專利名稱：組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子p的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種DNA片段的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。所述的DNA片段包含一個(gè)編碼水稻光系統(tǒng)II 10 kD蛋白的基因D54O的啟動(dòng)子，它能夠在水稻的綠色組織中表達(dá)，且在胚和胚乳中不表達(dá)。將該片段與報(bào)告基因GUS連接后直接轉(zhuǎn)入植物體，轉(zhuǎn)基因植株中的報(bào)告基因僅在葉和葉鞘等綠色組織中表達(dá)。將該片段與抗蟲(chóng)的Bt基因融合后轉(zhuǎn)入水稻，遺傳轉(zhuǎn)化植株在田間自然發(fā)蟲(chóng)的條件下表現(xiàn)出對(duì)蟲(chóng)害的抗性。
背景技術(shù)：
水稻是世界上主要的糧食作物之一，全世界有超過(guò)20億的人口以水稻為主食，而蟲(chóng)害是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑是減少蟲(chóng)害的重要方法，為減少蟲(chóng)害損失起到了巨大作用。但是，化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用會(huì)不可避免的造成環(huán)境污染以及威脅人類(lèi)健康。
在人們對(duì)食物的安全性和環(huán)保性日益重視的今天，減少甚至杜絕化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的新要求。轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物就可以很好地做到這一點(diǎn)。這是一種新的抗病蟲(chóng)害技術(shù)，從1996年開(kāi)始在世界范圍內(nèi)大規(guī)模應(yīng)用。這些轉(zhuǎn)基因作物可以表達(dá)一種細(xì)菌Bacillus thuringiensis(Bt)來(lái)源的殺蟲(chóng)蛋白。這種細(xì)菌作為一種生物殺蟲(chóng)劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上已經(jīng)使用了60多年的歷史了。Bt作物在農(nóng)業(yè)上的使用可以大幅度的減少殺蟲(chóng)劑的使用量，這不僅直接降低了種植者的種植成本，而且對(duì)保護(hù)人類(lèi)的健康和生態(tài)環(huán)境都有積極的意義。
日本的研究者石渡于1901年在感病的家蠶體液中分離到了Bt細(xì)菌。1915年，Berliner重新分離到了這種菌株，并命名為“Bacillus thuringiensis n.sp.”。1938年，第一種商品化的Bt殺蟲(chóng)劑(商品名Sporeine)在法國(guó)上市。在上世紀(jì)50年代，Bt殺蟲(chóng)劑在美國(guó)開(kāi)始大規(guī)模推廣(Martin和Travers，1989)。1987年，獲得了第一批Bt轉(zhuǎn)基因植物，包括煙草，番茄等作物(Barton et al.，1987；Fischhoffet al.，1987；Vaeck et al.，1987)。1995年，轉(zhuǎn)Bt作物首次在美國(guó)和加拿大實(shí)現(xiàn)了商品化種植。2004年，全球Bt作物的種植面積達(dá)到了2240萬(wàn)公頃(James，2004)。
在1997年，中國(guó)批準(zhǔn)了第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物——耐貯藏番茄的商品化生產(chǎn)。同年，中國(guó)批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因Bt棉(Bollgard棉，美國(guó)Monsanto公司)在河北省的種植，正式成為了種植轉(zhuǎn)Bt作物的國(guó)家之一(Shelton et al.，2002)。在水稻的應(yīng)用上，Wunn等在1996年首次獲得了轉(zhuǎn)Bt基因的秈稻。1999年，首次報(bào)道了獲得了雙價(jià)的Bt水稻，使用的兩個(gè)Bt基因分別是Cry1Ac和Cry2A(Maqbool et al.，1999)。2000年，首次報(bào)道了對(duì)Bt水稻進(jìn)行的田間評(píng)價(jià)(Tu et al.，2000)。到目前為止，已經(jīng)有大量的轉(zhuǎn)Bt水稻的試驗(yàn)被報(bào)道(Fujimoto et al.，1993；Nayak et al.，1996；Wuun et al.，1996；Ghareyazie et al.，1997；Wu et al.，1997；Cheng et al.，1998；Alam et al.，1999；Tu et al.，2000；Ye et al.，2001；Khanna et al.，2002；Wang et al.2002；Wu et al.，2002；Ramesh et al.；2004)。
這些抗蟲(chóng)害的基因雖然已經(jīng)克隆出來(lái)，有些還已應(yīng)用與生產(chǎn)實(shí)踐，取得了良好的效果，但是，隨之而來(lái)的轉(zhuǎn)基因安全性問(wèn)題已越來(lái)越受人關(guān)注。因?yàn)榭共∠x(chóng)害的功能基因必須通過(guò)轉(zhuǎn)基因發(fā)揮其功能，而目前的轉(zhuǎn)化體系存在一些不足，很重要的一點(diǎn)便是轉(zhuǎn)化載體中的啟動(dòng)子大多是組成型表達(dá)的。這不僅造成了植物體的負(fù)擔(dān)，使植物表達(dá)額外的蛋白，造成了浪費(fèi)，嚴(yán)重的還造成了植物體生理和代謝的紊亂，致其死亡(Karlowski etal.，2003；Ehsani et al.，2003；Miyao et al.，2003)；更重要的是外源基因在果實(shí)或人類(lèi)食用的器官的表達(dá)量很豐富，由此引發(fā)了轉(zhuǎn)基因安全性的擔(dān)憂。而另一方面，Bt蛋白在植物體內(nèi)的高劑量表達(dá)對(duì)害蟲(chóng)造成較高的選擇壓力，有可能促使害蟲(chóng)產(chǎn)生變異，很快獲得對(duì)Bt蛋白的耐受性。Tabashnik等(1990)報(bào)道了在田間發(fā)現(xiàn)了對(duì)Bt蛋白產(chǎn)生抗性的小菜蛾(diamond moth，Plutella xylostella)，這是第一例的在自然條件下發(fā)現(xiàn)的對(duì)Bt殺蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的昆蟲(chóng)。
為了解決以上問(wèn)題，一些改進(jìn)措施已經(jīng)開(kāi)始運(yùn)用，如標(biāo)記基因的消除技術(shù)(陳穎等，2001)和植物來(lái)源的特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用。啟動(dòng)子是一段對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用的DNA片段。特異性的啟動(dòng)子分為兩類(lèi)，一是受誘導(dǎo)表達(dá)的特異啟動(dòng)子，還有組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)性的啟動(dòng)子對(duì)外界的某些物質(zhì)，如病原物，化學(xué)物質(zhì)或逆境做出反應(yīng)，啟動(dòng)基因表達(dá)。組織特異性的啟動(dòng)子則驅(qū)動(dòng)基因在特定的組織中表達(dá)。植物來(lái)源的啟動(dòng)子不會(huì)造成基因的逃逸，而特異性的啟動(dòng)子又避免了基因過(guò)量表達(dá)對(duì)植物體的傷害，同時(shí)也可以避免外源基因在人們食用的部位表達(dá)，解除人們對(duì)食品安全性問(wèn)題的顧慮。而且組織特異性的表達(dá)減少了Bt蛋白的表達(dá)量，避免了高濃度的抗蟲(chóng)蛋白對(duì)害蟲(chóng)的高選擇壓力。因此，分離和克隆不同特異性的啟動(dòng)子，以此驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)，是轉(zhuǎn)基因作物中外源基因表達(dá)的最佳途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是分離克隆水稻品種農(nóng)墾58中攜帶的一個(gè)編碼類(lèi)光系統(tǒng)II的10 kD蛋白的基因D54O啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段，利用這個(gè)啟動(dòng)子一方面驅(qū)動(dòng)抗蟲(chóng)基因在水稻植株中表達(dá)，增強(qiáng)其抗蟲(chóng)性；另一方面在胚和胚乳中不表達(dá)該抗蟲(chóng)基因，以此增強(qiáng)稻米的安全性。這個(gè)啟動(dòng)子被命名為PD54O。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是將所克隆的啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。該轉(zhuǎn)基因水稻在特異組織中表達(dá)抗蟲(chóng)基因，使其抗蟲(chóng)性增強(qiáng)。
本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含D54O基因啟動(dòng)子的DNA片段(PD54O)，該片段包含調(diào)控在葉和葉鞘等綠色組織中表達(dá)而在胚和胚乳中不表達(dá)的調(diào)控元件。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO.1所示序列的亞片段。
可以采用已經(jīng)克隆的PD54O啟動(dòng)子作探針，從基因組文庫(kù)中篩選到本發(fā)明的啟動(dòng)子或同源啟動(dòng)子。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，也可以從基因組擴(kuò)增到本發(fā)明的啟動(dòng)子以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含PD54O啟動(dòng)子的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明為增強(qiáng)植物轉(zhuǎn)基因的安全性提供了一種新的方法。這些方法包括將該片段和需要的功能基因連接轉(zhuǎn)入植物，由于該啟動(dòng)子不在胚和胚乳中表達(dá)，避免了轉(zhuǎn)基因水稻可能產(chǎn)生的食品安全問(wèn)題。
將克隆的啟動(dòng)子連接抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入植物，可以避免植物過(guò)量表達(dá)目標(biāo)基因造成的不利影響，這是傳統(tǒng)的組成型啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因的過(guò)程中無(wú)法做到的本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述DNA片段獲得的抗蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的種子，以及用本發(fā)明的啟動(dòng)子或基于該啟動(dòng)子的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類(lèi)植株獲得的種子，可以用有性雜交的方式將本發(fā)明的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入其它的植株。
在本發(fā)明的實(shí)施例部分，申請(qǐng)人闡述了分離、驗(yàn)證和應(yīng)用PD54O啟動(dòng)子的過(guò)程以及該啟動(dòng)子的特點(diǎn)。


序列表SEQ ID No1.本發(fā)明分離克隆的PD54O啟動(dòng)子序列。
圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻組織特異表達(dá)啟動(dòng)子PD54O以及驗(yàn)證其功能的流程圖。
圖2.cDNA芯片上每個(gè)方格中cDNA克隆的排列方式。字母排列成的方框表示cDNA芯片上一個(gè)方格，每個(gè)方格中有8個(gè)位點(diǎn)。每個(gè)克隆占據(jù)兩個(gè)位點(diǎn)。A、B、C和D分別代表不同cDNA克隆。
圖3.利用cDNA芯片檢測(cè)不同組織差異表達(dá)的cDNA克隆。箭頭表示在左右對(duì)比的圖像中差異表達(dá)的cDNA克隆。1和2分別為兩次重復(fù)試驗(yàn)A探針來(lái)自水稻灌漿期的胚和胚乳的RNA；B探針來(lái)自水稻根、葉片、葉鞘和莖RNA的混合物。
圖4.RNA雜交分析D54O基因的表達(dá)譜。分別從水稻根、葉片、葉鞘、花期莖和灌漿期穗組織中抽提RNA。由圖可以看出，D54O基因在水稻葉和葉鞘中表達(dá)，在根、莖和穗中不表達(dá)。
圖5.D54O基因啟動(dòng)子(PD54O)的基本結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子包括從-2134到+41的共2175bp的區(qū)段。+1是預(yù)測(cè)的翻譯起始位點(diǎn)；-113是預(yù)測(cè)的CAAT框控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率。
圖6.遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1381的結(jié)構(gòu)。
圖7.用D54O基因啟動(dòng)子PD54O驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS表達(dá)。PD54O包含D54O基因的-2134至+41區(qū)段。+1是預(yù)測(cè)的D54O基因的翻譯起始位點(diǎn)。
圖8.轉(zhuǎn)基因水稻植株的GUS基因表達(dá)模式。組織染色的結(jié)果表明，PD54O調(diào)控的GUS基因在水稻葉、葉舌、幼嫩的穎殼和葉鞘中可以檢測(cè)到表達(dá)(藍(lán)色示GUS活性)，但是在水稻根、莖、胚乳和成熟的穎殼中檢測(cè)不到表達(dá)。a，葉鞘；b，葉舌；c，根；d，成熟穎殼；e，幼嫩穎殼；f，葉；g，莖；h，胚和胚乳。
圖9.在PD54O-Cry1Ac質(zhì)粒載體中PD54O啟動(dòng)子調(diào)控抗蟲(chóng)基因Cry1Ac的表達(dá)。
圖10.攜帶PD54O-Cry1Ac的轉(zhuǎn)基因水稻植株在成熟的胚和胚乳中檢測(cè)不到Bt蛋白。利用BT-Cry1Ab/1Ac金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試紙條(購(gòu)自北京銀土地生物技術(shù)公司)檢測(cè)混合的轉(zhuǎn)基因水稻植株胚和胚乳樣品，在樣品中檢測(cè)不到Bt蛋白的表達(dá)。1，陽(yáng)性對(duì)照；2和3，胚和胚乳的混合樣品。
圖11.攜帶PD54O-Cry1Ac的轉(zhuǎn)基因水稻植株的抗蟲(chóng)效果。轉(zhuǎn)基因水稻植株在田間自然條件感染三化螟后，未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照水稻植株(A)出現(xiàn)嚴(yán)重的蟲(chóng)害，而轉(zhuǎn)基因水稻植株(B)較好地抵抗了螟蟲(chóng)的侵染。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，圖1描述了鑒定和分離克隆PD54O啟動(dòng)子的流程。根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實(shí)施例1分離克隆PD54O啟動(dòng)子1.利用cDNA芯片技術(shù)鑒定水稻中的組織特異表達(dá)基因本發(fā)明利用中國(guó)普遍推廣應(yīng)用的一個(gè)水稻品種明恢63(Oryza sativa ssp.indica)的全生育期平衡化cDNA文庫(kù)進(jìn)行cDNA芯片分析。該文庫(kù)由水稻不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同生理狀態(tài)下的15種不同組織的cDNA組成(Chu等，2003)。芯片的制作和分析采用已發(fā)表的方法(Zhou等，2002)。為了保證雜交結(jié)果的可靠性，在cDNA芯片上每個(gè)cDNA克隆有兩個(gè)位點(diǎn)，它們位于同一方格的對(duì)稱位置(圖2)。
本發(fā)明利用來(lái)自水稻葉片、葉鞘、莖、根和胚及胚乳中的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA并標(biāo)記放射性同位素作探針，分別與cDNA芯片雜交通過(guò)分析不同探針雜交的同一cDNA位點(diǎn)的雜交信號(hào)的變化，鑒定出在胚和胚乳中特異不表達(dá)，而在其它組織中表達(dá)的基因(圖3)。其中有一基因經(jīng)序列檢索分析表明編碼一個(gè)水稻光系統(tǒng)中的10 kD蛋白，我們將其命名為D54O。
為進(jìn)一步確定該基因的表達(dá)情況，在明恢63的葉、葉鞘、莖、根及穗中取樣抽提RNA，用D54O基因的cDNA做探針，進(jìn)行RNA雜交分析。RNA雜交方法同已經(jīng)發(fā)表的方法(Zhou等，2002)。分析表明該基因僅在葉和葉鞘中表達(dá)(圖4)，這與cDNA芯片雜交的結(jié)果一致。
2.從水稻品種農(nóng)墾58中分離克隆包含PD54O啟動(dòng)子的亞克隆片段本發(fā)明以上述cDNA克隆做探針，從水稻品種農(nóng)墾58(一個(gè)中國(guó)常用品種)的BAC文庫(kù)中篩選到一個(gè)陽(yáng)性克隆119H12。用HindIII限制性內(nèi)切酶消化這個(gè)BAC克隆，然后做DNA雜交分析；分析方法同已經(jīng)發(fā)表的方法(Chen等，2002)；雜交探針是D54O基因的cDNA。確定一個(gè)包含該基因的約6.5 kb的片段。用HindIII消化BAC克隆119H12，將酶切片段與HindIII處理的pUC19載體(購(gòu)自美國(guó)Amersham Biosciences公司)連接，電轉(zhuǎn)化(Sambrook和Russell，2001)大腸桿菌DH10B(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，制備亞克隆。經(jīng)擴(kuò)增檢測(cè)，獲得插入片段為6.5 kb包含D54O基因啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性亞克隆。
3.測(cè)序分析克隆119H12的6.5kb片段的亞克隆本發(fā)明采用Shotgun的方法進(jìn)行測(cè)序(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。根據(jù)此方法，首先將該片段用超聲波(23300Hz，作用2秒)打斷，通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳分離大約1kb的DNA片段，純化后用T4-DNA聚合酶補(bǔ)平末端；將這些片段與限制性內(nèi)切酶Sma I處理的pUC18載體(購(gòu)自美國(guó)Amersham Biosciences公司)連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，挑克隆檢測(cè)插入片段大小。選擇插入片段在1kb左右的克隆進(jìn)行測(cè)序。
采用M13-R和M13-F通用引物(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)、美國(guó)PerkinElmer公司的測(cè)序試劑盒(Big Dye Kit)、根據(jù)試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)所介紹的雙脫氧核苷酸末端終止法分別從每個(gè)亞克隆的兩端測(cè)序。共計(jì)對(duì)17個(gè)亞克隆進(jìn)行了測(cè)序。使用Sequencher 4.1軟件(美國(guó)Gene Codes Corporation)拼接序列。用該軟件自動(dòng)去除末端測(cè)序較差的序列和pUC18載體序列。在重疊序列長(zhǎng)度大于40bp、重疊序列的一致性大于95％的條件下進(jìn)行序列拼接，得到一段長(zhǎng)6204bp的序列。目標(biāo)基因區(qū)段的每一個(gè)堿基都參照重疊在該位點(diǎn)的多個(gè)Shotgun片段的序列來(lái)確定。
4.PD54O啟動(dòng)子的分離和結(jié)構(gòu)分析將測(cè)序得到的序列分別用玉米和用擬南芥做參考模型采用GenScan軟件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，兩者預(yù)測(cè)的目標(biāo)基因編碼區(qū)結(jié)構(gòu)和位置完全相同，分析結(jié)果表明該亞克隆包含一個(gè)完整的基因，即D54O基因。采用一系列啟動(dòng)子分析軟件，如Softberry網(wǎng)站(http://www.softberry.com)的TSSP軟件、PROSCAN軟件(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan)、PLACE(A Database ofPlant Cis-acting Regulatory DNA Elements)中的Signal Scan分析工具(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)、TESS軟件(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/gene-search.html)、Match 1.0軟件(http://www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/match/bin/match.cgi)、以及AliBata2.1軟件(http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibata2/index.html)等分析D54O基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)段包含在-2134到+41的2175bp片段內(nèi)，在-113bp的位置含有調(diào)控轉(zhuǎn)錄頻率的CAAT盒(圖5)。
實(shí)施例2PD54O啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證1.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建所用pCAMBIA1381載體(圖6)是國(guó)際上常用的植物農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(Sun等，2004)的系列載體。該載體攜帶無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)告基因GUS，由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室(Centerfor the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture)惠贈(zèng)。
根據(jù)序列的分析結(jié)果，選取限制性內(nèi)切酶SmaI和SphI，消化119H12的6.5kb片段的亞克隆，得到約2.1kb的啟動(dòng)子片段，該片段包含了從-2134到+41的區(qū)域(相對(duì)與翻譯起始密碼子ATG為+1)，命名為PD54O。得到的片段用T4 DNA聚合酶抹平酶切片段末端；同時(shí)用平端的限制性內(nèi)切酶SmaI酶切遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1381；酶切完畢，用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，純化酶切產(chǎn)物；然后用去磷酸化酶Alk對(duì)純化的酶切產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理；用包含PD54O啟動(dòng)子的酶切片段和去磷酸化的pCAMBIA1381載體做連接反應(yīng)，使其驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶基因)的表達(dá)(圖7)。獲得的重組質(zhì)粒被命名為D54O。將D54O質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化(Sambrook和Russell，2001)進(jìn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105(Sun等，2004)。
2.PD54O啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，1994)將EHA105菌株攜帶的D54O導(dǎo)入水稻品種牡丹江8(Oryza sativa ssp.japonica)。本發(fā)明共獲得轉(zhuǎn)化水稻植株36株。在T0代植株中，對(duì)不同的組織進(jìn)行GUS染色檢測(cè)(Jefferson and Bevan，1987)，發(fā)現(xiàn)GUS活性僅在葉、葉舌和葉鞘中檢測(cè)到；而在莖、根中無(wú)法檢測(cè)到；在穗發(fā)育的初期，穎殼中GUS呈陽(yáng)性，而在灌漿期開(kāi)始漸漸減弱，直至消失。在胚和胚乳中全生育期都沒(méi)有檢測(cè)出GUS的活性(圖8)。這些結(jié)果說(shuō)明PD54O是綠色組織特異表達(dá)啟動(dòng)子，是在胚和胚乳中特異不表達(dá)的啟動(dòng)子。
實(shí)施例3PD54O啟動(dòng)子的應(yīng)用1.PD54O與抗蟲(chóng)基因Bt的融合載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化為了檢驗(yàn)PD54O啟動(dòng)子在水稻抗蟲(chóng)中的應(yīng)用價(jià)值，本發(fā)明將前述pCAMBIA1381載體中的報(bào)告基因GUS用Bt抗蟲(chóng)基因Cry1Ac(Cheng等，1998)替代，采用實(shí)施例2所述的方法將PD54O啟動(dòng)子與攜帶Cry1Ac基因的pCAMBIA1381載體連接。獲得的重組質(zhì)粒被命名為PD54O-Cry1Ac(圖9)。將PD54O-Cry1Ac質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化(Sambrook和Russell，2001)進(jìn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105(Sun等，2004)。
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，1994)將EHA105菌株攜帶的PD54O-Cry1Ac質(zhì)粒導(dǎo)入水稻品種牡丹江8中，獲得20株陽(yáng)性獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株。利用BT-Cry1Ab/1Ac金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試紙條(購(gòu)自北京銀土地生物技術(shù)公司)和廠商(北京銀土地生物技術(shù)公司)提供的分析方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的胚和胚乳樣品，沒(méi)有檢測(cè)到抗蟲(chóng)蛋白Cry1Ac(圖10)。
2.攜帶PD54O-Cry1Ac轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)表現(xiàn)本發(fā)明在大田中對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)性進(jìn)行了檢測(cè)。大田的抗蟲(chóng)試驗(yàn)在一塊不施任何農(nóng)藥而自然發(fā)蟲(chóng)的田地中進(jìn)行。在試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)螟蟲(chóng)較好的抗性，有效地抵抗了螟蟲(chóng)對(duì)水稻的侵害。在轉(zhuǎn)基因的受體材料牡丹江8(對(duì)照)的大部分葉片已經(jīng)枯黃、卷曲的情況下，轉(zhuǎn)基因植株未見(jiàn)明顯蟲(chóng)害(圖11)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，總共20株轉(zhuǎn)基因水稻中，有7株未見(jiàn)明顯蟲(chóng)害，8株僅一片葉被蟲(chóng)害(蟲(chóng)害的葉片卷曲，褪綠)，4株有2片蟲(chóng)害的病葉，僅1株有3片葉遭到蟲(chóng)害，總體結(jié)果較好，顯示出了良好的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)應(yīng)用前景。
采用“三夾板”ELISA的方法(EnvironLogix，Portland，USA)分析轉(zhuǎn)基因植株葉片中Bt蛋白Cry1Ac的表達(dá)量。Bt蛋白的測(cè)定采用EnvironLogix公司(EnvironLogix，Portland，USA)的Bt蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒EnvironLogix kits APP003。檢測(cè)的方法如下首先從田間采集新鮮的水稻材料，每個(gè)材料取大約20mg并精確稱重。用500μl檢測(cè)試劑盒提供的蛋白抽提液在研缽中將材料磨成漿。然后轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中靜置5min，10,000r/min離心2min。最后，用新的1.5ml離心管取上清。在測(cè)量Bt蛋白濃度前，用相應(yīng)的抽提液將樣品稀釋50倍。按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)稀釋后的樣品進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算。檢測(cè)的結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株抗蟲(chóng)的效果與植株中抗蟲(chóng)基因的表達(dá)量密切相關(guān)，如果植株體內(nèi)的Bt蛋白可以達(dá)到3μg/g鮮組織重以上的表達(dá)量則抗蟲(chóng)的效果良好，植株上蟲(chóng)害的葉片少于等于1片；而低于此濃度的植株則表現(xiàn)為一定程度的蟲(chóng)害。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株抗蟲(chóng)的效果與基因的拷貝數(shù)無(wú)關(guān)，在高拷貝的植株中表達(dá)量不一定比低拷貝數(shù)的植株高，因此抗蟲(chóng)的效果也不一定更好(表1)。
以上結(jié)果表明，PD54O啟動(dòng)子確實(shí)可以抑制Bt蛋白在胚和胚乳中的表達(dá)，而且抗蟲(chóng)的效果和Bt蛋白的表達(dá)量呈正相關(guān)。
表1.轉(zhuǎn)基因植株(PD54OCry1Ac-)的Cry1Ac基因拷貝數(shù)、Cry1Ac表達(dá)量及抗蟲(chóng)效果

參考文獻(xiàn)Alam M，Datta K，Abrigo E，Oliva N，Tu J，Virmani SS，Datta SK(1999)Transgenicinsect-resistant maintainer line(IR68899B)for improvement of hybrid rice.Plant CellRep 187-8.
Barton KA，Whiteley HR，Yang NS(1987)Bacillus thuringiensisδ-endotoxinexpressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to lepidopteran insects.Plant Physiol 851103-1109.
Chen H，Wang S，Zhang Q(2002)New gene for bacterial blight resistance in rice located onchromosome 12 identified from Minghui 63，an elite restorer line. Phytopathology92750-754.
Cheng X， Sardana R， Kaplan H， Altosaar I (1998) Agrobacterium transformed rice plantsexpressing synthetic cry1A(b) and cry1A(c) genes are highly toxic to striped stem borerand yellow stem borer. Proc Natl Acad Sci USA 952767-2772.
Chu Z，Peng K，Zhang L，Zhou B，Wei J，Wang S(2003) Construction and characterization ofa normalized whole-life-cycle cDNA library of rice. Chinese Science Bulletin48229-235.
Ehsani P，Meunier A，Nato F，Jafari A，Nato A，Lafaye P(2003)Expression of anti humanIL-4 and IL-6 scFvs in transgenic tobacco plants. Plant Mol Biol 5217-29.
Fischhoff DA，Bowdish KS，Perlak FJ，Marrone PG，McCoormick SM，Niedermeyer J G，Dean DA，Kusano KK，Mayer EJ，Rochester DE，Rogers SG. Fraley RT(1987)Insecttolerant transgenic tomato plants. Bio/Technology 5807-813.
Fujimoto H，Itoh K，Yamamoto M，Kyozuka J，Shimamoto K(1993)Insect resistant ricegenerated by introduction of a modifiedδ-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis.Bio/Technology 111151-1155.
Ghareyazie B，Alinia F，Menguito CA，Rubia LG，De Palma JM，Liwanag EA，Cohen MB，Khush GS，Bennett J(1997)Enhanced resistance to two stem borers in an aromatic ricecontaining a synthetic cryIA(b) gene. Mol Breed 3401-414.
Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T.(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativaL.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J 6271-282.
James C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops2004.ISAAA Briefs，No 32，2004，Ithaca，NYISAAA.
Jefferson RA，Bevan MW(1987)GUS fusionsbeta-glucuronidase as a sensitive and versatilegene fusion marker in higher plants. EMBO J 63901-3907.
Karlowski WM，Hirsch AM (2003) The over-expression of an alfalfa RING-H2 gene inducespleiotropic effects on plant growth and development. Plant Mol Biol 52121-133.
Khanna HK，Raina SK (2002) Elite Indica transgenic rice plants expressing modified Cry1Acendotoxin of Bacillus thuringiensis show enhanced resistance to yellow stem borer(Scirpophaga incertulas). Transgenic Res 11411-423.
Maqbool SB，Christou P (1999) Multiple traits of agronomic importance in transgenic indicarice plantsanalysis of transgene integration patterns，expression levels and stability. MolBreed 5471-480
Martin PAW，Travers TS (1989) Worldwide abundance and distribution of BT isolates. ApplEnviron Microbiol 552437-2442.
Miyao M，F(xiàn)ukayama H (2003) Metabolic consequences of overproduction ofphosphoenolpymvate carboxylase in C3 plants. Arch Biochem Biophys 414197-203.
Nayak P，Basu D，Das S，Basu A，Ghosh D，Ramakrishnan NA，Ghosh M，Sen SK (1996)Transgenic elite indica plants expressing cryA(c)δ-endotoxin of Bacillus thuringiensisare resistant against yellow stem borer (Scirpophaga incertulas).Proc Natl Acad Sci USA942111-2116.
Ramesh S，Nagadhara D，Pasalu IC，Kumari AP，Sarma NP，Reddy VD，Rao KV (2004)Development of stem borer resistant transgenic parental lines involved in the productionof hybrid rice. J Biotech 111131-141.
Sambrook J，Russell DW (2001) Molecular CloningA Laboratory Manual. Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York.
Shelton A M，Zhao J Z，Roush R T.(2002) Economic，ecological，food，safety and socialconsequence of the deployment of Bt transgenic plants. Annu Rev Entomol，47845-881.
Sun X，Cao Y，Yang Z，Xu C，Li X，Wang S，Zhang Q (2004) Xa26，a gene conferringresistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-likeprotein. Plant J 37517-527.
Tabashnik BE，Liu YB，Malvar T，Heckel DG，Masson L，Ballester V，Granero F，Mensua J L，F(xiàn)erre J.(1997) Global variation in the genetic and biochemical basis of diamondbackmoth resistance to Bacillus thuringiensis. Proc Natl Acad Sci USA 9412780-12785.
Tu J，Zhang G，Datta K，Xu C，He Y，Zhang Q，Khush GS，Datta SK (2000) Fieldperformance of transgenic elite commercial hybrid rice expressing Bacillus thuringiensisdelta-endotoxin.Nat Biotechnol 181101-1104.
Vaeck M，Reynaerts A，Hofte H，Jansens S，Beukeleer MD，Dean C，Zabeau M，Montagu MV，Leemans J (1987) Transgenic plants protected from insect attack. Nature 32833-37.
Wang ZH，Shu QY，Ye GY，Cui HR，Wu DX，Altosaar I，Xia YW (2002) Genetic analysis ofresistance of Bt rice to stripe stem borer (Chilo suppressalis). Euphytica 123379-386.
Wu C，F(xiàn)an Y，Zhang C，Oliva N，Datta SK.(1997) Transgenic fertile japonica rice plantsexpressing a modified cry1A(b) gene resistant to yellow stem borer. Plant Cell Rep17129-132.
Wu G，Cui H，Ye G，Xia Y，Sardana R，Cheng X，Li Y，Altosaar I，Shu Q (2002) Inheritanceand expression of the cry1Ab gene in Bt (Bacillus thuringiensis) transgenic rice. TheorAppl Genet 104727-734.
Wunn J， Kloti A，Burkhardt PK，Biswas GCG，Launis K，Iglesias VA，Potrykus I (1996)Transgenic indica rice breeding line IR58 expressing a synthetic cryA(b) gene fromBacillus thuringiensis provides effective insect pest control. Bio/Technology 14171-176.
Ye GY，Shu QY，Yao HW，Cui HR，Cheng XY，Hu C，Xia YW，Gao M，Altosaar I (2001)Field evaluation of resistance of transgenic rice containing a synthetic cry1Ab gene fromBacillus thuringiensis Berliner to two stem borers. J Econ Entomol 94271-276.
Zhou B，Peng K，Chu Z，Wang S，Zhang Q (2002) The defense-responsive genes showingenhanced and repressed expression after pathogen infection in rice (Oryza sativa L.).Science in China (Series C) 45449-467.
序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>組織特異表達(dá)啟動(dòng)子PD540及其在水稻改良中的應(yīng)用<130>
<141>2007-01-19<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2175<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
<221>promoter<222>(1)..(2175)<223>
<400>1gcatgcagtt gccactggtg caacgtaata gttggagtct cctttgtaaa tagaggatac 60gagattctga atttttgtag caaatagtca atgatttttt cacccttgtg tagatgagtg120gcattcgcat gttctgtatt cttgaggata aatttcaacg gttttcttct gaaatgcaga180atatgtggtc ttgttggtaa actgttgtct tggactagtc catgctatgc aattttgagc240aattcgcatc tggttgtaaa ccgatatatt ctatgggttg tgtttacgaa cgtgactatt300gttgagataa tatgatgtca ttatctttgt ttatcttctg tggttcgaac caaacattac360taacagaact actccgtgat atgttatttg tgaaagcaat attcatagtt gcaaacataa420gctagtgaga tgcacagtaa ctagttatca aaacgaaaaa gaggctagct gactctgctc480gtcatgcatg atatgtatga atttttgtag gttactactg atatcagttc atcgatgctg540catcatgcat gaactgcagg ttactactga tattgttttg ggcattagca ggtttcagaa600ttgaactttc gactgttgct gcgcgcacac aaaataacct tcactgcaaa aatttagtat660gacgtatttg caactactgg taaactcata ttgtcacgtt agcattatcc gagacaaatc720tatgcttttc aggttaataa gctaaatatt tcagaaaacg tataataata acagttactc780cggtgatttt ggaaatttga ctacggtgac gacttgttat cttgatcgaa atgagcgccg840tatgaatccc ttcttcggac ttttgagttt acagagcagc tgctgatgga agcaaacctg900aggtaaatac tgaggagctt tgctctattg gggatttggg ggtggggtac atatccaagg960aggtccagac aactggattt gatctatttc tcctaaaata tactctctcc ggttccatat 1020taattgatgt tttggacaag gttgaggtca aatttttata acttagacta tcaataactt 1080tagaaatatt tagtttaaag aaactataac aacatatata gatttgtctt ttaaaatatt 1140ataataaaag taaacataga tttatttatt atatatatta taatagaaaa ataaggtcaa 1200agatgtatct tgtagaccgt gtcattgtcc aaaacgtcaa ttaaaatgaa accggaggga 1260gtaagttgtt tgtgctttta ttattattat ttttaagaaa aagaagaaaa tttatgctag 1320ccatggattt cagtctcctt gctggatagg ataattgcca gtggctgaaa ttacccagtc 1380agaaagaaaa taacttacct tatcttgtat tgtcacaggc tcagaattta tctatttccc 1440cccttgatag taataataat accatctttg gcagagaaac ccagattctt accttctgaa 1500
gtcccctcat tcctgatttg gagtaaatat ttgagtagca tctgaatgtg atgccctagc 1560tagtgaccat atattaacat tcagttcttt tagataatgg attaaaacct ggcctctata 1620tccaaactcg gatgtacatg gccaaattaa catccagttc ttcatccacc ttcatatcag 1680aacattccag aatacagatt gcaatggcat ccattggcac cacatgtttt gactgattct 1740ttcactgttt cttgatatat ttgttgattt ttaatggtaa atagctcatc tgtccaatcc 1800tggcaccaca taatttcccc tgttaaaaca gtgccaacac aaatttactc atgtccactg 1860aaaatcccca gaggataacg ttctggcact gccatatcag gaccggacca tacgcggcgc 1920gccacgtggc gcgccggcgg tcacacctgt gctggtgcac cctggcatta tccccatcca 1980ccatcctgtg ggtgactggc caccaaaggt ttttggcgcc acaattatat tgagctgcca 2040ttgcttctca cctctgcttt gcatccatcc atccatcaga gatcaggtag aacagtgaga 2100gtgaggtgca gaaaaatttg agctgaagct gaggatggca acatccatga tcacctcgcc 2160gctggtggcg ccggc217權(quán)利要求
1.一種在植物綠色組織中表達(dá)、在胚和胚乳中不表達(dá)的啟動(dòng)子PD54O，它是SEQ ID NO1所示的DNA序列。
2.一種使植物在綠色組織中表達(dá)目標(biāo)基因而種子中不表達(dá)該基因的方法，包括將權(quán)利要求1所述的DNA片段連接上合適的基因后轉(zhuǎn)入植物體，使植物組織特異性的表達(dá)所述的基因。
3.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子PD54O在增加水稻對(duì)蟲(chóng)害抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及包含水稻組織特異表達(dá)啟動(dòng)子P
文檔編號(hào)C12N15/82GK101016546SQ20071005144
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月31日
發(fā)明者王石平, 蔡萌, 魏君 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)