專利名稱：：處理生物質(zhì)的酶及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及處理生物質(zhì)的酶及方法，且更具體地涉及一種水溶性的、且還在至少約80。C的溫度下以及低于約2的pH下顯示最佳酶活性的酶。
背景技術(shù)：
：人們久已知曉的是，在生物精煉安排(biorefineryarrangements)中利用木質(zhì)素纖維素殘余物的纖維素和半纖維素中所含的糖類來生產(chǎn)燃料和增值的化學(xué)藥品是令人滿意的。木質(zhì)素纖維素殘余物包括比如玉米秸稈這樣的材料，其由主要含有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的異質(zhì)三維基質(zhì)組成。人們早就知道，由于木質(zhì)素纖維素的異質(zhì)性質(zhì)，纖維素和半纖維素并不能直接接近比如纖維素酶這樣的相對較大的分子。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了酸預(yù)處理法來水解和除去半纖維素，并由此提高基質(zhì)中的纖維素對由纖維素酶發(fā)起的纖維素分解攻擊的易感性。盡管該方法已經(jīng)在一定程度上取得成功，但長久以來人們就知道由于所需的高溫和壓力，這些酸預(yù)處理方法需要高資金和運(yùn)作成本，并且依賴于該方法所提供的預(yù)處理嚴(yán)重程度，這些預(yù)處理方法還產(chǎn)生顯著量的毒性分解產(chǎn)物。伴隨該相同方法的另一缺陷是，這些相同的熱分解產(chǎn)物代表著本能夠在隨后的發(fā)酵中被利用的潛在糖類的損失。因此，本申請的主題是，一種處理生物質(zhì)的方法，以及一種酶，當(dāng)其與一種預(yù)處理方法共同利用時(shí)，它可降低酸預(yù)處理的嚴(yán)重程度，并降低能源和資金成本，以允許提高半纖維素來源的糖類的產(chǎn)量，以及將毒性副產(chǎn)物的形成降到最低。發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面涉及分離自嗜極端微生物的酶，其在大于約80°C的溫度以及低于約2的pH下表現(xiàn)最佳酶活性。本發(fā)明的另一方面涉及源自酸熱脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)ATCC27009的半纖維素酶。本發(fā)明另一方面涉及用于多糖水解的酶。本發(fā)明還有另一方面涉及可用于同時(shí)糖化和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖類轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物的酶。本發(fā)明又一另一方面涉及處理生物質(zhì)的方法，其包括提供具有生物質(zhì)糖類的生物質(zhì)源、用源自酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009的水溶性半纖維素酶預(yù)處理生物質(zhì)以產(chǎn)生終產(chǎn)物的步驟。本發(fā)明另一方面涉及制備半纖維素酶的方法，其包括以下步驟提供酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009源；在帶有上清液的微生物營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009;從營養(yǎng)培養(yǎng)基上清液分離酸熱脂環(huán)酸桿菌細(xì)胞；以及從營養(yǎng)培養(yǎng)基上清液回收和純化源自酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009的半纖維素酶。此外，本發(fā)明的另一方面還涉及水解多糖的方法，其包括提供源自微生物的水溶性半纖維素酶以及在低于約2的pH下用該水溶性半纖維素酶進(jìn)行多糖的水解的步驟。本發(fā)明的這些和其它方面將在下文中得到更為詳細(xì)的描述。附圖簡述以下參考下列附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。圖1是溫度對如本發(fā)明所提供的纖維素酶活性的作用的圖示說明。圖2是在pH4.0下溫度對如本發(fā)明所提供的纖維素酶活性的作用的圖示說明。圖3是在60°C的溫度下pH對本發(fā)明的纖維素酶活性的作用的圖示說明。圖4是在60°C的溫度下pH對本發(fā)明的木聚糖酶活性的作用的圖示說明。優(yōu)選實(shí)施方案詳述如下文所述，本發(fā)明涉及分離自嗜極端微生物的酶，其在大于約80。C的溫度以及小于約2的最佳pH下表現(xiàn)最佳酶活性。在本發(fā)明中，該酶是源自酸熱脂環(huán)酸桿菌的半纖維素酶和/或木聚糖酶，且其中該生物進(jìn)一步被鑒定為ATCC27009。該酶，如下文中所討論的，似乎在約為1的pH下表現(xiàn)酶活性。而且，該相同的酶具有至少約120kDa的分子量。在本發(fā)明中，如所公開的，該酶可用于同時(shí)糖化和發(fā)酵過程和/或順序水解和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖類轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物。此外，如本文所述的該酶可用于生物質(zhì)漿的預(yù)處理以降解存在于生物質(zhì)漿中的水溶性或水不溶性寡聚體和/或多糖以產(chǎn)生終產(chǎn)物。如下文所-使用的，術(shù)語"嗜才及端樣i生物，，意指，可以在比如沸水、水點(diǎn)、電池用酸(batteryacid)或海洋底部這樣的人類認(rèn)為極端的條件下生存并茁壯生長的生物。這樣的微生物的例子包括但不限于，在最高至235。F的溫度下生長的延胡索酸火葉菌(Pyrolobusfumarii)，在-20。C(-4。F)的溫度下存活的Psychrobactercryopegella,在核反應(yīng)器中存活的耐放射異常球菌(Deinococcusmdiodurans),在300倍于海平面大氣壓力的壓力下茁壯生長的Photobacteriumprofundum,以及在pH0(與電池用酸相同)下生活的嗜苦古菌(Picrophilustorridus)?？梢园l(fā)現(xiàn)這些微生物的環(huán)境包括沸騰的溫泉、深海洋熱孔、水河、鹽灘和核反應(yīng)器。本發(fā)明中所使用的微生物可通過天然和人工來源或從培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)商業(yè)獲得。在本發(fā)明中，培養(yǎng)優(yōu)選在高于40。C的溫度和低于約5的pH下，且更優(yōu)選高于50。C和低于pH4，和最優(yōu)選高于55。C和低于pH3.5,以及有氧條件下進(jìn)行。盡管培養(yǎng)時(shí)間段依賴于所使用的pH、溫度和營養(yǎng)培養(yǎng)基而變化，但12小時(shí)至幾日的時(shí)間段通常將得到令人滿意的結(jié)果。如本文所使用的，酸熱脂環(huán)酸桿菌被定義為可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Manassas,Virginia的微生物，且其被筌定為酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009。如本文所使用的，短語"酶活性"意指，由酶導(dǎo)致發(fā)生的反應(yīng)。酶是由所有活生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其介導(dǎo)、導(dǎo)致和/或促進(jìn)將一種化學(xué)藥品改變成另一種類型的化學(xué)藥品的反應(yīng)而其本身并不^皮改變或破壞。在本申請的上下文中，詞語"最佳"當(dāng)與術(shù)語"酶活性"組合使用時(shí)意指，對于給定的最終結(jié)果使酶能夠表現(xiàn)最好且最快的最令人滿意的條件。最佳酶活性可受包括溫度、pH以及鹽濃度的條件的影響。如本文所使用的，詞語"木聚糖酶"意指，通過破壞構(gòu)成半纖維素分子主鏈的木糖糖類之間的化學(xué)鍵，或通過破壞半纖維素側(cè)鏈中的木糖糖類之間的鍵，來使半纖維素分裂開的酶。如本文所使用的詞語"多糖"應(yīng)意指，通過化學(xué)鍵聯(lián)接在一起的糖(可以是相同的糖類或不同糖類)鏈。多糖可由帶或不帶側(cè)鏈的這些糖類的直鏈組成。多糖的例子包括淀粉、果膠、纖維素和半纖維素。本申請上下文中的詞語"水解"應(yīng)意指，其中水與分子發(fā)生的并將該分子打破成至少兩部分的化學(xué)反應(yīng)。如本文所使用的，短語"生物質(zhì)糖類"應(yīng)意指，來自于比如纖維素和半纖維素這樣的生物質(zhì)組分分解的糖類。生物質(zhì)糖類的例子包括但不限于葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。下文中的短語"同時(shí)糖化和發(fā)酵過程，，應(yīng)意指，從可能已經(jīng)或未經(jīng)化學(xué)方法預(yù)處理的生物質(zhì)制備燃料或比如乙醇這樣的化學(xué)藥品的方法，且其中纖維素酶和/或半纖維素酶酶類被用于將生物質(zhì)多糖分解為糖類(糖化)；以及這些糖類^皮微生物源發(fā)酵成產(chǎn)物燃料或化學(xué)藥品(發(fā)酵)。這兩個(gè)過程在相同的反應(yīng)容器中同時(shí)發(fā)生(同時(shí))。如本申請中所使用的短語"終產(chǎn)物"在下文中應(yīng)意指，通過化學(xué)或酶反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)藥品。依賴于處理時(shí)間和反應(yīng)條件，本發(fā)明預(yù)期的終產(chǎn)物的例子包括木糖和/或一種至幾種木糖分子。本發(fā)明上下文中的詞語"生物質(zhì)"應(yīng)意指，植物和比如玉米稈、小麥稈以及比如鋸屑等這樣的木頭副產(chǎn)物的其他纖維素材料。在本申請上下文中，短語"生物質(zhì)漿的預(yù)處理"應(yīng)意指，為隨后將生物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)楸热缫掖歼@樣的燃料對生物質(zhì)的準(zhǔn)備。該預(yù)處理包括將生物質(zhì)研磨成粉末或小顆粒、以及加水(這構(gòu)成漿)的步驟。然后通過多種-故設(shè)計(jì)用于從生物質(zhì)中部分或完全除去木質(zhì)素、并用比如纖維素酶和半纖維素酶這樣的酶類將半纖維素和纖維素轉(zhuǎn)化為更易于被降解成其組分糖類的形式的方法對該漿進(jìn)行處理。一些預(yù)處理將半纖維素降解成其組分糖類但將纖維素剩余為固體殘余物的一部分。該處理步驟被稱作"預(yù)處理"，因?yàn)樗l(fā)生在酶降解步驟和將糖類轉(zhuǎn)化為乙醇的發(fā)酵步驟之前。本發(fā)明上下文中短語"水溶性的"應(yīng)意指，可完全溶于水而不剩余任何固體殘余物的化學(xué)藥品或其它物質(zhì)。本發(fā)明上下文中詞語"半纖維素"意指，一種植物組分(其它兩種為纖維素和木質(zhì)素)，且它由比如木糖、和甘露糖這樣的糖類的線性鏈構(gòu)成，且通過化學(xué)鍵連接。該線性鏈也可沿該鏈帶有由糖類和其它化學(xué)藥品組成的分支。本發(fā)明上下文中詞語"半纖維素酶"意指，可將半纖維素破壞為其組分糖類的一類酶。半纖維素酶的例子包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡糖醛酸糖苦酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。本發(fā)明上下文中短語"順序水解和發(fā)酵過程"應(yīng)意指，從生物質(zhì)制備燃料或化學(xué)藥品的過程，比如乙醇，且其中生物質(zhì)在高溫下且用酸處理(水解)以除去木質(zhì)素，以及用比如纖維素酶和半纖維素酶這樣的酶類將存在于生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化成其組分糖類或更易于被降解成其組分糖類的形式。之后將這些溶于水的糖類冷卻，并將pH調(diào)至中性，以及之后通過各種類型的微生物發(fā)酵為產(chǎn)物燃料或化學(xué)藥品(發(fā)酵)。這兩個(gè)過程在不同的反應(yīng)容器中發(fā)生，其中水解步驟先進(jìn)行，發(fā)酵步驟其次進(jìn)行(順序)。本發(fā)明上下文中短語"培養(yǎng)酸熱脂環(huán)酸桿菌"應(yīng)意指，向上述微生物提供食物來源(可溶或不溶的半纖維素)和各種維生素和溶解于水中的礦物質(zhì)(這構(gòu)成營養(yǎng)培養(yǎng)基)，并給予這些微生物允許其生長的正確條件(溫度140。F,pH3.5和氧)。本發(fā)明上下文中短語"分離酸熱脂環(huán)酸桿菌細(xì)胞"應(yīng)包括通過稱作離心的過程從營養(yǎng)培養(yǎng)基中取出細(xì)菌細(xì)胞的方法。在離心中，細(xì)月包和營養(yǎng)培養(yǎng)基被置于管中并環(huán)狀旋轉(zhuǎn)。這與你在旋轉(zhuǎn)木馬上所經(jīng)歷的感覺到被向外推的作用是相同的。通過類似的方式，細(xì)胞被推向管底部并能夠從營養(yǎng)培養(yǎng)基中被取出。本發(fā)明上下文中短語"回收和純化半纖維素酶"應(yīng)意指，從營養(yǎng)培養(yǎng)基分離出半纖維素酶。在本發(fā)明中，用稱作離子交換的方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基分離半纖維素酶。在這點(diǎn)上，將營養(yǎng)培養(yǎng)基(含半纖維素酶)泵過離子交換材料。當(dāng)被帶至與離子交換材料接觸時(shí)，半纖維素酶將使其自身附著于離子交換材料，但營養(yǎng)培養(yǎng)基將穿過。之后從離子交換材料上取出半纖維素酶且進(jìn)行純化。本申請上下文中短語"微生物營養(yǎng)培養(yǎng)基"意指，微生物(酸熱脂環(huán)酸桿菌)的食物來源以及維生素和礦物質(zhì)，其全部溶于水中并被調(diào)至微生物生長所需的pH。更具體地說，該微生物營養(yǎng)培養(yǎng)基包括約1克/升木聚糖、約10mMNH4Cl、約5.2mMK2HP04、約0.8mMMgS04-7H20約1.74mMNa2S04、約25mg/升MgCl2、約6.6mg/升CaCl2、約2.0mg/升MnS04、約0.5mg/升ZnS04、約0.5mg/升硼酸、約5mg/升FeCl3、約0.15mg/升CuS04、約0.025mg/升NaMo04、約0.05mg/升CoN03、約0.02mg/升NiCl2、約0.08mg/升鹽酸吡。多醇、約0.01mg/升葉酸、約0.1mg/升鹽酸疏胺素、約0.04mg/升核黃素、約0.08mg/升煙酰胺、0.08mg/升對氨基苯曱酸酯、約0.01mg/升生物素、約0.0004mg/升氰鈷胺素、約0.08mg/升D-泛酸-Ca、約0.02mg/升肌醇、約0.05mg/升溴化膽堿、約0.02mg/升乳清酸一鈉、和約0.1mg/升亞精胺，且其中所得營養(yǎng)培養(yǎng)基被調(diào)至pH約3.5。本申請上下文中詞語"上清液"應(yīng)意指，從營養(yǎng)培養(yǎng)基中基本取出了細(xì)菌細(xì)胞之后剩余的營養(yǎng)培養(yǎng)基。本發(fā)明人已經(jīng)分離并表征了溫度和酸穩(wěn)定的木聚糖酶，該酶在升高的溫度和低pH下顯示了活性，且在這些條件下溫育時(shí)顯示保持延長的時(shí)間段的穩(wěn)定性。本發(fā)明人認(rèn)識到，熱和酸穩(wěn)定的半纖維素酶和纖維素酶，如下文所述，在這些過程中或者作為這些過程的附屬物具有特定的價(jià)值，另一方面，這將導(dǎo)致前述預(yù)處理過程嚴(yán)重程度的降低，和/或在各過程中去除這些限制。在這點(diǎn)上，本發(fā)明人從黃石國家公園(YellowstoneNationalPark)以及各培養(yǎng)物保藏中心篩選了許多種生物，以找到具有生產(chǎn)在高溫和低pH下均穩(wěn)定的酶的能力的微生物。在這點(diǎn)上，從黃石國家公園NorrisGeyserBasin中的六個(gè)泉收集了水和沉積物樣品。這些樣品被接種到液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基具有pH3.5，且還含有0.5克/升燕麥木聚糖(oatspeltxylan)或者0.5克/升碎玉米穗軸。隨后培養(yǎng)物在8(TC下溫育并每天通過視覺和顯微鏡術(shù)觀察其生長。更進(jìn)一步，對美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和DeutscheSammlungVonMikroorganismenUndZellkuturen(DSMZ)的搜索得到了4個(gè)可能的異養(yǎng)生物，它們生長的最適宜溫度和pH大于約60。C和低于約pH4。這幾種生物在由ATCC或DSMZ推薦的培養(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基如上述具有用燕麥木聚糖或者碎玉米穗軸替代的碳源。這些培養(yǎng)物之后在其最適宜生長溫度和pH3.5下培養(yǎng)。隨后通過濁度外觀視覺評估微生物生長。在該研究中，如果在木聚糖存在下發(fā)生生長，則據(jù)推測假定存在半纖維素酶和/或纖維素酶活性。溫育約三天后收獲發(fā)生了生長的培養(yǎng)物。通過離心從培養(yǎng)物取出細(xì)胞。用帶有10,000MWCO膜的AmiconTM超濾池在約1000-2000倍下濃縮培養(yǎng)物上清液。之后用小麥阿拉伯糖木聚糖(其由Megazyme商業(yè)獲得)或羧曱基纖維素(其由Sigma-Aldrich商業(yè)獲得)，利用砷鉬酸鹽還原糖酸測定測試所得上清液濃縮物的半纖維素酶和纖維素酶活性且其之前由Somogyi(1952),J.Biol.Chem.195:19-23描述。它們分別用作半纖維素酶和纖維素酶活性的底物。該測定的標(biāo)準(zhǔn)條件設(shè)于60。C和pH約3.5。如同參考附圖所將看到的，半纖維素酶和纖維素酶活性在最高達(dá)約90。C的溫度下測量以確定最佳酶活性溫度。通過改變上清液濃縮物與底物的溫育溫度來改良上述提及的還原糖測定。類似地，在1至約8的pH下測量酶活性以確定酶活性的最佳pH。為進(jìn)行這些研究，通過在適宜的pH緩沖液(pHl-2,50mM馬來酸鈉或50mM甘氨酸；pH2-6，50mM乙酸鈉；pH6-8,50mM石粦酸鈉；和pH8-9，50mMTris)中制備測定組分來修改還原糖測定。除前述外，通過在約70。C的溫度和pH2.0下溫育上清液濃縮物檢查了半纖維素酶和纖維素酶的穩(wěn)定性隨溫度和pH而變。在這點(diǎn)上，在濃縮物上放置一層礦物油以限制該檢查過程中的蒸發(fā)。定期收集樣品并在前述的標(biāo)準(zhǔn)測定條件下檢測半纖維素酶和纖維素酶活性。至于半纖維素酶和纖維素酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，用變化量的小麥阿拉伯木聚糖和羧曱基纖維素利用還原糖測定進(jìn)行確定。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)在60。C和pH3.5下確定。用可從SynexChem獲得的EnzymeKineticsProTM通過非線性分析計(jì)算Michaelis-Menten參數(shù)vMAX和KM。上述過程后，本發(fā)明人鑒定了酸熱脂環(huán)酸桿菌(ATCC27009)用于進(jìn)一步的考察。隨后，通過濃縮無細(xì)胞培養(yǎng)物材料制備粗酶制劑。隨后的SDS-page凝膠顯示5條主帶和幾條小帶。隨后計(jì)算出的這些條帶的質(zhì)量與其他報(bào)導(dǎo)的木聚糖酶和纖維素酶的一致。如圖1、2、3和4中所見的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了，從酸熱脂環(huán)酸桿菌分離的酶，且其在本文中被鑒定為ATCC27009,具有在約80。C的酶活性(木聚糖酶和纖維素酶)的最佳溫度。如圖1中可見，相對酶活性與由從另一種類似的微生物疏棉狀嗜熱絲孢菌(T.lanuginosus)中分離的類似的酶所提供的酶活性形成對照。此夕卜，還發(fā)現(xiàn)所分離的木聚糖酶在低至1的pH下表現(xiàn)酶活性，最佳pH為2,而纖維素酶活性的最佳pH在pH約4,盡管它在低至2的pH下的確顯示一些活性。圖4顯示木聚糖酶活性隨上述pH而變。就本發(fā)明人所知，以前所報(bào)道的最低最佳半纖維素酶pH是在Collins的文獻(xiàn)中(2005,FEMS,Micro.Review,29(1):3-23)?？梢韵胂?，已凈皮分離的本發(fā)明的水溶性木聚糖酶酶類可能在低于l的pH下具有活性，然而，目前，還原糖測定試劑在低于1的pH下不穩(wěn)定。進(jìn)一步的研究揭示，新分離的半纖維素酶和纖維素酶活性在70。C和pH下溫育時(shí)不顯示活性降低。前述研究引導(dǎo)本發(fā)明人斷定，酸熱脂環(huán)酸桿菌(ATCC27009)能夠在木聚糖底物上生長，且進(jìn)一步產(chǎn)生均為水溶性的細(xì)胞外半纖維素酶和纖維素酶活性，且它們在約為2的pH下顯示顯著的半纖維素酶活性，其還具有至少約120kDa的分子量。亦參見圖4。現(xiàn)有技術(shù)公開了，已經(jīng)從川地曲霉(Aspergilluskawachii)純化且表征了酸穩(wěn)定的木聚糖酶，且其最佳pH為2.0,最佳溫度為50-60°C。(PurificationandpropertiesofacidstablexylanasesfromAspergilluskawachii,Ito,K.,Ogasawara,H.,SugomotoT.,andIshikawaT.，BioscienceBiotechnologyandBiochemistry56(4):547-550,1992年4月)。此夕卜，已經(jīng)報(bào)道了幾種木聚糖酶的最佳pH為4-5,且已經(jīng)報(bào)道了許多種木聚糖酶的最佳溫度最高至100°C。然而，在本發(fā)明人的知識范圍內(nèi)，下文所述的酶是第一種已知在本文所請求保護(hù)的這樣的低pH下以及這樣的高溫度下具有活性的酶。除前述之外，本發(fā)明人還知道，已經(jīng)從相同的生物，即酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009，純化了內(nèi)切葡聚糖酶，且據(jù)報(bào)道其伴有木聚糖酶活性。據(jù)報(bào)道，該酶最佳pH為4.0,最佳溫度為約80°C。在這點(diǎn)上，來自酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009的嗜熱嗜酸內(nèi)切葡聚糖酶(eelB)展示與屬于糖苷水解酶家族51的阿拉伯呋喃糖苷酶的高序列相似性(EckertK.,SnyderE,，EuropeanJournalofBiochemistry,270(17):3593-3602,September,2003)。通過對如下所示SEQIDNO:5的研究可以最好地理解如現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中所述的前述纖維素酶前體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>QASSSIVGNALAQAASLSPTISAYLRQNGLSPSDLARTWSSYYCTQFDDPQGAAQTALATRICNDQALGGGAPTASAT]TVNTAAR正如所應(yīng)當(dāng)理解的，該SEQIDNO:2與如SEQIDNO:5中所示的ce舊序列的第166~248位匹配/對應(yīng)。應(yīng)當(dāng)注意到，SEQIDNO:2包括分別在第207、208、212、229和231位的改變的氨基酸以及在第209、213和230添加的氨基酸。在本發(fā)明中，本發(fā)明的酶將得到進(jìn)一步的表征，且通過對以下SEQIDNO:3的研究得到最佳的理解GLNAAVWDSGLNSQTVISEVQALHPA1JRWPGGSISDMDYNWBTNTR如同所應(yīng)當(dāng)理解的，SEQIDNO:3與SEQIDNO:5的第258-304位匹配/對應(yīng)。應(yīng)當(dāng)注意到，SEQIDNO:3在第295位具有改變的氨基酸，且在第296位具有添加的氨基酸。在本發(fā)明中，如本發(fā)明所預(yù)期的酶還包含如下所見的SEQIDNO:4:EADDHAVPNQPQKGNPGLSPQAYAQNALQFMQSPWYYRSEQIDNO:4與SEQIDNO:5的第379-415位匹配/對應(yīng)。應(yīng)當(dāng)理解，就較早的SEQIDNO:5來說，目前的SEQIDNO:4分別在第409、411和413位有氨基酸變化。此外，另外的氨基酸分別位于第412和414-415位。在如上述Eckert和Schneider的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中，在相同出版物的第3596頁觀察到了為確定具有多糖降解活性的細(xì)胞外嗜熱嗜酸酶的存在已經(jīng)對酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009作了同樣的工作。作者注意到，發(fā)現(xiàn)該生物利用包括木聚糖在內(nèi)的多種多糖作為唯一的碳源和能源。然而，這些作者未能檢測到培養(yǎng)物上清液中的木聚糖酶活性。這些作者假定了細(xì)胞相關(guān)的酶并用TritonX-100成功地/人完整細(xì)胞提取了具有相關(guān)的木聚糖降解活性的纖維素降解活性。這些作者觀察到，纖維素降解活性及其相關(guān)木聚糖酶活性甚至在培養(yǎng)物達(dá)到生長穩(wěn)定期之后仍然維持與細(xì)胞結(jié)合。相反，本發(fā)明的從嗜極端微生物分離，且在等于或高于80°C的溫度和低于2的pH下顯示最佳酶活性的酶，被認(rèn)為是水溶的，且已經(jīng)被從細(xì)胞上清液中分離。本發(fā)明還涉及制備半纖維素酶的方法，其包括步驟提供酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009源，在帶有上清液的微生物營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009,從營養(yǎng)培養(yǎng)基上清液分離酸熱脂環(huán)酸桿菌細(xì)胞，以及從營養(yǎng)培養(yǎng)基上清液回收和純化源自酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009的半纖維素酶。如同所描述的方法，產(chǎn)生水溶性的且在低于約2的pH以及大于約80。C的溫度下表現(xiàn)顯著酶活性的半纖維素酶。在所述的方法中，半纖維素酶含有如SEQIDN0:1、2、3和/或4所述的序列。此外，且在所述的方法中，所利用的營養(yǎng)培養(yǎng)基還包括約1克/升木聚糖、約10mMNH4Cl、約5.2mMK2HP04、約0.8mMMgS04-7H20、約1.74mMNa2S04、約25mg/升MgCl2、約6.6mg/升CaCl2、約2.0mg/升MnS04、約0.5mg/升ZnS04、約0.5mg/升硼酸、約5mg/升FeCl3、約0.15mg/升CuS04、約0.025mg/升NaMo04、約0.05mg/升CoN03、約0.02mg/升NiCl2、約0.08mg/升鹽酸吡。多醇、約0.01mg/升葉酸、約0.1mg/升鹽酸石危胺素、約0.04mg/升核黃素、約0.08mg/升煙酰胺、約0.08mg/升對氨基苯曱酸酯、約O.Olmg/升生物素、約0.0004mg/升氰鈷胺素、約0.08mg/升D-泛酸-Ca、約0.02mg/升肌醇、約0.05mg/升溴化膽堿、約0.02mg/升乳清酸一鈉，和約0.1mg/升亞精胺，且其中所得營養(yǎng)培養(yǎng)基^L調(diào)至pH約3.5。如本申請前述討論的，本發(fā)明的酶可用于各種方法中。因此如上所述的方法包括向同時(shí)糖化和發(fā)酵過程中提供回收和純化的半纖維素酶以促進(jìn)生物質(zhì)多糖轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物。利用上述酶的一種方法包括，用回收和純化的半纖維素酶，或從生物制得的含有包括半纖維素酶在內(nèi)的大量蛋白質(zhì)的粗酶制品，預(yù)處理生物質(zhì)漿，以降解存在于生物質(zhì)漿中的寡聚體和/或多糖，以產(chǎn)生終產(chǎn)物的步驟?？梢圆捎闷渌蒙鲜雒傅目赡芊椒ā＠?，可以在水解多糖的方法中使用已從嗜極端微生物中分離的酶，包括提供源自嗜極端微生物的水溶性半纖維素酶和在低于約2的pH下用水溶性半纖維素酶進(jìn)行多糖水解的步驟。如前述討論的，該水溶性半纖維素酶在約80'C具有最佳酶活性。操作16據(jù)信所描述的本發(fā)明實(shí)施方案的操作是顯然的，且在此作簡要概括。如所述的，通過對SEQIDNO:2-4的分別研究可以對分離自嗜極端微生物、在約80。C的溫度以及低于約2的pH下顯示最佳酶活性的酶作最好的理解。已經(jīng)被分離的酶用于處理生物質(zhì)的方法中，包括以下步驟提供具有生物質(zhì)糖類的生物質(zhì)源，用源自酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009的水溶性半纖維素酶預(yù)處理生物質(zhì)以產(chǎn)生終產(chǎn)物。在本方法中，該生物質(zhì)糖類包含多糖，且該半纖維素酶水解該多糖。如上述討論的，該半纖維素酶在低于約2的pH以及高于約80。C的溫度下顯示酶活性。本發(fā)明所預(yù)期的半纖維素酶具有約120kDa的分子量。在如上述的方法中，該方法包括其它步驟在存在或不存在半纖維素酶的情況下預(yù)處理生物質(zhì)，提供順序水解和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖類轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物，和向順序水解和發(fā)酵過程供應(yīng)半纖維素酶以促進(jìn)生物質(zhì)糖類向終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在如上所討論的預(yù)處理生物質(zhì)的步驟之后，且該步驟可以在存在或不存在半纖維素酶下以降低的嚴(yán)重程度完成，該方法還包括其它步驟提供同時(shí)糖化和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖類轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物，和向同時(shí)糖化和發(fā)酵過程供應(yīng)半纖維素酶以促進(jìn)生物質(zhì)糖類向終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。因此，可以看到，如上所述的本發(fā)明的酶和方法，避免了伴隨現(xiàn)有技術(shù)的酶以及迄今為止使用的實(shí)踐的許多缺陷，且還提供了生產(chǎn)各種所需終產(chǎn)物的便利方法，而同時(shí)降低了預(yù)處理步驟的嚴(yán)重程度，所述預(yù)處理步驟有產(chǎn)生各種有害廢產(chǎn)物以及為達(dá)到高預(yù)處理嚴(yán)重程度而需要高溫、壓力和酸量從而增加整體方法成本的傾向。權(quán)利要求1.分離自嗜極端微生物的酶，其在大于約80℃的溫度下以及低于約2的pH下表現(xiàn)最佳酶活性。2.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的酶，且其中該酶是源自酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009的半纖維素酶。3.如權(quán)利要求2所要求保護(hù)的酶，且其中該酶是源自酸熱脂環(huán)酸桿菌，ATCC27009的木聚糖酶。4.如權(quán)利要求2所要求保護(hù)的酶，且其中該酶是水溶性的。5.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的酶，且其中該酶是在約為1的pH下表現(xiàn)顯著酶活性的木聚糖酶。6.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的酶，且其中該酶具有至少約120kDa的分子量。7.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的酶，且其中該酶具有比SEQIDN0:5所示的酶至少高20%的分子量。8.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的酶，且其用于多糖的水解。9.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的酶，且其用于同時(shí)糖化和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖類轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物。10.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的酶，且其用于順序水解和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖類轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物。11.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的酶，且其用于生物質(zhì)漿的預(yù)處理以降解存在于生物質(zhì)漿中的寡聚體/或多糖以產(chǎn)生終產(chǎn)物。12.分離自嗜極端微生物的酶，其包含SEQIDNO:2。13.如權(quán)利要求12所要求保護(hù)的酶，且其還具有包含SEQIDNO:l的N-末端序列。14.如權(quán)利要求12所要求保護(hù)的酶，且其還包含SEQIDNO:3。15.如權(quán)利要求12所要求保護(hù)的酶，且其還包含SEQIDNO:4。16.如權(quán)利要求12所要求保護(hù)的酶，且其還包含SEQIDNO:3和4。17.如權(quán)利要求12所要求保護(hù)的酶，且其中該酶是水溶性的，且在至少約80。C的溫度下以及低于約2的pH下表現(xiàn)最佳酶活性。18.—種處理生物質(zhì)的方法，包括提供具有生物質(zhì)糖類的生物質(zhì)源，用源自酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009的水溶性半纖維素酶預(yù)處理該生物質(zhì)以產(chǎn)生終產(chǎn)物。19.如權(quán)利要求18所要求保護(hù)的方法，且其中的生物質(zhì)糖類含有多糖，且該半纖維素酶水解該多糖。20.如權(quán)利要求18所要求保護(hù)的方法，且其中的半纖維素酶在低于約2的pH下以及大于約80。C的溫度下表現(xiàn)酶活性。21.如權(quán)利要求19所要求保護(hù)的方法，且其中的半纖維素酶SEQIDN0:2、SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4。22.如權(quán)利要求18所要求保護(hù)的方法，且其中的半纖維素酶具有約120kDa的分子量。23.如權(quán)利要求18所要求保護(hù)的方法，且其中在預(yù)處理生物質(zhì)步驟之后，該方法還包4舌提供順序水解和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖類轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物，和向順序水解和發(fā)酵過程供應(yīng)半纖維素酶以促進(jìn)生物質(zhì)糖類向終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。24.如權(quán)利要求18所要求保護(hù)的方法，且其中在預(yù)處理生物質(zhì)的步驟之后，該方法還包括提供同時(shí)糖化和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖類轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物，和向同時(shí)糖化和發(fā)酵過程供應(yīng)半纖維素酶以促進(jìn)生物質(zhì)糖類向終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。25.制備半纖維素酶的方法，包括提供酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009源，在帶有上清液的微生物營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009,從營養(yǎng)培養(yǎng)基上清液分離酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009細(xì)胞，和從營養(yǎng)培養(yǎng)基上清液回收和純化源自酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009的半纖維素酶。26.如權(quán)利要求25所要求保護(hù)的方法，且其中的半纖維素酶是水溶性的，且在低于約2的pH下以及大于約80。C的溫度下表現(xiàn)顯著的酶活性。27.如權(quán)利要求25所要求保護(hù)的方法，且其中的半纖維素酶含有如SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4中所述的序列。28.如權(quán)利要求25所要求保護(hù)的方法，且其中營養(yǎng)培養(yǎng)基還含有:約1克/升木聚糖，約10mMNH4Cl,約5.2mMK2HP04,約0.8mMMgS04-7H20,約1.74mMNa2S04，約25mg/升MgCl2,約6.6mg/升CaCl2約2.0mg/升MnS04,約0.5mg/升ZnS04，約0.5mg/升硼酸，約5mg/升FeCl3，約0.15mg/升CuS04,約0.025mg/升NaMo04,約0.05mg/升CoN03,約0.02mg/升NiCl2,約0.08mg/升鹽酸吡。多醇，約0.01mg/升葉酸，約0.1mg/升鹽酸石危胺素，約0.04mg/升核黃素，約0.08mg/升煙酰胺，約0.08mg/升對氨基苯曱酸酯，約0.01mg/升生物素，約0細(xì)4mg所氰鈷胺素，約0.08mg/升D-泛酸-Ca,約0.02mg/升肌醇，約0.05mg/升溴化膽堿，約0.02mg/升乳清酸一鈉；和約0.1mg/升亞精胺，且其中所得營養(yǎng)培養(yǎng)基^L調(diào)至pH約3.5。29.如權(quán)利要求25所要求保護(hù)的方法，且還包括向順序水解和發(fā)酵過程供應(yīng)所回收和純化的半纖維素酶以促進(jìn)生物質(zhì)糖類向終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。30.如權(quán)利要求25所要求保護(hù)的方法，且還包括向同時(shí)水解和發(fā)酵過程供應(yīng)所回收和純化的半纖維素酶以促進(jìn)生物質(zhì)糖類向終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。31.如權(quán)利要求25所要求保護(hù)的方法，且還包括用所回收和純化的半纖維素酶預(yù)處理生物質(zhì)漿以降解存在于生物質(zhì)漿中的寡聚體和/或多糖以產(chǎn)生終產(chǎn)物。32.—種水解多糖的方法，包括提供源自嗜極端微生物的水溶性半纖維素酶，和用水溶性半纖維素酶在低于約2的pH下進(jìn)行多糖的水解。33.如權(quán)利要求32所要求保護(hù)的方法，且其中的水溶性半纖維素酶分離自酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC27009。34.如權(quán)利要求32所要求保護(hù)的方法，且其中的水溶性半纖維素酶在大于約8(TC的溫度下具有最佳酶活性。全文摘要一種分離自嗜極端微生物的酶，以及一種利用所述酶的方法，且其中該酶在大于約80℃的溫度下以及低于約2的pH下表現(xiàn)最佳酶活性，且還可用于包括預(yù)處理生物質(zhì)從而促進(jìn)終產(chǎn)物生產(chǎn)的方法中。文檔編號C12P1/00GK101535487SQ200680050210公開日2009年9月16日申請日期2006年10月31日優(yōu)先權(quán)日2005年11月2日發(fā)明者D·N·湯普森,K·D·沙勒,V·S·湯普森,W·A·阿佩爾申請人:巴特爾能源聯(lián)合有限責(zé)任公司