專利名稱：重組人源過氧化氫酶的制備方法及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種制備人源過氧化氫酶的方法。具體而言，本發(fā)明提供了一種采用 基因工程技術(shù)克隆人源過氧化氫酶基因，構(gòu)建其表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化細胞獲得高產(chǎn)量人源 過氧化氫酶的方法。 技術(shù)背景-過氧化氫酶是一類在自然界需氧生物體內(nèi)分布很廣泛的酶，能高效的催化過氧化 氫生成分子氧和水。機體細胞呼吸過程中部分氧會被還原為HA， &02易被細胞內(nèi)還原 劑還原為體內(nèi)最強的一種氧化劑 0H自由基，體內(nèi)也可通過Fenton反應和 HarbeWeiss反應產(chǎn)生。在病理情況下，HA累積，會造成過多 0H，產(chǎn)生嚴重的氧化 損傷，過氧化氫酶能消除由機體代謝過程中產(chǎn)生的H202，阻斷，0H的累積，達到防止 氧化損傷的作用。自由基病理學的研究，發(fā)現(xiàn)了活性氧與許多人類疾病日益密切的聯(lián)系，因此研究 如何清除活性氧成為一個熱點。從機體自身的角度講，主要有機體抗氧化酶、脂溶性 抗氧化劑、水溶性小分子抗氧化劑、蛋白抗氧化劑等組成了機體抗抗氧化防御系統(tǒng)。 作為抗氧化酶體系之一的過氧化氫酶受到更大關(guān)注。近年來，國外有關(guān)治療性應用過氧化氫酶的研究報道逐步增加。例如AshokG叩ta 等人報道了過氧化氫酶能有效地減少腫瘤發(fā)生的細胞模型。有人用脂質(zhì)體包埋的S0D 和CAT通過靜脈注射的方式，使暴露于100%氧氣中的小鼠存活率明顯上升。Roscoe L. Warner等人用免疫復合物誘導急性肺損傷的大鼠模型，注射牛肝過氧化氫酶，可以 明顯地減少炎癥反應中嗜中性白血球及減輕肺泡的損傷。另外Joachim Ruh等人用非 類固醇類消炎劑吲哚美辛誘導炎性腸胃道疾病的大鼠模型，靜脈注射過氧化氫酶，可 以很明顯的減輕炎癥區(qū)域的充血情況和減少了小動脈的血管直徑，起到抗炎作用等。 在國內(nèi)有人用CAT和SOD聯(lián)合用藥，對眼前段堿燒傷的治療作了一定的探索。國外Holly等研究者曾測定長壽命的轉(zhuǎn)基因鼠(the armes dwarf mouse-single point mutation in Prophet of pit-l gene)禾口同胞鼠體內(nèi)各器官內(nèi)Catalase表達
水平，結(jié)果轉(zhuǎn)基因鼠在不同生長時間、在肝臟、腎、心臟內(nèi)Catalase含量明顯高于對 照鼠。國內(nèi)也有通過調(diào)節(jié)過氧化氫酶水平，達到抗衰老目的相關(guān)報道。這些實驗報道 給我們啟示了過氧化氫酶可延緩機體衰老，可能有臨床使用的可能性。但是，目前的研究試驗所采用的基本上都為牛肝過氧化氫酶，或者是采用基因工 程表達的微生物來源的過氧化氫酶，尚未發(fā)現(xiàn)用人源過氧化氫酶通過外源性給藥的方 式進行臨床用途的試驗的報道。為了解決基因同源性，避免外源蛋白引起的免疫反應 問題，必須采用人源過氧化氫酶和解決人源過氧化氫酶來源的問題，目前有研究擬從人組織中提取獲得過氧化氫酶，但是由于來源受到限制以及疾病 源污染的問題，不能符合臨床上的廣泛用途。目前也尚見人源的過氧化氫酶在細菌， 酵母，昆蟲等表達系統(tǒng)表達制備的報道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種制備重組人源過氧化氫酶的方法。 本發(fā)明利用基因工程的手段制備重組人源過氧化氫酶。本發(fā)明所制備的人源過氧化氫酶產(chǎn)量高，高活性，生產(chǎn)方法簡便，無疾病源污染的問題。本發(fā)明進一步目的是提供本方法制得的重組人源過氧化氫酶在抗氧化抗衰老中的用途。本發(fā)明提供的利用基因工程技術(shù)制備人源的過氧化氫酶的方法，其包含下述步驟 (1)將可編碼人源過氧化氫酶的基因嵌入含適當轉(zhuǎn)錄啟動子的表達載體中構(gòu)建重組 質(zhì)粒；(2) 將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到適當?shù)乃拗骷毎校?3) 于適合該細胞表達過氧化氫酶的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細胞；(4) 純化所表達的人源過氧化氫酶。 基于人所有組織的過氧化氫酶基因均具有一致的基因同源性，本發(fā)明的方法除可以生產(chǎn)人胚胎肝細胞來源的過氧化氫酶外，還適用于人組織和血漿來源的所有過氧化 氫酶。本發(fā)明方法以基因庫中的人源過氧化氫酶基因的DNA序列為基礎設計引物，PCR 擴增各種人組織來源的過氧化氫酶基因，構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞，并令其表達 而制得。
擴增的人源過氧化氫酶基因以公知的方法插入表達載體中，包括任何可用于細菌， 酵母，昆蟲表達系統(tǒng)的表達載體。例如PBR， PUC， PET， pPIC等載體，可根據(jù)需要選 用。構(gòu)建完成的表達載體可以轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗鞑⑦M行表達?？捎糜诒景l(fā)明的宿主細胞 包括細菌大腸桿菌或者枯草芽孢桿菌，酵母甲醇酵母，或是昆蟲細胞果蠅表達 系統(tǒng)，家蠶表達系統(tǒng)，其中優(yōu)選酵母表達系統(tǒng)，最優(yōu)選畢氏甲醇酵母表達系統(tǒng)。所述 的畢氏甲醇酵母表達系統(tǒng)已于2006年9月26日保藏，保藏單位CGMCC,北京市海 淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，保藏編號CGMCC No.1825,分類命名畢氏甲醇酵母^'c力is pastorj's 。轉(zhuǎn)化的宿主細胞株于適宜該外來質(zhì)粒大量表達的條件下培養(yǎng)，最后將產(chǎn)物分離。 依常法，硫酸銨沉淀，疏水層析，離子交換層析，獲得95%的人源過氧化氫酶。采用本方法制備的過氧化氫酶可用于外源性抗感染如急性肺炎；抗氧化損傷如燒 傷等氧自由基引起的急性氧化損傷；抗衰老如抗長期氧自由基損傷引起的衰老等病理 狀況和抗腫瘤等用途。


圖1: RT-PCR擴增得到基因片段泳道l， RT-PCR擴增得到的基因片段，大小為1.6Kb， 泳道2， RT-PCR擴增得到的基因片段，大小為1.6Kb，泳道3， DNA Marker,從上到下為10000bp， 7500bp， 5000bp， 2500bp， 1000bp， 500bp，泳道4， RT-PCR的模版RNA。 圖2: pPIC9k_CAT重組表達質(zhì)粒構(gòu)建。 圖3:重組質(zhì)粒的PCR鑒定泳道l: DNA Marker大小從2000bp， 1000bp， 750bp， 500bp， 200bp，泳道2:陽性對照，A0X引物PCR產(chǎn)物大小為2. 1Kb左右，泳道3:陰性對照，A0X引物，PCR產(chǎn)物大小為492bp，泳道4:重組質(zhì)粒l， A0X引物，PCR產(chǎn)物大小為2.1Kb，泳道5:重組質(zhì)粒2， A0X引物，PCR產(chǎn)物大小為2. 1Kb,泳道6:重組質(zhì)粒l，基因引物，PCR產(chǎn)物大小為1.6Kb， 泳道7:重組質(zhì)粒2，基因引物，PCR產(chǎn)物大小為1.6Kb，泳道8: DNA Marker大小從15000bp， 10000bp， 7500bp, 5000bp， 2500bp，1000bp， 500bp。 圖4:重組質(zhì)粒的酶切鑒定泳道l:陽性重組質(zhì)粒，BglII酶切后，大片段在8400bp，小片段為2500bp; 泳道2:腿Marker大小從15000bp, 10000bp， 7500bp， 5000bp， 2500bp，1000bp， 500bp，泳道3:空質(zhì)粒，Bgl II酶切后，大片段在6800bp,小片段為2500bp。 圖5:陽性重組菌PCR鑒定泳道l、 2、 3:均為陽性重組菌，泳道4: DNA Marker大小從2000bp, 1000bp， 750bp， 500bp， 200bp， 泳道5 :重組質(zhì)粒作為陽性對照。 圖6:.表達菌株發(fā)酵曲線。圖7:表達產(chǎn)物的純化(SDS-PAGE)及westen blot鑒定 其中A : SDS-PAGE鑒定泳道l:發(fā)酵液上清硫酸銨濃縮液，泳道2:發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨濃縮后，疏水柱脫鹽后，上柱于Q-S柱，純度已經(jīng)達 80%，泳道3:將Q-S柱分液，再經(jīng)羥基磷灰石，純度達95%，B: westen-blot鑒定泳道l:發(fā)酵液上清濃縮液，泳道2: Q-S離子交換柱純化后的人源過氧化氫酶泳道3:羥基磷灰石柱分后的人源過氧化氫酶 圖8:抗急性肺炎模型三張切片分別為正常組小鼠肺部切片，病毒誘導組小鼠肺部切片，病毒給藥組 小鼠肺部切片，顯示給藥能明顯減輕小鼠肺部病變程度。圖9:抗亞急性衰老模型Morris水迷宮試驗結(jié)果 其中，A為正常對照組，B為亞急性衰老組，C為給藥組。
具體實施方式
為使本發(fā)明的內(nèi)容更為明確，以下列非限制實施例進一步詳細說明。實施例1 pPIC9k-CAT表達質(zhì)粒的構(gòu)建 人胚胎肝細胞CDNA的提取將lg新鮮的人胚胎肝組織液氮冷凍，研磨，研細后，用上海生物工程公司購得RNA 提取試劑盒，提取RNA。將RNA溶液用上海生物工程公司購得CDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒通過 RT-PCR獲得總的CDNA。編碼人肝過氧化氫酶的基因擴增5'端和3'端引物的合成根據(jù)NCBI基因庫中2004年剛發(fā)布的人肝全長 CDNA[gi :50490312]，找出其中的ORF序列，設計引物。合成5，端引物TACGTA ATGGCTGACAGCCGGGATCC，此序列含SNABI酶切位 點。3，端引物CCGGCGGCCGC TCACAGATTTGCCTTCTCC,此序列含Notl酶切位點。PCR擴增:取肌C腿，加入1叱DNTP， 5叱10XBuffer，機5，端引物和化L3， 端引物，34叱水，l叱Taq酶(takara大連寶生)后，加入50叱石蠟油液封。設定PCR 參數(shù)如下攝氏94度5分鐘，l個循環(huán)；攝氏94度30秒，63度30秒，72度1分40 秒，3個循環(huán)；攝氏94度30秒，60度30秒，72度1分40秒，共25個循環(huán)。PCR結(jié) 束后，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析，確定擴增得到的DNA片段的大小為1.6Kb左右 (見圖1)。T-A克隆將Taq酶PCR得到的DNA片段取4叱，加l禮T-vector, 5叱solution 1,16度水 浴連接8小時，將連接產(chǎn)物加入大腸桿菌TGI感受態(tài)細胞中，42度熱激90秒，冰浴2 分鐘，加lmlLB100rpm培養(yǎng)復蘇，4000RPM離心5分鐘，棄去大部分上清，將其余部 分混均，取20(HiL涂布于含Xgal和IPTG的抗性平板上(lOOPg/ml氨芐青霉素)，37 度，生長18小時，將白色菌落，挑出擴增，抽取質(zhì)粒，PCR鑒定條件同前，得到陽性 的T-A質(zhì)粒。測序與NCBI基因庫上公布的CDNA全長序列中ORF區(qū)域100%吻合，證明所獲得基因片段為目的基因片斷。 pPIC9k-CAT表達質(zhì)粒的構(gòu)建將篩選得到的T-A克隆質(zhì)粒，用SnaB I和Not I在37攝氏度下反應2h，利用瓊 脂糖凝膠回收1. 6Kb左右的目的基因片段，將純化后的片段用T4 DNA連接酶連接到也 同樣用SnaB I和Not I酶切好的pPIC9k載體上(invitrogen公司)，16攝氏度連接 過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGI感受態(tài)細胞，經(jīng)篩選得到陽性pPIC9k-CAT表達 質(zhì)粒。再經(jīng)酶切和用A0X1序列作引物的PCR驗證，確定目的基因已經(jīng)克隆進pPIC9k 載體(見圖2，圖3，圖4)。實施例2 pPIC9k-CAT表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和陽性菌株篩選將獲得的pPIC9k-CAT表達質(zhì)粒經(jīng)Bgl II在37度下酶切2小時線性化完全，無水 乙醇沉淀，10000RPM離心，棄上清，揮去殘留的乙醇，用無菌水溶解。取5叱與80叱 處于感受狀態(tài)的新鮮制備的酵母菌SMD1168 (市購)混勻，具體參考irwitrogen公司 的電轉(zhuǎn)化Protocol,電擊穿孔導入。將電擊完的菌液30度復蘇1小時，涂布于MD平 板上，30度生長3-5天，將生長的白色克隆接到含4mg/ml的G418的YPD平板上進行 抗性篩選，篩選高拷貝的重組菌畢氏甲醇酵母pic力ia / a"o/^s，將獲得的重組菌用 煮_凍-煮的方法裂解細胞，抽取基因組DNA，進行PCR驗證。用基因引物和AOX引物都 能獲得陽性的條帶，說明目的基因已經(jīng)整合到基因組上。(見圖5)實施例3高表達活力的陽性重組菌的篩選和人源過氧化氫酶的過量表達將所得的陽性重組菌與原始菌在5mlBMGY培養(yǎng)基中，250RPM， 30攝氏度，生長24 小時后，4000RPM離心，換BMMY培養(yǎng)基，以1%的甲醇誘導，每隔24小時補加一次， 培養(yǎng)條件同上。取菌液10000RPM離心后，觀察上清的過氧化氫酶活力，篩選得到畢氏 甲醇酵母(Fudan s4)高活力菌種。將S4高產(chǎn)菌株用14L的全自動發(fā)酵罐進行高效表達，在BS培養(yǎng)基中，30攝氏度， 溶氧40%，攪拌400RPM， PH為6. 8的時候，在甲醇誘導36小時，活力達到最高，其表 達活力以牛肝過氧化氫酶(sigma公司)為對照，達到每升220mg等量的牛肝過氧化氫 酶。(見圖6)實施例4表達產(chǎn)物的純化將發(fā)酵液4000RPM， 4攝氏度冷凍離心，收獲上清，加入80%飽和度的硫酸銨，攪 拌，置4攝氏度放置2小時，待沉淀完全后，10000RPM， 4攝氏度冷凍離心，收獲沉淀。 活力回收率為85%以上。將沉淀用1M的硫酸銨溶液溶解，上柱于同樣用1M硫酸銨平衡的苯基纖維素疏水 柱，用1M-0M硫酸銨濃度遞減的方法洗脫，酶活力集中在O. 1M硫酸銨的洗脫液中。去 除部分雜蛋白和脫鹽。將0. 1M硫酸銨洗脫液用PH7. 0， 10mM的磷酸緩沖液透析3次，每次體積比為1: 100以上，透析完全后，上柱于同樣磷酸緩沖液平衡的Q-S印harose FF柱，以含0M-0. 5M NaCl的磷酸緩沖液洗脫，收集酶活部分，獲得85%純度的目的蛋白。將上步洗脫液用lOmM的ra6. 8的磷酸鉀緩沖液透析3次，每次體積比為1: 100 以上，透析完全后，上柱于同樣用緩沖液平衡的羥基磷灰石，以0-0.3M磷酸鉀緩沖液 洗脫，收集酶活部分，獲得95%純度的目的蛋白。(見圖7)實施例5表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定及Westen Blot鑒定將表達產(chǎn)物在10%的濃度的SDS-PAGE，牛肝過氧化氫酶作為對照，考馬斯亮藍染 色發(fā)現(xiàn)66KD下有一明顯蛋白條帶。同樣做一塊SDS-PAGE膠，半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛奶封閉過夜，與鼠抗人過氧化 氫酶的一抗雜交，25攝氏度1小時，洗膜后，與AP標記抗鼠的二抗雜交后，洗膜， BCIP/NBT底物顯色后，發(fā)現(xiàn)膜上有明顯的特異性條帶。說明此表達蛋白為人源的過氧 化氫酶。(見圖8)蛋白質(zhì)及活性測量蛋白質(zhì)的含量測定以牛血清白蛋白為標準，采用蛋白質(zhì)定量試 劑盒及方法(購自南京建成出品)；過氧化氫酶活性測定采用鉬酸銨法測定，牛肝過氧 化氫酶(sigma公司，13800U/mg)作為標準品對照，所有的樣品活力均用牛肝過氧化 氫酶標定。 -實施例6純化過氧化氫酶抗小鼠急性肺炎損傷實驗將昆明種小鼠，6只為一組，每只重量都在16-18g，分為正常組，單純病毒組，病 毒給藥組。給病毒組和病毒給藥組接種流感病毒，制造急性肺炎模型。誘導一天后，病毒組給生理鹽水30ul，吸入給藥。病毒給藥組給含純化過氧化氫 酶的生理鹽水30ul，吸入給藥。連續(xù)給藥到第5天，第6天處置，觀察各組小鼠的肺部病變情況及切片觀察肺部組 織。(見圖9)結(jié)果顯示，給藥組能明顯減輕肺部的病變情況，表明通過外源性的人過氧化氫酶的給
藥方式能有效抗急性肺炎產(chǎn)生的氧化損傷。實施例7純化的過氧化氫酶抗小鼠亞急性衰老實驗將昆明種小鼠，6只為一組，分為正常組，亞急性衰老組，給藥組，每只重量16-18g。 亞急性衰老組和給藥組，分別頸背部皮下注射定量的D-半乳糖，連續(xù)40天，誘導其產(chǎn) 生亞急性衰老。正常組和亞急性衰老組注射生理鹽水，給藥組注射純化的人源過氧化 氫酶。觀察各組小鼠的各臟器衰老程度，如心肌，腦部，海馬回，腎臟等的電鏡，光 鏡及生化指標和小鼠行為學差異，如morris水迷宮等。實驗結(jié)果顯示，在行為學上表現(xiàn)為經(jīng)過訓練后，給藥的小鼠的各象限的尋臺時間少 于衰老組，表明過氧化氫酶對的小鼠的學習，記憶能力及活動能力都有明顯提高，具 有抗衰老的作用(見圖9)。
權(quán)利要求
1、重組人源過氧化氫酶的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)將可編碼人源過氧化氫酶的基因嵌入含適當轉(zhuǎn)錄啟動子的表達載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒；(2)將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到適當?shù)乃拗骷毎校?3)于適合該細胞表達過氧化氫酶的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細胞；(4)純化所表達的人源過氧化氫酶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的過氧化氫酶其來源是人組織 和/或血漿。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的宿主細胞選自細菌，酵母或昆蟲細 胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其中所述的宿主細胞是畢氏甲醇酵母pj'c力h pas"r/s，保藏單位CGMCC,保藏編號CGMCCNo.1825 。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟(4)的純化是以硫酸銨沉淀，有機 溶劑沉淀，疏水層析法和離子交換法，分子排阻法，將所表達的過氧化氫酶予以 純化。6、 一種表達人源的過氧化氫酶的重組質(zhì)粒，其特征是所述重組質(zhì)粒是采用基 因工程技術(shù)將人源過氧化氫酶基因嵌入表達載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒，其基因來源為人組織和/或血漿。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒，其表達載體選自細菌，酵母或昆蟲表達 系統(tǒng)的表達載體。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法所制得的人源的過氧化氫酶在制備外源性抗感染、 抗氧化損傷，抗衰老或抗腫瘤藥物中的用途。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中外源性抗感染是抗急性肺炎；外源性抗氧化 損傷是抗燒傷等氧自由基引起的急性氧化損傷；抗衰老是抗長期氧自由基損傷引 起的衰老病理狀況。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領域，涉及制備重組人源過氧化氫酶的方法。具體而言，本發(fā)明提供了一種采用基因工程技術(shù)克隆人源過氧化氫酶基因，構(gòu)建其表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化細胞獲得高產(chǎn)量人源過氧化氫酶的方法。本發(fā)明所制得的人源過氧化氫酶產(chǎn)量高，高活性，生產(chǎn)方法簡便，無疾病源污染的問題。本發(fā)明亦包括此方法中構(gòu)建的新的重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化細胞。本發(fā)明經(jīng)實驗證實，可將表達的重組人源的過氧化氫酶應用于制備抗感染、抗氧化、抗衰老或抗腫瘤藥物。
文檔編號C12N9/08GK101148659SQ20071012672
公開日2008年3月26日 申請日期2007年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日
發(fā)明者馮美卿, 史訓龍, 珮 周, 李繼揚, 海 黃 申請人:復旦大學