發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生方法
【專利說明】
[0001]本發(fā)明申請是基于申請日為2006年2月7日、申請?zhí)枮?200680004345. 8"（國際 申請?zhí)枮镻CT/US2006/006966)、名稱為"發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生方法"的發(fā)明專利申請的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品的方法，例如乙醇，所述方法從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn) 品，包括降解包含于含淀粉材料中的蛋白質(zhì)。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 大量難以合成生產(chǎn)的商業(yè)產(chǎn)品可以通過發(fā)酵產(chǎn)生。這種產(chǎn)品包括酒精（例如，乙 醇、甲醇、丁醇、1，3_丙二醇）；有機(jī)酸（例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸 鹽、乳酸、琥珀酸、2, 5-二酮-D-葡糖酸）；酮（例如，丙酮）；氨基酸（例如，谷氨酸）；氣體 (例如，HjPC02)，和更復(fù)雜的化合物，包括，舉例來說，抗生素（例如，青霉素和四環(huán)素）； 酶；維生素（例如，核黃素、B 12、胡蘿卜素）；激素；以及通常用在消耗性的酒精（例如， 啤酒和葡萄酒）、乳制品（例如，在酸奶和干酪的生產(chǎn)中）、皮革和煙草工業(yè)中的產(chǎn)品。
[0005] 乙醇具有廣泛的應(yīng)用，包括，作為化工原料、汽油添加劑或直餾（straight)液體 燃料。作為燃料或燃料添加劑，乙醇顯著地減少氣體排放同時改進(jìn)發(fā)動機(jī)性能。作為可再 生燃料，乙醇減少對有限的并且主要是外來的化石燃料資源的國家依賴，同時減少大氣層 中二氧化碳的凈累積。
[0006]通常乙醇通過液化含淀粉材料，接著是相繼或同時的糖化作用和發(fā)酵作用而產(chǎn) 生。液化包括淀粉的糊化，與之同時或在其之后添加a-淀粉酶以降解淀粉成為糊精。當(dāng) 產(chǎn)生乙醇時，將液化的含淀粉材料糖化。糖化是將糊精轉(zhuǎn)化成低分子DP^糖的步驟，例如， 酵母能夠?qū)⒃撎寝D(zhuǎn)化成為乙醇。
[0007] 美國專利編號5, 231，017A公開的乙醇產(chǎn)生方法包含（a)在a -淀粉酶存在下液 化原料，（b)在葡糖淀粉酶存在下糖化液化醪（liquefied mash)，（c)發(fā)酵和（d)乙醇回收， 其中在糖化和/或發(fā)酵期間將蛋白酶引入液化醪。
[0008] 加拿大專利1，143, 677公開從淀粉原料產(chǎn)生乙醇的方法，其通過用源自康寧木霉 (Trichoderma )培養(yǎng)物的淀粉分解酶和纖維素酶制備物水解所述原材料，該制備 物包含水解酶和多種淀粉分解酶的復(fù)合物，所述水解酶包括(^酶、外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚 糖酶、纖維二糖酶、木聚糖酶、葡糖苷酶、蛋白酶。
[0009]Mullins等，〃Biomass〃16 (1988) 2, pp. 77-87論證向醪液添加堿性蛋白酶導(dǎo)致氨 基氮的增加，其足以支持加速的乙醇發(fā)酵速率。
[0010] 存在對進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生方法的需求。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明的一方面涉及從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品的方法，所述產(chǎn)品例如乙醇，該 方法包括：
[0013] (a)用a-淀粉酶液化所述含淀粉材料；
[0014](b)用蛋白酶處理；
[0015] (c)在糖源產(chǎn)生酶（carbohydrate-source generating enzyme)存在下糖化；
[0016] (d)在發(fā)酵生物存在下發(fā)酵。
[0017] 步驟（a)和（b)中所述的液化和蛋白質(zhì)降解可以同時或相繼地（sequentially) 進(jìn)行。同樣所述糖化和發(fā)酵步驟可以同時（SSF)或相繼地進(jìn)行。
[0018] 具體地，本發(fā)明涉及如下各項：
[0019] 1.從含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包含：
[0020] (a)用a -淀粉酶液化所述含淀粉材料；
[0021] (b)用蛋白酶處理；
[0022] (c)在糖源產(chǎn)生酶存在下糖化；
[0023] (d)在發(fā)酵生物存在下發(fā)酵。
[0024] 2.項1的方法，其中步驟（a)和（b)同時或相繼地進(jìn)行。
[0025] 3.項2的方法，其中在步驟（b)用蛋白酶處理液化醪。
[0026] 4?項1-3中任一項的方法，進(jìn)一步包含步驟：
[0027] (e)蒸餾以獲得發(fā)酵產(chǎn)品。
[0028] 5.項1-4中任一項的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)品是乙醇。
[0029] 6.項1的方法，其中步驟（a)使用細(xì)菌a _淀粉酶或真菌a _淀粉酶進(jìn)行。
[0030] 7.項6的方法，其中所述細(xì)菌a -淀粉酶是芽孢桿菌屬a -淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱 脂肪芽孢桿菌a -淀粉酶或其變體，所述變體具有突變：R179*和G180*或1181*+G182*，特 別是 I181*+G182*+N193F。
[0031] 8.項6或7的方法，其中所述細(xì)菌a-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS之間的量使 用，優(yōu)選0. 001-1KNU每g DS，例如大約0. 050KNU每g DS。
[0032] 9.項1-8中任一項的方法，其中所述液化期間的pH為大約4. 5-7,優(yōu)選5-6,優(yōu)選 大約5. 4或5. 6。
[0033] 10.項1-9中的方法，在步驟（a)之前，進(jìn)一步包含步驟：
[0034]i)碾磨含淀粉材料；
[0035]ii)形成包含碾磨的含淀粉材料和水的漿。
[0036] 11.項10的方法，其中加熱所述漿至初始糊化溫度以上。
[0037] 12.項10或11的方法，其中在步驟（a)之前，將漿在95-140°C的溫度，優(yōu)選 105-125°C的溫度蒸汽蒸煮1-15分鐘，優(yōu)選3-10分鐘，特別是約5分鐘。
[0038] 13.項1的方法，其中步驟（b)作為液化后蛋白酶處理進(jìn)行。
[0039] 14.項1-13中任一項的方法，其中所述蛋白酶是真菌、細(xì)菌或植物來源的。
[0040] 15.項1-13中任一項的方法，其中所述蛋白酶是內(nèi)切蛋白酶和/或外切蛋白酶，優(yōu) 選是細(xì)菌或真菌來源。
[0041] 16.項1-12中任一項的方法，其中所述蛋白酶是金屬蛋白酶。
[0042] 17.項1-16中任一項的方法，其中所述蛋白酶是真菌蛋白酶，其源自曲霉屬， 優(yōu)選黑曲霉、齋藤曲霉、泡盛曲霉、棘孢曲霉、米曲霉；毛霉屬，優(yōu)選微小毛霉或米黑毛 霉；根毛霉屬，優(yōu)選微小根毛霉或曼赫根毛霉；根霉屬；念珠菌屬；革蓋菌屬；內(nèi)座殼菌； Enthomophtra ;耙菌屬；青霉屬；小核菌屬；嗜熱子囊菌屬，優(yōu)選嗜熱子囊菌和球擬酵母菌 屬。
[0043] 18.項1-16中任一項的方法，其中所述蛋白酶是細(xì)菌蛋白酶，其源自芽孢桿菌 屬，優(yōu)選解淀粉芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌；擬諾卡氏菌屬，優(yōu)選Nocardiopsis prasina或 Nocardiopsis dassonavilla。
[0044] 19.項1-18中任一項的方法，其中所述蛋白酶是源自大麥的植物蛋白酶。
[0045] 20.項1-20中任一項的方法，其中步驟（b)在對于所討論蛋白酶最佳的條件進(jìn)行。
[0046] 21.項1-20中任一項的方法，其中步驟（b)中的蛋白酶處理期間的溫度在 25-90°C的范圍內(nèi)，優(yōu)選30-80°C，例如從65-75°C，特別大約50°C或70°C。
[0047] 22.項1-21中任一項的方法，其中步驟（b)中蛋白酶處理期間的pH在2-11。
[0048] 23?項1-22中任一項的方法，其中步驟（b)中液化的淀粉具有在20-50% (w/w) 總固體（TS)，優(yōu)選30-40 % (w/w) TS的濃度。
[0049] 24?項1-19中任一項的方法，其中步驟（b)中的蛋白酶處理進(jìn)行0? 1至12小時， 優(yōu)選1至10小時，特別是2至8小時。
[0050] 25.項1-24中任一項的方法，其中所述蛋白酶以0. 0001至lwt. -%的TS的濃度 存在，優(yōu)選〇. 001至〇. lwt. -%的TS。
[0051] 26.項1-25中任一項的方法，其中步驟（C)的糖化按照如下步驟進(jìn)行：預(yù)糖化步 驟，其在從大約28至65°C的溫度，在pH 4-6持續(xù)大約40至90分鐘，然后是在同時糖化和 發(fā)酵方法（SSF)中的發(fā)酵期間的完全糖化。
[0052] 27.項1-26中任一項的方法，其中所述糖化和發(fā)酵步驟作為同時的糖化和發(fā)酵方 法（SSF方法）進(jìn)行。
[0053] 28.項27的方法，其中SSF進(jìn)行20-100小時，優(yōu)選大約24至72小時。
[0054] 29.項1-28中任一項的方法，其中所述糖源產(chǎn)生酶是葡糖淀粉酶、麥芽糖淀粉酶、 3 _淀粉酶，或它們的組合。
[0055] 30.項1-29中任一項的方法，其中所述糖源產(chǎn)生酶是葡糖淀粉酶，優(yōu)選以 0. 005-5AGU/g DS的濃度存在，更優(yōu)選0. 01-lAGU/g DS之間，例如特別大約0. 1-0. 5AGU/g DS的濃度存在。
[0056] 31.項30的方法，其中所述葡糖淀粉酶源自曲霉屬菌株，優(yōu)選黑曲霉、泡盛曲霉 或米曲霉，或踝節(jié)菌屬（Talaromyces)屬的菌株，優(yōu)選Talaromyes emersonii的菌株，或 Athelia屬的菌株，優(yōu)選Athelia rolfsii，或栓菌屬的菌株，優(yōu)選Trametes ciingulata的 菌株。
[0057] 32.項1-31中任一項的方法，其中所述發(fā)酵生物是酵母，優(yōu)選能夠發(fā)酵糖成為乙 醇的酵母，例如酵母屬菌種，特別是釀酒酵母。
[0058] 附圖簡述
[0059] 圖1顯示SSF之后的乙醇收率（gigDs)l)用蛋白酶ALC(Alc)液化后處理和2) 不用酶（NE-無酶），其是于多種溫度、處理時間和pH下進(jìn)行；
[0060] 圖2顯示達(dá)到在沒有液化后（post-liquefaction)對照發(fā)酵中所觀察到的乙醇產(chǎn) 率發(fā)酵理論上所需的時間。數(shù)值基于每克玉米醪（mash)的重量損失；
[0061]圖3顯示甘油/乙醇關(guān)系（g/g)l)用蛋白酶ALC(Alc)液化后處理和2)不用酶 (NE-無酶），于多種溫度、處理時間和pH條件下；
[0062]圖4顯示殘基葡萄糖[g/gDS]l)用蛋白酶ALC(Alc)液化后處理和2)不用酶 (NE-無酶），于多種溫度、處理時間和pH條件下；
[0063] 圖5顯示兩種蛋白酶與無蛋白酶對照比較，于67. 5°C同時液化和蛋白質(zhì)降解的重 量損失與發(fā)酵時間之間函數(shù)的分布圖（profile);
[0064] 圖6顯示兩種蛋白酶與無蛋白酶對照比較，于70°C同時液化和蛋白質(zhì)降解的重量 損失與發(fā)酵時間之間函數(shù)的分布圖；
[0065]圖7顯示當(dāng)液化和蛋白質(zhì)降解同時進(jìn)行時，70小時發(fā)酵之后的乙醇收率（g/g DS)，其分別是于67. 5°C和70°C、有和無蛋白酶條件下進(jìn)行。
[0066] 圖8顯示當(dāng)液化和蛋白質(zhì)降解同時進(jìn)行時，70小時發(fā)酵之后的甘油水平（g/g DS)，其分別于67. 5°C和70°C、有和無蛋白酶條件下。
[0067]圖9顯示當(dāng)液化和蛋白質(zhì)降解同時進(jìn)行時