專利名稱：一種克隆野生稻新抗性基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因克隆技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種克隆野生稻新抗性基因的方法。
背景技術(shù)：
野生稻中蘊(yùn)含豐富的有利基因，被譽(yù)為植物大熊貓。由于長(zhǎng)期處于野生狀態(tài)，野生稻在其生長(zhǎng)過(guò)程中要受到包括病毒、細(xì)菌、霉菌和線充等多種病原生物的侵害，同時(shí)還要經(jīng)受各種自然災(zāi)害和不良環(huán)境的選擇，從而在緩慢的進(jìn)化過(guò)程中形成了對(duì)各種病蟲害的抗性和各種逆境的適應(yīng)性，如抗病、抗蟲、耐寒、耐旱、耐鹽堿、耐淹、耐蔭以及高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、雄性不育、磷鉀高效利用等性狀，這些優(yōu)良性狀都是水稻遺傳改良的重要基因資源。野生稻有利基因資源的成功挖掘和利用曾帶來(lái)了世界的二次綠色革命從野生稻中轉(zhuǎn)育矮稈基因到栽培稻帶來(lái)了第一次綠色革命；袁隆平院士最先從野生稻中發(fā)現(xiàn)野敗不育基因并成功培育了雜交水稻，開創(chuàng)了第二次綠色革命。
對(duì)于產(chǎn)物未知的植物抗性基因的克隆，現(xiàn)階段常用的策略是圖位克隆法和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法。圖位克隆法是分離克隆基因的一種方法，需要先要構(gòu)建一個(gè)覆蓋目的基因區(qū)域的精密分子標(biāo)記遺傳連鎖圖，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步制作覆蓋目標(biāo)基因區(qū)域的物理圖譜，獲得包含目的基因的克隆及候選基因，最后通過(guò)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證。在分離性狀簡(jiǎn)單穩(wěn)定的條件下，理論上任何一個(gè)基因都可以分離得到，但前提條件是前期工作基礎(chǔ)要扎實(shí)，必須完成包括目的基因區(qū)域的精細(xì)遺傳圖譜、必須構(gòu)建基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)等多種文庫(kù)、必須有連鎖非常緊密的分子標(biāo)記、目的基因所控制的性狀必須容易識(shí)別等，由于野生稻基因組基礎(chǔ)研究才剛剛起步，在尚未獲得遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜和表達(dá)圖譜之前，要利用這一方法分離特定基因顯然存在不少困難。
轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法是利用轉(zhuǎn)座子插入突變使某一基因失活，進(jìn)而用轉(zhuǎn)座子特異基因片段做探針?lè)蛛x出突變的目的基因，該方法需要篩選并鑒定突變體，工作量較大且轉(zhuǎn)座子引起有效變異的頻率很低，約10-6～10-4，而轉(zhuǎn)座子從一個(gè)突變基因切離的頻率卻很高，自主轉(zhuǎn)座子的跳躍很不容易控制，轉(zhuǎn)座子從插入位點(diǎn)切離后會(huì)使原來(lái)的突變恢復(fù)或產(chǎn)生新的變異造成變異的不穩(wěn)定性，從而無(wú)法控制和研究好底頻率變異?？茖W(xué)家通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽的修飾，改造成第二代轉(zhuǎn)座子——非自主轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽，這樣可以使突變得以穩(wěn)定并提高轉(zhuǎn)座頻率，但雙轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽仍不能解決轉(zhuǎn)座因子繼續(xù)轉(zhuǎn)座的問(wèn)題。
以上克隆技術(shù)分離克隆野生稻新基因都需要對(duì)目標(biāo)基因研究比較透徹且過(guò)程煩瑣、工作量巨大，因此，現(xiàn)階段迫切需要尋求一種簡(jiǎn)便、有效的高通量技術(shù)來(lái)分離克隆有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值及廣闊的應(yīng)用前景的野生稻新抗性基因。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有水稻基因克隆技術(shù)所存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種高效、快捷的克隆野生稻新抗性基因的方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案包括如下步驟(1)供體野生稻可轉(zhuǎn)化基因組文庫(kù)的構(gòu)建；(2)設(shè)計(jì)植物抗性基因引物，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物用生物素標(biāo)記作為探針；(3)使用已標(biāo)記探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行磁珠富集，構(gòu)建富集文庫(kù)；(4)對(duì)富集文庫(kù)的克隆進(jìn)行鑒定分析，包括使用上述引物進(jìn)行PCR分析、點(diǎn)雜交分析、擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序分析；(5)對(duì)利用富集文庫(kù)篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行功能驗(yàn)證，篩選出野生稻新抗性基因。
本發(fā)明的技術(shù)方案能產(chǎn)生以下技術(shù)效果1、本發(fā)明利用了植物抗性基因的保守性構(gòu)建富集可轉(zhuǎn)化基因組文庫(kù)，只要對(duì)候選抗性基因的磁珠富集文庫(kù)作進(jìn)一步鑒定，就可以快速搜尋到抗性基因家族的新成員，適合于現(xiàn)階段對(duì)野生稻的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)背景研究不夠的情況下從野生稻分離克隆新抗性基因。
2、本發(fā)明提供了一種全新高效的從文庫(kù)溶液中快速構(gòu)建候選抗性基因富集文庫(kù)的技術(shù)方法，克服了傳統(tǒng)的文庫(kù)構(gòu)建方法的過(guò)程煩瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)。
3、本發(fā)明率先大規(guī)模利用野生稻基因資源發(fā)掘水稻抗性基因，將野生稻抗性基因引入栽培稻中，并可用于其它水稻有利基因的篩選，使現(xiàn)有水稻品種得到整體改良。


圖1為pCAMBIA1301質(zhì)粒的酶切電泳圖。
圖2為pCAMBIA1301載體經(jīng)HindIII酶切，Lambda DNA-6kb連接測(cè)試結(jié)果圖。
圖3為東鄉(xiāng)野生稻基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果圖。
圖4為東鄉(xiāng)野生稻基因組DNA回收結(jié)果圖。
圖5為8-10kb和10-23kb膠塊大量酶切第二次回收結(jié)果圖。
圖6為Qiagen膠回收試劑盒回收片段濃度測(cè)定結(jié)果圖。
圖7為文庫(kù)質(zhì)粒插入片斷大小檢測(cè)結(jié)果圖。
圖8為NautilusTMMiniPrepKit純化東鄉(xiāng)野生稻文庫(kù)質(zhì)粒濃度測(cè)定圖。
圖9為PCR檢測(cè)到文庫(kù)質(zhì)粒中含有待富集基因結(jié)果圖。
圖10為探針模板回收檢測(cè)圖。
圖11為特異性PCR產(chǎn)物電泳定量結(jié)果圖。
圖12為質(zhì)粒文庫(kù)富集前后比較圖。
圖13為富集文庫(kù)的點(diǎn)雜交篩選圖。
圖14為兩個(gè)陽(yáng)性克隆DB19H21和DB17G9的PCR檢測(cè)圖。
圖15為所得兩個(gè)陽(yáng)性克隆序列DB19H21和DB17G9與已知9個(gè)抗性基因NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域比較圖。
圖16為所得兩個(gè)陽(yáng)性克隆序列DB19H21和DB17G9序列與已知9個(gè)抗性基因的聚類分析圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1利用東鄉(xiāng)野生稻候選抗性基因富集文庫(kù)分離克隆稻瘟病和白葉枯病新抗性基因。
1、東鄉(xiāng)野生稻可轉(zhuǎn)化基因組文庫(kù)的構(gòu)建1)pCAMBIA1301質(zhì)粒的大量抽提及純化將鑒定后的小規(guī)模培養(yǎng)物按1∶200接種于1L的Km/LB液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床，225rpm培養(yǎng)過(guò)夜。按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版大量法抽提質(zhì)粒方法抽提質(zhì)粒，然后將1L培養(yǎng)物提取的質(zhì)粒溶解于3mlTE中。
將粗提的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入15ml尖底離心管中，然后加入3ml預(yù)冷的5M的LiCl溶液，充分混勻，4℃，10000rpm，離心10min。將上清轉(zhuǎn)入30ml尖底離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻。室溫10000rpm離心10min。棄上清，在干凈的衛(wèi)生紙上將離心管中殘留的溶液扣干。然后將沉淀物溶解于4mlTE中，并用2M的Tris堿調(diào)節(jié)pH到7.5-8.0。在每4ml溶解質(zhì)粒的TE溶液，加入4g的CsCl，稍加熱使CsCl固體溶解，然后轉(zhuǎn)入超速離心管中，向每管中加入0.2ml、10mg/ml的EB，再用TE調(diào)節(jié)平衡，使液面離管口距離約為1mm。25℃、62500rpm，離心16hrs。離心完畢后，將離心管輕輕取出，固定于鐵架臺(tái)上，在暗室下，用帶18號(hào)針頭的5ml一次性注射器在離管底最近的一條紅色的環(huán)帶下附近刺穿管壁，將目的帶慢慢的吸出，操作時(shí)盡量不要將分層的液面攪動(dòng)。把含超螺旋質(zhì)粒的液體轉(zhuǎn)入新的超速離心管中，加入含有1g/ml CsCl的TE溶液，向其中加入10mg/ml、0.05ml的EB，25℃、625000rpm離心16hrs。同上從超速離心管中取出超螺旋質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入到1.5mlEP管中，然后加入等體積的用TE飽和的異戊醇，用16000rpm離心5min，吸取上清部分，重復(fù)以上步驟用異戊醇抽提EB，直至上清溶液顏色由紅色變成無(wú)色透明。
將上清液體轉(zhuǎn)入50ml的透明離心管中，加入3倍體積的TE，然后加入8倍于含有CsCl的上清液體體積的無(wú)水乙醇，4℃下靜置15min。然后，4℃、20000g離心15min。將上清轉(zhuǎn)入新的50ml離心管，加入等體積的無(wú)水乙醇，4℃、靜置15min以上，4℃、20000g，離心15min。將兩次離心的沉淀用70％的乙醇洗滌兩次，在干凈的衛(wèi)生紙上將離心管中殘留的液體扣干。用合適體積的TE溶解，使終濃度為1mg/ml，分裝后放入-20℃低溫冰箱保存。
2)pCAMBIA1301質(zhì)粒的大量酶切pCAMBIA1301質(zhì)粒的質(zhì)粒濃度確定。用已知濃度的Lambda DNA作為Marker，1.0％的瓊脂糖，150V，普通瓊脂糖電泳20min，電泳完畢后在EB工作液中染色20min，對(duì)純化的pCAMBIA1301質(zhì)粒的濃度進(jìn)行測(cè)定；對(duì)比紫外分光光度計(jì)的結(jié)果。在以下反應(yīng)體系對(duì)載體進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)

以上反應(yīng)體系在37℃下反應(yīng)2hrs后補(bǔ)加15U的HindIII，37℃，再繼續(xù)反應(yīng)1hrs后進(jìn)行電泳，(參見圖1)，圖中M1為L(zhǎng)ambdaDNA/HindIII marker，1-3分別為pCAMBIA1301質(zhì)粒經(jīng)XhoI、BamHI、HindIII酶切的效果，4為超高速離心純化質(zhì)粒，M2為100bp marker。
分別將2ul酶切前和酶切后的質(zhì)粒溶液，轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)，用1ml的SOC在37℃，225rpm條件下復(fù)蘇1hr，將1hr培養(yǎng)物涂布于Km/LB固體培養(yǎng)基上，然后放置于37℃生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過(guò)夜。當(dāng)酶切后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)極少量的克隆則表明酶切比較徹底，繼續(xù)進(jìn)行去磷酸反應(yīng)。向酶切后的反應(yīng)體系加入1/10體積的pH7.0、3M的NaAC和2倍體積的無(wú)水乙醇，-80℃放置10min，10000rpm，離心15min。用70％乙醇洗滌沉淀，在干凈的衛(wèi)生紙上將離心管中殘留的液體扣干，最后將沉淀溶解于40ul的TE中。
3)載體的去磷酸化根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定的酶切后載體的濃度，計(jì)算其pmol數(shù)。然后按以下反應(yīng)體系進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)40ul的DNA(pCAMBIA1301/HindIII)，40ul的10buffer，按0.1U/pmol加1U/ul CIAP，最后加dd H2O使終體積為400ul，37℃下反應(yīng)30min。去磷酸化反應(yīng)結(jié)束后立即加入4ul的0.5M、pH8.0的EDTA，20ul的10％SDS，40ul的1mg/ml proteinase K，56℃下反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后在室溫條件下進(jìn)行冷卻，然后分別用1倍體積的苯酚、1∶1的苯酚+氯仿、氯仿抽提。然后加入1/10倍體積的3M、pH7.0的NaAC和2倍體積的無(wú)水乙醇，-80℃放置10min，10000rpm，離心15min。再用70％的乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌，在干凈的衛(wèi)生紙上將離心管中殘留的溶液扣干，最后將沉淀溶解于無(wú)菌的ddH2O。通過(guò)1.0％的瓊脂糖電泳確定其濃度，調(diào)整DNA溶液終濃度為40-60ng/ul，將溶液等份分裝后，放置于-20℃低溫冰箱中進(jìn)行保存。然后進(jìn)行去磷酸化效果檢測(cè)。
4)處理后載體質(zhì)量的檢測(cè)將Lambda DNA質(zhì)粒用pCAMBIA1301質(zhì)粒的大量酶切的方法進(jìn)行酶切，酶切后利用步驟3)中有機(jī)溶劑抽提，然后加入1/10倍體積的3M、pH7.0的NaAC和2倍體積的無(wú)水乙醇，-80℃放置10min，10000rpm，離心15min。用70％乙醇洗滌沉淀，在干凈的衛(wèi)生紙上將離心管中殘留的溶液扣干，將沉淀溶解于適當(dāng)體積的TE中，然后用1.0％的瓊脂糖電泳確定其濃度。將處理好的pCAMBIA1301載體和Lambda/HindIII按照1∶10的摩爾比濃度在10ul反應(yīng)體系中，用PCR熱循環(huán)儀，16℃條件下進(jìn)行連接過(guò)夜，連接完畢后，將連接液在65℃條件下失活15min。并設(shè)置連接對(duì)照酶切的pCAMBIA1301，去磷酸化的pCAMBIA1301。
取2ul連接液，電擊轉(zhuǎn)化到DH10B感受態(tài)中，用1ml的SOC對(duì)電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞進(jìn)行1hr復(fù)蘇。吸取1hr的培養(yǎng)物0.1ml涂布于Km/LB，IPTG/X-gal固體培養(yǎng)基上，放入37℃生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過(guò)夜。共有5個(gè)處理pCAMBIA1301以確定轉(zhuǎn)化效率；酶切的pCAMBIA1301回收產(chǎn)物以確定酶切效果；酶切的pCAMBIA1301自連以確定連接效果；去磷酸化的pCAMBIA1301自連以確定去磷酸化效果；pCAMBIA1301載體和Lambda/HindIII的連接產(chǎn)物以確定與插入片斷連接效果。
挑取重組單克隆，接種于Km/LB液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床、225rpm條件下培養(yǎng)過(guò)夜。參照分子克隆第三版的SDS堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA提取pCAMBIA1301重組質(zhì)粒。采用HindIII酶對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，一般采用20ul反應(yīng)體系，37℃，反應(yīng)1～2hr。通過(guò)0.7％的普通瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳完畢后，將凝膠在EB工作液中浸泡20min，然后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。確定是否有插入片段來(lái)判斷載體的處理質(zhì)量。以載體的空載率小于10％，克隆數(shù)≥2cfu/ul判斷為質(zhì)量較好。
5)載體特定片段的連接測(cè)試。
將處理后的pCAMBIA1301載體與用HindIII酶切的Lambda DNA-6kb片段按照摩爾比濃度為1∶5室溫連接一小時(shí)后連接過(guò)夜，并將1ul連接液電擊轉(zhuǎn)化DH10B，通過(guò)統(tǒng)計(jì)單克隆數(shù)的數(shù)目來(lái)判斷處理的載體去磷酸化效果，即處理過(guò)的載體是否可以用于文庫(kù)構(gòu)建(參見圖2)，計(jì)算顯示克隆數(shù)大約為1600個(gè)，克隆數(shù)＞8cfu/ul。同時(shí)對(duì)處理好的載體進(jìn)行自連并電擊轉(zhuǎn)化DH10B，結(jié)果只出現(xiàn)少數(shù)的克隆。陽(yáng)性克隆用HindIII酶切進(jìn)行酶切分析，瓊脂糖凝膠電泳。
6)包埋法提取東鄉(xiāng)野生稻大片段基因組DNA取50g分裝保存于-80℃的東鄉(xiāng)野生稻幼嫩葉片，在液氮預(yù)冷的研缽中加液氮將其迅速研磨成比較細(xì)的粉末。將研磨好的葉片粉末轉(zhuǎn)入到1L的三角瓶中，加入500ml預(yù)冷的BME，冰上放置12min，期間每2min對(duì)溶液輕搖20s。用四層無(wú)菌的紗布對(duì)混合物進(jìn)行過(guò)濾，將溶液轉(zhuǎn)入另一個(gè)無(wú)菌的預(yù)冷的1L三角瓶中，紗布過(guò)濾兩次，過(guò)濾完后再用2～4層無(wú)菌的擦鏡紙對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾，然后溶液轉(zhuǎn)入到新的預(yù)冷的1L三角瓶中，過(guò)濾好的溶液顏色一般為淡黃綠色。然后加入25ml的Lysis buffer，冰上放置12min，期間每2min輕搖溶液20s。
將溶液分裝于50ml離心管中，用轉(zhuǎn)頭T12A4，4℃，3200rpm離心12min。棄上清后用3～5ml BME重旋，將兩管懸液并入一管中，將離心管加滿BME，4℃，3200rpm離心12min。重復(fù)以上步驟，直到懸液全部并入一個(gè)離心管中，用BME重懸，4℃，1300rpm，離心12min。如果沉淀物顏色有明顯的綠色物質(zhì)，可通過(guò)增加離心次數(shù)和降低離心力來(lái)盡可能的將葉綠體從中分離出去。沉淀物為淡的黃綠色最佳。用NIB重懸沉淀，4℃，3200rpm離心12min。輕棄上清，留沉淀物大小1/2體積的NIB重旋沉淀。將重旋液和已經(jīng)溶解好的1.0％的低熔點(diǎn)瓊脂糖在45℃恒溫浴中預(yù)熱7min，將兩者等體積混合?；旌虾蟓傊堑臐舛瓤刂圃?.3％～0.5％。將混合物用大口吸頭轉(zhuǎn)入plugmold中，每個(gè)孔的體積約為85μl，將plug mold置于冰上放置60min使瓊脂糖凝固好。
用plug mold配套的工具將膠塊擠出到50ml離心管中，然后向離心管中加入含1mg/ml proteinase K的EPS buffer，體積為膠塊數(shù)的10倍體積，將離心管置于50℃的水浴搖床中，低速振蕩24hrs。輕輕的將EPS buffer倒掉，加入同體積的含1mg/ml proteinase K的EPS buffer，將離心管置于50℃的水浴搖床中，低速振蕩24hrs。輕輕的將EPS buffer倒掉，按每個(gè)膠塊加入1ml T10E10溶液，其中PMSF終濃度為1mM，室溫下輕搖1hr，重復(fù)此步驟一次。棄掉溶液，按每個(gè)膠塊加入1ml T10E1溶液，室溫下輕搖1hr，重復(fù)此步驟三次。將膠塊保存于T10E1中，置于4℃冰箱，可放置半年而DNA不發(fā)生明顯降解。
將1/2、1/4、1/8、1/16大小的膠塊依次放入到1×TAE配置的1.0％濃度的瓊脂糖膠的膠孔中，用1.0％的低熔點(diǎn)瓊脂糖膠將膠孔封好，冷卻后將瓊脂糖膠放入脈沖電泳儀電泳槽中，按下面的參數(shù)條件進(jìn)行脈沖電泳1TAE；buffertemperature＝12℃；volts/cm＝6.0；included angle＝120；initial switchtime＝1s；final switch time＝40s；ramping＝linear；run time＝20hrs。電泳完畢將瓊脂糖膠放入到EB工作液中浸泡20～30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照(參見圖3)，圖中M為NEB脈沖marker，1-4分別是1/16、1/8、1/4、1/12大小的膠塊電泳效果。
7)野生稻基因組DNA的酶切和分離為獲得高質(zhì)量的基因組DNA，對(duì)包埋的膠塊進(jìn)行回收，將包埋塊通過(guò)下列參數(shù)5V/cm，12℃，switch time＝50s，time＝4h，將包埋膠塊中的DNA回收至0.6％的低熔點(diǎn)瓊脂糖?；厥张c包埋膠塊相鄰的3～5mm膠塊，并用TE洗滌(參見圖4)，再進(jìn)行梯度酶切實(shí)驗(yàn)配置15ml Hind的1×工作緩沖液，分別吸取250ul 1×工作緩沖液于11個(gè)標(biāo)記為a-k的1.5ml的EP管中。將回收的100mg的低熔點(diǎn)瓊脂糖膠塊保存于T10E1的膠塊放入到剩下的HindIII 1×工作緩沖液，置于冰上放置1hr。配置兩個(gè)不同濃度的HindIII溶液，配方如下

然后在a-k這11個(gè)管中按下表的量加入HindIII

將膠塊從HindIII工作緩沖液中取出，在潔凈的載玻片上用經(jīng)乙醇消毒的蓋玻片將每個(gè)膠塊放入b-k管，a中放入200mg膠塊，置于冰上放置1h，使酶與膠塊的中的DNA充分接觸。1h后將11個(gè)管子在37℃恒溫水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)20min，然后馬上將11個(gè)管子插在冰上，每個(gè)管中加入，pH8.0、0.5M的EDTA 30ul，終止酶活反應(yīng)。將HindIII/Lambda Marker，10kbmarker及各個(gè)管中的膠塊依次放入到1TAE配置的1.0％濃度的瓊脂糖膠的膠孔中，用1.0％的低熔點(diǎn)瓊脂糖膠將膠孔封好，冷卻后將瓊脂糖膠放入脈沖電泳槽中，按以下參數(shù)條件進(jìn)行脈沖電泳1TAE；buffer temperature＝12℃；volts/cm＝6.0；included angle＝120；initial switch time＝1s；final switch time＝40s；ramping＝linear；runtime＝20hrs。電泳完畢將瓊脂糖膠放入到EB工作液中浸泡20～30min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)拍照。根據(jù)酶切產(chǎn)生的片段是否在所需片段的范圍內(nèi)來(lái)確定最佳的酶量用酶切測(cè)試確定的最佳酶量對(duì)回收膠塊進(jìn)行大量酶切，準(zhǔn)確反應(yīng)之后按上述的參數(shù)進(jìn)行脈沖電泳。開始第一次分離切取邊緣少量的酶切膠塊進(jìn)行EB染色，然后準(zhǔn)確度量確定8-10kb和10-23kb位置，切取含有目的片段未染色的膠塊；第二次分離對(duì)8-10kb和10-23kb膠塊以以上條件再回收(參見圖5)，圖中M1為L(zhǎng)ambdaDNA/HindIII marker，M2為10kb marker，A為10-23kb回收效果，B為8-10kb回收效果。最后使用Qiagen試劑盒對(duì)含目的片段的膠塊進(jìn)行膠回收操作。用已知濃度的Lambda DNA作為Marker、1.0％的瓊脂糖、150V普通瓊脂糖電泳20min，電泳完畢后在EB工作液中染色20min(參見圖6)，圖中1～5分別為濃度是50、25、10、5、2.5ng的Lambda DNA電泳效果，6～7分別為0.5ul回收的8-10kb和10-23kb電泳效果，8為0.5ul處理的pCAMBIA1301質(zhì)粒電泳效果。
8)連接反應(yīng)及電擊轉(zhuǎn)化將處理后的pCAMBIA1301載體與用HindIII酶切進(jìn)行兩次分離的東鄉(xiāng)野生稻8-10kb和10-23kb片段按照摩爾比濃度為1∶5室溫連接1小時(shí)后連接過(guò)夜，并將連接液在0.025um Millipore濾膜、10％PEG8000上進(jìn)行脫鹽和濃縮1.5-2hrs。然后用寬口吸頭輕輕地將連接液放入1.5ml EP管中，可以在4℃條件下短時(shí)間保存，也可在-20℃做較長(zhǎng)時(shí)間的保存。取1ul濃縮連接液電擊轉(zhuǎn)化20ulInvitrogen ElectroMAXTMDH10BTMCells。電擊參數(shù)為1800V，25uF，20Ω，1mm，在37℃恒溫?fù)u床、225rpm條件下復(fù)蘇1hrs，然后將培養(yǎng)物涂布于含有Km的LB固體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。共獲得80個(gè)平板，平均每個(gè)平板單克隆數(shù)為1700-2000個(gè)，故文庫(kù)共有約130000-150000個(gè)克隆。
9)東鄉(xiāng)野生稻文庫(kù)的檢測(cè)及文庫(kù)質(zhì)粒抽提隨機(jī)在平板挑取100個(gè)克隆進(jìn)行文庫(kù)插入片斷大小的檢測(cè)，過(guò)夜培養(yǎng)并用分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版小量抽提質(zhì)粒法抽提質(zhì)粒，20ul反應(yīng)體系，37℃，反應(yīng)1-2h(參見圖7)，圖中M為L(zhǎng)ambdaDNA/HindIII marker，1-15分別為文庫(kù)質(zhì)粒經(jīng)BamH I酶切鑒定結(jié)果，16為pCAMBIA1301載體經(jīng)BamH I酶切結(jié)果，M為L(zhǎng)ambdaDNA/HindIII marker。進(jìn)行文庫(kù)容量的估計(jì)根據(jù)文庫(kù)所抽提的100個(gè)單克隆質(zhì)粒，自連＜1％，空載＜0.5％，平均插入片斷長(zhǎng)度9.5kb，覆蓋東鄉(xiāng)野生稻基因組約3.28倍，覆蓋每個(gè)基因的概率為96.2％。
由于含有質(zhì)粒的細(xì)菌間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)時(shí)不利于基因的選擇，故先將細(xì)菌在平板上擴(kuò)增然后刮取擴(kuò)增的單克隆優(yōu)于使用液體培養(yǎng)基的方法。對(duì)于在起始文庫(kù)中含量很少的基因，有必要進(jìn)行第二輪的富集。第一輪富集的DNA作為第二輪富集的起始材料。將5mlLB加入到平板中，小心的將平板上的菌落用涂布棒混入液體中。按此方法一般能得到2000-3500個(gè)克隆。用移液槍將細(xì)胞懸液移至50ml的離心管中，重復(fù)此步操作，將所有的平板中的克隆收集。4℃，4000rpm離心10min，小心的倒掉上清。使用NautilusTMMiniPrep Kit抽提質(zhì)粒并將濃度定至1μg/ul。提取質(zhì)粒后對(duì)DNA進(jìn)行定量(參見圖8)，圖中1～6分別為濃度100、50、25、10、5、2.5ng的Lambda DNA，7～8分別為兩批純化0.5ul文庫(kù)質(zhì)粒DNA。用篩選引物檢測(cè)富集后的DNA，與富集之前進(jìn)行定量比較。將純化的文庫(kù)質(zhì)粒分裝后-80℃保存。采用PCR分析檢測(cè)到文庫(kù)中確實(shí)含有所要富集的基因(參見圖9)，圖中M為100bp marker，1～3分別為pCAMBIA1301、文庫(kù)質(zhì)粒、探針模版相同的五對(duì)混合引物擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增方法均按本實(shí)施例候選抗性基因富集文庫(kù)的構(gòu)建所述方法。
上述實(shí)施例僅對(duì)雙元質(zhì)粒載體文庫(kù)的構(gòu)建進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，同樣本發(fā)明涉及的野生稻可轉(zhuǎn)化基因組文庫(kù)也可以采用普通雙元質(zhì)粒載體文庫(kù)或雙元細(xì)菌人工染色體文庫(kù)。
2、候選抗性基因富集文庫(kù)的構(gòu)建1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)已克隆的抗稻瘟病基因Pi-9的NBS和LRR保守序列設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物①Pi-9N(上游引物5-TGGTTTAGGCAAGACAGC-3，下游引物5-ATGTTATGGCATCGTT CA-3)②Pi-9L1(上游引物5-GATGTTACGGGTCTTGGA-3，下游引物5-ACTACTGGTCCGCCTGAT-3)③Pi-9L2(上游引物5-ATGTGAATGCTGCGTTAT-3，下游引物5-GCCTAGCCAC TTTACTTTT-3)根據(jù)抗白葉枯基因Xa21的LRR和STK保守序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物④Xa21L(上游引物5-GCGATAACTCCATCCAAG-3，下游引物5-TCCACTGAACAAGTTGCC-3)⑤Xa21S(上游引物5-GTTTCACTGCCGAATGTG-3，下游引物5-CGAGCTTGTTGACTGTTG-3)根據(jù)NBS-LRR類及STK類抗病基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)簡(jiǎn)并引物⑥RNL1F 5’-GGN GGN NTN GGN AAR ACN AC-3’，RNL1R 5’-AN NSH NAR NGG NAR NCC-3’⑦RS1F 5’-TTY GGN RDN GTN TAY MRN GG-3’，RS1R5’-AY NCC RWA NGA RTA NAY RTC-3’(簡(jiǎn)并引物中混合堿基代碼R＝A/G，W＝A/T，Y＝C/T，M＝A/C，S＝C/G，H＝A/T/C，N＝A/T/G/C.)2)探針模板的制備制備用于探針合成的DNA模板并檢測(cè)文庫(kù)中是否含有所需要富集的基因，PCR反應(yīng)體系(35ul)為

PCR反應(yīng)程序如下①95℃預(yù)變性3min；②95℃變性1min→54.3℃退火1min→72℃延伸1min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；③72℃延伸7min。可以根據(jù)設(shè)計(jì)的引物對(duì)條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
3)模板的純化取摸板12μl，用1％的瓊脂糖膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的純度，選擇用于探針合成的最佳模板。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行膠回收用于探針合成(參見圖10)，圖中M為100bpmarker，1～4分別為Pi-9L2、Pi-9L1、Xa21S和Xa21L四對(duì)特異性引物對(duì)東鄉(xiāng)基因組DNA擴(kuò)增片段。結(jié)果顯示四個(gè)引物組合均能夠產(chǎn)生特異的PCR產(chǎn)物。
4)探針生物素標(biāo)記PCR反應(yīng)體系(50μl)為

PCR反應(yīng)程序如下①95℃預(yù)變性3min；②95℃變性1min→54.3℃退火1min→72℃延伸2min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；③72℃延伸7min。
5)探針的回收取2μl PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)產(chǎn)物的純度和濃度。對(duì)膠回收的特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，通過(guò)電泳或者光吸收進(jìn)行定量(參見圖11)，圖中M為100bp marker，1為混合引物擴(kuò)增生物素探針。每50μl PCR反應(yīng)體系應(yīng)該產(chǎn)生0.5～1.5μg的探針?；厥蘸笥煤?0mM Tris-HCl、pH＝8.0，0.1mM EDTA的TE)將探針濃度稀釋到25ng/μl。
6)富集反應(yīng)按以下步驟進(jìn)行生物素標(biāo)記的探針包裝重組酶將50ng生物素標(biāo)記的探針加入1.5ml的EP管中，并加入足夠的水，使終體積為12.4μl；將探針在95℃變性3min，在冰上淬火1min。短時(shí)間離心使液體聚集到管底；在0.5mlEP管中依次加入5×Coating Mix 6.0μl、Nucleotide Cofactor3.7μl、RecA recombinase0.7μl、準(zhǔn)備RecA反應(yīng)混和液；將10.4μl的RecA反應(yīng)混和液加入含有12.4μl 50ng變性的生物素標(biāo)記探針中，輕輕的混和；37℃溫浴15min。為了優(yōu)化試驗(yàn)，此步操作之后不要將樣品放到冰上。在溫浴的過(guò)程中開始磁珠的準(zhǔn)備。
在溫浴開始磁珠的準(zhǔn)備磁珠的體積和其他緩沖液的體積應(yīng)該跟據(jù)樣品的數(shù)目按比例增加。具體步驟為輕輕的渦旋親和素標(biāo)記的磁珠成懸液，每個(gè)反應(yīng)在1.5mlEP管中加入30μl的磁珠懸液。每次反應(yīng)加入100μl Binding Buffer，然后室溫下在環(huán)形搖床上混勻2min；低速短時(shí)間離心把所有的液體聚集的管底；打開EP管蓋并放置到磁力架上1min，將EP管放置到磁力架上，小心的用移液器去上清；重復(fù)用100μl Binding Buffer洗兩次，一共洗三次；先將30μl BindingBuffer加入盛有磁珠的EP管中，然后每次反應(yīng)加入2μl沒有稀釋的CompetitorDNA飽和非特異性的結(jié)合位點(diǎn)，輕輕搖勻并放到環(huán)形搖床上室溫下?lián)u勻10-30min；短時(shí)間離心將所有液體沉到管底，敞開EP管蓋，放置到磁力架上大約1min。EP管放到磁力架上的同時(shí)，小心的去上清，每個(gè)反應(yīng)加入30μl Bindingbuffer。
進(jìn)行探針與目的片斷雜交先將1.5μl CompetitorDNA和148.5μl TE加入到0.5ml EP管中，取1.5μl 1∶100稀釋液倒新的0.5mlEP管中，95℃變性3min，在冰上淬火1min。短時(shí)間離心把管內(nèi)液體沉到管底；再將已標(biāo)記的生物素探針包裝反應(yīng)物從37℃取出，加入1∶100變性的Competitor DNA 1μl，輕輕的用移液器充分混勻；立即加入試劑盒提供的Targeting Additive 1.2μl、質(zhì)粒文庫(kù)混合液5.0μl，總體積為30.0μl；輕輕混勻后在37℃放置20min；加入1.2μl SDS去除核酸核蛋白中的蛋白，總體積為31.2μl；再輕輕的混勻并在37℃溫浴10min。
與磁珠進(jìn)行雜交結(jié)合先將30μl處理的磁珠加到盛有31.2μl同源重組反應(yīng)的EP管中，總體積為61.2μl；再將混合液室溫在環(huán)形搖床上搖勻30min，使磁珠與同源重組形成的雜交復(fù)合物連接；進(jìn)行短時(shí)間離心，使管中的液體沉到管底；打開EP管蓋并放置到磁力架上1min，小心的用移液器去上清；加入1ml的WashBuffer，室溫下在環(huán)形搖床上搖勻5min。短時(shí)間離心使管內(nèi)的液體沉到管底，將EP管放置到磁力架上，小心的用移液器去上清。再重復(fù)該步操作3次，一共處理4次；加入1ml 0.1×TE，室溫下在環(huán)形搖床上搖勻5min。打開EP管蓋并放置到磁力架上1min，將EP管放置到磁力架上，小心的用移液器去上清；加入10μl0.1×TE，充分混合，用移液槍充分的重懸磁珠混合液；將磁珠重懸液加入到新的0.5mlEP管中，65℃溫浴5min，以洗脫目的DNA；將管放置到磁力架上，室溫下使磁珠聚集，小心的將上清移至新的0.5mlEP管中。上清中含有富集的目的DNA。
使用InvitrogenDH10B感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。富集前后的比較(參見圖12)，圖中A表示質(zhì)粒文庫(kù)富集前，B表示經(jīng)RecActiveTM富集試劑盒提供的質(zhì)粒文庫(kù)富集后，圖中可以觀察到質(zhì)粒文庫(kù)富集后菌落密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出富集前。
挑取單菌落至含80μl LB凍存液為384孔板，并進(jìn)行復(fù)制以制備富集平板文庫(kù)，共3板，其中兩塊保存，另1塊使用。
3、富集鑒定與篩選由于富集文庫(kù)DNA轉(zhuǎn)化的感受態(tài)所鋪的平板太密集會(huì)使挑單克隆非常困難。故稀釋SOC轉(zhuǎn)化物后重新鋪平板，并在37℃過(guò)夜培養(yǎng)16小時(shí)。
1)點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)富集平板，使用生物素標(biāo)記的探針，按點(diǎn)雜交方法檢測(cè)，并設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照(參見圖13)。圖中顯示3塊平板共篩選12個(gè)陽(yáng)性克隆。
2)PCR鑒定及擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測(cè)序?yàn)榱吮ＷC獲得含量低的基因和基因的全長(zhǎng)度，使用兩個(gè)96孔板，將含有Km抗生素的LB加入到96孔板中；從平板上挑取單克隆至含有LB的96孔板中，用滲透性膜封好96孔板防止污染；將96孔板在37℃溫浴2hrs；再將9μl水加到兩個(gè)新的96孔PCR板上；加1μl 37℃溫浴的克隆平板樣品到相應(yīng)的96孔板上，留出兩個(gè)孔作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。用100ng的文庫(kù)DNA作為陽(yáng)性對(duì)照；將其在PCR儀上95℃變性10min，快速的在冰上淬火；在每個(gè)96孔板中加入15μl下列反應(yīng)混和物

PCR反應(yīng)程序?yàn)棰?5℃預(yù)變性3min；②95℃變性1min→54.3℃退火1min→72℃延伸2min，共計(jì)34個(gè)循環(huán)；③72℃延伸7min。反應(yīng)后通過(guò)12μl點(diǎn)樣到1％的瓊脂糖膠上，檢測(cè)PCR產(chǎn)量。選擇與預(yù)期條帶一樣的陽(yáng)性克隆。進(jìn)行擴(kuò)增片斷克隆與測(cè)序挑取2個(gè)陽(yáng)性克隆DB19H21和DB17G9抽提質(zhì)粒后，用PCR進(jìn)行擴(kuò)增鑒定(參見圖14)，圖中M為100bp marker，1-12均為陽(yáng)性克隆。同時(shí)用TA載體進(jìn)行克隆。上述2個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果見SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
由于氨基酸水平上更容易反映序列的保守性，采用SMS軟件將SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2翻譯成蛋白序列，結(jié)果見SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
因?yàn)樾蛄蠨B19H21與DB17G9是采用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增得到的，將其氨基酸序列用NCBI網(wǎng)站上的blastp程序進(jìn)行分析，顯示所得的序列中含有保守的NB-ARC結(jié)構(gòu)域。該區(qū)域?yàn)橹参锟共』虍a(chǎn)物中的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)，含有典型的保守區(qū)的P-loop(GGXGKTT)、Kinase-2(VLDD)、Kinase-3(SRXXXTTR)和跨膜區(qū)GLPL結(jié)構(gòu)，為NBS-LRR類型抗病蛋白編碼基因。
從NCBI網(wǎng)站上獲得已知的9個(gè)植物抗病基因RPS2、RPS-2、I2C-1、I2C-2、RPP13、RPP8、RPM1、Prf、RPP5的序列，利用ClustalX 1.81軟件對(duì)這9個(gè)已知的植物抗病基因的NB-ARC保守區(qū)域序列(SEQ ID NO.5～13)與DB19H21、DB17G9序列的保守結(jié)構(gòu)域序列(SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15)之間進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們的保守結(jié)構(gòu)域高度一致(參見圖15)，且都具有抗病基因的NBS特征結(jié)構(gòu)域。
將所得的氨基酸序列與9個(gè)已知抗性基因的序列在氨基酸水平上進(jìn)行聚類分析(參見圖16)，結(jié)果表明DB19H21、DB17G9與Prf基因的親緣關(guān)系較近，與RPP5的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；同時(shí)DB19H21、DB17G9被聚為一類，由此推測(cè)這兩個(gè)序列可能屬于同一個(gè)基因家族。鑒于Prf基因已經(jīng)被證明是蕃茄中的一個(gè)抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病的基因，故推測(cè)所得到的序列也是一個(gè)新候選抗性基因。
Untitled.ST25SEQUENCE LISTING<110>湖南西城雜交水稻基因科技有限公司長(zhǎng)沙雜交水稻基因工程技術(shù)研究中心<120>一種克隆野生稻新抗性基因的方法<130>
<160>15<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>504<212>DNA<213>Oryza sativa<400>1gggggggtgg ggaagacgac actagctcag aaaatattca atgataaaaa attagaaggg60agatttgacc atcgtgcctg ggtttgtgtc tccaaggagt attctatggt ttcccttttg120acacaagttc ttagtaacat gaaaattcat tatgaacaaa atgaatcagt tgggaacctt180caaagcaaac tcaaagcagg cattgcagac aagagttttt tccttgtgtt ggatgatgta240tggcactata aagcatggga agatttacta agaactccac taaatgcggc agccacagga300ataattctag taactactcg agatgaaact attgctcgtg taattggggt ggaccggact360catagagttg atttgatgtc agccgatgta ggatgggagt tactttggag gagcatgaac420atcaaagaag agaaacaagt gaaaaatcta cgggacacag gtatcgagat tgtccgcaaa480tgtggtggcc tccccctcgc cctc504
Untitled.ST25<210>2<211>504<212>DNA<213>Oryza sativa<400>2gggggggtgg ggaagacgac actagctcag aaaatattca atgataaaaa aataaaagat60caattcaaca tgcatacatg ggtctgtgtt accaaggact attctgaagc ttctattttg120agagaaattc ttcggaacat gggaaagcca tatgcgcaag atgaatcagt tggagagctc180caaattaagc tccaatcagc cattgaaggg aagagttttt tccttgtgtt ggatgatgtg240tggcaatctg aagcatggac aaatttacta agaactccac tgcgtgctgc agccacagga300atacttctag tgactacacg acatgataat atcacaaaag aaattgggac aaaccatact360catagagtaa atttgatgtt agctgatgtg ggatgggagc tactttggag gagcttgaac420atcgatgaag aaaaaccagt gcaaaaactg cggaacatag ggattgagat tgttcgcaga480tgtgatggcc tccccctcgc cctc504<210>3<211>168<212>PRT<213>Oryza sativa<400>3Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Phe Asn Asp Lys1 5 10 15Lys Leu Glu Gly Arg Phe Asp His Arg Ala Trp Val Cys Val Ser Lys20 25 30
Untitled.ST25Glu Tyr Ser Met Val Ser Leu Leu Thr Gln Val Leu Ser Asn Met Lys35 40 45Ile His Tyr Glu Gln Asn Glu Ser Val Gly Asn Leu Gln Ser Lys Leu50 55 60Lys Ala Gly Ile Ala Asp Lys Ser Phe Phe Leu Val Leu Asp Asp Val65 70 75 80Trp His Tyr Lys Ala Trp Glu Asp Leu Leu Arg Thr Pro Leu Asn Ala85 90 95Ala Ala Thr Gly Ile Ile Leu Val Thr Thr Arg Asp Glu Thr Ile Ala100 105 110Arg Val Ile Gly Val Asp Arg Thr His Arg Val Asp Leu Met Ser Ala115 120 125Asp Val Gly Trp Glu Leu Leu Trp Arg Ser Met Asn Ile Lys Glu Glu130 135 140Lys Gln Val Lys Asn Leu Arg Asp Thr Gly Ile Glu Ile Val Arg Lys145 150 155 160Cys Gly Gly Leu Pro Leu Ala Leu165<210>4<211>168<212>PRT<213>Oryza sativa<400>4Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Phe Asn Asp Lys1 5 10 15
Untitled.ST25Lys Ile Lys Asp Gln Phe Asn Met His Thr Trp Val Cys Val Thr Lys20 25 30Asp Tyr Ser Glu Ala Ser Ile Leu Arg Glu Ile Leu Arg Asn Met Gly35 40 45Lys Pro Tyr Ala Gln Asp Glu Ser Val Gly Glu Leu Gln Ile Lys Leu50 55 60Gln Ser Ala Ile Glu Gly Lys Ser Phe Phe Leu Val Leu Asp Asp Val65 70 75 80Trp Gln Ser Glu Ala Trp Thr Asn Leu Leu Arg Thr Pro Leu Arg Ala85 90 95Ala Ala Thr Gly Ile Leu Leu Val Thr Thr Arg His Asp Asn Ile Thr100 105 110Lys Glu Ile Gly Thr Asn His Thr His Arg Val Asn Leu Met Leu Ala115 120 125Asp Val Gly Trp Glu Leu Leu Trp Arg Ser Leu Asn Ile Asp Glu Glu130 135 140Lys Pro Val Gln Lys Leu Arg Asn Ile Gly Ile Glu Ile Val Arg Arg145 150 155 160Cys Asp Gly Leu Pro Leu Ala Leu165<210>5<211>70<212>PRT<213>arabidopsis thaliana<400>5
Untitled.ST25Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Met Gln Ser Ile Asn Asn Tyr Asp1 5 10 15Val Leu Ile Trp Val Gln Met Ser Lys Arg Phe Leu Leu Leu Leu Asp20 25 30Asp Val Trp Leu Glu Lys Thr Gly Val Pro Arg Pro Lys Val Met Phe35 40 45Thr Thr Arg Ile Arg Arg Leu Ala Glu Ile Ile Val Ser Lys Cys Gly50 55 60Gly Leu Pro Leu Ala Leu65 70<210>6<211>70<212>PRT<213>arabidopsis thaliana<400>6Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Phe Lys Lys Ile His Asn Phe Asp1 5 10 15Ile Val Ile Trp Ile Val Val Ser Lys Arg Phe Val Leu Met Leu Asp20 25 30Asp Ile Trp Leu Glu Ala Ile Gly Ile Pro Tyr Pro Lys Val Ala Phe35 40 45Thr Thr Arg Ile Val Glu Leu Ala Arg Glu Val Ala Gln Lys Cys Arg50 55 60Gly Leu Pro Leu Ala Leu65 70<210>7
Untitled.ST25<211>70<212>PRT<213>lycopersicom esculentum<400>7Gly Gly Met Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Ala Val Tyr Asn Phe Gly1 5 10 15Leu Thr Ala Trp Phe Cys Val Ser Lys Arg Phe Leu Val Val Leu Asp20 25 30Asp Val Trp Trp Asp Asp Leu Arg Asn Leu Phe Leu Lys Ile Ile Val35 40 45Thr Thr Arg Phe Glu Glu Val Gly Lys Gln Ile Ala Asp Lys Cys Lys50 55 60Gly Leu Pro Leu Ala Leu65 70<210>8<211>70<212>PRT<213>lycopersicom esculentum<400>8Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Ala Val Tyr Asn Phe Asp1 5 10 15Leu Lys Ala Trp Phe Cys Val Ser Lys Lys Phe Leu Ile Val Leu Asp20 25 30Asp Val Trp Trp Asp Glu Leu Arg Asn Val Phe Val Lys Ile Ile Val35 40 45Thr Thr Arg Leu Glu Glu Val Gly Arg Gln Ile Ala Ala Lys Cys Lys50 55 60
Untitled.ST25Gly Leu Pro Leu Ala Leu65 70<210>9<211>70<212>PRT<213>arabidopsis thaliana<400>9Gly Gly Leu Gly Lys Thr Ala Leu Ala Arg Lys Leu Tyr Asn Phe Glu1 5 10 15Tyr Arg Ala Trp Thr Tyr Val Ser Lys Lys Tyr Leu Val Val Val Asp20 25 30Asp Ile Trp Trp Asp Ser Leu Lys Arg Ala Leu Pro Arg Val Ile Ile35 40 45Thr Thr Arg Leu Leu Lys Thr Gly Lys Glu Met Val Gln Lys Cys Arg50 55 60Gly Leu Pro Leu Cys Ile65 70<210>10<211>70<212>PRT<213>arabidopsis thaliana<400>10Gly Gly Ile Gly Lys Thr Thr Leu Ala Arg Gln Val Phe His Phe Asp1 5 10 15Gly Phe Ala Trp Val Cys Val Ser Gly Arg Tyr Leu Val Val Leu Asp20 25 30Asp Val Trp Trp Asp Val Ile Lys Ala Val Phe Pro Lys Met Leu Leu
Untitled.ST2535 40 45Thr Ser Arg Met Glu Ala Met Gly Lys Glu Met Val Thr His Cys Gly50 55 60Gly Leu Pro Leu Ala Val65 70<210>11<211>70<212>PRT<213>arabidopsis thaliana<400>11Gly Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ile Phe Lys Phe Glu1 5 10 15Ser Tyr Ala Trp Val Thr Ile Ser Lys Arg Tyr Ile Val Val Leu Asp20 25 30Asp Val Trp Trp Arg Glu Ile Ser Ile Ala Leu Pro Arg Val Met Met35 40 45Thr Thr Arg Leu Glu Pro Ile Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Cys Gln50 55 60Gly Leu Pro Leu Ala Ile65 70<210>12<211>70<212>PRT<213>lycopersicom esculentum<400>12Pro Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Lys Ile Tyr Asn Phe Asp1 5 10 15
Untitled.ST25Val His Ala Gln Cys Val Val Thr Lys Arg Phe Leu Ile Leu Ile Asp20 25 30Asp Val Trp Trp Asp Asn Leu Cys Met Cys Phe Ser Arg Ile Ile Leu35 40 45Thr Thr Arg Leu Glu Asp Val Gly Phe Glu Ile Ser Lys Ser Cys Arg50 55 60Gly Leu Pro Leu Ser Val65 70<210>13<211>70<212>PRT<213>arabidopsis thaliana<400>13Ser Gly Ile Gly Lys Ser Thr Ile Gly Arg Ala Leu Phe Ser Arg Ala1 5 10 15Phe Leu Thr Tyr Lys Ser Thr Ser Lys Lys Val Leu Ile Leu Leu Asp20 25 30Asp Val Asp Leu Lys Thr Leu Val Gly Lys Ala Glu Arg Ile Ile Val35 40 45Ile Thr Gln Phe Lys Glu Leu Ala Phe Glu Val Ala Glu Leu Val Gly50 55 60Ser Leu Pro Leu Gly Leu65 70<210>14<211>70<212>PRT<213>Oryza sativa
Untitled.ST25<400>14Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Phe Asn Phe Asp1 5 10 15His Arg Ala Trp Val Cys Val Ser Lys Ser Phe Phe Leu Val Leu Asp20 25 30Asp Val Trp Trp Glu Asp Leu Leu Arg Thr Pro Leu Ile Ile Leu Val35 40 45Thr Thr Arg Leu Arg Asp Thr Gly Ile Glu Ile Val Arg Lys Cys Gly50 55 60Gly Leu Pro Leu Ala Leu65 70<210>15<211>70<212>PRT<213>Oryza sativa<400>15Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Phe Asn Phe Asn1 5 10 15Met His Thr Trp Val Cys Val Thr Lys Ser Phe Phe Leu Val Leu Asp20 25 30Asp Val Trp Trp Thr Asn Leu Leu Arg Thr Pro Leu Ile Leu Leu Val35 40 45Thr Thr Arg Leu Arg Asn Ile Gly Ile Glu Ile Val Arg Arg Cys Asp50 55 60Gly Leu Pro Leu Ala Leu65 70
權(quán)利要求
1.一種克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于包括如下步驟(1)供體野生稻可轉(zhuǎn)化基因組文庫(kù)的構(gòu)建；(2)根據(jù)植物抗性基因的保守性設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用生物素標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針；(3)使用已標(biāo)記探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行磁珠富集，構(gòu)建富集文庫(kù)；(4)對(duì)富集文庫(kù)的克隆進(jìn)行鑒定分析，包括使用上述引物進(jìn)行PCR分析、點(diǎn)雜交分析、擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序分析；(5)對(duì)利用富集文庫(kù)篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行功能驗(yàn)證，篩選出野生稻新抗性基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步驟(1)中野生稻可轉(zhuǎn)化基因組文庫(kù)為普通雙元質(zhì)粒載體文庫(kù)、雙元細(xì)菌人工染色體文庫(kù)或可轉(zhuǎn)化人工染色體文庫(kù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步驟(2)中所述的引物為以下5對(duì)特異性引物①Pi-9，上游引物5-TGGTTTAGGCAAGACAGC-3，下游引物5-ATGTTATGGCATCGTTCA-3；②Pi-9L，上游引物5-GATGTTACGGGTCTTGGA-3，下游引物5-ACTACTGGTCCGCCTGAT-3；③Pi-9L2，上游引物5-ATGTGAATGCTGCGTTAT-3，下游引物5-GCCTAGCCACTTTACTTTT-3；④Xa21L，上游引物5-GCGATAACTCCATCCAAG-3，下游引物5-TCCACTGAACAAGTTGCC-3；⑤Xa21S，上游引物5-GTTTCACTGCCGAATGTG-3，下游引物5-CGAGCTTGTTGACTGTTG-3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于所述五對(duì)引物中Pi-9N、Pi-9L1、Pi-9L2是根據(jù)已克隆的抗稻瘟病基因Pi-9的NBS和LRR保守序列所設(shè)計(jì)的三對(duì)特異性引物，Xa21L和Xa21S是根據(jù)已克隆的抗白葉枯基因Xa21的LRR和STK保守序列所設(shè)計(jì)的特異性引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步驟(2)中所述的探針為以上五對(duì)引物等量混合所擴(kuò)增野生稻的混合產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步驟(2)中所述的引物可以為以下兩對(duì)簡(jiǎn)并引物⑥RNL1F 5’-GGN GGN NTN GGN AAR ACN AC-3’，RNL1R 5’-AN NSH NAR NGG NARNCC-3’⑦RS1F 5’-TTY GGN RDN GTN TAY MRN GG-3’，RS1R5’-AY NCC RWA NGA RTA NAYRTC-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于所述兩對(duì)引物是根據(jù)NBS-LRR類及STK類抗病基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成的兩對(duì)簡(jiǎn)并引物，且簡(jiǎn)并引物中混合堿基代碼為R＝A/G，W＝A/T，Y＝C/T，M＝A/C，S＝C/G，H＝A/T/C，N＝A/T/G/C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步驟(2)中所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)棰?5℃預(yù)變性3min；②95℃變性1min、54.3℃退火1min、72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；③72℃延伸7min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步驟(4)中PCR反應(yīng)程序?yàn)棰?5℃預(yù)變性3min；②95℃變性1min、54.3℃退火1min、72℃延伸2min，共34個(gè)循環(huán)；③72℃延伸7min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步驟(4)中擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序分析得到2個(gè)陽(yáng)性克隆核苷酸序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種克隆野生稻新抗性基因的方法，它包括首先構(gòu)建供體野生稻可轉(zhuǎn)化基因組文庫(kù)，再根據(jù)已克隆抗稻瘟病基因及抗白葉枯基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針，然后使用已標(biāo)記探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行磁珠富集，建立候選抗性基因富集文庫(kù)，最后對(duì)富集文庫(kù)的克隆進(jìn)行點(diǎn)雜交分析、PCR鑒定、擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測(cè)序分析及功能驗(yàn)證。本發(fā)明集成了候選抗性基因克隆技術(shù)和磁珠富集文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)，適用于野生稻新抗性基因及其他植物有利基因的克隆。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101045928SQ20071003442
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2007年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月12日
發(fā)明者曹孟良, 辜顯旺, 田志堅(jiān), 李磊, 邢俊杰, 袁隆平, 李強(qiáng), 崔玲玲, 張朝良, 金緯, 李煊, 孔潔潔 申請(qǐng)人:湖南西城雜交水稻基因科技有限公司, 長(zhǎng)沙雜交水稻基因工程技術(shù)研究中心