專利名稱：酸法結(jié)合酶法制備低分子量巖藻聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種巖藻聚糖的提取方法，特別是涉及利用酸法結(jié)合酶法制備低分子量巖藻聚糖的方法。
背景技術(shù)：
巖藻聚糖(Fucoidan)存在于海藻中具有較高生物活性的天然物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫力、清除活性氧自由基和體內(nèi)外抗氧化等功效。巖藻聚糖為含有多種單糖和硫酸基的水溶性多糖，分子質(zhì)量從幾萬至幾十萬不等。其特殊的結(jié)構(gòu)和功能引起了不少專家學(xué)者的重視。隨著多糖抗病毒作用機理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)影響多糖活性的因素很多，如多糖的高級結(jié)構(gòu)、側(cè)鏈的連接位置、分支密度及單糖間糖苷鍵的結(jié)合形式、多糖的聚合度、分子質(zhì)量以及硫酸根的含量等，均與藥理活性有關(guān)。
研究表明硫酸多糖的分子量在1000-50000Da，硫酸基在15～20％時生物活性較高。所以通過適當(dāng)?shù)姆椒▽⒃跍p少硫酸基脫落量的同時降低巖藻聚糖的分子量，是巖藻聚糖及其產(chǎn)品開發(fā)急待解決的問題。目前報道的巖藻聚糖的降解方法主要有酸解和酶解兩種。其中強酸水解反應(yīng)條件劇烈，很難操作，并且產(chǎn)品需進(jìn)行除鹽操作；而專一性的海藻多糖硫酸酯水解酶價格昂貴，產(chǎn)量小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、條件溫和、產(chǎn)量高、硫酸根脫落率低、成本低的酸法結(jié)合酶法制備低分子量巖藻聚糖的方法，該方法可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是本發(fā)明是一種酸法結(jié)合酶法制備低分子量巖藻聚糖的方法，它包括以下步驟(1)按干海藻與酸之比為1∶8-10的比例加酸，提取2-4小時后，離心收集上清液，加入乙醇溶液至30％-40％飽和度，收集上清液再加入乙醇溶液至70％-80％飽和度，攪拌均勻、靜置20分鐘沉淀，將溶液離心收集沉淀得巖藻聚糖，冷凍干燥；(2)提取過的巖藻聚糖利用蛋白酶在37℃-45℃和pH＝2～3下除蛋白；(3)加入果膠酶在30℃-45℃溫度下加熱水解2-3小時；用酸調(diào)節(jié)至pH值為4-5，放置2-4小時，過濾或離心除去雜質(zhì)，取上清液；(4)選擇截留分子量為1000-5000Da的膜進(jìn)行超濾濃縮，將濃縮過的溶液裝于燒杯中，預(yù)凍1-2小時，后放入真空干燥箱中，蓋上蓋子，調(diào)好真空度和溫度，溫度為-55℃，冷凍干燥一天左右，即得到分子量為1000-5000D的低分子量巖藻聚糖。
步驟(1)中加酸為0.1-0.2N鹽酸。
步驟(2)中加蛋白酶為胃蛋白酶。
步驟(3)中所述的酶為果膠酶。
采用上述方案后，本發(fā)明采用了商業(yè)上的工具酶果膠酶水解粗巖藻聚糖，控制了酶解時間，溫度和pH值，并采用截留分子量為1000-5000Da的超濾膜，獲得低分子量的巖藻聚糖。具有操作簡單、條件溫和、產(chǎn)量高、硫酸根脫落率低、成本低等優(yōu)點，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
由于本發(fā)明采用酸法結(jié)合酶法從海藻直接提取低分子量的巖藻聚糖，使巖藻聚糖的提取及低分子量巖藻聚糖的制備能同時進(jìn)行，簡化了工藝流程，提高了生產(chǎn)效率，節(jié)約生產(chǎn)費用30％以上。與此同時，整個工藝避免使用有毒有害的化學(xué)試劑，制備的產(chǎn)品安全無毒，特別適合于應(yīng)用于功能食品及藥品的生產(chǎn)。
本發(fā)明制備的巖藻聚糖具有廣闊的藥用前景，可應(yīng)用于治療乙肝、抗病毒、抗凝血、降血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫力、清除活性氧自由基和體內(nèi)外抗氧化的海洋藥物。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
具體實施例方式
實施例1一種酸法結(jié)合酶法制備低分子量巖藻聚糖的方法，包括以下步驟(1)取干海帶1000kg按1∶9的比例加酸，提取2小時后，離心收集上清液加入乙醇溶液，至30％飽和度，收集上清液再加入乙醇溶液至70％飽和度攪拌均勻、靜置20分鐘沉淀，將溶液離心收集沉淀得巖藻聚糖，冷凍干燥。
(2)提取過的巖藻聚糖選擇截留分子量為1000Da的膜進(jìn)行超濾，并利用蛋白酶在37℃和pH＝2～3下除蛋白。得到21g粗巖藻聚糖產(chǎn)品。取巖藻聚糖粗品1g，利用蛋白酶在37℃和pH＝2～3下除蛋白。
(3)加入果膠酶在30℃溫度下加熱水解2小時；用酸調(diào)節(jié)至PH值為4，放置2小時，過濾或離心除去雜質(zhì)，取上清液。
(4)選擇截留分子量為5000Da的膜超濾濃縮后的多糖水溶液裝于燒杯中，預(yù)凍1小時，后放入真空干燥箱中，蓋上蓋子，調(diào)好真空度和溫度，溫度為-55℃，干燥一天左右，使用冷凍干燥法除去水分得到低分子量巖藻聚糖0.70g。
實施例2一種酸法結(jié)合酶法制備低分子量巖藻聚糖的方法，包括以下步驟(1)取干海帶1000按1∶10的比例加酸，提取4小時后，離心收集上清液加入乙醇溶液，至40％飽和度，收集上清液再加入乙醇溶液至80％飽和度攪拌均勻、靜置20分鐘沉淀，將溶液離心收集沉淀得巖藻聚糖，冷凍干燥。
(2)提取過的巖藻聚糖選擇截留分子量為5000Da的膜進(jìn)行超濾，并利用蛋白酶在45℃和pH＝2下除蛋白，得到21g粗巖藻聚糖產(chǎn)品。取巖藻聚糖粗品1g，利用蛋白酶在45℃和pH＝2下除蛋白。
(3)加入果膠酶在45℃溫度下加熱水解3小時；用酸調(diào)節(jié)至PH值為5，放置3小時，過濾或離心除去雜質(zhì)，取上清液。
(4)選擇截留分子量為5000Da的膜超濾濃縮后的多糖水溶液裝于燒杯中，預(yù)凍2小時，后放入真空干燥箱中，蓋上蓋子，調(diào)好真空度和溫度，溫度為-55℃，干燥一天左右，使用冷凍干燥法除去水分得到低分子量巖藻聚糖。
實施例3(1)取干海帶1000kg按1∶8的比例加酸，提取3小時后，離心收集上清液加入乙醇溶液，至35％飽和度，收集上清液再加入乙醇溶液至75％飽和度攪拌均勻、靜置20分鐘沉淀，將溶液離心收集沉淀得巖藻聚糖，冷凍干燥。
(2)提取過的巖藻聚糖選擇截留分子量為1000Da的膜進(jìn)行超濾，并利用酶在40℃和pH＝2.5下除蛋白，得到粗的巖藻聚糖產(chǎn)品。取巖藻聚糖粗品，利用蛋白酶在40℃和pH＝2.5下除蛋白。
(3)加入果膠酶在35℃溫度下加熱水解2.5小時；用酸調(diào)節(jié)至PH值為4.5，放置2.5小時，過濾或離心除去雜質(zhì)，取上清液。
(4)選擇截留分子量為5000Da的膜超濾濃縮后的多糖水溶液裝于燒杯中，預(yù)凍1.5小時，后放入真空干燥箱中，蓋上蓋子，調(diào)好真空度和溫度，溫度為-55℃，干燥一天左右，使用冷凍干燥法除去水分得到低分子量巖藻聚糖。
本發(fā)明所采用的果膠酶為市售果膠酶(Pectinase)pH4.0，40℃，≥1.0u/mg)。
本發(fā)明所用的酸為0.1-0.2N鹽酸。所用的蛋白酶為胃蛋白酶。
本發(fā)明從海藻中提取制備的低分子量巖藻聚糖產(chǎn)品，經(jīng)權(quán)威部門檢驗，低分子量巖藻聚糖的含量達(dá)到98％以上，采用硫酸鋇重量法測得硫酸基含量為20.83％，并保留原有的天然結(jié)構(gòu)及生物活性。
權(quán)利要求
1.一種酸法結(jié)合酶法制備低分子量巖藻聚糖的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)按干海藻與酸之比為1∶8-10的比例加酸，提取2-4小時后，離心收集上清液，加入乙醇溶液至30％-40％飽和度，收集上清液再加入乙醇溶液至70％-80％飽和度，攪拌均勻、靜置20分鐘沉淀，將溶液離心收集沉淀得巖藻聚糖，冷凍干燥；(2)提取過的巖藻聚糖利用蛋白酶在37℃-45℃和pH＝2～3下除蛋白；(3)加入果膠酶在30℃-45℃溫度下加熱水解2-3小時；用酸調(diào)節(jié)至pH值為4-5，放置2-4小時，過濾或離心除去雜質(zhì)，取上清液；(4)選擇截留分子量為1000-5000Da的膜進(jìn)行超濾濃縮，將濃縮過的溶液裝于燒杯中，預(yù)凍1-2小時，后放入真空干燥箱中，蓋上蓋子，調(diào)好真空度和溫度，溫度為-55℃，冷凍干燥一天左右，即得到分子量為1000-5000D的低分子量巖藻聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是步驟(1)中加酸為0.1-0.2N鹽酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是步驟(2)中加蛋白酶為胃蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用海藻制造低分子量巖藻聚糖的方法，其特征在于步驟(3)中所述的酶為果膠酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酸法結(jié)合酶法制造低分子量巖藻聚糖的方法，它采用了商業(yè)上的工具酶果膠酶水解粗巖藻聚糖，控制酶解時間，溫度和pH值，并采用截留分子量為1000－5000Da的超濾膜，獲得低分子量的巖藻聚糖。具有操作簡單、條件溫和、產(chǎn)量高、硫酸根脫落率低、成本低等優(yōu)點，易于工業(yè)化生產(chǎn)。由于本發(fā)明采用酸法結(jié)合酶法從海藻直接提取低分子量的巖藻聚糖，使巖藻聚糖的提取及低分子量巖藻聚糖的制備能同時進(jìn)行，簡化了工藝流程，提高了生產(chǎn)效率，節(jié)約生產(chǎn)費用30％以上。與此同時，整個工藝避免使用有毒有害的化學(xué)試劑，制備的產(chǎn)品安全無毒，特別適合于應(yīng)用于功能食品及藥品的生產(chǎn)。
文檔編號C12P19/00GK101020914SQ20071000867
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日
發(fā)明者吳永沛, 劉明 申請人:集美大學(xué)