專利名稱：：一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細胞瞬間表達的方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，公開了一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細胞瞬間表達的方法及其應用。
背景技術：
：白粉病是小麥的主要真菌病害之一，培育抗病品種是目前最經(jīng)濟有效的方法。常規(guī)育種周期長，轉(zhuǎn)基因生物技術育種是高效培育抗病小麥抗病新品種的有效策略。但小麥基因組龐大、組織培養(yǎng)周期長且轉(zhuǎn)基因頻率太低，限制了利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法高通量、快速鑒定白粉病抗病候選基因及相關基因功能的研究，使得有效抗白粉病基因的發(fā)掘受阻。因此，建立快速而有效的鑒定白粉病抗病候選基因功能的技術體系顯得尤為重要。單細胞瞬間表達技術可將外源基因?qū)胫参锛毎麅?nèi)在一定時間內(nèi)(降解之前)可獲得瞬間超量表達，亦可將外源基因片段構建呈“發(fā)夾(hairpin)結構”導入植物細胞內(nèi)瞬間表達后引起內(nèi)源基因沉默(TIGS)，同時在單細胞基礎上研究瞬間表達細胞內(nèi)的外源基因表達改變對病原菌侵染的影響，分析外源基因的抗病功能。對抗病基因工程的上游已經(jīng)篩選和克隆出的包括抗病基因類似物、轉(zhuǎn)錄因子、信號傳導因子及大量的抗病基因類似物片段等，利用單細胞瞬間表達技術這種高效而快速的功能驗證方法，來鑒定它們的功能，可以有效地推動其在分子育種中的研究和利用。利用單細胞瞬間表達技術在大麥中鑒定白粉病抗病基因的功能已經(jīng)得到了廣泛的應用(NelsonAJ,BushnellffR.Transientexpressionofanthocyaningenesinbarleyepidermalcells:potentialforuseinevaluationofdiseaseresponsegenes.TransgenicRes，1997，6(3):233-244;SchultheissH,DechertC.AsmallGTP—bindinghostproteinsrequiredforentryofpowderymildewfungusintoepidermalcellsofbarley.PlantPhysiol，2002，128(4):1447-1454X—個高效的小麥基因槍瞬間表達技術體系的包括三個要素1、方便觀察和統(tǒng)計的報告基因；2、高效的基因槍轉(zhuǎn)化參數(shù)；3、適合的目標基因表達產(chǎn)物與白粉菌互作效率的統(tǒng)計參數(shù)。近幾年，單細胞瞬間表達技術在小麥中也有初步的應用(Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheat.MolecularPlant-Microbelnteractions.1999，12:647-654)，但是該技術在小麥中還存在基因槍轉(zhuǎn)化的效率受人為操作的主觀影響而效率較低、在小麥中缺乏高效的基因槍轉(zhuǎn)化參數(shù)的篩選、選用報告基因表達效率不穩(wěn)定等一些問題。為了建立高效小麥單細胞瞬間表達體系，本發(fā)明緊扣上述三要素，以小麥離體葉片為受體，使用綠色熒光蛋白(GFP)基因作為報告基因，對表達效率影響較大的多個轉(zhuǎn)化參數(shù)進行優(yōu)化，建立了適合小麥單細胞瞬間表達的技術體系，并利于該體系對族毛麥Sgtl基因在小麥白粉病抗病中的功能研究，為下一步該基因在小麥抗白粉病轉(zhuǎn)基因育種中的利用提供依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述缺陷，對小麥離體葉片基因槍轉(zhuǎn)化方法進行了系統(tǒng)的研究，建立了高效的小麥單細胞瞬間表達體系。本發(fā)明的另一目的是提供一種高頻小麥葉片瞬間表達體系分析外源基因的抗白粉病功能的方法。本發(fā)明的又一目的是提供含有抗白粉病相關基因族毛麥SGTl基因的表達載體。本發(fā)明的又一目的是提供該表達載體在小麥抗白粉病轉(zhuǎn)基因育種中的應用。本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細胞的方法，使用綠色熒光蛋白GFP基因作為報告基因，以小麥第一葉的離體葉片為轉(zhuǎn)化受體進行基因槍轉(zhuǎn)化，小麥葉片采用固體保鮮培養(yǎng)基固定，基因槍轉(zhuǎn)化采用直徑為IUm的鎢粉，用量為300ug/槍，質(zhì)粒DNA用量為750ng/槍，轟擊距離采用可裂膜氦壓為1350psi，可裂膜與受體膜距離為6mm，受體與阻擋網(wǎng)距離為6cm。本發(fā)明所述高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細胞的方法在白粉病抗病基因篩選和/或功能鑒定中的應用。一種利用本發(fā)明所述的高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細胞的方法分析外源基因的抗白粉病功能的方法，包括如下步驟I)采用權利要求I所述的方法將含有候選基因的質(zhì)粒通過基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片；2)接種白粉菌，觀察基因瞬間表達的葉片單細胞對白粉菌的抗性作用，以白粉菌吸器指數(shù)大小作為抗性高低的衡量標準。利用上述的方法篩選到的含有Hv-SGTl基因的表達載體。所述的Hv-SGTl的表達載體優(yōu)選以PBI220為出發(fā)載體，將Hv-SGTl基因插入PBI220的BamHI和SacI酶切位點間所得。本發(fā)明所述的含Hv-SGTl的表達載體在培育抗白粉病小麥品種中的應用。有益效果I)基因槍轉(zhuǎn)化過程中，基因槍轉(zhuǎn)化效率受多個因素的綜合影響，本發(fā)明運用單因素試驗設計研究了離體葉片固定方法、每槍金粉用量、每槍DNA用量、可裂膜氦壓等因素的影響，并且雙因素試驗設計綜合考察了轟擊距離A(可裂膜與載體膜之間的距離)和B(阻擋網(wǎng)與受體組織之間的距離)組合對表達效率的影響。找到了優(yōu)化的基因槍轟擊參數(shù)，建立了高效的轉(zhuǎn)化體系。2)本發(fā)明提供了一種高頻小麥葉片瞬間表達體系分析外源基因的抗白粉病功能的方法，運用優(yōu)化的基因槍轉(zhuǎn)化技術體系在感病小麥品種離體葉片表皮細胞中過量表達簇毛麥SGTl基因，結果表明該基因瞬間表達使互作細胞吸器指數(shù)降低，對白粉病菌侵入和吸器形成有抑制作用，可增強對白粉病菌的抗性。本發(fā)明建立的單細胞瞬間表達體系可成功應用于白粉病抗病基因功能的鑒定。圖I離體葉片的兩種固定方式-固體培養(yǎng)基法(A)和載玻片法(B)圖2報告基因Cl-Lc(A)、GFP⑶、⑶S(C)在小麥葉片表皮細胞中的表達圖3基因槍轉(zhuǎn)化參數(shù)的瞬間表達分析，A:每槍鎢粉用量對瞬間表達效率的影響；B:每槍質(zhì)粒DNA用量對瞬間表達效率的影響；C:可裂膜氦壓對瞬間表達效率的影響；D:轟擊距離A(可裂膜與載體膜之間距離)+B(阻擋網(wǎng)與受體組織之間距離)對瞬間表達效率的影響圖4pBI220=Hv-SGTl過量表達載體構建圖譜圖5⑶S基因在小麥葉片表皮細胞中的表達及目標基因與白粉菌的互作，a-d:白粉菌成功侵入表達GUS基因的表皮細胞后形成的吸器，200X;e-h:白粉菌附著孢未能侵入表達⑶S和目標基因的表皮細胞，200X。geec:表達⑶S基因的表皮細胞；ha:吸器；app:附著孢；co:接種孢子；hy:菌絲。具體實施例方式實施例I高基因槍轉(zhuǎn)化小麥離體葉片體系的建立I.I材料與方法帶不同報告基因的表達載體報告基因花青素苷合成調(diào)節(jié)基因Cl-Lc的表達載體pBecks400.RecKMcCormacAC,WuHX,BaoMZ,WangYB,XuRJ,ElliottMC,ChenDF.Theuseofvisualmarkergenesascell-specificreportersofAgrobacterium-mediatedT-DNAdeliverytowheat(TriticumaestivumL.)andbarley(HordeumvulgareL.).Euphytica,1998，99(I):17-25.)。綠色熒光蛋白基因GFP的表達載體psGFP(TakashiTamura,KojiroHara,YubeYamaguchi,NozomuKoizumiandHiroshiSano.Osmoticstresstoleranceoftransgenictobaccoexpressingageneencodingamembrane-locatedreceptor-1ikeproteinfromtobaccoplants.PlantPhysiol,2003，131:454-462.)。P-1，3-葡萄糖苷酸酶基因⑶S的表達載體pAHC25(ChristensenAH,QuailPH,Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)。高感白粉病小麥品種揚麥158的種子分別種在小塑料盆缽中，放置在無病原菌的光照箱中于25°C、每天12h光照培養(yǎng)7d。剪下一葉期小麥幼苗葉片約4cm長的端部，取5飛片葉片，背面朝上，并排貼在加了20mg/L6-BA的水瓊脂固體培養(yǎng)基表面，用塑料插地牌制作的阻擋扣固定兩端(圖1A);用雙面膠貼在載玻片上，剪切口用濕潤的吸水紙壓住以保濕，接受基因槍轟擊(圖1B)?；驑屖褂胇^1000/抱系統(tǒng)，采用直徑1.011111鎢粉，表達載體質(zhì)粒用北京天根公司質(zhì)粒小提中量試劑盒提取并用酶標儀定量，終濃度為IUg/Ul。待優(yōu)化的參數(shù)包括葉片固定方式(圖I)、鎢粉用量、質(zhì)粒DNA用量、可破裂膜的氦壓、轟擊距離(A-可裂膜與載體膜之間的距離；B-阻擋網(wǎng)與受體組織之間的距離)、真空度。鎢粉的準備和質(zhì)粒的包裹如下制備鶴粉稱取30mg的鶴粉于I.5mleppendorf管中，加入Iml70%酒精，潤旋3-5min后靜置15min,使鶴粉完全沉淀。12000rpm離心Imin后棄上清。加入Iml(1(11120水，渦旋混勻后，離心棄上清(重復三次)。最后加入500ii150%甘油渦旋混勻，以備用。包裹子彈吸取16-135ill渦旋均勻的鎢粉(10槍，100-800iig/槍)于1.5ml的eppendorf管中，加入220無菌水,邊潤旋邊向eppendorf管內(nèi)滴加50ii12.5MCaCl2,然后加入20u10.IM亞精氨(現(xiàn)配先用)，10uI質(zhì)粒DNA(總量應為0.25-1.5yg/槍)，冰上渦旋lOmin。靜置Imin后離心2s，棄上清。加入600iU70%酒精，充分渦旋，離心2s，棄上清。然后加入600iill00%酒精，充分渦旋，離心2s，棄上清。最后加入100iill00%酒精(IOiil/槍)，充分渦旋，以備使用。I.2結果與分析I.2.I報告基因Cl-Lc、GFP、⑶S均能在小麥的葉片表皮細胞中表達本研究首先采用花青素合成酶調(diào)節(jié)基因(Cl-Lc)，綠色熒光蛋白基因(GFP)，^-半乳糖苷酶基因(GUS)分別作為報告基因轉(zhuǎn)化小麥葉片獲得瞬間表達，結果發(fā)現(xiàn)，雖然花青素合成酶基因和GFP基因表達載體使用的是CAMV35S啟動子，而GUS使用的是Ubi啟動子，但三者在小麥葉片表皮細胞中的表達效率沒有顯著差異，每張葉片均可獲得幾十甚至上百個表達細胞(圖2)，而且報告基因在表皮長細胞、氣孔保衛(wèi)細胞、氣孔間短細胞等各種類型的表皮細胞中都能夠正常表達。三種報告基因中，以花青素的觀察最為簡單，表達細胞肉眼可見紅色花青素積累(圖2A)，但由于表達細胞顏色會逐漸加深至紅褐色，在顯微鏡下無法看清楚表達細胞內(nèi)的白粉菌的結構，而且脫色時會和葉綠素一樣迅速褪去。GFP的觀察可在活體進行，在熒光顯微鏡下使用藍光激發(fā)，可見到呈亮綠色熒光的轉(zhuǎn)化細胞(圖2B)，但是在表達GFP的細胞內(nèi)也無法看清楚白粉菌的結構。GUS基因產(chǎn)物不能進行活體觀察，必需經(jīng)過化學染色和脫色再觀察，但在將轉(zhuǎn)化陽性細胞染成藍色的同時也能特異地將白粉菌的吸器染成藍色(圖2C)，易于觀察和統(tǒng)計。綜合上述特點，后續(xù)的研究在優(yōu)化基因槍轟擊參數(shù)的實驗中采用GFP做報告基因，而在驗證基因功能的實驗中采用GUS做報告基因。I.2.2葉片固定方式的選擇在基因槍轟擊到實現(xiàn)目標基因瞬間表達，再到后續(xù)接種白粉菌研究其互作特性的過程中，離體的葉片要保持其細胞活力至少52個小時，加上要盡量減少葉片在轟擊過程中的損傷，以及避免轟擊時由于可裂膜破裂產(chǎn)生的沖力而打飛葉片影響轟擊的效率，葉片的固定方式值得進行探究。本實驗通過培養(yǎng)基和載破片兩種固定方式的比較發(fā)現(xiàn)小麥葉片寬且平整，表面無絨毛及較厚的蠟質(zhì)層，采用含保鮮劑固體培養(yǎng)基固定，便于保濕透氣，進而保持了葉片細胞的活性；兩端用自制的阻擋扣壓緊，使葉片在基因槍轟擊過程中也不會被打飛掉；接種白粉菌后葉片在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，既能使葉片保持活性，延緩轟擊損傷造成的細胞死亡，又能保證濕度有利于白粉菌的發(fā)育。因此，采用含保鮮劑固體培養(yǎng)基固定離體葉片的方法的優(yōu)點明顯，在后續(xù)的基因功能驗證實驗中被一直使用。I.2.3基因槍轟擊參數(shù)對表達效率的影響用帶有報告基因GFP的質(zhì)粒對影響較大的鎢粉用量，質(zhì)粒DNA用量，氦壓，轟擊距離A(可裂膜與載體膜之間的距離)和B(阻擋網(wǎng)與受體組織之間的距離)組合等轉(zhuǎn)化參數(shù)進行優(yōu)化以獲得較高的瞬間表達頻率。鎢粉用量在50-500ug/槍的范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，瞬間表達效率也隨之提聞，300-500iig/槍的范圍內(nèi)，GFP瞬間表達頻率差異不大(圖3-a)。這與王華忠等(2006)報道的金粉的用量對表達效率的影響的結果一致，可見使用鎢粉與金粉的差異不大，且鎢粉濃度較高，不僅不利于包裹上DNA后微彈的分散，而且還可能因轟擊損傷細胞數(shù)目的增加而影響表達效率的提高，故采用300yg/槍鎢粉是適宜的。鎢粉用量為300ug/槍時，質(zhì)粒DNA濃度在250-1500Ug/槍的范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，GFP瞬間表達效率也隨之提高，在750ng/槍，GFP表達的效率最高，超過IOOOng/槍后則GFP表達細胞數(shù)明顯下降(圖3-b)，可能因為質(zhì)粒濃度高影響了鎢粉顆粒的分散，從而影響轟擊的效果。在研究氦壓對表達效率的影響時，鎢粉用量為300iig/槍，質(zhì)粒濃度為750ng/槍，采用可承受750psi、900psi、1100psi、1350psi、1550psi氦壓的五種可破裂膜進行實驗。結果表明，當使用1350psi的可破裂膜時，單張葉片轟擊后表達GFP的細胞個數(shù)最多(圖3-c)，且明顯高于其他參數(shù)組。在研究轟擊距離對表達效率的影響時，鎢粉用量為300iig/槍，質(zhì)粒濃度為750ng/槍。轟擊距離A-可裂膜與載體膜之間的距離采用(3，6，9，12mm)4個梯度；B-阻擋網(wǎng)與受體組織之間的距離(6，9，12cm)3個梯度，共計12個組合。結果表明，轟擊距離A_6mm和B-6cm的組合，單張葉片轟擊后表達GFP的細胞個數(shù)最多(圖3_d)。最適的轟擊參數(shù)主要是轟擊損傷(細胞損傷)和轟擊效率(接受金粉的細胞數(shù))之間的平衡。綜合上述影響因素，選擇以下參數(shù)用于基因槍轉(zhuǎn)化鎢粉用量300yg/槍；質(zhì)粒DNA濃度750ng/槍，氦壓1350psi;可裂膜與受體膜距離6mm;受體與阻擋網(wǎng)距離6cm。實施例2簇毛麥SGTl基因Hv-SGTl過量表達載體的構建以簇毛麥SGTl基因cDNA(SEQIDNO.I)為模板，使用引物對SGTlATG-BamHIF(TTGGATCCTCGACGCAGACATGG,SEQIDNO.2)和SGH-TGA-KpnI-R(GCGGTACCTCATTAATACTCCCAC,SEQIDNO.3)進行PCR擴增，回收擴增片段。用BamHI和KpnI對擴增產(chǎn)物進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物插入到BamHI和KpnI雙酶切后的載體pBI220((JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.GUSfusions:beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.1987,6:3901-3907.))JfHv-SGTl置于35S啟動子后面的多克隆位點處。由此將目標基因Hv-SGTl克隆到強啟動子35S的下游，獲得表達載體pBI220:Hv-SGTl(圖4)。經(jīng)測序驗證，表明載體構建成功。實施例3利用瞬間表達方法將Hv-SGTl基因轉(zhuǎn)入感病小麥葉片，研究其與小麥白粉病的互作效果3.I材料與方法將目標基因Hv-SGTl的表達載體與⑶S表達載體pAHC25(ChristensenAH，QuailPH.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996，5:213-218.)質(zhì)粒DNA混合同時包裹鎢粉(目標基因載體與GUS基因載體濃度的摩爾比例為2:1)，用基因槍轟擊小麥葉片共轉(zhuǎn)化。葉片轟擊后4h接種白粉病菌孢子。接種方法將一塑料片卷成圓桶狀置于瓷盤上，從上面均勻抖落新鮮的白粉病菌孢子，接種密度要高，至少I個表皮細胞表面落有I個孢子。瞬間表達后的處理過程為接種后48h進行⑶S染色(配方為0.lmol/LNa2HPO4/NaH2PO4緩沖液(pH7.0),含10mmol/LEDTA,5mmol/L鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀,0.lmg/mlX-Gluc,0.l%TritonX-100,20%甲醇，)真空滲透lOmin，37°C染色24h，然后用70%酒精脫色2天直至葉片變成白色為止，最后利用濃度為0.6%的考馬斯亮藍對白粉菌孢子染色。然后在載玻片上滴加50%甘油作為浮載劑和保存劑，在Olympus顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化陽性細胞表面白粉病菌的發(fā)育情況及細胞內(nèi)吸器的有無。吸器指數(shù)定義為在一定數(shù)目的表達GUS基因并且落有白粉病孢子的陽性表皮細胞中，白粉菌成功侵入并在細胞內(nèi)形成吸器的細胞所占的比例。相對吸器指數(shù)將對照組侵入頻率矯正為100%，處理組作相應矯正。每個質(zhì)粒載體的轟擊重復3次，每次重復轟擊4個培養(yǎng)皿的葉片，根據(jù)3次重復的數(shù)據(jù)計算平均吸器指數(shù)并運用卡方測驗進行差異顯著性分析。3.2結果與分析感白粉病葉片只轉(zhuǎn)GUS基因?qū)φ战臃N白粉菌后經(jīng)GUS染色，可以觀察到大部分GUS陽性細胞表面的孢子都能夠正常萌發(fā)，長出初生芽管和附著孢芽管，附著孢芽管末端形成附著孢緊緊貼附于表皮細胞表面并向表皮細胞壁的方向形成侵入釘，進一步侵入表皮細胞并在細胞內(nèi)形成吸器，由于吸器是白粉菌吸收營養(yǎng)繼續(xù)生長并形成次級菌絲和菌落等(圖5a-d)。而在共轉(zhuǎn)化目的基因Hv-SGTl與⑶S基因的⑶S陽性細胞中，白粉菌的侵染終止在侵入釘侵入表皮細胞這一步，并不能在細胞內(nèi)形成吸器，這樣的細胞視為由于目標基因過量表達產(chǎn)物在該GUS陽性細胞中的積累抑制吸器的形成，增強了對白粉病菌的抗性的陽性細胞(圖5e-h)。目的基因Hv-SGTl與小麥白粉病的互作效果統(tǒng)計結果表明(表1)，該基因使互作細胞吸器指數(shù)降低至25.5%，對照為單獨導入GUS基因的葉片表皮細胞吸器指數(shù)為42.5%，表明該基因?qū)Π追鄄【秩牒臀餍纬捎幸种谱饔?，可增強小麥對白粉病菌的抗性。表I利用建立的瞬間表達體系研究Hv-SGTl對白粉菌吸器形成的影響權利要求1.一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細胞的方法，其特征在于使用綠色熒光蛋白GFP基因作為報告基因，以小麥第一葉的離體葉片為轉(zhuǎn)化受體進行基因槍轉(zhuǎn)化，小麥葉片采用固體保鮮培養(yǎng)基固定，基因槍轉(zhuǎn)化采用直徑為IUm的鎢粉，用量為300ug/槍，質(zhì)粒DNA用量為750ng/槍，轟擊距離采用可裂膜氦壓為1350psi，可裂膜與受體膜距離為6mm，受體與阻擋網(wǎng)距離為6cm。2.權利要求I所述的方法在白粉病抗病基因篩選和/或功能鑒定中的應用。3.一種利用權利要求I所述的方法分析外源基因抗白粉病功能的方法，其特征在于包括如下步驟1)采用權利要求I所述的方法將含有候選基因的質(zhì)粒通過基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片；2)接種白粉菌，觀察基因瞬間表達的葉片單細胞對白粉菌的抗性作用，以白粉菌吸器指數(shù)大小作為抗性高低的衡量標準。4.利用權利要求3所述的方法篩選到的含有Hv-SGTl基因的表達載體。5.根據(jù)權利要求4所述的表達載體，其特征在于所述的Hv-SGTl的表達載體是以PBI220為出發(fā)載體，將Hv-SGTl基因插入pBI220的BamHI和SacI酶切位點間所得。6.權利要求4或5所述的含Hv-SGTl的表達載體在培育抗白粉病小麥品種中的應用。全文摘要本發(fā)明公開一種高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細胞瞬間表達的方法及其應用。高效基因槍轉(zhuǎn)化小麥葉片單細胞的方法，使用GFP基因作為報告基因，以小麥第一葉的離體葉片為轉(zhuǎn)化受體進行基因槍轉(zhuǎn)化，小麥葉片采用固體保鮮培養(yǎng)基固定，基因槍轉(zhuǎn)化采用直徑為1μm的鎢粉，用量為300ug/槍，質(zhì)粒DNA用量為750ng/槍，轟擊距離采用可裂膜氦壓為1350psi，可裂膜與受體膜距離為6mm，受體與阻擋網(wǎng)距離為6cm。利用該方法在感病小麥品種揚麥158的離體葉片表皮細胞中過量表達簇毛麥SGT1基因，結果表明該基因瞬間表達可降低互作細胞中白粉菌吸器指數(shù)，表明該基因?qū)Π追鄄【秩牒臀餍纬捎幸种谱饔茫稍鰪妼Π追鄄【目剐?。文檔編號C12N15/63GK102978230SQ20121050703公開日2013年3月20日申請日期2012年12月3日優(yōu)先權日2012年12月3日發(fā)明者邢莉萍,曹愛忠,錢晨,王秀娥,陳佩度申請人:南京農(nóng)業(yè)大學