專利名稱：胰島素前體發(fā)酵過程補(bǔ)料優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種生產(chǎn)胰島素的方法，特別涉及酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組豬胰島素前體過程的方法。
背景技術(shù)：
胰島素前體即胰島素原，分子量約為9000，含有86個(gè)氨基酸，是一個(gè)單鏈多肽。胰島素是含有51個(gè)氨基酸的小分子蛋白質(zhì)，分子量6000左右。豬與人的胰島素只在B鏈C末端的一個(gè)氨基酸殘基上存在差異，前者為丙氨酸，后者為蘇氨酸，但兩種胰島素的生理功效完全一致。胰島素是促進(jìn)合成代謝、調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)定的主要激素，是治療胰島素依賴型糖尿病的特效藥物。
目前，工業(yè)上采用的幾種生產(chǎn)人胰島素方法有(1)從人的胰臟中直接提取，但原料供應(yīng)的限制。(2)由單個(gè)氨基酸直接化學(xué)合成，可工業(yè)生產(chǎn)成本很高。(3)由豬胰島素化學(xué)轉(zhuǎn)型為人胰島素，成本相對(duì)低廉，所以在重組胰島素大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化之前，這種半合成方法是相當(dāng)多生物廠家采用的生產(chǎn)工藝。在酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組豬胰島素前體方法的過程中，甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母(Methylotrophic yeastPichia Pastoris)已經(jīng)被公認(rèn)為外源分泌蛋白和胞內(nèi)蛋白生產(chǎn)的優(yōu)秀的表達(dá)系統(tǒng)之一，并且其強(qiáng)勁的生長(zhǎng)和一些獨(dú)特性已開發(fā)成外源蛋白商業(yè)生產(chǎn)的重組表達(dá)系統(tǒng)，但現(xiàn)有技術(shù)(Invitrogen酵母發(fā)酵手冊(cè))酵母發(fā)酵存在著濃度較低(僅0.8g.L-1)的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，在保持Invitrogen酵母發(fā)酵手冊(cè)工藝中其它條件不變的前提下，基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)，提供一種畢赤酵母發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)豬胰島素前體過程補(bǔ)料優(yōu)化方法。
本發(fā)明的胰島素前體發(fā)酵過程補(bǔ)料優(yōu)化方法，是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，首先通過分批補(bǔ)加甲醇來確定最初甲醇流加速率，然后通過最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí)測(cè)樣菌體密度的差值以及發(fā)酵周期來進(jìn)行比生長(zhǎng)速率的計(jì)算和調(diào)整，最后計(jì)算出實(shí)時(shí)待調(diào)整的甲醇流加速率。
以下對(duì)本發(fā)明作具體描述(一)通過分批補(bǔ)加甲醇來確定最初甲醇流加速率，具體為(1)停止補(bǔ)加甘油，溶氧反彈，一次性補(bǔ)入0.3％(w/v)甲醇，菌體緩慢利用，逐漸適應(yīng)甲醇。
(2)甲醇消耗，溶氧第二次反彈，再一次性補(bǔ)入0.3％(w/v)甲醇，菌體迅速利用，全面適應(yīng)甲醇。
(3)甲醇再次消耗，溶氧第三次反彈，開始連續(xù)流加甲醇，并增大甲醇流加速率，使得溶氧回落至反彈前的最低點(diǎn)，此時(shí)的甲醇流加速率即為最初甲醇流加速率。
(二)通過最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí)測(cè)樣菌體密度的差值以及發(fā)酵周期來進(jìn)行比生長(zhǎng)速率的計(jì)算和調(diào)整，具體為(1)確定最終發(fā)酵菌體密度和發(fā)酵周期。由用戶根據(jù)具體需要指定。
(2)確定實(shí)時(shí)測(cè)樣菌體密度。甲醇流加開始后，每隔2h取樣一次，測(cè)定菌體密度。
(3)比生長(zhǎng)速率的計(jì)算。根據(jù)最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí)測(cè)樣菌體密度的差值以及發(fā)酵周期，通過微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，進(jìn)行比生長(zhǎng)速率的計(jì)算。
(4)比生長(zhǎng)速率的調(diào)整。把計(jì)算出來的比生長(zhǎng)速率作為下一時(shí)刻的比生長(zhǎng)速率。
(三)計(jì)算出實(shí)時(shí)待調(diào)整的甲醇流加速率，具體為
由下一時(shí)刻的比生長(zhǎng)速率，忽略誘導(dǎo)期單位時(shí)間內(nèi)菌體和產(chǎn)物的增加，計(jì)算出實(shí)時(shí)待調(diào)整的甲醇流加速率。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果是基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了根據(jù)菌體生長(zhǎng)狀況及時(shí)調(diào)整實(shí)時(shí)甲醇流加速率的變比生長(zhǎng)速率控制，將比生長(zhǎng)速率與菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物表達(dá)進(jìn)行參數(shù)相關(guān)，通過最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí)測(cè)樣菌體密度的差值以及發(fā)酵周期來進(jìn)行比生長(zhǎng)速率計(jì)算和調(diào)整，從而計(jì)算出實(shí)時(shí)待調(diào)整的甲醇流加速率。這種變比生長(zhǎng)速率調(diào)控策略能夠及時(shí)地調(diào)整菌體的生長(zhǎng)，使之與產(chǎn)物表達(dá)相協(xié)調(diào)，可以明顯地提高蛋白的濃度，重組豬胰島素前體的濃度和總產(chǎn)量較Invitrogen酵母發(fā)酵手冊(cè)提供的補(bǔ)料方法提高了50％。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例對(duì)象畢赤酵母GS115重組豬胰島素前體發(fā)酵過程，發(fā)酵罐體積為50L，基礎(chǔ)料4％(w/v)甘油作為分批發(fā)酵階段，連續(xù)流加濃度50％(w/w)的甘油，待菌體密度(OD600)約為300時(shí)，停止甘油補(bǔ)加，分批兩次補(bǔ)加0.3％(w/v)甲醇，根據(jù)溶氧確定初始甲醇流加速率，設(shè)定最終OD600為520，發(fā)酵周期T為100h。
控制目標(biāo)發(fā)酵最終OD600為520。
具體步驟如下(一)待OD600約為300時(shí)，停止甘油補(bǔ)加。分批兩次補(bǔ)加0.3％(w/v)甲醇。
(二)甲醇耗盡，溶氧反彈，開始流加甲醇，并增大補(bǔ)加速率，使溶氧回落至反彈前溶氧最低點(diǎn)，此時(shí)甲醇流加速率為最初甲醇流加速率V0＝5.24g.L-1.h-1。
(三)取樣，設(shè)時(shí)間為t0＝33h，測(cè)得菌體密度為X0(OD600＝321)。
按照微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，μ＝dx/dt/X，單位時(shí)間為1h，比生長(zhǎng)速率為μ0，則X1＝X0(1+μ0)，X2＝X1(1+μ1)以此類推......，Xn＝Xn-1(1+μn-1)。
預(yù)計(jì)t0后比生長(zhǎng)速率為恒定值，即μ0＝μ1＝......μn-1，則Xn＝X0(1+μ0)n，Xn由用戶設(shè)定，n＝T-t0，可求得μ0。
μ0＝(Xn/X0)1/n-1＝(520/321)1/(100-33)-1＝0.007226同理，當(dāng)下一取樣時(shí)刻時(shí)，設(shè)時(shí)間為t0，所測(cè)得菌體密度為X0，可求得下一時(shí)刻的μ0。
(四)根據(jù)計(jì)算出的比生長(zhǎng)速率μ，調(diào)整實(shí)時(shí)甲醇流加速率。
按照底物消耗方程，ΔS＝m1X+m2μX+m3ΔP，其中m1、m2、m3為比例系數(shù)，考慮到誘導(dǎo)期單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物和菌體增加都很小，忽略不計(jì)，則ΔS＝m1X，因時(shí)間單位為1h，所以ΔS即為甲醇流加速率。
設(shè)取樣時(shí)間為t0＝33h，所測(cè)得菌體密度為X0(OD600＝321)，甲醇流加速率為ΔS0＝V0＝5.24g.L-1.h-1，計(jì)算出的比生長(zhǎng)速率為μ0＝0.007226，則下一時(shí)段ΔS1＝m1X1，所以ΔS1/ΔS0＝X1/X0＝(1+μ0)，可求得下一時(shí)段的ΔS1。
ΔS1＝ΔS0(1+μ0)＝5.24×(1+0.007226)＝5.28g.L-1.h-1同理，當(dāng)再下一取樣時(shí)段時(shí)，設(shè)時(shí)間為t0，所測(cè)得菌體密度為X0，可求得再下一時(shí)段的ΔS1。
注由于對(duì)誘導(dǎo)期單位時(shí)間內(nèi)菌體和產(chǎn)物增加的忽略，導(dǎo)致單位時(shí)間內(nèi)計(jì)算結(jié)果略有偏差，但通過實(shí)時(shí)取樣，及時(shí)地調(diào)整甲醇流加速率，總體上卻能夠很好地控制菌體生長(zhǎng)，提高外源蛋白表達(dá)濃度，達(dá)到菌體生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)相協(xié)調(diào)的目的。
按照上述方法得到甲醇流加誘導(dǎo)階段的補(bǔ)料方法可以很好地協(xié)調(diào)菌體生長(zhǎng)與蛋白的表達(dá)。周期100h時(shí)，達(dá)到最終用戶設(shè)定菌體密度(OD600＝520)，并明顯地提高了外源蛋白的濃度(達(dá)1.2g.L-1)，重組豬胰島素前體的濃度和總產(chǎn)量較Invitrogen酵母發(fā)酵手冊(cè)提供的補(bǔ)料方法提高了50％。
權(quán)利要求
1.一種胰島素前體發(fā)酵過程補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在于將比生長(zhǎng)速率與菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物表達(dá)進(jìn)行參數(shù)相關(guān)聯(lián)，使得生長(zhǎng)與表達(dá)二種途徑相協(xié)調(diào)，首先通過分批補(bǔ)加甲醇來確定最初甲醇流加速率，然后通過最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí)測(cè)樣菌體密度的差值以及發(fā)酵周期來進(jìn)行比生長(zhǎng)速率的計(jì)算和調(diào)整，最后計(jì)算出實(shí)時(shí)待調(diào)整的甲醇流加速率，其中最終發(fā)酵菌體密度和發(fā)酵周期由用戶指定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素前體發(fā)酵過程補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在于通過分批補(bǔ)加甲醇來確定最初甲醇流加速率，具體為(1)停止補(bǔ)加甘油，溶氧反彈，一次性補(bǔ)入0.3％w/v甲醇，菌體緩慢利用，逐漸適應(yīng)甲醇；(2)甲醇消耗，溶氧第二次反彈，再一次性補(bǔ)入0.3％w/v甲醇，菌體迅速利用，全面適應(yīng)甲醇；(3)甲醇再次消耗，溶氧第三次反彈，開始連續(xù)流加甲醇，并增大甲醇流加速率，使得溶氧回落至反彈前的最低點(diǎn)，此時(shí)甲醇的流加速率即為最初甲醇流加速率。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素前體發(fā)酵過程補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在于，通過最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí)測(cè)樣菌體密度的差值以及發(fā)酵周期來進(jìn)行比生長(zhǎng)速率的計(jì)算和調(diào)整，具體為(1)確定最終發(fā)酵菌體密度和發(fā)酵周期。由用戶根據(jù)具體需要指定；(2)確定實(shí)時(shí)測(cè)樣菌體密度。甲醇流加開始后，每隔2h取樣一次，測(cè)定菌體密度；(3)比生長(zhǎng)速率的計(jì)算。根據(jù)最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí)測(cè)樣菌體密度的差值以及發(fā)酵周期，通過微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，進(jìn)行比生長(zhǎng)速率的計(jì)算；(4)比生長(zhǎng)速率的調(diào)整。把計(jì)算出來的比生長(zhǎng)速率作為下一時(shí)刻的比生長(zhǎng)速率。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素前體發(fā)酵過程補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在于計(jì)算出實(shí)時(shí)待調(diào)整的甲醇流加速率，具體為由下一時(shí)刻的比生長(zhǎng)速率，忽略誘導(dǎo)期單位時(shí)間內(nèi)菌體和產(chǎn)物的增加，計(jì)算出實(shí)時(shí)待調(diào)整的甲醇流加速率。
全文摘要
本發(fā)明的胰島素前體發(fā)酵過程的補(bǔ)料優(yōu)化方法，基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)，采用首先通過分批補(bǔ)加甲醇來確定最初甲醇流加速率，然后通過最終發(fā)酵菌體密度與實(shí)時(shí)測(cè)樣菌體密度的差值以及發(fā)酵周期來進(jìn)行比生長(zhǎng)速率的計(jì)算和調(diào)整，最后計(jì)算出實(shí)時(shí)待調(diào)整的甲醇流加速率的方法，實(shí)現(xiàn)了根據(jù)菌體生長(zhǎng)狀況及時(shí)調(diào)整實(shí)時(shí)甲醇流加速率的變比生長(zhǎng)速率控制，將比生長(zhǎng)速率與菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物表達(dá)進(jìn)行參數(shù)相關(guān)，這種變比生長(zhǎng)速率調(diào)控策略能夠及時(shí)地調(diào)整菌體的生長(zhǎng)，使之與產(chǎn)物表達(dá)相協(xié)調(diào)，可以明顯地提高蛋白的濃度，重組豬胰島素前體的濃度和總產(chǎn)量較現(xiàn)有技術(shù)(Invitrogen酵母發(fā)酵手冊(cè))酵母發(fā)酵的方法提高了50％。
文檔編號(hào)C12R1/84GK101029323SQ20071002668
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2007年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者朱志鋼, 鄭強(qiáng), 張富權(quán), 謝俊杰, 唐新發(fā) 申請(qǐng)人:廣東東陽光藥業(yè)有限公司