專利名稱：一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國香菇產(chǎn)量已從1983年的1.95萬噸迅速發(fā)展到2005年的242萬噸，占全球香菇總產(chǎn)量的70％以上，改寫了世界食用菌產(chǎn)量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產(chǎn)量差距，有專家預(yù)測，由于中國香菇產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在近10年內(nèi)其將成為世界產(chǎn)量最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發(fā)展速度，優(yōu)質(zhì)的品質(zhì)及低廉的成本為世界菇業(yè)人士矚目，中國香菇已風(fēng)靡世界。
優(yōu)質(zhì)菌種在香菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產(chǎn)業(yè)中的重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種知識產(chǎn)權(quán)，同時也要加強保護我們國家自己的品種知識產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護我國的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定基礎(chǔ)。尤其日本2004年4月1日開始實行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是香菇的出口構(gòu)成了極大的威脅。就國內(nèi)而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現(xiàn)象，不僅給菇農(nóng)帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香菇的快速發(fā)展；而且，隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對香菇栽培菌株質(zhì)量的要求越來越高，需要發(fā)展更為簡便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)，以保證每批次的用種都準(zhǔn)確無誤。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分子標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為發(fā)展簡便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region)標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡便、低成本的特點，本發(fā)明建立了香菇45菌種的SCAR分子標(biāo)記，能對香菇45菌種進行快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了能對香菇45菌種進行簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定和檢測，提供了一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記，同時提供了這種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法。
本發(fā)明提供的一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記為604bp大小的特異片段，其特異性PCR擴增引物對序列為5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’。
本發(fā)明的一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，包括下列步驟(1)菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取將低溫保藏的香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25℃培養(yǎng)活化。兩周后接到100mL PD液體培養(yǎng)基中，25℃100r/min振蕩培養(yǎng)兩周，收集菌絲，用改進的CTAB法提取基因組DNA香菇。
(2)菌株45的特異DNA片斷的獲得采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量的篩選試驗，在采用隨機引物(引物序列TGCGCCCTTC獲得了香菇菌株45的特異DNA片斷，分子量為613bp，將該片段克隆測序。
(3)特異PCR擴增引物的獲得以得到的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異PCR擴增引物，引物對的序列5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’。
(4)用特異PCR擴增引物對對45菌株進行SCAR-PCR擴增。
擴增體系總體積為25μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/LdNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L 45菌株檢測專用引物對各1μL，模板DNA 1μL(濃度1ng～10ng/μL)，ddH2O 18.6μL。PCR反應(yīng)條件94℃ 1min；94℃15second，61℃15second，72℃1min，30個循環(huán)；72℃5min。
(5)電泳檢測可見604bp大小的特異片段(圖1)。而其它香菇菌種均未見特異性片斷。
對114(為生產(chǎn)用種)個收集自全國各地的香菇生產(chǎn)用菌種及少數(shù)野生種共164個菌株進行SCAR擴增。164個菌種中只有45菌株擴增出分子量為604bp的專一擴增條帶。
根據(jù)采用這一對特殊引物進行PCR擴增，以能否產(chǎn)生604bpDNA片段作為對香菇45菌株進行鑒定和檢測的依據(jù)。
該檢測方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點。該檢測所需時間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要至少3個月的時間。


圖1 SCAR-PCR擴增電泳圖17為45菌株(日本)，箭頭所示為香菇45菌株擴增出分子量約為604bp的特殊DNA條帶，其余編號為其它香菇菌株。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實施例1菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取將低溫保藏的香菇45菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25℃培養(yǎng)活化。兩周后接到100mL PD液體培養(yǎng)基中，25℃100r/min振蕩培養(yǎng)兩周，收集菌絲，放入-20℃冰箱凍存。用改進的CTAB法提取基因組DNA，DNA稀釋至20ng/μ L，-20℃冰箱貯藏備用。
SCAR-PCR擴增擴增體系總體積為25μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/LdNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L 45菌株檢測專用引物對(5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’)各1μL，模板DNA1μL(濃度1ng～10ng/μL)，ddH2O 18.6μL。
PCR反應(yīng)條件94℃ 1min；94℃15second，61℃15second，72℃1min，30個循環(huán)；72℃5min。
為了排除其它菌種的假陰性情況，在SCAR-PCR反應(yīng)體系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)通用引物對(ITS1、ITS4)，驗證所有模板DNA的完整性。
電泳檢測取上述PCR擴增產(chǎn)物8μL，與1μL加樣緩沖液混勻，點樣于1.5％的瓊醋糖凝膠上，于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。
權(quán)利要求
1.一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記，其特征在于特異性PCR擴增引物對序列為5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’；DNA片斷大小為604bp。
2.一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，其特征在于包括如下步驟(1)菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提??；(2)香菇菌株45的特異DNA片斷的獲得；(3)特異PCR擴增引物的獲得；(4)用特異PCR擴增引物對對45菌株進行SCAR-PCR擴增；(5)電泳檢測。
3.如權(quán)利要求2所述的一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所述步驟(2)中香菇菌株45的特異DNA片斷是通過采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量的篩選試驗，在采用隨機引物獲得，分子量為613bp，將該片段克隆測序。
4.如權(quán)利要求3所述的一種香菇45菌種的分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所用隨機引物序列為TGCGCCCTTC。
5.如權(quán)利要求2所述的一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所述步驟(3)中特異PCR擴增引物通過下列方法獲得以得到的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異PCR擴增引物，引物對的序列如下5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’。
6.如權(quán)利要求2所述的一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所述步驟(1)中菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取包括下列步驟將低溫保藏的香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25℃培養(yǎng)活化，兩周后接到100mL PD液體培養(yǎng)基中，25℃100r/min振蕩培養(yǎng)兩周，收集菌絲，放入-20℃冰箱凍存；用改進的CTAB法提取基因組DNA，DNA稀釋至20ng/μL，-20℃冰箱貯藏備用。
7.如權(quán)利要求2所述的一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所述步驟(4)中的SCAR-PCR擴增擴增體系總體積為25μL，擴增體系10×PCR buffer2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L 45菌株檢測專用引物對各1μL，模板DNA 1μL(濃度1ng～10ng/μL)，ddH2O18.6μL，PCR反應(yīng)條件94℃ 1min；94℃ 15second，61℃ 15second，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 5min。
8.如權(quán)利要求2所述的一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所述步驟(4)中SCAR分子標(biāo)記的PCR擴增反應(yīng)體系中加入ITS(Internal Transcribed Spacer)，通用引物對(ITS1、ITS4)。
9.如權(quán)利要求2所述的一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所述步驟(5)電泳檢測為取步驟(4)PCR擴增產(chǎn)物8μL，與1μL加樣緩沖液混勻，點樣于1.5％的瓊醋糖凝膠上，于0.5XTBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。
10.一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記在香菇45菌種的快速鑒定和檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香菇45菌種的分子特異標(biāo)記及其獲得方法和應(yīng)用。本發(fā)明的香菇45菌種的分子標(biāo)記DNA片斷大小為604bp，特異性PCR擴增引物對序列為5′GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3′和5′CTTCCCGTCGTACACTCG 3′。方法包括菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取；香菇菌株45的特異DNA片斷的獲得；特異PCR擴增引物的獲得；SCAR－PCR擴增；電泳檢測。本發(fā)明的分子特異標(biāo)記應(yīng)用于香菇45菌種的快速鑒定和檢測。
文檔編號C12N15/11GK101086015SQ200710040319
公開日2007年12月12日 申請日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者宋春艷, 譚琦, 陳明杰, 尚曉冬, 潘迎捷 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所