一種種皮與纖維組織特異性表達(dá)啟動子sfs及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種種皮與纖維組織特異性表達(dá)啟動子SFS及其應(yīng)用，具體為一種能 夠在植物種子表皮和棉花纖維特異表達(dá)的啟動子ProSFS (簡稱為SFS啟動子）以及該啟動 子在植物遺傳改良上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物生長發(fā)育是不同基因在時間、空間上有序表達(dá)和協(xié)同作用的過程。基因在整 個生長過程中的開關(guān)、表達(dá)模式以及表達(dá)豐度等均受到精確調(diào)控。植物基因的表達(dá)調(diào)控可 以分為轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后等5個不同水平，其中轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最主 要和最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)?；蛟谵D(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控主要是通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與啟動子的 結(jié)合與否、強(qiáng)弱變化等來實(shí)現(xiàn)。因此，分離克隆有關(guān)特異的啟動子可以有效調(diào)芐基因的轉(zhuǎn)錄 水平，包括基因在不同組織以及不同環(huán)境條件下的表達(dá)。此外，獲得組織特異性啟動子對于 轉(zhuǎn)基因作物的研宄以及商業(yè)化開發(fā)都具有重大意義。
[0003]組織器官特異型啟動子按照植物組織器官可以分為根、維管束、花器官、種子特異 以及其它組織特異表達(dá)啟動子等。組織器官特異型啟動子可以定向表達(dá)外源蛋白，在發(fā)育 生物學(xué)研宄、以及植物基因工程方面逐步得到應(yīng)用。果實(shí)和種子是植物的生殖器官、營養(yǎng)物 質(zhì)主要的儲藏場所。利用果實(shí)或種子等器官特異啟動子來調(diào)控相應(yīng)的目的基因表達(dá)，不但 可以提高基因在這些部位的表達(dá)量，而且可以降低生物能耗，有利于表達(dá)產(chǎn)物的分離以及 提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。
[0004] 來源于小麥的TaPR61基因啟動子在禾本科作物中可以維持其種子特異表達(dá)的模 式（Kovafchuk et al，2012)。瓜爾豆甘露糖聚合酶基因的啟動子能夠在紫花苜蓿的胚乳 組織中特異表達(dá)（Naoumkina and Dixon, 2011)。近年來，分離與種子特異表達(dá)有關(guān)的啟動 子還包括：來源于西瓜的果實(shí)特異表達(dá)基因AGPL1的啟動子（Yin et aL，2009)、番茄的E8 基因啟動子等。研宄表明：2個胚乳特異表達(dá)順式作用元件一GCN4和AACA對于維持基因 的胚乳特異表達(dá)模式起著重要的作用（Qu and Takaiwa, 2004 ;Wu et aL, 1998 ;Takaiwa et aL，1996)。此外，糊粉層特異表達(dá)的基因ALJ啟動子、胚乳特異表達(dá)啟動子Gtl3a在生物反 應(yīng)器上展現(xiàn)了很好的應(yīng)用前景（Kuwano et al，2011 ;He et al，2011)。
[0005]盡管科學(xué)家已經(jīng)在不同的植物種克隆了上述與種子特異表達(dá)有關(guān)的啟動子，但是 到目前為止還沒有有關(guān)具有種皮特異和棉花纖維組織特異的啟動子報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對上述技術(shù)缺陷，目的在于提供一種種皮與纖維組織特異性表達(dá)啟動 子-SFS及其應(yīng)用，即提供一種新的能夠在植物種皮以及棉花纖維組織中特異表達(dá)的啟動 子SFS〇
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008]第一方面，本發(fā)明提供一種核苷酸SFS，序列如SEQ ID NO. 1所示；該序列可以通 過人工合成的方法進(jìn)行合成，也可以通過PCR和酶切的方法從棉花的基因組中進(jìn)行克隆。
[0009] 第二方面，本發(fā)明提供一組用于擴(kuò)增所述核苷酸SFS的外側(cè)引物對，所述外側(cè)引 物對的序列如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 第三方面，本發(fā)明提供一組用于擴(kuò)增所述核苷酸SFS的內(nèi)側(cè)引物對，所述內(nèi)側(cè)引 物對的序列如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5所示。
[0011] 第四方面，本發(fā)明提供一種重組載體，包含所述核苷酸SFS，如實(shí)施例1中的連接 核苷酸SFS的pMD18-T載體等。
[0012] 第五方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化體，包含所述核苷酸SFS，所述轉(zhuǎn)化體采用的宿主 為大腸桿菌或農(nóng)桿菌。
[0013] 第六方面，本發(fā)明提供一種所述核苷酸SFS作為啟動子的用途。
[0014]優(yōu)選地，所述用途具體為核苷酸SFS作為啟動子在驅(qū)動植物中目的基因在特定組 織中表達(dá)的應(yīng)用；所述植物包括棉花、擬南芥；所述組織包括表皮、纖維等。
[0015] 優(yōu)選地，所述核苷酸SFS作為啟動子在驅(qū)動植物中目的基因在特定組織中表達(dá)的 應(yīng)用具體為用所述轉(zhuǎn)化體的懸浮液浸泡植物組織。
[0016] 優(yōu)選地，所述用途具體為核苷酸SFS作為啟動子在植物育種中的應(yīng)用。
[0017] 第七方面，本發(fā)明提供一種所述核苷酸SFS的制備方法，包括人工合成法或生物 克隆法；
[0018] 優(yōu)選地，所述核苷酸SFS的人工合成的方法具體為：
[0019] 步驟一、根據(jù)核苷酸SFS的正鏈和副鏈序列，分別合成出長度150~200bp、具有粘 性末端的單鏈寡核苷酸正鏈片段和單鏈寡核苷酸副鏈片段；
[0020] 步驟二、將所述單鏈寡核苷酸正鏈片段和單鏈寡核苷酸副鏈片段分別退火，形成 帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段；
[0021] 步驟三、混合所述雙鏈寡核苷酸片段，經(jīng)T4DNA連接酶催化組裝成一個完整的核 苷酸SFS。
[0022] 優(yōu)選地，所述生物克隆法具體為：
[0023] 步驟1、提取棉花DNA ;
[0024] 步驟2、以所述DNA為模板，依次用所述外側(cè)引物、內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行擴(kuò)增；
[0025] 步驟3、將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，即得核苷酸SFS。
[0026] 優(yōu)選地，所述棉花為陸地棉。
[0027] 本發(fā)明首次采用分子克隆方法，從陸地棉（Gossypium hirsutum)基因組中分離獲 得了新的SFS啟動子，并且通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了它具有種皮及纖維組織特異性，利用該 啟動子可以特異驅(qū)動基因在上述組織中高水平地轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而達(dá)到了本發(fā)明目的。
[0028] 本發(fā)明克隆分離組織特異表達(dá)啟動子SFS，并利用該啟動子在擬南芥中特異表達(dá) 報(bào)告基因以提高基因在特定組織的表達(dá)水平。
[0029] 本發(fā)明的SFS啟動子具有如下特性:A)在棉花和擬南芥組織的表達(dá)情況十分明 確，該啟動子在棉花等植物上沒有報(bào)道；B)結(jié)構(gòu)新，在核酸水平上與已見報(bào)道的其它啟動 子無任何同源性，同源性位點(diǎn)不含有現(xiàn)有專利保護(hù)序列和突變位點(diǎn)。
[0030] SFS啟動子為提高基因在植物種皮、以及棉花纖維的衣分含量提供了新的途徑，因 而具有巨大的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0031] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯：
[0032]圖1是SFS啟動子遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建示意圖；
[0033] 其中，LB、RB分別為T-DNA的左右邊界序列，SFS為本發(fā)明所特異表達(dá)啟動子，NOS 為終止子；
[0034]圖2是轉(zhuǎn)SFS啟動子轉(zhuǎn)化擬南芥的不同組織的⑶S染色分析圖；
[0035] 其中，A :根；B