專利名稱：：光高粱的檢測引物及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)植物檢驗檢疫
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及一種利用分子生物學(xué)檢測技術(shù)快速準(zhǔn)確地檢測光高粱的檢測方法以及用于該方法的檢測引物，適合于口岸檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)等領(lǐng)域使用。(二)
背景技術(shù)：
光高粱(Sorghum.nitidum(VaW)Pers)是世界十大惡性雜草假高粱的近似種，光高粱最早發(fā)現(xiàn)于印度西部，后傳播到東南亞、印度尼西亞、澳大利亞等國。光高粱為多年生，且產(chǎn)生根莖，其形態(tài)和染色體大小與假高粱相似。Y.Sun等(1994)曾認(rèn)為光高粱應(yīng)歸入Sorghum區(qū)組，而DeWet(1978)，Guo(1996)等則建議將其并入Parasorghum中，近似種的存在為口岸檢疫準(zhǔn)確快速鑒定假高粱增加了困難。實際工作中，農(nóng)產(chǎn)品中夾雜的假高粱等雜草種子的外觀特征往往會因運輸受到磨損與變型，同時由于環(huán)境、氣候、栽培條件的影響、種子成熟度的不同等引起的個體差異，更為形態(tài)鑒定增加了難度，而細(xì)胞生物學(xué)方法等不僅需要較長的周期，而且僅依據(jù)染色體的形態(tài)仍難以鑒定。(三)
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于形態(tài)鑒定和細(xì)胞生物學(xué)方法存在的困難，提出釆用分子生物學(xué)方法，針對核糖體序列設(shè)計光高粱的特異性引物，建立光高粱PCR檢測方法，以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測鑒定的目的。技術(shù)方案目前，未見有光高粱的PCR方法鑒定報道，本引物是針對光高粱的rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列設(shè)計的。18S26S核核糖體DNA(nrDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS被5.8S分為ITS1和ITS2兩部分。ITS區(qū)在植物核基因組中是高度重復(fù)的。全部nrDNA重復(fù)單位包括4萬個拷貝以串聯(lián)重復(fù)(tandemrepeats)方式出現(xiàn)在一個或多個染色體基因位點上(Regers&Bendich1987，綜述見Hamby&Zimmer1992)。在被子植物中，ITS區(qū)既具有核苷酸序列的高度變異性又有長度上的保守性，說明這些間隔區(qū)的序列很容易在近緣類群間排序，而且豐富的變異可在較低的分類階元上(如屬間、種間)解決植物系統(tǒng)發(fā)育問題。屈良鵠和陳月琴(1999)通過對不同生物類群的ITS序列(自生物學(xué)數(shù)據(jù)庫)的比較得出被子植物大多數(shù)科屬的ITS序列的種間差異值為1.2%10.2%，屬間差異值為9.6%28.8%，這對系統(tǒng)發(fā)育研究來說都是較合適的范圍。本發(fā)明的重點是用于檢測光高粱的引物N3/N5以及所述的引物序列的完全互補鏈。針對光高粱ITS序列的特異性位點差異，設(shè)計了檢測光高粱引物N3/N5，建立了光高粱種子的PCR檢測技術(shù)。光高粱PCR的檢測方法，包括。檢測過程如下1種子DNA獲取單粒種子研磨粉碎，按照以下步驟提取1)液氮中碾種子于1.5mL離心管中，加入500nLTES,TES由100mMTris(pH8.0)，10mMEDTA，2%SDS組成；2)加7nL蛋白酶K混勻，置于55'C水浴60120min,期間混勻幾次；3)調(diào)節(jié)鹽濃度至1.4M，加1/10體積的10%十六垸三甲基溴化銨，置于65'C水浴10min;4)加入等體積的SEVGA混勻，SEVGA為氯仿異戊醇==24:1，不能太劇烈，以保證DNA的完整性，0'C孵育30min;5)4°C13，000r/min離心10min，取上清夜至L5mL離心管中；6)力卩225pL5M醋酸銨混勻，(TC孵育30min以上，4°C13，000r/min離心2min;7)取上清，加入3pL核糖核酸酶A，37。C水浴30min，以去除RNA;8)加0.55體積的預(yù)冷異丙醇，-201:放置301^11以上；9)4'C13，000r/min離心1520min，棄異丙醇，70%乙醇洗2次。室溫干燥，50nLTE或雙蒸水溶解，TE為10mMTris，lmMEDTA(pH8.0)。2PCR擴(kuò)增利用引物N3(5，一GGCGTCAAGGAACACTTATA—3，)/N5(5，一ACGTCCCTCCTCCCCTCT—3，)；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積為30^1，包含1Ommol/L三羥基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl;50mmol/LKC1(pH8.3);1.5mmol/LMgC12;dATP，dGTP，dCTP，dTTP濃度為lOOpmol/L;引物濃度100nmol/L:0.5UTaqDNA聚合酶(寶生物工程有限公司)。加雙蒸水至終體積為30pl，混勻離心，置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)程序預(yù)變性95。C3min;然后94。C30s,60。C30s,72。Clmin，循環(huán)30次。3瓊脂糖凝膠電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物10pL，加入3pL上樣緩沖液,混勻，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳，EB染色后于凝膠成像儀中成像存盤。有益效果傳統(tǒng)光高粱的鑒定傳統(tǒng)的鑒定方法是利用種子形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞生物學(xué)特征等。外觀形態(tài)鑒定作為能便捷地辨別不同植物的外部特征對不同種植物進(jìn)行分類而成為口岸檢疫雜草的重要手段之一。但是，由于進(jìn)口的農(nóng)產(chǎn)品中因脫落、干燥、儲運、裝卸等原因，夾雜的雜草種子的外觀特征往往會因此受到磨損與變型，同時由于環(huán)境、氣候、栽培條件的影響、種子成熟度的不同等引起的個體差異也是難免的，這樣就給外表形態(tài)鑒定帶來了困難。而細(xì)胞生物學(xué)方法等不僅需要較長的周期，而且僅依據(jù)染色體的形態(tài)仍難以鑒定。光高粱的特異性檢測光高粱的近似種，包括黑高粱(SorghumalmumParodi)、擬高粱(S.propinquum(Kunth.)Hitchc.)、蘇丹草(S.sudanense(Piper)Stapf)、二色高粱(S.bicolor(L.)Moench)以及假高粱(Sorghumhalepense(L.)Pers)。它們的籽實與光高粱極為相似，但是其危害性及檢疫地位各有不同。利用引物可以特異性區(qū)分光高粱。一、驗證測試實驗內(nèi)容光高粱的PCR鑒定二、測試材料1、PCR鑒定所用材料假高粱1個，黑高粱1個，光高粱10個，擬高粱1個，二色高梁1個，蘇丹草l個(表l)。表l、PCR擴(kuò)增所用材料編號拉丁名來源1中國連云港2澳大利亞澳大利亞4澳大利亞澳大利亞6澳大利亞了澳大利亞8澳大利亞9澳大利亞10澳大利亞11澳大利亞12S.Wco/or(五沙王)中國農(nóng)科院13南京14美國15澳大利亞三、驗證測試實驗結(jié)果通用引物檢測DNA提取效果見圖1。PCR特異引物檢測見表2及圖2。表2PCR檢測光高粱及其近似種結(jié)果樣品編號檢測結(jié)果樣品編號檢測結(jié)果1+9+2+10+3+11-4+12-5+13-<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>"+":陽性；"—'，:陰性四、結(jié)論1、檢測結(jié)果與實驗材料完全相符。2、檢測時間大大縮短，可以在l個工作日內(nèi)完成檢測；3、單粒種子的檢測，檢測的靈敏度大大提高；4、傳統(tǒng)的常規(guī)檢測方法不能區(qū)分形態(tài)磨損和成熟度不夠的種子，建立的PCR方法能特異、敏感、準(zhǔn)確、快速地鑒定光高粱及近似物種。圖1，ITS通用引物檢測DNA提取效果說明使用的DNA標(biāo)記是Takara生產(chǎn)的DL2000(2000bp;1000bp;750bp;500bp;250bp;腸p)110，光高粱(S.nitidum);11，假高粱(S.halepense);12，二色高粱(S.bicolor);13，擬高粱(S.propinquum);14，黑高粱(S.almum);15，蘇丹草(S.sudannese);16，負(fù)對照(negativecontrol)圖2，特異引物N3/N5檢測樣品說明使用的DNA標(biāo)記是Takara生產(chǎn)的DL2000(2000bp;1000bp;750bp;500bp;250bp;謹(jǐn)p)，110,光高粱(S.nitidum);11，假高粱(S.halepense);12，二色高粱(S.bicolor);13，擬高粱(S.propinquum);14，黑高粱(S.almum);15,蘇丹草(S.sudannese);16，負(fù)對照(negativecontrol)圖3是特異引物檢測光高粱的檢測結(jié)果M，標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)記DL2000(2000，1000，750，500，250，薩p);110，光高粱(S.nitidum);11，假高粱(S.halepense);12，二色高粱(S.bicolor);13，擬高粱(S.propinquum);14，黑高梁(S.almum);15,蘇丹草(S.sudannese);16,負(fù)對照(negativecontrol)*圖中上半部為ITS特異引物擴(kuò)增結(jié)果；下半部為ITS通用引物擴(kuò)增。圖4是本發(fā)明的技術(shù)路線圖本發(fā)明的技術(shù)路線是將單粒種子提取DNA,利用引物N3/N5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以此區(qū)分和其它高粱屬種子，其中上游引物N35，-GGCGTCAAGGAACACTTATA-3，；下游引物N55，-ACGTCCCTCCTCCCCTCT-3';具體實施方式1種子DNA獲取單粒種子研磨粉碎，按照以下步驟提取1)液氮中碾種子于1.5mL離心管中，加入500nLTES,TES由100mMTris(pH8.0)，10mMEDTA，2XSDS組成;2)加7nL蛋白酶K混勻，置于55'C水浴60120min，期間混勻幾次；3)調(diào)節(jié)鹽濃度至1.4M，加1/10體積的10%十六烷三甲基溴化銨，置于65°C水浴10min;4)加入等體積的SEVGA混勻，SEVGA為氯仿異戊醇=24:1，不能太劇烈，以保證DNA的完整性，(TC孵育30min;5)4°C13，000r/min離心10min，取上清夜至1.5mL離心管中；6)加225pL5M醋酸銨混勻，O'C孵育30min以上，4°C13,000r/min離心2min;7)取上清，加入3nL核糖核酸酶A,37。C水浴30min,以去除RNA;8)加0.55體積的預(yù)冷異丙醇，-20°。放置30111111以上；9)4'C13，000r/min離心1520min,棄異丙醇，70%乙醇洗2次。室溫干燥，50nLTE或雙蒸水溶解，TE為10mMTris,lmMEDTA(pH8.0)。2PCR擴(kuò)增利用引物N3(5，一GGCGTCAAGGAACACTTATA—3，)/N5(5，一ACGTCCCTCCTCCCCTCT—3，)；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積為30^1，包含1Ommol/L三羥基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl;50mmol/LKC1(pH8.3);1.5mmol/LMgC12;dATP，dGTP,dCTP，dTTP濃度為10Onmol/L;引物濃度100nmol/L;0.5UTaqDNA聚合酶(寶生物工程有限公司)。加雙蒸水至終體積為30nl，混勻離心，置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)程序預(yù)變性95'C3min;然后94"30s，60。C30s,72。Clmin，循環(huán)30次。3瓊脂糖凝膠電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物l(HiL，加入3^L上樣緩沖液，混勻，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳，EB染色后于凝膠成像儀中成像存盤。光髙粱ITS序列Sorg/j鵬m力-血wribosomalDNAinternaltranscribedspacer:GCCTCGGCTCCCACGGCGCC121TAAGGCGTCAAGGAACACTTAT森TTGCCTTGCACGGCGGAGCGGTCGGCCTGCCTTCCGCTCTCGGCTCTATCCCGCGAAACGTCTGCCT361GGGCGTCACGCCAAAAGACACTCCCAACCCACCCAGAGGGGAGGAGGGACGTGGTGTTTG421GCCTCCCGTGCCTCGCGGCGCGGTGGGCCGAAGTTGGGGCTGCCGGCGAATCGTGTCGGG481CACAGCACGTGGTGGGCGACACCTTAGTTGTTCTCGGTGCAGCGCCTCGGCACGCGGCCGACCGCGACCC601CA注上游引物N35'-GGCGTCAAGGAACACTTATA陽3，；下游引物N55，-ACGTCCCTCCTCCCCTCT-3，；權(quán)利要求1.一種用于光高粱檢測的特異性引物對的上游引物，其DNA序列是5’-GGCGTCAAGGAACACTTATA-3’。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物序列的完全互補鏈。3、一種用于光高粱檢測的特異性引物對，其特征在于該引物對DNA序列為上游引物N3:5，-GGCGTCAAGGAACACTTATA-3，；下游引物N5:5，-ACGTCCCTCCTCCCCTCT-3，。4、一種利用PCR檢測技術(shù)檢測光高粱種子的檢測方法，其特征是利用如權(quán)利要求3所述的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5、如權(quán)利要求4所述的一種用于光高粱檢測的檢測方法，其特征是檢測過程包括如下步驟(1)種子DNA獲?。?2)PCR擴(kuò)增；(3)瓊脂糖凝膠電泳。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于光高粱檢測的檢測方法，其特征是步驟(2)中PCR反應(yīng)總體積為30pl，其中包含三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽Tris-HCl、KC1、MgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、引物和TaqDNA聚合酶；加雙蒸水至終體積為30nl，混勻離心，置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于光高粱檢測的檢測方法，其特征是步驟中(3)中取擴(kuò)增產(chǎn)物加入緩沖液，混勻，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種用于光高粱檢測的檢測方法，其特征是步驟(3)中擴(kuò)增產(chǎn)物為10nL，緩沖液是0.25%溴酚蘭，質(zhì)量體積百分含量40%(W/V)蔗糖水溶液。9、一種用于光高粱檢測的檢測方法，其特征是檢測過程包括如下步驟(1)種子DNA獲取單粒種子研磨粉碎，按照以下步驟提取(a)液氮中碾種子于1.5mL離心管中，加入500nLTES,TES由100mMTris，pH=8.0，10mMEDTA，2MSDS組成；(b)力n7pL蛋白酶K混勻，置于55"C水浴60120min，期間混勻幾次；(c)調(diào)節(jié)鹽濃度至1.4M，加1/10體積的10%十六烷三甲基溴化銨，置于65-C水浴10min;(d)加入等體積的SEVGA混勻，SEVGA為氯仿異戊醇=24:1，不能太劇烈，以保證DNA的完整性，0。C孵育30min;(e)4'C13,000r/min離心10min，取上清夜至1.5mL離心管中；(f)加225pL5M醋酸銨混勻，(TC孵育30min以上，4"C13，000r/min離心(g)取上清，加入3nL核糖核酸酶A，37。C水浴30min，以去除RNA;(h)力B0.55體積的預(yù)冷異丙醇，-20°。放置301!^以上；(i)4。Cl3,000r/min離心1520min，棄異丙醇，70%乙醇洗2次，室溫干燥，50pLTE或雙蒸水溶解，TE為10mMTris，lmMEDTA，pH=8.0;(2)PCR擴(kuò)增；別mai/、k5GGCGTCAAGGAACACTTATA-3、*廣抄說利用引物N3/N5:-進(jìn)燈PCR擴(kuò)增，5-ACGTCCCTCCTCCCCTCT-3PCR反應(yīng)總體積為3(^1,包含10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl、5Ommol/L并且pH為8,3的KC1、1.5mmol/LMgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP濃度為10(Himol/L、引物濃度為10Onmol/L;TaqDNA聚合酶為0.5U;加雙蒸水至終體積為3(HU，混勻離心，置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增反應(yīng)程序預(yù)變性95。C3min;然后94°C30s，60°C30s，72°Clmin，循環(huán)30次；(3)瓊脂糖凝膠電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物IOjxL，加入3pL上樣緩沖液混勻，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后于凝膠成像儀中成像存盤，其中緩沖液是0.25%溴酚蘭，質(zhì)量體積百分含量40%(W/V)蔗糖水溶液。10、根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項權(quán)利要求所述的引物在用于光高粱檢測中的用途。11、根據(jù)權(quán)利要求4-9任意一項權(quán)利要求所述的檢測方法在用于光高粱檢測中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種光高粱的特異性引物及利用該特異性引物的PCR檢測方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于形態(tài)鑒定和細(xì)胞生物學(xué)方法存在的困難，適合于口岸檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)等領(lǐng)域。該PCR檢測方法，包括步驟1)種子DNA獲取，2)PCR擴(kuò)增，3)瓊脂糖凝膠電泳。文檔編號C12Q1/68GK101245372SQ20071003757公開日2008年8月20日申請日期2007年2月15日優(yōu)先權(quán)日2007年2月15日發(fā)明者印麗萍,易建平,偉王申請人:印麗萍