專利名稱：：對(duì)hcv進(jìn)行基因分型的方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及對(duì)測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種進(jìn)行基因分型的方法和材料。
背景技術(shù)：
：據(jù)估計(jì)，全世界有大約l億7千萬(wàn)人感染丙型肝炎病毒(HCV),并且該病毒會(huì)引起慢性肝病，還提高了肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)。HCV的治療主要局限于抗病毒療法，它的效力主要受到幾個(gè)生物學(xué)參數(shù)例如病毒基因型的影響。因而，HCV基因分型一皮廣泛地用于預(yù)測(cè)對(duì)于抗病毒治療的反應(yīng)性，并用于優(yōu)化治療的持續(xù)時(shí)間。HCV基因分型也已經(jīng)成為流行病學(xué)研究和示蹤HCV污染源的重要工具。正鏈HCVRNA基因組長(zhǎng)度是大約9600個(gè)核苦酸，編碼大約3010個(gè)氨基酸的至少一個(gè)開(kāi)放閱讀框。在被感染的細(xì)胞中，這種多聚蛋白被細(xì)胞蛋白酶和病毒蛋白酶在多個(gè)位點(diǎn)裂解，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。HCV分離物的特征在于高度的遺傳變異性，原因在于HCVRNA依賴性RNA聚合酶缺乏保真性，該聚合酶由非結(jié)構(gòu)5B(NS5B)基因編碼。此外，由于內(nèi)源突變或被多個(gè)種感染，還在單一患者內(nèi)產(chǎn)生遺傳變異的HCV準(zhǔn)種。已經(jīng)描述了六種主要的HCV基因型和一百多種亞型。HCV的遺傳變異性使得擴(kuò)增、測(cè)序和基因分型的過(guò)程復(fù)雜化。這些過(guò)程一般依靠使用寡核苷酸引物和探針(例如，PCR擴(kuò)增引物、測(cè)序引物和位點(diǎn)特異性探針)，所述寡核苷酸引物和探針與HCV基因組的相應(yīng)核酸序列互補(bǔ)，并且能與之雜交。由于HCV基因組的高度變異性，與HCV的一個(gè)種互補(bǔ)的寡核苷酸引物和探針可能不與另一個(gè)種互補(bǔ)。因而這樣的引物和探針必須根據(jù)對(duì)高度保守區(qū)域的特異性來(lái)設(shè)計(jì)。作為選擇，分析必須使用對(duì)所有種互補(bǔ)的簡(jiǎn)并引物和探針的混合物。某些基因分型方法著眼于于5'非編碼(5'NC)區(qū)。HCV的5'非編碼(NC)區(qū)高度保守，但卻含有可被利用來(lái)區(qū)分基因型的型特異性多態(tài)性。迄今為止，大多數(shù)商購(gòu)5'NC區(qū)基因分型分析是通過(guò)RFLP或與寡核苷酸探針的雜交基于PCR擴(kuò)增和片段分析的。這些分析類(lèi)型是快速的，但是不像基于測(cè)序的分析那么精確。為此，已經(jīng)提出了可選擇的基因組區(qū)域用于對(duì)HCV進(jìn)行基因分型，包括NS5B區(qū)域。對(duì)HCV進(jìn)行基因分型的最精確和直接的方法是對(duì)某一區(qū)域的病毒基因組進(jìn)行測(cè)序，所述區(qū)域在各個(gè)種之間不同到可區(qū)分病毒型和亞型。同樣重要地，系統(tǒng)發(fā)生分析的數(shù)據(jù)庫(kù)必須是可容易獲得的，以分析從這些區(qū)域產(chǎn)生的序列。商業(yè)上可獲得的基于測(cè)序的HCV基因分型分析包括，例如，TRUGENE//CK5'WC基因分型試劑盒(BayerHealthCare)，它是利用HCV的5'NC區(qū)的快速的基于測(cè)序的分析。這種分析產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)利用系統(tǒng)發(fā)生5'NC區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)(TRUGENE/ZCr5'7VC軟件模塊v3丄l)來(lái)直接分析。早先，5'NC數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)包括了來(lái)自從未被完全驗(yàn)證的各種來(lái)源的序列，在某些情況下，當(dāng)分析5'NC或NS5B序列時(shí)特定抹系的亞型分配是不一致的。存在著改進(jìn)基于測(cè)序的HCV分析的持續(xù)的需求，以為了臨床分析和治療介入的目的改善HCV型和亞型的鑒定。發(fā)明概述本發(fā)明一般地涉及對(duì)測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種進(jìn)行基因分型的方法和試劑。更具體而言，本發(fā)明涉及擴(kuò)增和測(cè)序樣品中HCV種的NS5B區(qū)域的一部分并確定它的基因型的改進(jìn)的方法。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)測(cè)序HCV的NS5B區(qū)域的至少一部分來(lái)測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，對(duì)于多種HCV種中的每一種而言，所述NS5B區(qū)域指示該種的型和/或亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)測(cè)定指示測(cè)試樣品中存在的HCV種的基因型的所述HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核普酸序列，其中多種HCV種的相應(yīng)核苷酸序列指示所述HCV種的特有基因型；并且(b)將(a)中測(cè)定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述多種HCV種之一的基因型相關(guān)聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)測(cè)定指示存在于所述測(cè)試樣品中的所述HCV種的基因型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6的多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苷酸序列指示所述HCV種的特有基因型；以及(b)將(a)中測(cè)定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關(guān)聯(lián)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)測(cè)定指示存在于測(cè)試樣品的所述HCV種的基因型和亞型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6以及表1中所列的每一種HCV亞型的相應(yīng)核苦酸序列指示所述HCV種的特有基因型和亞型；以及(b)將(a)中測(cè)定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1中所列所述HCV亞型之一相關(guān)聯(lián)。在上述方法的一個(gè)特定實(shí)施方案中，HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由SEQIDNO:1的乂人核苷酸位置大約8344到大約8547的區(qū)域組成。在上述方法的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由SEQIDNO:1的/人核苷酸位置8344到8547的區(qū)域組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苦酸序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苦酸序列指示所述HCV種的特有基因型；(b)測(cè)定指示存在于測(cè)試樣品中的所述種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；并(c)將(b)中測(cè)定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核普酸序列與所述多種HCV種之一的基因型相關(guān)聯(lián)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序f1物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苦酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一；(b)測(cè)定指示存在于測(cè)試樣品中的所述HCV種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；并(c)將(b)中測(cè)定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苦酸序列與HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關(guān)聯(lián)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核香酸序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序《1物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一和表1中所列亞型之一；(b)測(cè)定作為所述種的基因型的指示的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；并(c)將(b)中測(cè)定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與HCV基因型和亞型[HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1所列亞型之一]相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域乂人大約核苦酸8256到大約8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互補(bǔ)物，和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苷酸8611到大約8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5]或它的互補(bǔ)物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從核普酸8256到8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互補(bǔ)物，和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的核苦酸8611到8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[例如，CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5]或它的互補(bǔ)物。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含由一個(gè)或多個(gè)下式定義的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC國(guó)3';和SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及通過(guò)擴(kuò)增HCV的NS5B區(qū)域的至少一部分來(lái)測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，對(duì)于多種HCV種中的每一種而言，所述NS5B區(qū)域指示該種的型和/或亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)提供簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域/人大約核苷酸8245到大約8269互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[例如，正向引物FF1和/或FF2]或其互補(bǔ)物；以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苷酸8616到大約8641互補(bǔ)[例如，反向引物RR1]的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物；以及(b)擴(kuò)增NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列。在具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域/人核苷酸8256到8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[例如，CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5.5]或其互補(bǔ)物；以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的核苦酸8611到8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[例如，CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5]或其互補(bǔ)物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由一個(gè)或多個(gè)下式定義的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:6:5'-TGGSBTTYKCNTAYGAYACYMGNTG-3'SEQIDNO:5:5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'在又一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核苦酸PCR引物的混合物包含由一個(gè)或多個(gè)下式定義的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:3:5'-TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'SEQIDNO:4:5'-TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'SEQIDNO:5:5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明附圖1是顯示本發(fā)明的特定實(shí)施方案中利用的HCVNS5b結(jié)構(gòu)域和相關(guān)區(qū)域的示意圖。附圖2顯示了在GenBankAccessionNo.M67463中所列的HCV的NS5b結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。引物區(qū)域是高亮的，并在邊緣指出。附圖2與SEQIDNO:12相對(duì)應(yīng)。發(fā)明的詳細(xì)i兌明定義雖然在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)是本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的，但還是提供了某些術(shù)語(yǔ)的以下定義來(lái)確保清楚。單位、前綴和符號(hào)可以按它們SI接受的形式來(lái)表示。除非另有陳述，核酸按照5'到3'方向從左到右書(shū)寫(xiě)。在此敘述的數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)字，并且包括和支持所定義的范圍內(nèi)的每個(gè)整數(shù)。氨基酸在此可以通過(guò)它們公知的三字母符號(hào)或通過(guò)IUPAC-IUBMB命名委員會(huì)建議的單字母符號(hào)來(lái)指代。同樣地，核苷酸可以通過(guò)它們公認(rèn)的單字母代碼來(lái)指代。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"一(a)"或"一(an)"被看作意味著"至少一個(gè)"。在此使用的小節(jié)標(biāo)題僅是為了組織的目的，不能被認(rèn)為是限制所描述的主題。在本申請(qǐng)中引用的所有文件或文件的部分(包括但不限于專利、專利申請(qǐng)、文章、書(shū)和論文)基于任一目的通過(guò)引用完整地將它們明確地合并在此。若本申請(qǐng)中的任何氨基酸或核酸序列不一致，則以附圖為準(zhǔn)。如在此使用的術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增"是指提高反應(yīng)混合物中一種或多種特定基因或基因片段相對(duì)于其他基因的相對(duì)豐度的過(guò)程。提及具體的核苷酸序列使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"基本上由......組成"是指具體的序列和任何其他序列，所述其他序列并不會(huì)顯著影響所述序列的互補(bǔ)性和所述序列雜交多種HCV型或亞型的能力。如在此使用的，"樣品"是指含有或懷疑含有核酸例如RNA或DNA的任何物質(zhì)，包括從一個(gè)個(gè)體或多個(gè)個(gè)體分離的組織或液體的樣品，包括但不限于，例如，皮膚、血漿、血清、脊液、淋巴液、滑液、尿液、淚液、血細(xì)胞、器官、腫瘤以及體外細(xì)胞培養(yǎng)物成分的樣品(包括但不限于細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所得到的條件培養(yǎng)基、重組細(xì)胞和細(xì)胞組分)。術(shù)語(yǔ)"核苷酸"是指核苷酸腺苷酸、胞嘧啶、鳥(niǎo)噤呤和胸腺嘧啶，分別由它們的單字母代碼A、C、G和T表示。在簡(jiǎn)并引物的表述中，符號(hào)R是指G或A,符號(hào)Y是指T/U或C,符號(hào)M是指A或C，符號(hào)K是指G或T/U,符號(hào)S是指G或C,符號(hào)W是指A或T/U,符號(hào)B是指"非A",符號(hào)D是指"非C",符號(hào)H是指"非G",符號(hào)V是指"非T/U",符號(hào)N是指任何核苷酸。符號(hào)I代表肌苷，它是一般將與任何C、T或A配對(duì)的中性石咸基。在本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)和4又利要求中，簡(jiǎn)并引物是指堿基選擇的任一或所有組合，并且指DNA或相應(yīng)的RNA序列(即，T被U替代)。因而，簡(jiǎn)并引物可以代表單個(gè)種、落入選擇內(nèi)的兩個(gè)種的混合物、或落入選擇內(nèi)的三種選擇的混合物，以及諸如此類(lèi)直到含有所有可能組合的混合物。術(shù)語(yǔ)"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"是指引物、探針、要檢測(cè)的寡聚物片段、寡聚物對(duì)照以及未標(biāo)記的封閉寡聚體，并且應(yīng)當(dāng)屬于多聚脫氧核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、屬于多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、屬于為嘌呤或嘧咬》咸基的N-糖苦或經(jīng)l奮飾的噤呤或嘧咬堿基的任何其他類(lèi)型的多核普酸。在術(shù)語(yǔ)"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"之間沒(méi)有預(yù)定的長(zhǎng)度區(qū)別，這些術(shù)語(yǔ)將可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因而，這些術(shù)語(yǔ)包括雙鏈和單鏈DNA,以及雙鏈和單鏈RNA。寡核苷酸包含與指定核苷酸序列的區(qū)域相對(duì)應(yīng)的大約至少6個(gè)核苷酸、優(yōu)選地至少約10-12個(gè)核普酸、更優(yōu)選地至少約15-25個(gè)核苷酸的序列。在此使用來(lái)定義參考核苷酸序列形式的核酸序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)"相對(duì)應(yīng)，，是指匹配所有或部分參考序列的核苷酸序列，以及作為所有或部分參考序列的互補(bǔ)物的核苷酸序列。寡核苦酸不必完全來(lái)自于任何現(xiàn)有的或天然的序列，而可以以任何方式產(chǎn)生，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、逆轉(zhuǎn)錄或其組合。術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"或"核酸"意指基因組DNA或RNA、cDNA、半合成或合成來(lái)源的多核苷酸，就其來(lái)源或操作而言，所述多核苷酸(l)與其在自然中相關(guān)的所有或部分多核苷酸不相關(guān)；和/或(2)與不同于其在自然中連接的多核苷酸的多核苷酸連接；和(3)在自然中不存在。由于單核苷酸以某一形式反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生寡核苷酸，從而使得一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸在一個(gè)方向上經(jīng)由磷酸二酯鍵連接到與之相鄰的3'氧上，若其5'磷酸沒(méi)有連接到單核苷酸戊糖環(huán)的3'氧，則寡核苷酸的末端被稱為"5'末端"，而若其3'氧沒(méi)有連接到隨后的單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸，則寡核苷酸的末端稱為"3'末端"。即便處于較大寡核苷酸內(nèi)部，在此4吏用的核酸序列也可以纟皮i人為具有5'和3'末端。當(dāng)兩個(gè)不同的、非重疊的寡核苦酸退火到同一線性互補(bǔ)核酸序列的不同區(qū)域，并且一個(gè)寡核苷酸的3'末端指向另一個(gè)的5'末端時(shí)，前者可以被稱為"上游"寡核苷酸，后者被稱為"下游"寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)"引物，，可以指不止一個(gè)引物，并且可以指天然存在(經(jīng)純化的限制性酶切產(chǎn)物形式)或合成產(chǎn)生的寡核苷酸，使其處于與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成被催化的條件下時(shí)，所述寡核苷酸能夠作為沿互補(bǔ)鏈的合成起點(diǎn)。這些條件包括存在四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸鹽和聚合誘導(dǎo)試劑例如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，在適合的緩沖劑中("緩沖劑"包括作為輔助因子、或影響pH、離子強(qiáng)度等等的替代物)，以及在適合的溫度下。為使擴(kuò)增效力最大，引物優(yōu)選地是單鏈的，但作為選擇可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，在用于制備延伸產(chǎn)物之前，引物首先^t處理從而將其鏈分開(kāi)。優(yōu)選地，引物是寡聚脫氧核糖核苷酸。引物必需足夠長(zhǎng)以在存在聚合試劑的情況下啟動(dòng)延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度將取決于許多因素，包括溫度和引物的來(lái)源以及方法的使用。例如，根據(jù)目標(biāo)序列的復(fù)雜度，寡核苷酸引物一般含有15-25個(gè)核苷酸，而它可以含有更多或更少的核苷酸。短的引物分子一般需要更低的溫度來(lái)與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)"延伸引物，，是指與模板序列互補(bǔ)、并且能夠在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下雜交并延伸序列的多核苷酸序列。在提及兩個(gè)核酸序列時(shí)所使用的術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)"和它相關(guān)的形容詞形式"互補(bǔ)的"是指，當(dāng)兩個(gè)核酸序列以反向平行連接方式排列時(shí)(一個(gè)序列的5'末端與另一個(gè)序列的3'末端配對(duì))，序列相應(yīng)的G和C核苷酸堿基是配對(duì)的，相應(yīng)的A和T核苷酸堿基是配對(duì)的。通常在天然核酸中不存在的某些堿基可以被包括在本發(fā)明的核酸中，包括，例如，肌苷和7-去氮鳥(niǎo)噤呤。術(shù)語(yǔ)基因座中核普酸的"位置"或"位點(diǎn)"是指在基因中分配給核苷酸的編號(hào)，一般取自基因的基因組序列的cDNA序列。術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸引物"是指包含三個(gè)以上脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。它的確切長(zhǎng)度將取決于與寡核苷酸引物的最終功能和用途相關(guān)的許多因素，包括退火反應(yīng)的溫度以及引物的來(lái)源和組成。擴(kuò)增引于誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下時(shí)，寡核苷酸引物能夠作為合成起點(diǎn)。條件可以包括在適合的溫度和pH下核苷酸和誘導(dǎo)試劑例如DNA聚合酶的存在。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，引物是足夠長(zhǎng)度的單鏈寡聚脫氧核糖核苷酸，以在存在誘導(dǎo)試劑的情況下啟動(dòng)延伸產(chǎn)物從特定序列的合成。在本發(fā)明的一個(gè)方面，寡核苷酸引物長(zhǎng)度是約15到約30個(gè)核普酸，然而引物可以含有更多或更少的核普酸。寡核苦酸引物長(zhǎng)度優(yōu)選地是至少15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸。更優(yōu)選地，引物將含有約20-25個(gè)核苷酸。寡核苷酸引物的敏感性和特異性由引物長(zhǎng)度和給定的模板核酸樣品內(nèi)序列的獨(dú)特性來(lái)決定。例如，太短的引物可能表現(xiàn)出對(duì)多個(gè)序列的非特異性結(jié)合。除非另有陳述，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、寡核苷酸合成技術(shù)，所有這些都處在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整說(shuō)明。根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)或如本領(lǐng)域通常實(shí)現(xiàn)的或如在此描述的進(jìn)行酶反應(yīng)和純化技術(shù)。上述技術(shù)和方法通常根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法以及如多篇一般性參考文獻(xiàn)和更具體的參考文獻(xiàn)的描述進(jìn)行，這些參考文獻(xiàn)在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)中被引i正禾口i寸"i侖。參見(jiàn),1"列Jt口Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989));OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.，1984);NucleicAddHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.,1984);APracticalGuidetoMolecularCloning(B.Perbal,1984);以及MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.)系列，所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用合并在此。術(shù)語(yǔ)"逆轉(zhuǎn)錄"是指產(chǎn)生與RNA分子互補(bǔ)的DNA的過(guò)程，一般借助于逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。引物可以用于啟動(dòng)聚合；這種引物可以是稍后用于PCR擴(kuò)增的引物對(duì)之一。然后將RNA分子與拷貝的DNA("cDNA")相分離，或通過(guò)具有RNAseH活性的酶來(lái)降解，從而容許cDNA的第二鏈通過(guò)沖莫板依賴性DNA聚合酶產(chǎn)生。在CurrentProtocolsinMolecularBiology,Eds.Ausubel,F.M.etal,(JohnWiley&Sons;1995)的3.7和15.4單元中公開(kāi)了這種方法，其內(nèi)容通過(guò)引用合并在此。術(shù)語(yǔ)"測(cè)序"是指確定至少部分基因中核苷酸的順序。除非另有陳述，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、寡核苷酸合成技術(shù)，所有這些都處在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整說(shuō)明。根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)或如本領(lǐng)域通常實(shí)現(xiàn)的或如在此描述的進(jìn)行酶反應(yīng)和純化沖支術(shù)。上述技術(shù)和方法通常根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法以及如多篇一般性參考文獻(xiàn)和更具體的參考文獻(xiàn)的描述進(jìn)行，這些參考文獻(xiàn)在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)中被引i正和"i寸論。參見(jiàn)，i^列i口Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989));OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1984);NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.丄Higgins,eds.,1984);APracticalGuidetoMolecularCloning(B.Perbal,1984);和MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.)系列，所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用合并在此。DNA的來(lái)源在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述方法包括首先從患者樣品獲得包含所研究突變的雙鏈多核苷酸才莫板。雙鏈多核苷酸模板起初可以包含基因組DNA、基因組DNA的片段或者從RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。這種模板將不僅包含所研究突變，還可能包含含有產(chǎn)生多種準(zhǔn)種的長(zhǎng)度多態(tài)性的區(qū)域。雙鏈多核苷酸^t板一般從患者樣品制備，這通過(guò)處理含有DNA的患者樣品從而使得樣本中全部或部分DNA能與寡核苦酸引物雜交，與寡核苷酸引物雜交的、所述樣品中的所有或部分DNA,例如通過(guò)裂解、離心來(lái)除去細(xì)胞碎屑以及蛋白水解消化來(lái)暴露DNA。因而DNA模板可以僅含有通過(guò)從組織樣品分離獲得的核DNA，僅含有線粒體DNA或核DNA或線粒體DNA的某些子片段。DNA沖莫板也可以通過(guò)將總mRNA制品或RNA病毒的基因組轉(zhuǎn)化為cDNA例如通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄來(lái)制備，可為從在平板上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落或從富集的細(xì)菌培養(yǎng)物分離的DNA，并且可為其中分離了基本上整個(gè)病毒基因組的病毒DNA制品。DNA可以通過(guò)多種技術(shù)中的任何一種從液體樣品例如血液、尿液或組織樣品制備，這通過(guò)多種技術(shù)的任何一種，這些技術(shù)包括包括裂解、離心來(lái)除去細(xì)胞碎屑以及蛋白水解消化來(lái)暴露DNA;鹽沉淀反應(yīng)或標(biāo)準(zhǔn)的SDS-蛋白酶K-苯酚提取。樣品也可以使用試劑盒例如PureGeneDNAIsolation試劑盒(Gentra)來(lái)制備。核酸的擴(kuò)增本發(fā)明包括用于DNA擴(kuò)增以提供用于隨后的測(cè)序的豐富DNA資源的方法禾口i式劑。一般地，在測(cè)序之前，通過(guò)首先擴(kuò)增包含要測(cè)序的目標(biāo)區(qū)域的DNA區(qū)域來(lái)制備測(cè)序模板。要擴(kuò)增的序列不必首先以純的形式存在；它可以是復(fù)合混合物的較小的部分或一部分核酸序列。起始核酸可以含有一個(gè)以上相同或不同的期望的特定核酸序列。因而，本方法不僅可用于產(chǎn)生大量的一種特定核酸序列，而且如果在序列中存在超過(guò)一個(gè)的堿基對(duì)變異，該方法也可用于同時(shí)擴(kuò)增位于相同或不同核酸分子上一種以上不同的特定核酸序列。本發(fā)明涉及用于對(duì)HCV進(jìn)行基因分型的方法和試劑，包括擴(kuò)增和測(cè)序引物。本發(fā)明利用了使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(即PCR)技術(shù)或某些其他基于引物延伸的方法來(lái)擴(kuò)增特定核酸序列的公知方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法是本領(lǐng)域廣泛已知的。例如，在美國(guó)專利NO.4,683,195、4,683,202和4,800,159;K.Mullis,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.,51:263-273(1986);禾口C.R.Newton&A.Graham,IntroductiontoBiotechniques:PCR,2.sup.ndEd.,Springer-Verlag(NewYork:1997)中描述了這些方法，它們的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并在此。PCR涉及使用引物對(duì)，每一引物針對(duì)雙鏈DNA的每一互補(bǔ)鏈(其中編碼鏈被稱為"有義鏈，，，它的互補(bǔ)鏈被稱為"反義鏈")，其將在位于基因中所研究區(qū)域任一側(cè)的位置上雜交。然后在重復(fù)的循環(huán)中進(jìn)行鏈延伸聚合，從而以指數(shù)方式提高所研究區(qū)域的拷貝數(shù)量。簡(jiǎn)言之，在PCR反應(yīng)的第一步中，樣品的核酸分子一皮短暫地加熱，然后冷卻，以^吏雙鏈分子變性。正向和反向引物以相對(duì)于樣品目標(biāo)過(guò)量的濃度存在于擴(kuò)增反應(yīng)混合物中。當(dāng)樣品在有助于雜交和聚合的條件下孵育時(shí)，引物在希望擴(kuò)增的區(qū)域的序列的3'位置處與核酸分子的互補(bǔ)鏈雜交，所述互補(bǔ)鏈?zhǔn)窍Ｍ麛U(kuò)增的序列的互補(bǔ)物。一旦發(fā)生雜交，引物的3'末端被聚合酶延伸。引物的延伸引起DNA分子的合成，所述DNA分子具有希望的核酸樣品目標(biāo)的互補(bǔ)物的確切序列。PCR反應(yīng)能夠指數(shù)擴(kuò)增期望的核酸序列，在每個(gè)循環(huán)中具有期望序列的分子的數(shù)量幾乎翻倍。因而，通過(guò)允許雜交、聚合和變性的循環(huán)，則可以實(shí)現(xiàn)期望的核酸分子其濃度呈指數(shù)增長(zhǎng)。擴(kuò)增得到的多核香酸可以用作測(cè)序反應(yīng)的才莫板。Gdfand等人描述了來(lái)自有機(jī)體水生棲熱菌(Thermusaquaticus)的熱穩(wěn)定酶"Taq聚合酶"，該酶可用于這種擴(kuò)增方法中(參見(jiàn)美國(guó)專利NO.4,889,818;5,352,600;和5,079,352，通過(guò)引用將它們合并在此)?？蛇x擇的擴(kuò)增:技術(shù)例如NASBA、3SR、QbReplicase和支鏈擴(kuò)增是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和可獲得的。術(shù)語(yǔ)"RT-PCR"—般指包括可擴(kuò)增RNA序列的逆轉(zhuǎn)錄步驟在內(nèi)的擴(kuò)增。多核苷酸擴(kuò)增才莫板的制備本發(fā)明涉及HCV和它的變體形式的擴(kuò)增和測(cè)序。例如，本發(fā)明的方法可以采用DNA或RNA(包括信^吏RNA),所述DNA或RNA可以是單鏈的或雙鏈的。此外，可以利用含有DNA和RNA各一條鏈的DNA-RNA雜合體。也可以采用任何這些核酸的混合物，或者也可以利用在此使用相同或不同的引物從早先的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的核酸。要擴(kuò)增的特定核酸序列可以只是較大分子的一部分，或可以首先作為分立的分子存在，從而所述具體的序列構(gòu)成整個(gè)核酸。要擴(kuò)增的序列不必首先以純的形式存在；它可以是復(fù)合混合物的較小的部分或一部分核酸序列。起始核酸可以含有一個(gè)以上相同或相異的期望的特定核酸序列。因而，本方法不僅可用于產(chǎn)生大量的一種特定核酸序列，而且如果在序列中存在超過(guò)一個(gè)的堿基對(duì)變異，該方法也可用于同時(shí)擴(kuò)增位于相同或不同核酸分子上一種以上的不同的特定核酸序列。核酸才莫板可以,人任何來(lái)源獲得，例如，來(lái)自質(zhì)粒如pBR322,來(lái)自克隆的DNA或RNA,或來(lái)自來(lái)自任何來(lái)源的天然DNA或RNA。DNA或RNA可以通過(guò)多種4支術(shù)例如由Maniatisetal.,MolecularCloning(1982),280-281所描述的沖支術(shù)/人血液、組織材津?；蜓蚰ぜ?xì)胞提取。如果細(xì)胞懸浮在低滲緩沖液中，則細(xì)胞可以直接使用而不用純化核酸，并加熱到約90°C-100°C，直到出現(xiàn)細(xì)胞裂解且細(xì)胞內(nèi)組分分散出來(lái)，一般約1到15分鐘。在加熱步驟之后，可以直接向裂解的細(xì)胞添加擴(kuò)胞。樣品中含有的目標(biāo)核酸起初可為RNA的形式，優(yōu)選地;故逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適合的變性方法，包括物理的、化學(xué)的或酶學(xué)的方法來(lái)變性。鏈分離的優(yōu)選的物理方法包括加熱核酸直到它完全地(〉99%)變性。典型的熱變性包括「/人約8(TC到約105。C的溫度范圍，幾秒到數(shù)分鐘的時(shí)間范圍。作為對(duì)變性的選擇，目標(biāo)核酸可以在樣品中以單鏈形式存在，例如，單鏈RNA或DNA病毒。變性的核酸鏈然后在便于引物和探針與單一核酸鏈結(jié)合的條件下與預(yù)選的寡核苷酸引物孵育，任選地，與標(biāo)記的寡核苷酸(在此稱為"探針")孵育，以檢測(cè)擴(kuò)增的序列。如本領(lǐng)域已知的，選擇引物使得它們沿雙鏈體序列的相對(duì)位置是這樣的當(dāng)延伸產(chǎn)物從它的模板(互補(bǔ)物)分離時(shí)，從一個(gè)引物合成的延伸產(chǎn)物充當(dāng)了另一個(gè)引物的延伸的模板來(lái)產(chǎn)生預(yù)定長(zhǎng)度的復(fù)制鏈。HCV的擴(kuò)增本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)擴(kuò)增HCV的NS5B區(qū)域的至少一部分來(lái)測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，對(duì)于多種HCV種的每一種而言，所述NS5B區(qū)域指示該種的型和/或亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)提供筒并寡核苷酸PCR引物的混合物，所述簡(jiǎn)并寡核苦酸PCR引物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從大約核普酸8245到大約8269互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核普酸序列[例如，正向引物FF1和/或FF2]或其互補(bǔ)物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苦酸8616到大約8641互補(bǔ)[例如，反向引物RR1]互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物，以及(b)擴(kuò)增NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列。在具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核普酸PCR引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域乂人核普酸8256到8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[例如，CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5.5]或其互補(bǔ)物；以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的核苦酸8611到8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[例如，CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5]或其互補(bǔ)物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由一個(gè)或多個(gè)下式定義的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:6:5'-TGGSBTTYKCNTAYGAYACYMGNTG-3'SEQIDNO:5:5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'在又一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由一個(gè)或多個(gè)下式定義的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:3:5'-TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'SEQIDNO:4:5'隱TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'SEQIDNO:5:5'國(guó)GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'核酸的測(cè)序以上描述的DNA的擴(kuò)增將產(chǎn)生用于測(cè)序的豐富的DNA資源。如上所述制備的多核苷酸才莫板使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可用和已知的用于測(cè)序核苷酸的多種方法的任一種來(lái)測(cè)序。用于測(cè)序核苷酸的多種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可用和已知的，其中的4壬何一種都可以用于本發(fā)明的方法中。一種7>知的測(cè)序方法是Sangeretal.,PNAS(USA)74(12):5463-5467(1977)首先描述的"鏈終止"法，在Sequenase2.0產(chǎn)品資料(AmershamLifeSciences,Cleveland)中得到詳細(xì)描述，并且近來(lái)在歐洲專利EP-B1-655506中得到更為《子細(xì)地描述，它們的內(nèi)容通過(guò)引用全部合并在此。在該方法中，要測(cè)序的DNA被分離，變?yōu)閱捂湹?，并置入四個(gè)容器中。在每個(gè)容器中有復(fù)制DNA鏈的必需組分，包括才莫板依賴性DNA聚合酶、與要測(cè)序的DNA的測(cè)序起始位點(diǎn)互補(bǔ)的短引物分子以及每種堿基A、C、G和T的脫氧核糖核苷酸三磷酸鹽，處在有助于引物和要測(cè)序的DNA之間的雜交以及雜交的引物的鏈延伸的緩沖劑中。此外，每個(gè)容器含有少量的一種雙脫氧核苦酸三磷酸鹽，例如雙脫氧腺。票呤核苦三磷酸鹽("ddA")、雙脫氧鳥(niǎo)。票呤核苷三磷酸鹽("ddG")、雙脫氧胞嘧啶核苦三磷酸鹽("ddC")、雙脫氧胸腺嘧啶核苦三磷酸鹽("ddT")。在每個(gè)容器中，每段分離的DNA均與引物雜交。然后延伸引物，一次一個(gè)堿基來(lái)形成與才莫板DNA互補(bǔ)的新的核酸聚合物。當(dāng)雙脫氧核苷酸被摻入延伸聚合物中時(shí)，就阻止了聚合物的進(jìn)一步延伸。因而，在每個(gè)容器中，形成了一組特定長(zhǎng)度的經(jīng)延伸的聚合物，這指出與該容器中雙脫氧核苷酸相應(yīng)的核苷酸的位置。然后使用凝膠電泳評(píng)估這些組次的聚合物來(lái)確定序列。多核苷酸的測(cè)序可以使用單鏈或雙鏈DNA來(lái)進(jìn)行。用于引物延伸的聚合酶的使用需要單鏈DNA模板。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用雙鏈DNA以獲得測(cè)序結(jié)果的確證性相反鏈確認(rèn)。雙鏈DNA模板可以使用堿或熱變性來(lái)將兩條互補(bǔ)DNA模板分離成單鏈來(lái)測(cè)序。在聚合期間，每個(gè)DNA模板分子被復(fù)制一次形成互補(bǔ)的經(jīng)引物延伸的鏈。利用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(例如，Taq、Bst、Tth或VentDNA聚合酶)容許雙鏈DNA模板在測(cè)序反應(yīng)中通過(guò)熱變性、引物退火、延伸和雙脫氧終止的交替周期反復(fù)循環(huán)。該循環(huán)過(guò)程有效地?cái)U(kuò)增了少量的輸入DNA模板來(lái)產(chǎn)生用于測(cè)序的足夠的模板。測(cè)序也可以對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物直接進(jìn)4亍。雖然對(duì)經(jīng)擴(kuò)增的DNA的克隆是相對(duì)直接，但是PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序便于并加快了序列信息的獲取。只要PCR反應(yīng)產(chǎn)生分立的擴(kuò)增產(chǎn)物，它將可用于直接測(cè)序。與克隆PCR產(chǎn)物并測(cè)序單獨(dú)的克隆的方法相比，直接分析PCR產(chǎn)物的序列的方法一般地不受TaqDNA聚合酶的相對(duì)高差錯(cuò)率的影響。差錯(cuò)可能隨機(jī)地分布在整個(gè)分子上。因而，擴(kuò)增產(chǎn)物的絕大多數(shù)將由正確的序列組成。PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序相對(duì)于測(cè)序克隆的PCR產(chǎn)物具有的優(yōu)勢(shì)在于(1)它容易標(biāo)準(zhǔn)化，因?yàn)樗遣蝗Q于活細(xì)胞的使用的簡(jiǎn)單的酶過(guò)程，以及(2)對(duì)于每個(gè)樣品僅需要測(cè)定單個(gè)序列。本發(fā)明中使用的擴(kuò)增方法也可以同時(shí)地連同測(cè)序來(lái)^f吏用。同時(shí)地?cái)U(kuò)增和測(cè)序的方法是本領(lǐng)域公知的，包括聯(lián)合的擴(kuò)增和序列(CAS)(由RuanoandKidd,Proc.Nat'l.Acad.Sci.(USA)88(7):2815-2819(1991)以及在美國(guó)專利No.5,427,911中描述，通過(guò)引用將它們合并在此)，以及CLIP擴(kuò)增和測(cè)序(在美國(guó)專利NO.6,007,983和J.Clin.Microbiology41(4);1586-1593(April2003)中描述，通過(guò)引用將它們合并在此)。CLIP測(cè)序使得早先產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增片段同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和直接測(cè)序。在CAS測(cè)序中，在第一反應(yīng)階段用兩個(gè)引物處理樣品，并進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)10,000到100,000倍擴(kuò)增。然后在擴(kuò)增反應(yīng)的指數(shù)期添加ddNTP,繼續(xù)反應(yīng)持續(xù)另外的熱循環(huán)數(shù)來(lái)產(chǎn)生鏈終止的測(cè)序片段。CAS法要求中途添加試劑(ddNTP試劑)，這引入了差錯(cuò)或污染的機(jī)會(huì)并提高了將用于自動(dòng)化的任何設(shè)備的復(fù)雜度。因而CAS方法優(yōu)選地與CLIP測(cè)序聯(lián)合起來(lái)，這使得早先產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增片段同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和直接測(cè)序。例如，利用CLH^方法的同時(shí)擴(kuò)增和測(cè)序可以使用在此描述的試劑，在類(lèi)似于商業(yè)上可獲得的試劑盒如TRUGENEHCV基因分型試劑盒(BayerHealthCareLLC)中描述的條件下來(lái)實(shí)現(xiàn)。在特定的方面，本發(fā)明涉及HCV的測(cè)序。在本發(fā)明的方法中使用的雙鏈DNA才莫板可以來(lái)自例如單鏈或雙鏈的DNA或RNA(包括信使RNA)。此外，DNA模板可以是含有DNA的一條鏈和RNA的一條鏈的DNA-RNA雜合體的形式。也可以采用任何這些核酸的混合物，或者要擴(kuò)增的特定核酸序列可以只是較大分子的一部分，或可以首先作為分立的分子存在，從而所述具體序列構(gòu)成整個(gè)核酸。對(duì)HCV進(jìn)行基因分型本發(fā)明包括用于對(duì)懷l^含有或已知含有HCV的樣品中的HCV進(jìn)行基因分型的新的方法和試劑。本發(fā)明的測(cè)序引物由特異于HCV的NS5b區(qū)域的寡核苷酸組成，它可以用于擴(kuò)增和測(cè)序一部分HCV。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，從懷l是感染HCV的個(gè)體獲得的樣品;故用于回收RNA或DNA形式的病毒RNA。從樣品獲得的病毒HCVRNA被逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或其他基于引物延伸的方法來(lái)擴(kuò)增cDNA模板。產(chǎn)生的擴(kuò)增片段然后首先利用循環(huán)測(cè)序方法或CLIP雙向測(cè)序來(lái)用一組引物測(cè)序，所述引物包含期望的HCV的NS5b區(qū)域。本發(fā)明的一個(gè)特定的方面是擴(kuò)增和基因分型懷疑含有HCV的樣品中的HCV的一部分NS5b區(qū)域的方法。HCV的測(cè)序本發(fā)明一般地涉及用于對(duì)測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種進(jìn)行基因分型的改進(jìn)的方法和試劑。在本發(fā)明的某些方面，本發(fā)明涉及擴(kuò)增和測(cè)序樣品中HCV種的NS5B區(qū)域的一部分并確定它的基因型的方法。一般地，本發(fā)明涉及通過(guò)測(cè)序HCV的NS5B區(qū)域的至少一部分來(lái)測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)的基因型的方法，對(duì)于多種HCV種的每一種而言，所述NS5B區(qū)域指示該種的型或亞型。引物。本發(fā)明的測(cè)序引物包含正向引物和反向引物，它可以用可沖全測(cè)標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。對(duì)于最常見(jiàn)的測(cè)序儀器，熒光標(biāo)記是期望的，然而也可以采用其他標(biāo)記類(lèi)型，包括有色的、產(chǎn)色的、發(fā)熒光的(包括化學(xué)發(fā)光的)和放射性標(biāo)記。引物組合可以包括適合于逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增或測(cè)序的其他試劑，并且當(dāng)然地可以包括用于分析的HCV遺傳物質(zhì)。雖然以下公開(kāi)的本發(fā)明的測(cè)序引物優(yōu)選地選自具有以下公開(kāi)的相同序列的引物，但是還是認(rèn)為本發(fā)明包括具有等價(jià)的特異性和功能的簡(jiǎn)并序列，其可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)和構(gòu)建。具體而言，測(cè)序引物包括具有15或更多個(gè)核苷酸的上述引物的片段。測(cè)序引物也可以包含具有16、17、18、19或20或更多個(gè)核苷酸的上述引物的片段。這種簡(jiǎn)并序列的i殳計(jì)和構(gòu)建是本領(lǐng)域技術(shù)人員/>知的。與擴(kuò)增引物相反，由于如果測(cè)序引物相對(duì)于3'堿基不具有相同位置，則它們不能被混合在一起，因此只有特定的簡(jiǎn)并堿基被標(biāo)注出來(lái)，然而要理解的是也可以對(duì)3'位置進(jìn)行修飾。例如，5'長(zhǎng)度可以被改變以包括序列保守性更高的區(qū)域，或者以改變解鏈溫度和結(jié)合嚴(yán)格度。如果使用原始的引物(primaryprimer)發(fā)現(xiàn)成功率是足夠的，非簡(jiǎn)并的引物對(duì)是優(yōu)選的。反應(yīng)條件也可能顯著地影響性能。測(cè)序引物的可能的修飾在以下的小節(jié)和實(shí)施例中說(shuō)明。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括首先測(cè)定指示所述HCV種的基因型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列。指示其基因型的HCV的NS5b區(qū)域的部分是與多種HCV種的核苷酸序列相對(duì)應(yīng)的相同區(qū)域，所述核苷酸序列指示多種HCV種的每一種的基因型。因而，本發(fā)明的一個(gè)方面是鑒定在HCV種之中共有的、指示特定HCV種的型和/或亞型的區(qū)域。因而通過(guò)將上述步驟中測(cè)定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與已知序列/基因型的多種HCV種之一的基因型相關(guān)聯(lián)，任何HCV種的這個(gè)區(qū)域的測(cè)序能夠確定該種的型和亞型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)測(cè)定指示所述HCV種的基因型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有基因型1、2、3、4、5和6的每種HCV種的相應(yīng)核苷酸序列指示所述種的基因型；以及(b)將(a)中測(cè)定的NS5b區(qū)域的所述部分的核普酸序列與HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關(guān)聯(lián)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)測(cè)定指示所述HCV種的基因型和亞型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有基因型1、2、3、4、5和6以及表1中所列每種亞型的每種HCV種的相應(yīng)核苷酸序列指示所述種的基因型和亞型；以及(b)將(a)中測(cè)定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與基因型1、2、3、4、5和6之一以及表l中所列亞型之一相關(guān)耳關(guān)。在上述方法的一個(gè)特定實(shí)施方案中，HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由SEQIDNO:1的/人核苷酸位置大約8344到大約8547的區(qū)i或組成。在上述方法的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由SEQIDNO:1的乂人核苷酸位置8344到8547的區(qū)域組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序？I物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苦酸序列指示所述種的基因型；(b)測(cè)定指示所述種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；并(c)將(b)中測(cè)定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述多種HCV種之一的基因型相關(guān)聯(lián)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序虧1物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一；(b)測(cè)定指示所述種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；并(c)將(b)中測(cè)定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苦酸序列與HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關(guān)聯(lián)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序弓1物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一和表1中所列亞型之一；(b)測(cè)定指示所述種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苦酸序列；并(c)將(b)中測(cè)定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與HCV基因型和亞型[例如，HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1所列亞型之一]相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域/人大約核芬酸8256到大約8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[例如，CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互補(bǔ)物，和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苷酸8611到大約8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苦酸序列[例如，CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5]或它的互4卜物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述筒并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從核苷酸8256到8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[例如，CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互補(bǔ)物，和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的核苦酸8611到8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列[例如，CLIP測(cè)序引物M-NS5b-Cy5]或它的互補(bǔ)物。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含由一個(gè)或多個(gè)下式定義的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3';和SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。實(shí)施例1-通過(guò)測(cè)序的HCVNS5b基因分型以下的這個(gè)實(shí)施例描述了為了確定基因型和亞型而產(chǎn)生丙型肝炎病毒的NS5b區(qū)域中的204個(gè)堿基對(duì)的片^a的雙向序列的實(shí)-驗(yàn)室方案。一般地，如廠家描述的使用QiagenQIAampViralRNAMini試劑盒從血漿樣品提取病毒HCVRNA。筒要地，使用隨機(jī)六聚體逆轉(zhuǎn)錄提取的RNA樣本。在cDNA合成之后，使用特異性引物擴(kuò)增10juLcDNA模板來(lái)產(chǎn)生398個(gè)堿基對(duì)的擴(kuò)增子。在PCR擴(kuò)增之后，進(jìn)行染料-引物CLIP測(cè)序反應(yīng)。CLIP反應(yīng)通過(guò)使用各自用不同的熒光染料(Cy5.5,Cy5)標(biāo)記的正向(有義)和反向(反義)引物、鏈延伸試劑和四種鏈終止雙脫氧核苷酸三磷酸鹽(ddNTP)之一雙脫氧腺噤呤核苷(ddATP)、雙脫氧胞嘧咬核苦(ddCTP)、雙脫氧鳥(niǎo)。票呤核苷(ddGTP)或雙脫氧胸腺嘧啶核苷(ddTTP)三磷酸來(lái)同時(shí)地測(cè)序DNA的兩條鏈。通過(guò)添加樣品和具有對(duì)ddNTP的高親和性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶來(lái)啟動(dòng)反應(yīng)。隨著反應(yīng)混合物被熱循環(huán)，引物與模板DNA雜交并被延伸，然后通常在沿著目標(biāo)DNA序列的某處終止。四個(gè)CLIP反應(yīng)產(chǎn)生在兩個(gè)CLIP引物之間的目標(biāo)的正向和反向序列。反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，從每個(gè)引物產(chǎn)生高水平的鏈終止反應(yīng)產(chǎn)物。在完成循環(huán)程序之時(shí)，終止加載染料溶液;故添加到每個(gè)反應(yīng)管，加熱反應(yīng)來(lái)分離雙鏈DNA片段。每個(gè)反應(yīng)的一部分然后加載到MicroCel500盒的頂部，其含有具有特定孔徑大小的成形基質(zhì)的超薄的垂直聚合的聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠含有高濃度的尿素來(lái)將DNA片段維持在單鏈的變性狀態(tài)。緩沖溶液保持與超薄凝膠的頂部和底部接觸。施加高壓電場(chǎng)，促使帶負(fù)電的DNA片段遷移穿過(guò)凝膠走向陽(yáng)極。DNA片段的遷移速度與聚丙烯酰胺基質(zhì)形成的孔洞大小以及DNA片段大小相關(guān)，更小的片段遷移更快。接近聚丙烯酰胺凝膠的底部，激光束激發(fā)與移動(dòng)通過(guò)激光的DNA片段連接的熒光染料，檢測(cè)器測(cè)量焚光染料產(chǎn)生的光線數(shù)量和波長(zhǎng)。然后測(cè)序儀收集這種光學(xué)測(cè)量值并傳輸?shù)奖４鏀?shù)據(jù)的工作站。每個(gè)測(cè)序反應(yīng)需要四條泳道，每個(gè)泳道對(duì)應(yīng)四種鏈終止雙脫氧核苷酸(ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)的每一種。組合正向和反向CLIP序列，并與"最佳匹配的"參考序列(W)的序列比較。操作員檢查標(biāo)志位置處的比對(duì)并根據(jù)需要編輯堿基。軟件為每個(gè)樣品生成HCVNS5b報(bào)告。逆轉(zhuǎn)錄(cDNA合成)根據(jù)以下方案從來(lái)自樣品的基因組RNA合成cDNA。以下描述的RT試劑(除了Superscript和RNase抑制物)被渦旋和微離心來(lái)回收體積。制備HCVNS5bRT主混合物，使用根據(jù)以下式子計(jì)算的體積<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>PCR擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增如下進(jìn)行。制備PCR試管并對(duì)樣品標(biāo)記。以下描述的PCR試劑(除了AmpliTaqGold酶)被渦旋和微離心來(lái)回收體積。制備簡(jiǎn)并引物的混合物，該簡(jiǎn)并引物-皮設(shè)計(jì)來(lái)擴(kuò)增多個(gè)臨床相關(guān)的HCV種，具有以下的核苷酸序列正向PCR引物(FF-1):5'-TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'(SEQIDNO:7)正向PCR引物(FF-2):5'-TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'(SEQIDNO:8)反向PCR引物(RR1):5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'(SEQIDNO:9)使用試劑體積的工作表來(lái)制備PCR主混合物。根據(jù)以下公式計(jì)算體積<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>PCR主混合物(40juL)等分到每個(gè)標(biāo)記的PCR試管中。RTcDNA(10juL)添加到裝有PCR試劑的適當(dāng)標(biāo)記的試管中，將試管置于被編程以進(jìn)行以下步驟的熱循環(huán)儀中HCVNS5bPCR程序<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>從熱循環(huán)儀取出PCR樣品，可在4。C保存最長(zhǎng)到兩周或進(jìn)行如下所述的CLIP測(cè)序。CLIP測(cè)序制備簡(jiǎn)并測(cè)序引物的混合物，該簡(jiǎn)并測(cè)序引物被設(shè)計(jì)來(lái)對(duì)多個(gè)臨床相關(guān)HCV種進(jìn)行測(cè)序，具有以下的核苷酸序列正向CLIP引物5'Cy5.5-5'TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3'(SEQIDNO:10)反向CLIP引物Cy5-5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'(SEQIDNO:ll)將必需數(shù)量的PCR螺紋管和帽子裝配在托架上并置于冷塊中。對(duì)每個(gè)樣品和對(duì)照的0.5mL管進(jìn)行標(biāo)記并置于冷塊中。從冷藏箱取出CLIP試劑(除了ThermoSequenase酶)，并在室溫下解凍。渦旋每種組分(除了ThermoS叫uenase酶)并快速旋轉(zhuǎn)來(lái)回收體積。4吏用10pL可調(diào)整吸移管，將3juL合適的CLIP終止混合物直接轉(zhuǎn)移到每個(gè)PCR管中各個(gè)孔柱底部。制備ThermoSequenase酶在ThermoSequenase稀釋緩沖液中的1:10稀釋液。使用由以下公式計(jì)算得到的試劑體積制備CLIP主混合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>20juLCLIP主混合物等分到每個(gè)標(biāo)記的試管中，并轉(zhuǎn)移到裝有CLIP試劑的試管中。PCR擴(kuò)增子(2|uL)添加到裝有CLIP主混合物的合適的試管中，短暫渦旋并微離心來(lái)收集試管底部的體積。將CLIP混合物(5nL)添加到冷塊中的4個(gè)終止試管的每一個(gè)中。CLIP擴(kuò)增/測(cè)序反應(yīng)在熱循環(huán)儀上根據(jù)以下方案進(jìn)行HCVNS5bCLIP<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>從熱循環(huán)儀取出試管，向每個(gè)試管添加停止加載染料(6]LiL),渦旋混合。試管放回?zé)嵫h(huán)儀并經(jīng)歷變性條件，如下HCVNS5b變性<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>從熱循環(huán)儀取出試管，保存或進(jìn)行凝膠電泳，如下所述。如廠家所描述的使用Long-ReadTower測(cè)序儀進(jìn)行凝膠電泳，使用以下的測(cè)序儀控制設(shè)置凝膠溫度(°C)60°C凝膠電壓(V)1800V激光功率(％)50%運(yùn)行時(shí)鐘(采樣間隔)0.5秒運(yùn)行時(shí)鐘(運(yùn)行持續(xù)時(shí)間)50分鐘分析配備有樣品和對(duì)照信息。實(shí)施例2-通過(guò)測(cè)序的HCVNS5b基因分型的性能特征評(píng)估使用以下試劑，基本上根據(jù)以上在實(shí)施例1中描述的基因分型分析，評(píng)估了HCVNS5b基因分型分析的性能特征。HCVNS5b特定試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>使用以下的樣品:樣品<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>分析精度分析為了確定本發(fā)明的方法和試劑的分析精確性，使用包含基因型1-5的25成員系列、包含基因型1-6的6成員系列、包含基因型4-10的12成員系列進(jìn)行分析，并分析了包含基因型1-6的15種其他的臨床樣品，結(jié)果與早先的基因型比較。使用以上實(shí)施例1中描述的方法對(duì)樣品進(jìn)行基因分型，與早先通過(guò)LiPA或TmGene5'NC基因分型或在樣品小節(jié)中詳述的另一種NS5b方法表征的相同樣品的基因型比較，來(lái)確定分析精確性。這項(xiàng)分析的結(jié)果在以下的表格中概述分析精確度數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>樣品ID預(yù)期的基因型(新命名)BRTLNS5B基因型GP6A畫(huà)C2(10,000c/mL)6a薩i圖國(guó)國(guó)圖圖圖圍醫(yī)所分析的總共58份精確性樣品產(chǎn)生了51個(gè)NS5b基因型結(jié)果?？捎肗S5b基因分型的51個(gè)中的51個(gè)或100%的樣品產(chǎn)生了在型水平上與早先確定的基因型一致的基因型。51個(gè)樣品中的48個(gè)在型和亞型水平上是一致的，51個(gè)樣品中的3個(gè)僅在型水平上是一致的(所有的3個(gè)根據(jù)LiPA是lb,根據(jù)NS5b是la)。7個(gè)樣品(5個(gè)基因型6a和2個(gè)基因型7c)未能擴(kuò)增，并且不能通過(guò)NS5b來(lái)進(jìn)行基因分型。獲得的分析。該分析表現(xiàn)出與i前在型水平上可用NS5bi行丄因分^的51個(gè)樣品的基因型結(jié)果100%—致。不能用NS5b進(jìn)行基因分型的七個(gè)樣品從這個(gè)評(píng)估階段中排除。所有7個(gè)不能進(jìn)行基因分型的樣品在這項(xiàng)評(píng)估的階段2中重復(fù)。備選RT-PCR引物對(duì)正在開(kāi)發(fā)中以擴(kuò)增基因型6a和7c,如以下連同階段2分析描述的，隨后被設(shè)計(jì)和分析。重現(xiàn)性分析為了確定本發(fā)明的HCVNS5b基因分型分析和試劑的重現(xiàn)性，由兩個(gè)操作員在兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)上對(duì)包含基因型1-10的總共22個(gè)樣品進(jìn)行分析，并對(duì)結(jié)果在型和亞型水平上的一致性進(jìn)行比較。還比較了對(duì)八個(gè)試-險(xiǎn)的每一個(gè)上的陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果。操作員之間的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>試驗(yàn)之間的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>分別由兩個(gè)操作員分析了22個(gè)樣品，產(chǎn)生了16種NS5b基因型。以上數(shù)據(jù)表明，NS5b基因分型分析在兩個(gè)操作員之間以及在兩個(gè)試驗(yàn)之間NS5b基因型在型和亞型水平上產(chǎn)生了16/16或100%的一致性。6個(gè)樣品(4個(gè)基因型6a和2個(gè)基因型7c)不能被兩個(gè)操作員擴(kuò)增或進(jìn)行基因分型。試驗(yàn)之間的重現(xiàn)性8個(gè)試驗(yàn)的8份陽(yáng)性對(duì)照之間一致性為100%。敏感性分析為了確定基因分型分析的敏感性水平，還如以下詳述的制備了基因型1-10的系列稀釋物。HCVNS5b敏感性系列稀釋物<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*根據(jù)供應(yīng)廠商提供的分析值證書(shū)制造敏感性系列稀釋物。隨后通過(guò)bDNA測(cè)定的病毒載荷被用于重新計(jì)算這些敏感性系列成員的標(biāo)稱值。**這個(gè)樣品通過(guò)LiPA和HCV5'NCTruGene基因分型確認(rèn)為2b，用NS5b基因分型確認(rèn)為lb基因型。它將被送到參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行附加的測(cè)試來(lái)解決基因型矛盾。上述數(shù)據(jù)表明，對(duì)基因型1-5的HCVNS5b基因分型分析滿足可接受的壽丈感性的^見(jiàn)定，因?yàn)?,000c/mL(192IU/mL)的HCV基因型1-5被精確地和可重現(xiàn)地基因分型。然而，HCVNS5b基因分型分析并不能始終對(duì)HCV基因型6的樣品進(jìn)行基因分型。1,000c/mL(192IU/mL)的HCV基因型6樣品始終不能被基因分型。因而，由于在制備基因型6-10的敏感性稀釋物中的問(wèn)題，1,000c/mL的敏感性不能由這些數(shù)據(jù)確定。因而NS5b基因分型分析對(duì)于1,000c/mL的基因型l-5是精確的，同時(shí)一致性有所變化。實(shí)施例3-通過(guò)測(cè)序的HCVNS5b基因分型的性能特征評(píng)估分析精度分析將對(duì)一小部分階段1驗(yàn)證精確性樣品進(jìn)行分析，并將結(jié)果與之前的基因型進(jìn)行比較，所述樣品由包含基因型1-6的6成員系列、包含基因型4-10的12成員系列、以及包含基因型4、5和6的4個(gè)其他臨床樣品組成。樣品早先通過(guò)LiPA或TmGene5'NC基因分型或在采樣小節(jié)詳述的另一種NS5b方法來(lái)表征。分析精確度數(shù)據(jù)<table>complextableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>上述數(shù)據(jù)顯示了在來(lái)自4個(gè)試驗(yàn)的4份陽(yáng)性對(duì)照中的100%—致性。敏感性分析如以下詳述的制備基因型l-6的系列稀釋物:敏感性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>*這個(gè)樣品通過(guò)LiPA和HCV5'NCTruGene基因分型確認(rèn)為2b,用NS5b確認(rèn)為lb基因型。它將被送到參比實(shí)驗(yàn)室用于附加的測(cè)試來(lái)解決基因型矛盾。這項(xiàng)分析對(duì)1,000c/mL(192IU/mL)的基因型1-5產(chǎn)生了精確的和可重現(xiàn)的基因分型，并對(duì)5,000c/mL(962IU/mL)的基因型6產(chǎn)生了精確的和可重現(xiàn)的基因分型。權(quán)利要求1.一種測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，包括(a)測(cè)定指示測(cè)試樣品中存在的所述HCV種的基因型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中多種HCV種的相應(yīng)核苷酸序列指示所述HCV種的特有基因型；(b)將(a)中測(cè)定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述多種HCV種之一的基因型相關(guān)聯(lián)。2.權(quán)利要求l的方法，其中HCV的NS5b區(qū)域的所述部分基本上由從SEQIDNO:1的大約核苷酸位置8344到大約8547的區(qū)域組成。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由從SEQIDNO:l的核苷酸位置8344到8547的區(qū)域組成。4.一種測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，包4舌(a)測(cè)定指示存在于所述測(cè)試樣品中的所述HCV種的基因型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6的多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苦酸序列指示所述HCV種的特有基因型；(b)將(a)中測(cè)定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關(guān)耳關(guān)。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由從SEQIDNO:1的大約核苷酸位置8344到大約8547的區(qū)域組成。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由從SEQIDNO:1的核苷酸位置8344到8547的區(qū)域組成。7.—種測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型和亞型的方法，包括(a)測(cè)定指示存在于測(cè)試樣品的所述HCV種的基因型和亞型的HCV的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6以及表1所列的每一種HCV亞型的相應(yīng)核香酸序列指示所述HCV種的特有基因型和亞型；(b)將(a)中測(cè)定的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1中所列所述亞型之一相關(guān)耳關(guān)。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由從SEQIDNO:1的大約核普酸位置8344到大約8547的區(qū)域組成。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述HCV的NS5b區(qū)域的部分基本上由從SEQIDNO:l的核普酸位置8344到8547的區(qū)域組成。10.—種測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，包4舌(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苷酸序列指示所述HCV種的特有基因型；(b)測(cè)定指示存在于測(cè)試樣品中的所述HCV種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核普酸序列；并(c)將(b)中測(cè)定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與所述多種HCV種之一的基因型相關(guān)聯(lián)。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從大約核普酸8256到大約8278互補(bǔ)的筒并核苷酸序列或其互補(bǔ)物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苷酸8611到大約8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述簡(jiǎn)并寡核普酸測(cè)序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從核苷酸8256到8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:l的核苷酸8611到8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核普酸序列或其互補(bǔ)物。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述筒并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含由下式定義的筒并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC國(guó)3';和SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。14.一種測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，包4舌(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的筒并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苷酸序列指示HCV基因型l、2、3、4、5和6之一；(b)測(cè)定指示存在于所述測(cè)試樣品中的所述HCV種的基因型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；以及(c)將(b)中測(cè)定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相關(guān)耳關(guān)。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述筒并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從大約核苷酸8256到大約8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苷酸8611到大約8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從核苷酸8256到8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:l的核苷酸8611到8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苦酸序列或其互補(bǔ)物。17.權(quán)利要求14的方法，其中簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含由下式定義的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:1:5'畫(huà)TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3';和SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。18.—種測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法，包^t舌(a)提供能夠產(chǎn)生多種HCV種的NS5b區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列的筒并寡核普酸測(cè)序引物的混合物，其中所述多種HCV種的每一種的相應(yīng)核苦酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一和所述亞型之一；(b)測(cè)定指示存在于測(cè)試樣品中的所述HCV種的基因型和亞型的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列；以及(c)將(b)中測(cè)定的所述HCV種的NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列與HCV基因型和亞型相關(guān)聯(lián)。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從大約核苷酸8256到大約8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核苦酸8611到大約8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從核苷酸8256到8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物，以及與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:l的核苷酸8611到8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物。21.權(quán)利要求18的方法，其中所述簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物包含由下式定義的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3';和SEQIDNO:2:5'國(guó)VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC畫(huà)3'。22.—種擴(kuò)增測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的NS5b區(qū)域的一部分的方法，包括(a)提供簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物，它包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域從大約核普酸8245到大約8269互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物；和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的大約核香酸8616到大約8641互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物；并(b)擴(kuò)增NS5b區(qū)域的所述部分的核苷酸序列。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物包含與多種HCV種的NS5b區(qū)域乂人核苷酸8256到8278互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物；和與多種HCV種的NS5b區(qū)域從SEQIDNO:1的核苷酸8611到8633互補(bǔ)的簡(jiǎn)并核苷酸序列或其互補(bǔ)物。24.權(quán)利要求22的方法，其中所述簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由下式定義的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:6:5'-TGGSBTTYKCNTAYGAYACYMGNTG-3'SEQIDNO:5:5'誦GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'25.權(quán)利要求22的方法，其中所述簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由下式定義的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，或其互補(bǔ)物SEQIDNO:3:5'國(guó)TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'SEQIDNO:4:5'隱TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'SEQIDNO:5:5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'26.—種簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由一個(gè)或多個(gè)下式定義的多種寡核苷酸PCR引物SEQIDNO:3:5'-TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'SEQIDNO:4:5'-TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'SEQIDNO:5:5'-GARTAYCTVGTCATRGCITCYGTRAA-3'27.權(quán)利要求26的簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定義的多種寡核苷酸PCR引物SEQIDNO:3:5'-TGGGGTTCKCGTATGAYACCCGCTG-3'28.權(quán)利要求26的簡(jiǎn)并寡核普酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定義的多種寡核苷酸PCR引物SEQIDNO:4:5'隱TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3'29.權(quán)利要求26的簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定義的多種寡核苷酸PCR引物SEQIDNO:5:5'-TGGGGTTCKCITATGAYACYMGITG-3"30.—種簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物，其中所述混合物包含由一個(gè)或多個(gè)下式定義的多種寡核苷酸測(cè)序引物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3';和SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。31.權(quán)利要求30的簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定義的多種寡核苷酸測(cè)序引物SEQIDNO:1:5'-TATGAYACCCGCTGYTTYGAYTC-3';和32.權(quán)利要求30的簡(jiǎn)并寡核苷酸測(cè)序引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定義的多種寡核苷酸測(cè)序引物SEQIDNO:2:5'-VGTCATRGCITCYGTRAAGGCTC-3'。全文摘要本發(fā)明涉及用于測(cè)定測(cè)試樣品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)種的基因型的方法和試劑。本發(fā)明更特別地涉及簡(jiǎn)并擴(kuò)增和測(cè)序引物的混合物，以及使用這種引物的方法，所述引物與多種HCV種互補(bǔ)，并且能夠產(chǎn)生HCV的NS5B的一個(gè)區(qū)域的核苷酸序列信息，對(duì)于每個(gè)種而言，所述HCV的NS5B區(qū)域指示是在樣品中存在的種的型和/或亞型。文檔編號(hào)C12N5/08GK101341247SQ200680048422公開(kāi)日2009年1月7日申請(qǐng)日期2006年12月22日優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日發(fā)明者C·B·M·范德米爾,J·赫納蒂塞恩,M·G·H·M·貝爾德,R·古夫,T·格托赫申請(qǐng)人:西門(mén)子醫(yī)療保健診斷公司