體自行車運動員的通氣閾值時的氧耗量為2000ml/min時心搏頻率的圖。圖28為示出了在基礎(chǔ)水平和服用DHA3周后，竟賽、非竟賽和全體運動員的血漿總抗氧化能力的圖。在每種情況下，均示出了進(jìn)行運動試驗之前的抗氧化能力(左柱)和之后的抗氧化能力(右柱)。圖29為示出了在基礎(chǔ)水平和服用DHA3周后，根據(jù)MDA濃度測得的對竟賽、非竟賽和全體運動員血漿脂質(zhì)的氧化損傷的圖。在每種情況下，均示出了進(jìn)行運動試驗之前的氧化損傷(左柱)和之后的氧化損傷(右柱)。圖30為示出了在基礎(chǔ)水平和服用DHA3周后，使用氧化應(yīng)激標(biāo)記物8-oxodG測得的對竟賽、非竟賽和全體運動員DNA的氧化損害的圖。在每種情況下，均示出了進(jìn)行運動試驗之前的氧化損傷(左柱)和之后的氧化損傷(右柱)。圖31為示出了體育鍛煉過程中未服用DHA或者服用了DHA3周或4個月的竟賽運動員體內(nèi)的血糖的圖。圖32為示出了體育鍛煉過程中未服用DHA或者服用了DHA3周或4個月的非竟賽運動員體內(nèi)的血糖的圖。圖33為示出了體育鍛煉過程中未服用DHA或者服用了DHA3周或4個月的竟賽和非竟賽運動員體內(nèi)的血糖的圖。具體實施例方式下列實施例為本發(fā)明的說明性且非限制性實施例。實施例用于評估抗氧化活性的材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)物所用細(xì)胞模型為獲取自美國典型微生物菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的包皮細(xì)胞(未分化的表皮成纖維細(xì)胞，CRL-2076)和ARPE-19細(xì)胞(視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，CRL-2302)。使細(xì)胞培養(yǎng)物置于特別設(shè)計用于這一目的的具有合適生長條件的培養(yǎng)箱中，所述生長條件為溫度37°C、0)2濃度5%和濕度95°/。。將ARPE-19細(xì)胞在裝有鹿EM-F12培養(yǎng)基(BiologicalIndustries)的培養(yǎng)瓶中生長至0.3xl(^細(xì)胞/cm'的匯合度，所述DMEM-F12培養(yǎng)基補(bǔ)加了10°/。胎牛血清、青霉素抗生素(100U/mL)、鏈霉素(100pg/mL)和谷氨酰胺(BiologicalIndustries)。使CRL-2076成纖維細(xì)胞在裝有伊思考夫改良杜爾貝可培養(yǎng)基(Iscove，sModifiedDulbecco，sMedium,IMDM)(BiologicalIndustrie)的培養(yǎng)瓶中維持生長，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)加了10%胎牛血清、青霉素抗生素(100U/mL)、鏈霉素(100pg/mL)和谷氨酰胺(BiologicalIndustries)。將所述細(xì)胞由75ml培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至6、12或96孔板中，使其在37C下貼附于底物24小時以便進(jìn)行實驗(l()6個細(xì)胞/mL)。將DHA整合到所述細(xì)胞中加入不同濃度的DHA-TG(O.5-50jiM),以含20、50和70%DHA的DHA-TG(油密度0.92g/mL)為原料，通過將油溶于乙醇中制備儲液(1:100)并且使用用血清制備的培養(yǎng)基制備工作溶液。在37。C下，將細(xì)胞用補(bǔ)加了DHA-TG的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。誘導(dǎo)氧化應(yīng)激使用不同的誘導(dǎo)劑氧化性地刺激細(xì)胞a)黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系(0.8mM/10—2U/mL)，催化將次黃噤呤和黃噤呤氧化為尿酸的氧化反應(yīng)，同時將02還原為0_2和H202。b)2，2，-偶氮二-(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)(1-100mM);故廣泛用作自由基的親水引發(fā)劑，誘導(dǎo)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過氧化反應(yīng)。AAPH會通過已形成的過氧自由基的作用來氧化DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。AAPH還會作用于內(nèi)源防護(hù)系統(tǒng)，因為它會使關(guān)鍵性的酶S0D失活，從而失去CAT和GPx的保護(hù)能力。產(chǎn)生活性氧簇(R0S)使用二氬羅丹明123(DHR123,MolecularProbes)和2，7-二氯熒光素二乙酸鹽(HJ)CFDA，MolecularProbes)作為熒光探針通過熒光技術(shù)通過一個連續(xù)系統(tǒng)中測量人皮膚CRL-2076成纖維細(xì)胞和ARPE-19視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中的R0S水平，每30分鐘測量一次直至180分鐘。對于這兩種情況，這是一種非特異性測量ROS產(chǎn)生的方法。將熒光探針加入到細(xì)胞(lxl(^個細(xì)胞/mL)中至終濃度為10pM。使用激發(fā)波長為488nm且發(fā)射波長為525nm的Mithras熒光讀數(shù)器測量氧化探針(2，7-二氯熒光素和羅丹明123)的熒光，記錄為時間的函數(shù)。使用通過下文概述的MTT分光光度技術(shù)確定的細(xì)胞存活率來調(diào)制所獲得的熒光。細(xì)胞存活率進(jìn)行細(xì)胞存活率研究以評估各種樣本的細(xì)胞毒性作用。該方法包括將可溶于水性介質(zhì)的MTT試劑(3-(4，5-二曱基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴，Sigma)加入孵育培養(yǎng)基中。成活的細(xì)胞可代謝這種化合物并將其轉(zhuǎn)化為甲臜鹽。該鹽為一種不溶于水性介質(zhì)、可溶于畫S0并且可用于測量細(xì)胞存活率的顯色化合物。所述方法包括每孔加入20^17.5血g/ml(過量)的MTT溶液。使其在37'C下孵育1小時以使得所述成活細(xì)胞可代謝該化合物并產(chǎn)生甲臜鹽，而非成活細(xì)胞則不能。在孵育l小時后，沉淀細(xì)胞，并加入100jla1畫S0，使曱臜鹽溶解。最后用酶標(biāo)儀讀取550nm處的吸光度。將存活率結(jié)果表示為相對于對照的光密度百分?jǐn)?shù)，將對照記為具有100。/。的存活率。利用96孔板繪制細(xì)胞存活率曲線，其中每孔接種約20，OOO個細(xì)胞(在根據(jù)細(xì)胞生長率函數(shù)分析適合的細(xì)胞數(shù)目后接種)且每孔的培養(yǎng)基體積約為200jil。在使細(xì)胞與濃度范圍足夠?qū)挼母鞣N濃度產(chǎn)物接觸72小時后，研究所述產(chǎn)物的效率以找出IC5。值。利用SigmaPlot8.O修正實驗結(jié)果使其適用于Hill方程以確定IC50,IC5。定義為將培養(yǎng)物存活率降為對照的50%時所需的DHA濃度。測定蛋白質(zhì)所述測定基于比色檢測和利用了優(yōu)化的2，2，-聯(lián)會啉-4，4，-二甲酸(dizinconinicacid)制劑的總蛋白質(zhì)定量，所述二奮啉曱酸組分使得可以測量稀釋樣本中濃度范圍為0.5-20jag/ml的蛋白。該方法使用Cu+1檢測劑，所迷檢測劑在堿性介質(zhì)中可被蛋白質(zhì)還原為Cu"。兩個BCA分子與所述亞銅離子螯合可形成紫色反應(yīng)產(chǎn)物。所述水溶性復(fù)合物在562nm處有吸收。利用校準(zhǔn)曲線可獲得一個方程，結(jié)果以!Lig/mL的蛋白表示。所用的商業(yè)4匕試劑盒為Pierce的MicroBCA(No.23235)。直接分析產(chǎn)生的R0S測量產(chǎn)生的脂質(zhì)氫過氧化物利用紫外可見分光光度法測得的細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的丙二酰二醛(MDA)可用作脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的標(biāo)記物。MDA和4-鞋基烯烴(hydroxya1kena1,HAE)是多不飽和脂肪酸及相關(guān)酯的過氧化反應(yīng)產(chǎn)物。對這些醛的直接測量給出了一種簡便的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)指數(shù)。通過CalMochem的商業(yè)化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)試劑盒(No.437634),使用了在45'C下可與MDA反應(yīng)的顯色劑(溶于乙腈的N-甲基-2-苯基-吲哚)。一個MDA分子與兩個發(fā)色劑分子縮合可產(chǎn)生一個在586rmi處有最大吸收的穩(wěn)定發(fā)色團(tuán)，檢測極限為0.1pM。使用40niMAAPH誘導(dǎo)6小時并且等待24小時。通過在液氮中循環(huán)凍融來裂解細(xì)胞(107細(xì)胞/mL)。對樣本分級分離以測量MDA和蛋白質(zhì)。結(jié)果表示為jiMMDA/邁g蛋白。測量產(chǎn)生的超氧陰離子使用魯米諾(CalMochem，No.574590)利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)在微量板上直接測量超氧陰離子。使用化學(xué)發(fā)光法檢測超氧陰離子的原因在于魯米諾可能接近所有產(chǎn)生超氧化物的胞內(nèi)位點、在于魯米諾反應(yīng)的高特異性、極小的胞內(nèi)毒性以及與其他化學(xué)技術(shù)有較高的靈敏性。化學(xué)發(fā)光法是根據(jù)超氧陰離子氧化魯米諾的反應(yīng)可產(chǎn)生光子，所述光子可使用標(biāo)準(zhǔn)照度計來迅速地測量。在我們的測試中，我們對ELISA的微量板使用MITHRAS化學(xué)發(fā)光讀數(shù)器并且給出了自由基的短半衰期，使用增強(qiáng)劑來增加測試的靈敏度并且放大應(yīng)答。該試劑可被用于活細(xì)胞，因為所述試劑無毒且不會使亞細(xì)胞系統(tǒng)組分變性。還可使用特異性超氧陰離子螯合劑一~"Tyron(4，5-二羥基-l，3-苯二磺酸，Sigma)來研究抑制超氧陰離子生成的能力，所述Tyron常常被用于在體外對ROS的生成進(jìn)行阻斷測試，它可透過細(xì)胞膜；且超氧化物歧化酶(SOD,Sigma)可用作酶阻斷劑，成為內(nèi)源抗氧化防護(hù)體系中首要的酶。每60秒分析一次細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光測量值，持續(xù)分4斤4100秒，頻率為120秒/循環(huán)，所述細(xì)胞經(jīng)過了AAPH氧化應(yīng)激誘導(dǎo)處理。結(jié)果表示為UA化學(xué)發(fā)光/mg蛋白。測定抗氧化酶活性測量谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性GPx催化氫過氧化物的還原反應(yīng)成為還原態(tài)谷胱甘肽，該過程具有保護(hù)細(xì)胞免遭氧化損傷的功能。GPx使用谷胱甘肽作為最終的電子供體以再生還原態(tài)的硒代半胱氨酸。通過與谷胱甘肽還原酶相偶聯(lián)的反應(yīng)來間接測量GPx。利用谷胱甘肽還原酶并使用MDPH作為輔酶將由反應(yīng)產(chǎn)生的氧化態(tài)谷胱甘肽(GSSG)回收再循環(huán)為還原態(tài)谷胱甘肽，所述反應(yīng)通過使GPx作用于氫過氧化物來實現(xiàn)。隨著MDPH被氧化為MDP+，其在340nm處的吸光度會降低。340nm處吸光度的降低速度與樣本的GPx活性成正比。使用Cayman的ELISA微量板分光光度試劑盒(No.703102)來檢測原代培養(yǎng)物的細(xì)胞裂解物中的GPx。在37匸下使細(xì)胞貼附于底物上培養(yǎng)24小時。通過在50mMTris(pH7.5)、5mMEDTA和1mMDTT中超聲來獲得細(xì)胞裂解物。通過測定A34。nm/min(AAm)的變化來獲得GPx的活性，表示為納摩爾NADPH/min/mg樣本蛋白。測量超氧化物歧化酶活性(SOD)該化學(xué)發(fā)光法基于與SOD(CalbiochemNo.574590)陽性對照相比的細(xì)胞上清液中的S0D活性分析。黃噤呤氧化酶-黃噤呤-魯米諾系統(tǒng)中存在SOD會導(dǎo)致所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光降低，對超氧陰離子歧化作用的下降與SOD活性成比例。用MITHRAS照度計進(jìn)行分析，時間間隔為50ms直至終反應(yīng)時間為520s。還通過使用四唑鹽檢測超氧化物自由基的反應(yīng)測定細(xì)胞裂解物中超氧化物歧化酶活性(SOD)，所述自由基由黃噤呤氧化酶/次黃噤呤體系生成。在孩i:量板上使用分光光度法測量3種類型的S0D(Cu-Zn-S0D、Mn-S0D和Fe-SOD)，所述SOD為胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的S0D。定義1單位SOD為歧化50。/。的生成的超氧陰離子時所需的酶量。按照生產(chǎn)商所優(yōu)化的方案使用Cayman試劑盒(N.706002)檢測原代培養(yǎng)物的細(xì)胞裂解物內(nèi)的S0D。該測定法的動力學(xué)范圍為0.025-0.25S0D單位/ml。測定胞內(nèi)內(nèi)源抗氧化劑濃度測量還原態(tài)谷胱甘肽的胞內(nèi)濃度(GSH)使用直接的動力學(xué)測定法測量細(xì)胞裂解物內(nèi)的還原態(tài)谷胱甘肽(GSH)。細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽可主要以還原態(tài)形式(總谷胱甘肽的90-95%)存在，成為組織內(nèi)的主要抗氧化劑。其作用是去除外源物的毒性并移除氬過氧化物以保持細(xì)胞的氧化還原態(tài)。利用所述技術(shù)測量生物樣本(細(xì)胞裂解物)中的總谷胱甘肽(GSSG+GSH)，所述生物樣本已經(jīng)用磺基水楊酸進(jìn)行過去蛋白處理(Sigma-AldrichCS0260試劑盒)。GSH導(dǎo)致5，5，-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)被連續(xù)地還原為5-硫代(2-硝基苯曱酸)(TNB),并且利用谷胱甘肽還原酶和MDPH回收再利用所形成的GSSG。利用分光光度法在412訓(xùn)處測量TNB。特異性抑制Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的丁硫氨酸亞砜胺(BSO)可用作合成抑制劑。評估人皮膚模型中DHA的抗氧化活性在此體外測定中，使用包皮細(xì)胞(未分化的表皮成纖維細(xì)胞，ATCCCRL-2076)作為細(xì)胞模型用于測定DHA的潛在美容用途，由于包皮細(xì)胞在體外可對各種氧化誘導(dǎo)劑可作出很好的應(yīng)答所以它們是一種合適的細(xì)胞類型，此外包皮細(xì)胞還是一種僅需要常規(guī)營養(yǎng)和培養(yǎng)條件的原代培養(yǎng)物，因此成為一種可外推至體內(nèi)應(yīng)答的良好體外模型。結(jié)果設(shè)定起始條件以在所有研究條件下獲得活性細(xì)胞模型。這是指結(jié)果是利用代謝活性細(xì)胞獲得的。在先的研究已經(jīng)證實在包皮細(xì)胞中濃度低于1000jliM的DHA不會影響研究(為期3天)中的細(xì)胞存活率。也不會影響使用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系或AAPH的氧化應(yīng)激研究中的細(xì)胞存活率。還已經(jīng)證實連續(xù)3天向包皮細(xì)胞培養(yǎng)物加入濃度最高達(dá)50nM的DHA不會明顯增加細(xì)胞氧化水平，所述氧化水平是使用兩種探針即二氫羅丹明(DHR123)和2，7-二氯熒光素Oy)CFM)并根據(jù)細(xì)胞焚光測得的，所述探針分別對超氧陰離子和氫過氧化物檢測具有較高特異性。一旦確立了這些條件，即可評估摻入到包皮細(xì)胞膜中的DHA抗氧化應(yīng)激的總抗氧化能力，所述氧化應(yīng)激是由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系或AAPH誘導(dǎo)產(chǎn)生的。當(dāng)使用40mMAAPH誘導(dǎo)適度的氧化應(yīng)激并且使用DHR123作為ROS檢測劑時，濃度為0.5jiM(59%的保護(hù)作用)和5(33%的保護(hù)作用)的DHA均對活性氧簇生成顯示出抑制作用，濃度為10nM(26%的保護(hù)作用)的DHA作用較弱而濃度為50jiM的DHA沒有作用(圖1A)。當(dāng)使用60mMAAPH對細(xì)胞進(jìn)行劇烈誘導(dǎo)時，濃度為0.5pM(40%的保護(hù)作用)和5jiM(29%的保護(hù)作用)的DHA均顯示出抗ROS生成的保護(hù)作用，而較高濃度的DHA則失去這種保護(hù)作用(圖1A)。我們還注意到0.5yM的DHA可抵御黃噪呤/黃噤呤氧化酶體系誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激(圖1B)，這表明DHA對活性氧簇一一氧化過程中產(chǎn)生的超氧陰離子和氫過氧化物一一具有螯合作用。比較DHA與親脂抗氧化劑如維生素E的抗氧化能力(圖1B)，我們發(fā)現(xiàn)它們具有類似的保護(hù)作用動力學(xué)(DHA將細(xì)胞氧化抑制了33.46W而維生素E抑制了30%)。DHA保護(hù)作用動力學(xué)應(yīng)答表明DHA總是在誘導(dǎo)后的60-120分鐘期間產(chǎn)生最大的抗氧化作用，因此說明DHA的氫過氧化物和超氧陰離子螯合能力達(dá)到飽和?？寡趸饔没旧鲜莿┝恳蕾囆缘模驗樵黾覦HA濃度會導(dǎo)致ROS螯合能力下降，濃度為0.5jiM時具有最有效的抗氧化能力。在這一點上，另一個用于使系統(tǒng)效率最優(yōu)化的重要參數(shù)是DHA占總脂肪酸的比例。如圖2所示，在甘油三酯濃度相同時，DHA比例下降至50。/0或20%會明顯降低細(xì)胞的抗氧化能力，并且在低濃度或中濃度時DHA會恢復(fù)為促氧化劑。這些結(jié)果似乎說明DHA的細(xì)胞抗氧化作用并不僅取決于其濃度，其分子定位(即DHA在甘油三酯結(jié)構(gòu)中的分布)也是決定性因素。在特異性抑制ROS生成方面，我們分析了脂質(zhì)過氧化物(TBARS)和超氧陰離子的生成。所獲得結(jié)果表明與未誘導(dǎo)的細(xì)胞相比，用AAPH處理過的細(xì)胞會產(chǎn)生較高濃度的可與硫代巴比土酸反應(yīng)的物質(zhì)(TBARS),表示為jiMMDA/mg蛋白(圖3)。與預(yù)計的一樣，將DHA摻入到包皮細(xì)胞的膜中會以劑量依賴性方式(O.5、5和50pM)使基礎(chǔ)的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)略有增加(圖3)。在用40mMAAPH進(jìn)行了氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)，DHA具有保護(hù)所述成纖維細(xì)胞避免產(chǎn)生膜脂質(zhì)氫過氧化物的抗氧化能力，其作用是反濃度依賴性的。0.5uMDHA的保護(hù)作用為87%、5jiMDHA的保護(hù)作用為85%且50jiMDHA-TG的保護(hù)作用為48%(圖3)。然后分析了超氧陰離子的生成。用40函AAPH進(jìn)行氧化應(yīng)激處理過的包皮細(xì)胞會產(chǎn)生超氧陰離子，其生成量是未誘導(dǎo)細(xì)胞的2.5倍，生成的超氧陰離子維持在恒定水平(圖4)。與對照相比，含有DHA且未經(jīng)氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)不具有更高水平的胞內(nèi)超氧陰離子(圖4)。在氧化應(yīng)激條件下(圖4)，濃度為0.5jiM的DHA會抑制超氧陰離子的生成達(dá)16.5%、濃度為5yM的DHA會抑制超氧陰離子的生成達(dá)10%且濃度為50jaM的DHA會抑制超氧陰離子的生成達(dá)9W。通過加入Tyron(4，5-二羥基-l，3-苯二磺酸，一種可透過細(xì)胞膜并可作為胞內(nèi)超氧陰離子的高度特異性螯合劑的化合物)和胞外S0D(內(nèi)源抗氧化防護(hù)系統(tǒng)中歧化胞內(nèi)超氧陰離子的首要酶阻斷劑)證實了所述方法的特異性。在存在外源S0D或Tyron的情況下，用AAPH剌激的細(xì)胞內(nèi)(先前已經(jīng)摻入或未摻入DHA)超氧陰離子的產(chǎn)生會被完全抑制并且達(dá)到基礎(chǔ)值(圖4)。最后，我們分析了DHA是否會通過改變首要的細(xì)胞抗氧化酶活性來行使其抗氧化活性。分析了包皮細(xì)胞(含有或不含有DHA)中SOD和GPx的活性。在含有DHA的情況下，黃嘌呤/黃噤呤氧化酶體系可用作超氧陰離子的瞬時產(chǎn)生器(總測量時間為520秒，每50秒測量一次)。所得結(jié)果表明這是具有快速動力學(xué)的良好氧化誘導(dǎo)，同時可直接觀察到歧化反應(yīng)并且未產(chǎn)生超氧陰離子。氧化誘導(dǎo)后15秒所達(dá)到的最大化學(xué)發(fā)光可作為S0D活性的間接和定性的量度(圖5A)。在不含DHA的情況下，數(shù)值達(dá)到了310U.A.化學(xué)發(fā)光/l()6細(xì)胞，而在與0.5pMDHA預(yù)孵育的系統(tǒng)中該值下降至150U.A.化學(xué)發(fā)光/106細(xì)胞(52%的抗氧化保護(hù)作用)(圖5A)。在用5liM和50jliMDHA處理過的細(xì)胞內(nèi)，抗氧化效率分別維持在52%和42%的保護(hù)作用(圖5A)。此外，已知AAPH會通過擴(kuò)散所產(chǎn)生的過氧自由基來氧化DM、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，作為抗氧化劑的DHA可防止能歧化超氧陰離子的SOD的失活，維持胞內(nèi)的過氧化氬酶和谷胱甘肽過氧化物酶的內(nèi)源抗氧化防護(hù)系統(tǒng)。圖5B證實了這一方面，其中已證實處于基態(tài)時DHA的存在不會使S0D活性增加(-10/-15W，但是存在DHA時會抑制由于氧化應(yīng)激過程導(dǎo)致的S0D活性喪失，保持甚至增加SOD活性(10/20%)。至于GPx活性(圖6)，發(fā)現(xiàn)處于細(xì)胞基態(tài)時適當(dāng)濃度的DHA會使GPx活性增加(5liM時高達(dá)17W，但是高濃度的DHA會使GPx活性下降(50nM時下降20W。處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時可完全維持這種效應(yīng)(圖6)。這些結(jié)果表明在所有測試濃度下DHA均可與內(nèi)源抗氧化防護(hù)系統(tǒng)協(xié)作，所述防護(hù)系統(tǒng)涉及通過產(chǎn)生的SOD來歧化超氧陰離子，并且適當(dāng)濃度的DHA還能夠控制氫過氧化物的生成，因為它會增加GPx活性。評估視網(wǎng)膜細(xì)胞模型中DHA的抗氧化活性在此體外研究中，所述細(xì)胞模型基于ARPE-19細(xì)胞(視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，ATCCCRL-2302),由于ARPE-19細(xì)胞在體外可對各種氧化誘導(dǎo)劑作出很好的應(yīng)答所以它們是一種合適的細(xì)胞類型，此外ARPE-19細(xì)胞還是一種僅需要常規(guī)的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件的原代培養(yǎng)物。ARPE-19細(xì)胞還可構(gòu)成一種良好的眼科模型，因為它具有所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的生物特性和功能特性。結(jié)果使用該細(xì)胞系進(jìn)行的測定類似于前述部分中所述的對包皮細(xì)胞進(jìn)行的測定。在所有工作條件下(DHA的作用，氧化應(yīng)激的作用)，保持細(xì)胞存活所需的基本需求是相同的。在基礎(chǔ)細(xì)胞氧化態(tài)下，以所要分析劑量摻入的DHA也不會導(dǎo)致任何顯著變化。當(dāng)使用40mMAAPH誘導(dǎo)適度的氧化應(yīng)激并且^f吏用DHR123作為ROS檢測劑時，濃度為0.5pM(43°/的保護(hù)作用)和5jiM(32%的保護(hù)作用)的MA均對活性氧簇生成表現(xiàn)出抑制作用，但濃度為50nM(4°/的保護(hù)作用)的DHA的作用較弱(圖7A)。當(dāng)使用60mMAAPH對細(xì)胞進(jìn)行劇烈誘導(dǎo)時，濃度為0.5jaM(13%的保護(hù)作用)的DHA具有抗ROS生成的保護(hù)作用，而較高濃度的DHA的作用較弱(圖7A)。上述結(jié)果類似于使用包皮細(xì)胞獲得的結(jié)果，但是一個明顯不同的作用是觀察到的抗劇烈氧化誘導(dǎo)的保護(hù)作用較弱。通過，用對過氧化物更加特異的CDCFDA進(jìn)行ROS檢測，也證明DHA可產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，所述氧化應(yīng)激是由AAPH誘導(dǎo)的(圖7B)。MA保護(hù)作用動力學(xué)也總是在誘導(dǎo)后的60-120分鐘期間顯示出最大的抗氧化作用，因此說明DHA的氫過氧化物和超氧陰離子螯合能力達(dá)到飽和。在量上，抗氧化能力基本上是劑量依賴性的，因為增加DHA濃度會導(dǎo)致ROS螯合能力下降，濃度為0.5nM時具有最有效的抗氧化能力(圖7A和7B)。在這一點上，另一個用于使系統(tǒng)效率最優(yōu)化的重要參數(shù)是DHA占總脂肪酸的比例。將DHA占脂肪酸的比例從70%降低至50-20%可顯著地且不成比例地降低最佳濃度(0.5-5iiM)的DHA的細(xì)胞抗氧化能力，當(dāng)DHA為高濃度時(圖8A和8B)，與包皮細(xì)胞不同的是DHA以不成比例的方式變?yōu)榇傺趸瘎?。這些結(jié)果證實了DHA的細(xì)胞抗氧化作用并不僅取決于其濃度，其分子定位(即DHA在甘油三酯結(jié)構(gòu)中的分布)也是決定性因素。在特異性抑制R0S生成方面，分析了脂質(zhì)過氧化物(TBARS)(圖9)和超氧陰離子(圖10)的生成。所獲得結(jié)果非常類似于用包皮細(xì)胞獲得的結(jié)果。與未誘導(dǎo)的細(xì)胞相比，用AAPH處理過的細(xì)胞會產(chǎn)生較高濃度的可與硫代巴比土酸反應(yīng)的物質(zhì)(TBARS)以及較高濃度的超氧陰離子。將DHA摻入到ARPE-19細(xì)胞的膜中會以劑量依賴性方式(0.5、5和50uM)使細(xì)胞的基礎(chǔ)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)略有增加，但是在氧化誘導(dǎo)處理過的細(xì)胞內(nèi)，DHA具有抑制所述細(xì)胞產(chǎn)生膜脂質(zhì)氫過氧化物的細(xì)胞抗氧化活性，所述活性與其濃度成反比。0.5jiMDHA的保護(hù)作用為64%、5jaMDHA的保護(hù)作用為58°/且50jiMDHA的保護(hù)作用為42%(圖9)。然后分析超氧陰離子的生成。與對照相比，含有DHA且未進(jìn)行氧化誘導(dǎo)過的細(xì)胞內(nèi)不具有較高水平的胞內(nèi)超氧陰離子(圖IOA)。使用40mMAAPH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可生成超氧陰離子，超氧陰離子產(chǎn)量可被DHA部分抑制(濃度為0.5-50nM時抑制20-16%)。存在DHA時，該抑制作用與SOD活性一致(圖10B)。未發(fā)現(xiàn)處于基態(tài)時DHA的存在會使SOD活性增加(-10/15%)，但是如在包皮細(xì)胞中的情況一致，存在DHA時會抑制由于氧化應(yīng)激過程導(dǎo)致的SOD活性喪失，保持基礎(chǔ)SOD活性。最后，進(jìn)行了一項分析以研究DHA是否會改變作為首要細(xì)胞抗氧化劑的GPx酶的活性(圖11)。處于細(xì)胞基態(tài)時所測試的所有濃度的DHA均會增加GPx活性(12-40%),且處于氧化誘導(dǎo)狀態(tài)時可完全地維持這種效應(yīng)，同樣表現(xiàn)出使GPx活性升高2.5倍(圖11)。與包皮細(xì)胞的情況一樣，這些結(jié)果表明通過調(diào)節(jié)內(nèi)源細(xì)胞酶系統(tǒng)抗氧化防護(hù)系統(tǒng)，DHA可實現(xiàn)其抗氧化作用的一部分。合成方法對摻入甘油三酯中的DHA抗氣化活性的影響在此體外測量中，ARPE-19細(xì)胞(視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，ATCCCRL-2302)和包皮細(xì)胞(未分化的表皮成纖維細(xì)胞，CRL-2076)可用作細(xì)胞模型，由于這兩種細(xì)胞在體外可對各種氧化誘導(dǎo)劑作出很好的應(yīng)答所以它們是合適的細(xì)胞系。通過化學(xué)方法(CHEM)或酶學(xué)方法(ENZ)獲得的金槍魚油甘油三酯(DHA2(^-TG，DHA占20%(摩爾百分?jǐn)?shù)))或含有50%或70。/。(摩爾百分?jǐn)?shù))DHA的油衍生物(DHA50%-TG和DHA70%-TG)可用作活性成分。結(jié)果當(dāng)仗用40mMAAPH在ARPE-19細(xì)胞中誘導(dǎo)適度的氧化應(yīng)激并且使用DHR123或H2DCFDA作為ROS胞內(nèi)檢測劑時，濃度為0.5和5yM的天然DHA(DHA20。/。-TG)和摻入通過化學(xué)方法獲得的甘油三酯中的DHA(DHA5(T/廣TG-CHEM和DHA70%-TG-CHEM)均對活性氧蔟的生成具有抑制作用，濃度為50時具有較弱的作用(圖13A)。該作用取決于DHA的含量，依次為DHA70%-TG-CHEM>DHA50HG-C隨>DHA20%-TG。濃度相同時(O.5、5和50jiM),通過酶學(xué)方法獲得的油在所有DHA含量時(DHA70%-TG-ENZ和DHA50%-TG-ENZ)均顯示出較高的活性(圖13B)。在與包皮細(xì)胞類似的研究中，結(jié)果甚至更加令人吃驚。與高劑量DHA70%-TG-CHEM和DHA50%-TG-CHEM所顯示出的促氧化活性(圖13C)不同，所有濃度的酶來源的油(DHA70°/。-TG-ENZ和DHA50%-TG-ENZ)均具有抗氧化性(圖13D)。利用色鐠法移除化學(xué)方法獲得的油中的本征聚合物(DHA70。/。-Tg-BPM)會使得ARPE-19細(xì)胞中的抗氧化活性下降得更多，在高濃度時變?yōu)榇傺趸?5和50"M)(圖14)。摻入甘油三酯中的DHA的抗氧化活性也高于(至少兩倍)摻入其他化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如乙酯、游離脂肪酸或與血清白蛋白連接的脂肪酸)中的DHA的抗氧化活性，所述甘油三酯是通過酶法合成獲得的(圖15)。通過摻入DHA所顯示出的細(xì)胞抗氧化活性涉及先前考慮的所有方面例如維持SOD和GPx酶活性，而且還涉及谷胱甘肽(GSH)胞內(nèi)濃度的增加。在ARPE-19細(xì)胞中(圖16)，DHA誘導(dǎo)GSH胞內(nèi)濃度增加，所述濃度增加與GSH的重新合成直接相關(guān)，因為加入BSO(GSH合成的特異性抑制劑)會消除DHA的保護(hù)作用(圖17),直接導(dǎo)致GSH胞內(nèi)濃度的降低(圖15)。包皮細(xì)胞表現(xiàn)出了類似的情況(圖18)。通過酶法合成獲得的DHA的抗氧化活性的改善也適用于另一種oo一3脂肪酸例如二十碳五烯酸(EPA)。在使用ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行的研究中，證實通過酶學(xué)方法獲得的EPA(EPA70%-TG-ENZ)具有抗氧化活性，但是與使用DHA(DHA70%-TG-ENZ)時觀察到的抗氧化活性相比非常低，同時也證實了通過化學(xué)方法獲得的EPA(不含聚合物(EPA-70%-TG-BPM))則具有很高的促氧化性(圖19)。此外，在包皮細(xì)胞中通過酶學(xué)方法獲得的EPA(EPA70%-Tg-ENZ)顯示出顯著的抗氧化活性，甚至高于DHA(DHA70°/。-TG-ENZ)的抗氧化活性(圖20)，同DHA—樣EPA的抗氧化活性與GSH胞內(nèi)濃度的增加有關(guān)(圖21)。評估摻入結(jié)構(gòu)化甘油三酯中的DHA在視網(wǎng)膜細(xì)胞模型中的抗氧化活迭在此體外研究中，將ARPE-19細(xì)胞(視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，ATCCCRL-2302)用作細(xì)胞模型，由于ARPE-19細(xì)胞在體外可對各種氧化誘導(dǎo)劑作出很好的應(yīng)答所以它們是一種合適的細(xì)胞類型，此外ARPE-19細(xì)胞還是一種僅需要常規(guī)的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件的原代培養(yǎng)物。此外，ARPE-19細(xì)胞是一種良好的眼科模型，因為它具有所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的生物特性和功能特性。已經(jīng)使用衍生自金槍魚油的結(jié)構(gòu)化甘油三酯(DHA20%-TG,DHA占20%(摩爾百分?jǐn)?shù)))或含有70%DHA的油(DHA70%-TG，DHA占70%(摩爾百分?jǐn)?shù)))用作活性成分，其中通過酶學(xué)方法用辛酸置換sn-l和sn-3位的脂肪酸。在這些新化合物中，DHA20°/。-TG中DHA的摩爾含量為7。/。且DHA70y。-TO中DHA的摩爾含量為22%。結(jié)果(參見圖22)當(dāng)使用40mMAAPH誘導(dǎo)適度的氧化應(yīng)激并且使用DHR123作為ROS檢測劑時，濃度為0.5jiM和5的摻入常規(guī)甘油三酯中的DHA(DHA20。/。-TG和DHA70°y4-TG)均對活性氧簇的生成表現(xiàn)出抑制作用，濃度為50jiM的DHA的作用較弱(圖22)。該作用取決于DHA的含量，即為DHA70W-TG>DHA20%-TG。濃度相同時，實際DHA濃度低2-3倍的結(jié)構(gòu)化油顯示出與DHA204-TG相同(濃度為0.5gM)或更高(濃度為5和50jiM)的活性。對于DHA70%-TG，結(jié)構(gòu)化甘油三酯的效力稍微低于最佳濃度(0.5jiM和5jiM)，但是高濃度(50nM)時的情況相反，通常顯示出更穩(wěn)定且劑量依賴性更弱的作用。評估人皮膚模型中DHA作為一種與年齡相關(guān)的端粒長度保護(hù)劑的活性在此體外測定法中，可使用包皮細(xì)胞(未分化的表皮成纖維細(xì)胞，ATCCCRL-2076)作為細(xì)胞模型用于測定DHA的潛在美容用途，由于包皮細(xì)胞在體外可對各種氧化誘導(dǎo)劑作出很好的應(yīng)答所以它們是一種合適的細(xì)胞類型，此外包皮細(xì)胞還是一種僅需要常規(guī)的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件的原代培養(yǎng)物，因此成為一種可外推至體內(nèi)應(yīng)答的良好體外模型。方法學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)物所用的細(xì)胞模型為獲取自美國典型微生物菌種保藏中心的包皮細(xì)胞(未分化的表皮成纖維細(xì)胞，CRL-2076)。將細(xì)胞培養(yǎng)物置于特別設(shè)計用于這一目的的具有合適生長條件的培養(yǎng)箱中，所述生長條件為溫度37X:、()02濃度5%和濕度95%。使CRL-2076成纖維細(xì)胞在裝有伊思考夫改良杜爾貝可培養(yǎng)基(BiologicalIndustrie)的培養(yǎng)瓶中維持生長，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)加了10%胎牛血清、青霉素抗生素(1Q0U/mL)、鏈霉素(IOOjig/mL)和谷氨酖胺(BiologicalIndustries)。將DHA整合到所述細(xì)胞中加入濃度為0.5juM的通過酶法合成的DHA-TG70%，通過將油溶于乙醇中制備儲液(1:100)并且使用用血清制備的培養(yǎng)基制備工作溶液。在37X:下，將細(xì)胞用補(bǔ)加了DHA-TG的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。誘導(dǎo)氧化應(yīng)激使用濃度為40mM的2，2，-偶氮二-(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)氧化性地刺激細(xì)胞，AAPH被廣泛用作自由基的親水引發(fā)劑，誘導(dǎo)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過氧化反應(yīng)。AAPH會通過已形成的過氧自由基的作用來氧化DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。AAPH還會作用于內(nèi)源防護(hù)系統(tǒng)，因為它會使關(guān)鍵性的酶S0D失活，從而失去CAT和GPx的保護(hù)能力。測量端粒長度可利用原位雜交技術(shù)來評估由高度重復(fù)的DNA構(gòu)成的端粒區(qū)域。所述熒光原位雜交方法(FISH)可檢測是否存在端粒并且將每個細(xì)胞或每個染色體組的端粒定量，所述雜交方法使用與所述端粒序列互補(bǔ)的探針。被稱為flowFISH的方法聯(lián)合使用流式細(xì)胞術(shù)和FISH技術(shù)(使用pan-端粒PNA(肽核酸)作為探針)，并且可以利用熒光強(qiáng)度來測量位于各個細(xì)胞染色體末端的平均端粒長度。我們的目的在于測量PAN標(biāo)記的分裂中期染色體的熒光強(qiáng)度。將結(jié)果表式為端粒熒光單位(TFU),每ITFU對應(yīng)1kb的重復(fù)端粒。結(jié)果利用flow-FISH分析人成纖維細(xì)胞內(nèi)的端粒平均長度的變化，所述人成纖維細(xì)胞是在加入或未加入DHA的氧化應(yīng)激條件下培養(yǎng)的(圖23)。使用線性回歸分析端粒長度與細(xì)胞群傳代數(shù)之間的關(guān)系。對于所有分析的培養(yǎng)物來說，可以直接將回歸的斜率理解為端?？s短指數(shù)。在人成纖維細(xì)胞中，AAPH的處理會顯著加快端?？s減指數(shù)，所述AAPH會誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的胞內(nèi)自由基。另一方面，與未加入DHA的情況相比，加入濃度為0.5pM的DHA可將所述指數(shù)降低50。y4，已經(jīng)證明加入O.5yMDHA可增加細(xì)胞抗氧化防護(hù)。此外，與正常的成纖維細(xì)胞對照相比，加入DHA能夠降低端?？s減指數(shù)。權(quán)利要求1.二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA用于制備一種藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于治療與細(xì)胞氧化損傷相關(guān)的疾病，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA摻入甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂或乙酯中；所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA占總脂肪酸的重量百分?jǐn)?shù)為20％-100％。2.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA占總脂肪酸的重量百分?jǐn)?shù)為40%-100%。3.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA占總脂肪酸的重量百分?jǐn)?shù)為66°/-100%。4.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA摻入甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯中。5.權(quán)利要求4的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA摻入甘油三酯中。6.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA通過酯鍵特異性地結(jié)合到甘油的至少一個位點上形成結(jié)構(gòu)化的脂質(zhì)，以制備一種用于治療細(xì)胞氧化損傷的藥物組合物。7.權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述甘油還包括至少一種脂肪酸和/或磷酸。8.權(quán)利要求6或7的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA結(jié)合到選自sn-l、sn-2和sn-3的位點，并且所述甘油還任選地包括至少一種選自短鏈和/或中鏈脂肪酸和磷酸的酸。9.權(quán)利要求6或7的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA結(jié)合到sn-2位，并且任選地所述甘油還包括至少一種選自脂肪酸和磷酸的酸。10.權(quán)利要求8的用途，其特征在于所述短鏈脂肪酸為Cl-C8脂肪酸。11.權(quán)利要求8的用途，其特征在于所述中鏈脂肪酸為C9-C14脂肪酸。12.權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA摻入甘油三酯中。13.前述權(quán)利要求任一項的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA是通過化學(xué)方法獲得的。14.前述權(quán)利要求任一項的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA是通過酶學(xué)方法獲得的。15.前述權(quán)利要求任一項的用途，其特征在于所述藥物組合物還包括另一種活性成分。16.前述權(quán)利要求任一項的用途，其特征在于將所述藥物組合物給予一名正在接受抗細(xì)胞氧化損傷治療的患者。17.前述權(quán)利要求任一項的用途，其特征在于所述與氧化損傷相關(guān)的疾病為神經(jīng)變性疾病。18.前述權(quán)利要求任一項的用途，其特征在于所述與氧化損傷相關(guān)的疾病為目艮部疾病。19.前述權(quán)利要求任一項的用途，其特征在于所述與氧化損傷相關(guān)的疾病為缺血性疾病。20.前述權(quán)利要求任一項的用途，其特征在于所述與氧化損傷相關(guān)的疾病為炎性病變。21.前述權(quán)利要求任一項的用途，其特征在于所述與氧化損傷相關(guān)的疾病為動脈粥樣硬化。22.權(quán)利要求17的用途，其特征在于所述神經(jīng)變性疾病為下列疾病之一多發(fā)性硬化、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化和肌肉萎縮癥。23.權(quán)利要求18的用途，其特征在于所述眼部疾病為下列疾病之一色素性視網(wǎng)膜變性、黃斑變性和白內(nèi)障。24.權(quán)利要求19的用途，其特征在于所述缺血性疾病為心肌梗塞或腦梗塞。25.權(quán)利要求20的用途，其特征在于所述疾病為下列疾病之一關(guān)節(jié)炎、血管炎、腎小球腎炎和紅斑狼瘡。26.權(quán)利要求1至16任一項的用途，其特征在于使用所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA制備一種藥物組合物，所述藥物組合物用于治療細(xì)胞DNA氧化損傷。27.權(quán)利要求26的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA在端?？s短的自然過程中被用作保護(hù)劑。28.權(quán)利要求26的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA被用作過早性衰老的抑制劑。29.權(quán)利要求27的用途，其特征在于所述端?？s短與遺傳疾病有關(guān)，所述遺傳疾病與線粒體呼吸鏈障礙有關(guān)。30.權(quán)利要求27的用途，其特征在于所述端?？s短與唐氏綜合征有關(guān)。31.前述權(quán)利要求任一項的用途，其特征在于二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA的所述用途被用在食品工業(yè)中。32.權(quán)利要求31的用途，其特征在于所述用途被用在乳制品中。33.權(quán)利要求1至16任一項的用途，其特征在于二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA的所述用途被用于制備一種藥物組合物，所述藥物組合物用于治療與體育鍛煉相關(guān)的細(xì)胞氧化損傷。34.權(quán)利要求33的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA被用作運動績效增強(qiáng)劑。35.權(quán)利要求33的用途，其特征在于所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的BPA在體育運動過程中用作血糖水平調(diào)節(jié)劑。36.權(quán)利要求34的用途，其特征在于所述增強(qiáng)劑增加了在無氧閾時的最大絕對和相對氧耗量的百分?jǐn)?shù)。37.權(quán)利要求34的用途，其特征在于所述增強(qiáng)劑增加了無氧閾所對應(yīng)的負(fù)荷。38.權(quán)利要求34的用途，其特征在于所述增強(qiáng)劑增加了達(dá)到無氧閾的時間。39.權(quán)利要求34的用途，其特征在于所述增強(qiáng)劑降低了達(dá)到相同運動水平時的心搏頻率。40.權(quán)利要求34的用途，其特征在于所述增強(qiáng)劑增加了血漿總抗氧化能力(PTAC)。41.權(quán)利要求34的用途，其特征在于所述增強(qiáng)劑減少了對DNA的氧化損傷。42.權(quán)利要求34的用途，其特征在于所述增強(qiáng)劑減少了對血漿脂質(zhì)的氧化損傷。43.權(quán)利要求35的用途，其特征在于所述調(diào)節(jié)劑促進(jìn)了血糖量正常。44.權(quán)利要求33的用途，其特征在于二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA的所述用途被用在食品工業(yè)中。45.權(quán)利要求44的用途，其特征在于所述用途被用在乳制品中。46.權(quán)利要求33的用途，其特征在于將所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸或DHA衍生的EPA通過一種合適的方法給予，所述合適的方法選自用在體育鍛煉之前、期間和之后的任何特征的飲料；補(bǔ)充能量的棒；增進(jìn)機(jī)能的棒；用作食物的固體和制品；飲食補(bǔ)充物和多維生素制品；增進(jìn)機(jī)能的輔助手段；帶有用于皮膚吸收的納米^:嚢劑的紡織品，以及其他任何合適的給予方法。47.權(quán)利要求46的方法，其特征在于所述飲食補(bǔ)充物和多維生素制品的形式為膠嚢、片劑、丸劑、凍干形式，或者任何合適的給予形式。全文摘要本發(fā)明涉及一種富含二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)或DHA衍生的EPA的酸用于制備一種藥物的用途，所述藥物用于治療與氧化損傷相關(guān)的病變。具體而言，所述藥物用于治療與神經(jīng)變性性疾病、眼部疾病、缺血性疾病和炎性疾病相關(guān)的病變、與動脈粥樣硬化相關(guān)的病變、與DNA氧化損傷相關(guān)的病變和與體育鍛煉相關(guān)的病變。文檔編號A23L1/30GK101346138SQ200680048821公開日2009年1月14日申請日期2006年12月20日優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日發(fā)明者J·A·威勒蓋斯加西亞,J·C·多明果佩羅申請人:布魯?shù)峡萍加邢薰?