專利名稱：高羊茅高頻基因槍轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及高羊茅基因槍高頻轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)又稱葦狀羊茅，是世界溫帶地區(qū)的多年生冷季型草種，原產(chǎn)歐洲西部，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)迅速、抗干旱、抗病、耐瘠薄、適應(yīng)性廣等優(yōu)良特性，既可放牧又可建植草坪。是歐洲和北美重要的栽培牧草之一，并與草地早熟禾并列為最重要的草坪草種。我國(guó)20世紀(jì)70年代引進(jìn)，之后成為北方暖溫帶地區(qū)建立人工草地和補(bǔ)播天然草場(chǎng)的重要草種。近年來(lái)，高羊茅作為草坪草在我國(guó)利用發(fā)展很快，黑龍江、北京、山東、江蘇、湖北、江西等地都已引種栽培，在我國(guó)的草地建設(shè)、改良、城市綠化和運(yùn)動(dòng)草坪建植中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。但草質(zhì)粗糙、適口性差、無(wú)匍匐莖、易遭雜草侵害以及不耐寒冷、耐鹽性差等缺點(diǎn)使高羊茅的栽培具有一定的局限性。長(zhǎng)期以來(lái)，同其他牧草和草坪草一樣，高羊茅新品種培育基本上都是依靠常規(guī)育種方法，工作周期長(zhǎng)，定向性不好。另外，高羊茅的遺傳學(xué)和生殖生物學(xué)研究工作薄弱以致遺傳改良的研究成功率不高。植物基因工程技術(shù)的發(fā)展為高羊茅的遺傳改良提供了一種很有潛力的手段，利用基因工程技術(shù)可有效改善特定性狀，為高羊茅耐鹽耐旱和耐寒育種開辟新途徑。
近年來(lái)，在傳統(tǒng)育種手段的基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代生物技術(shù)如基因工程進(jìn)行培育已經(jīng)廣泛應(yīng)用于高羊茅的育種工作中?；驑尫ㄊ抢酶咚龠\(yùn)動(dòng)的金屬微粒將附著于表面的核酸分子引入到受體細(xì)胞中的一種遺傳物質(zhì)導(dǎo)入技術(shù)。其原理是利用火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作為驅(qū)動(dòng)力加速金屬粒子，并使其進(jìn)入帶壁的細(xì)胞。在此過(guò)程中，攜帶有目的基因的質(zhì)粒DNA首先粘附在微彈表面，結(jié)合有DNA分子的微彈經(jīng)加速而獲足夠的動(dòng)量，進(jìn)而穿透植物細(xì)胞壁進(jìn)入靶細(xì)胞。外源DNA分子也就隨之導(dǎo)入細(xì)胞，并隨機(jī)整合到寄主的基因組內(nèi)?；驑尫ǖ氖荏w可以是各種外植體、愈傷組織及胚性細(xì)胞或細(xì)胞器，突破了基因轉(zhuǎn)移的物種界限。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已成為研究植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和培育轉(zhuǎn)基因植物的最有效的手段之一。基因槍轉(zhuǎn)化法是目前質(zhì)體基因工程中最常用和最有效的DNA導(dǎo)入技術(shù)，它避開了原生質(zhì)體再生培養(yǎng)的困難，克服了當(dāng)時(shí)所認(rèn)為的農(nóng)桿菌的宿主限制，受體材料來(lái)源廣泛，且不受基因型限制。且具有高效表達(dá)、原核基因無(wú)需修飾改造、便于遺傳操作、可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合和易保持純系、后代不分離等優(yōu)點(diǎn)。
草高羊茅轉(zhuǎn)化過(guò)程中多采用這種方法，但是對(duì)其轉(zhuǎn)化過(guò)程研究較少，一般只簡(jiǎn)單獲得植株；對(duì)高羊茅進(jìn)行功能基因轉(zhuǎn)化的較少，抗旱、耐鹽等基因轉(zhuǎn)化尚屬空白。我們則對(duì)基因槍具體的轉(zhuǎn)化參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究，并且把兩種與抗旱、耐鹽有關(guān)的功能基因轉(zhuǎn)入高羊茅愈傷組織中，得到了再生植株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供高羊茅高頻基因槍轉(zhuǎn)化方法，以提高高羊茅的轉(zhuǎn)化效率。
本發(fā)明方法選擇高羊茅胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體通過(guò)調(diào)節(jié)基因槍轟擊過(guò)程中的各項(xiàng)影響因素，獲得適合高羊茅最佳轉(zhuǎn)化體系。
具體地說(shuō)，本發(fā)明的待轟擊愈傷組織塊直徑在0.5-1mm，采用CaCl2+Sperm(亞精胺)包被質(zhì)粒DNA，使用1μm金粉作為質(zhì)粒DNA的載體，轟擊的高度選擇6cm，轟擊次數(shù)為2次；轟擊后愈傷組織在含有滲透劑(0.2M山梨醇和0.2M甘露醇)的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)5d。經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織，在篩選壓為80mg/L潮霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)40d，而后轉(zhuǎn)入篩選壓為40mg/L潮霉素再生培養(yǎng)基中續(xù)篩選的同時(shí)再生植株。
本發(fā)明成功地將DREB1A、BADH-CMO基因轉(zhuǎn)入‘千年盛世’、‘凌志’、‘交戰(zhàn)II號(hào)’和‘獵狗5號(hào)’4個(gè)品種高羊茅基因組中，從而獲得移栽成活的潮霉素抗性株系。
本發(fā)明對(duì)高羊茅基因槍轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。具體包括1)基因槍轉(zhuǎn)化過(guò)程中，在轟擊壓力一定的情況下，基因槍轉(zhuǎn)化受多個(gè)因素的綜合影響，本發(fā)明研究了金粉直徑、受體處理、受體狀態(tài)等因素的影響，并且綜合考慮了轟擊高度、轟擊次數(shù)和滲透處理的綜合效果。找到了最佳的基因槍轟擊參數(shù)，建立了高效的轉(zhuǎn)化體系。
2)在含有潮霉素抗性標(biāo)記的外源基因轉(zhuǎn)入愈傷組織后，要進(jìn)行愈傷組織抗生素的篩選，本發(fā)明對(duì)不同抗生素濃度進(jìn)行篩選，獲得了愈傷組織篩選的臨界濃度，可應(yīng)用于含有潮霉素抗性標(biāo)記的外源基因轉(zhuǎn)入高羊茅愈傷組織后，進(jìn)行外源基因的初步篩選鑒定。
3)將2種功能基因通過(guò)此體系轉(zhuǎn)入高羊茅愈傷組織中，經(jīng)過(guò)分化再生，獲得了轉(zhuǎn)基因的高羊茅植株，證明了這種方法的可行性。
本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化效率高達(dá)6％，并且育種時(shí)間僅需半年，與傳統(tǒng)育種相比大大縮短了高羊茅育種的時(shí)間。


圖1是GUS顯色示意圖，A、B是轉(zhuǎn)化的愈傷組織，C是未轉(zhuǎn)化的愈傷組織；圖2是PCR產(chǎn)物的電泳圖，圖中1是未轉(zhuǎn)基因的植株，M是marker，24是質(zhì)粒對(duì)照，2～23是轉(zhuǎn)基因植株；圖3是轉(zhuǎn)基因高羊茅植株。
具體實(shí)施例方式
下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1高羊茅的基因槍轉(zhuǎn)化1.受體材料準(zhǔn)備供試高羊茅品種為獵狗5號(hào)(Houndog5，購(gòu)自北京中種草業(yè)有限公司)，交戰(zhàn)II號(hào)(Crossfire II，購(gòu)自北京中種草業(yè)有限公司)，凌志(Barlexas，購(gòu)自百綠集團(tuán)百綠草種公司)，千年盛世(Millennium，購(gòu)自北京綠冠草業(yè)科技發(fā)展中心)誘導(dǎo)的胚性愈傷組織。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織作為基因槍轉(zhuǎn)化的靶材料。挑取年齡3-5個(gè)月的胚性愈傷組織，用鑷子分成直徑約0.5-1mm的小塊，置于含有滲透劑的培養(yǎng)基中央，緊密排列出一個(gè)直徑2cm的圓。
2.篩選劑濃度和篩選時(shí)間的確定將愈傷接種到含有不同濃度的潮霉素的培養(yǎng)基上，稱取其質(zhì)量，20天后再稱取質(zhì)量，將愈傷轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，再過(guò)20天再稱取。根據(jù)質(zhì)量及愈傷狀態(tài)的變化判斷所用潮霉素的適宜濃度及確定適宜的篩選時(shí)間，得到潮霉素濃度為80mg/L，篩選時(shí)間為40天。
3.包裹DNA微彈(1)稱取30mg直徑1μm的金粉，置于1.5ml離心管中，加入1ml 70％乙醇，渦旋3-5min(混勻)，靜置15min，瞬時(shí)離心1-5s，棄上清。(2)重復(fù)以下步驟三次加入1ml無(wú)菌水洗滌金粉，渦旋1min，靜置1min，瞬時(shí)離心，棄上清。(3)加500μl 50％無(wú)菌甘油，金粉濃度約為60mg/ml，室溫下可保持兩周。(4)渦旋保存在甘油中的金粉5min。(5)吸取50μl(3mg)于1.5ml離心管中，吸取過(guò)程保持渦旋，冰上操作；(6)依次加入5μl攜帶有目的基因的質(zhì)粒DNA(1μg/μl)，50μl 2.5M CaCl2、20μl 0.1M亞精胺，持續(xù)渦旋2-3min，靜置1min，瞬時(shí)離心2s；(7)棄上清，加入140μl 70％乙醇；(8)棄上清，加入140μl無(wú)水乙醇；(9)棄上清，加入48μl無(wú)水乙醇，輕輕敲擊離心管數(shù)次懸浮金粉，低速渦旋2-3s，此時(shí)金粉可以用于轟擊之用。
4.轟擊處理所用基因槍為Biorad公司PDS1000/He型，將其放置于一個(gè)較大型的超凈工作臺(tái)上，以利于操作。工作臺(tái)、真空室、微彈載體和阻擋網(wǎng)等均需用70％酒精消毒，然后吹干。將微彈載體裝入載體架上，取6μl包被質(zhì)粒DNA的金粉懸浮液，均勻涂抹于微彈載體膜中心，干燥10min。將載有包被質(zhì)粒DNA的金粉顆粒的微彈載體及阻擋網(wǎng)裝入微彈發(fā)射裝置中，將盛有欲轉(zhuǎn)化愈傷組織的培養(yǎng)皿置于基因槍樣品室內(nèi)，可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8cm，氦氣壓力為1100psi，真空度28inchHg，微彈飛行距離在6cm轟擊2次。
5.過(guò)渡培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)將轟擊后的愈傷組織在含有滲透劑(0.2M山梨醇和0.2M甘露醇)的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中過(guò)夜，次日進(jìn)行g(shù)us基因化學(xué)組織染色，按照J(rèn)efferson(Jefferson Richard A，Tony A.Kanvanagh and MichaelW.Bevan.Gus fusionsβ-glucuronidaseand a sensitive and versatilegene[J].The EMBO Journal，1987，6(13)3901-3907)的方法進(jìn)行。將愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)5d，再轉(zhuǎn)入加有80mg/L潮霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)20d，25℃暗培養(yǎng)，連續(xù)篩選兩次，即篩選培養(yǎng)40d。
6.植株再生培養(yǎng)挑取存活愈傷轉(zhuǎn)入含有40mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基是指1/2MS+0.2mg/L KT(激動(dòng)素)中續(xù)篩選30d，25℃光照16h培養(yǎng)。挑取部分愈傷組織進(jìn)行g(shù)us基因化學(xué)組織染色。將長(zhǎng)出的小芽轉(zhuǎn)入到不含篩選劑的分化培養(yǎng)基中待小苗長(zhǎng)到3-4片葉時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基是指1/2MS+0.5mg/L NAA+0.2mg/L KT)中，壯苗生根。
7.抗性植株的移栽將根葉完全的壯苗室溫下煉苗3d后，清洗掉基部的培養(yǎng)基，直接栽入到花盆(基質(zhì)為沙∶土∶草炭＝1∶1∶1)中，自然光下生長(zhǎng)。(圖3)實(shí)施例2轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)通過(guò)實(shí)施例1的方法將DREB1A基因通過(guò)pCAMBIA1301(CAMBIA)載體(包含DREB1A和Gus基因，分別由ubi及CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，篩選基因?yàn)閔pt)轉(zhuǎn)入高羊茅胚性愈傷組織，并獲得抗性植株。轉(zhuǎn)化效率為6.12％。
1、GUS表達(dá)的檢測(cè)轉(zhuǎn)化后40h，對(duì)轉(zhuǎn)化的受體進(jìn)行組織化學(xué)染色，觀測(cè)愈傷組織中GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)，在Olympus體視顯微鏡下觀察染色情況；2個(gè)月后，對(duì)潮霉素抗性愈傷組織進(jìn)行組織化學(xué)染色，觀測(cè)GUS基因的穩(wěn)定表達(dá)。染色方法參考Jefferson方法(Jefferson，1987)，以未轉(zhuǎn)化愈傷組織作對(duì)照，結(jié)果如圖1所示，圖1中A、B是轉(zhuǎn)化的愈傷組織，C是未轉(zhuǎn)化的愈傷組織。
2、抗性植株的分子檢測(cè)提取抗性植株DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，DREB1A引物序列為引物F5’＞AAA GGA TCC TTA CCC GGG TTC TGA TCA ATGAAC TCA TTT TCT G＜3’，引物R5’＞AAA GGT ACC AAT CCC GGG GTT TTA ATA ACTCCA TAA CGA TAC G＜3’反應(yīng)體系采用25μl反應(yīng)體系，具體如下
10×Taq buffer2.5μLdNTP 2.0μL引物F+R 2×1.0μLTaq酶 0.5μL模板(質(zhì)粒和代測(cè)植物)DNA 1μLddH2O 17μL總體積25μL反應(yīng)條件熱蓋 105℃94℃預(yù)變性 4min 72℃延伸10min4℃保存PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，抗性植株中全部檢出DREB1A基因；將PCR產(chǎn)物克隆載體后測(cè)序，測(cè)序正確。
權(quán)利要求
1.高羊茅高頻基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，選擇胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用CaCl2+亞精胺包被質(zhì)粒DNA，使用1μm金粉作為質(zhì)粒DNA的載體，轟擊高度6cm，轟擊2次。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化的外源基因是DREB1A或BADH-CMO。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化使用DREB1A-GUS雙基因表達(dá)載體。
4.一種制備轉(zhuǎn)基因高羊茅的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)選擇胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用CaCl2+亞精胺包被質(zhì)粒DNA，使用1μm金粉作為質(zhì)粒DNA的載體，轟擊高度6cm，轟擊2次；2)轟擊后的愈傷組織在含有0.2M山梨醇和0.2M甘露醇的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4h，轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)5d。3)經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織，在篩選壓為80mg/L潮霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)40d，而后轉(zhuǎn)入篩選壓為40mg/L潮霉素再生培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選培養(yǎng)直至再生出植株。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化的外源基因是DREB1A或BADH-CMO。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化使用DREB1A-GUS雙基因表達(dá)載體。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化使用含有潮霉素抗性標(biāo)記的表達(dá)載體。
8.如權(quán)利要求4～7所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化受體為‘千年盛世’、‘凌志’、‘交戰(zhàn)II號(hào)’或‘獵狗5號(hào)’的胚性愈傷組織。
全文摘要
本發(fā)明提供了高羊茅高頻基因槍轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明選擇胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用CaCl
文檔編號(hào)C12N15/87GK101024844SQ20071006358
公開日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2007年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月5日
發(fā)明者韓烈保, 王維飛, 曾會(huì)明, 齊春暉, 方文娟 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué), 韓烈保, 王維飛