專利名稱：：一種用于胃癌組織的微小rna探針及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微小RNA，具體涉及一種用于胃癌組織的微小RNA探針及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：微小RNA是一類長度為19~24nt，在進化上比較保守的不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小分子RNA，是近年來新發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)節(jié)因子；在動物和植物細胞中，微小RNA通過對目標mRNA的切割或翻譯的抑制而發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。微小RNA在生物體的正常發(fā)育中起著舉足輕重的作用，人體基因組中已發(fā)現(xiàn)有250個左右的微小RNA，在不同組織細胞的生理異常變異中某些微小RNA具有明顯的異常表達，具體說在不同組織的腫瘤發(fā)生與某些微小RNA的表達和功能異常有密切的關(guān)系，大約有50%的得到注解的微小RNA在基因組上被定位為與腫瘤相關(guān)的脆性位點，因此對不同類型腫瘤組織中具體微小RNA的表達和功能異常的研究受到人們的重視。如Calin等于2002年首次報道了慢性B淋巴細胞白血病中常見的13ql4的缺失可導致2種微小RNA基因(miR-15a和miR-16a)的不表達，提示微小RNA具有抑制白血病發(fā)生的作用(ProcNatlAcadSciUSA2002;99:15524)。隨后，通過對結(jié)腸癌中28種微小RNA表達譜的分析，Michael等發(fā)現(xiàn)miR-143和miR-145的表達下調(diào)有可能促進了腫瘤的發(fā)生(MolCancerRes2003;1:882)。進一步擴大觀察的病種數(shù)，通過研究腫瘤細胞與正常細胞的微小RNA表達譜的差異，人們發(fā)現(xiàn)了至少21種在多種腫瘤中異常表達的微小RNA(ProcNatlAcadSciUSA2006;103:2257)。我國是胃癌組織高發(fā)區(qū)，現(xiàn)有的技術(shù)中均沒有涉及到胃組織的癌變與哪些低表達的微小RNA有關(guān)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測胃癌組織的微小RNA低表達的微小RNA探針，還提供了利用該探針檢測胃癌組織的微小RNA表達異常的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種用于胃癌組織的微小RNA探針，探針的序列由化學修飾過的寡聚核苷酸編碼片段和延伸臂片段組成，所述的寡聚核苷酸編碼片段包括下述微小RNA:hsa-miR-375、hsa-miR-34c-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-7、hsa-miR-200a、hsa-miR-l、hsa-miR-29b、hsa-miR-200b*、hsa-miR-31、hsa-miR-497、hsa-miR-146a、hsa-miR-200b、hsa-miR-378、hsa-miR-148a、hsa-miR-203、hsa-miR-34a、hsa-miR-l40-3p、hsa-miR-215、hsa-miR-29c、hsa-miR-429、hsa-miR-155、hsa-miR-768-3p、hsa-miR-200c、hsa-miR-768陽5p、hsa隱miR國936、hsa-miR-195、hsa-miR墨10a、hsa-miR-192、hsa-let-7b、hsa-miR-98、hsa-let-7c、hsa-miR-l6、hsa-let-7f、hsa-let-7d、hsa-miR-320、hsa-let-7e、hsa-miR-29a、hsa-let陽7a、hsa-miR-26b、hsa-let-7g禾卩hsa陽miR-145。一種檢測胃癌組織的微小RNA的方法，依次包括總RNA提取、總RNA質(zhì)量分析、微離心過濾得到小RNA樣品、添加Poly(A)聚合酶和用Cy3和Cy5特異性熒光標記小RNA樣品，用上述的探針對熒光標記的小RNA樣品雜交檢測?；瘜W修飾過的寡聚核苷酸編碼片段能與耙微小RNA互補雜交；延伸臂片段能使與它連接的編碼片段離片基有一定的距離，減少雜交空間阻礙；探針雜交的Tm值是通過化學修飾來平衡的。探針是由光敏試劑原位合成為微流體芯片。上述微小RNA在RNA基因數(shù)據(jù)庫中都能找到，延伸臂片段可以用分子生物學上能減少雜交空間阻礙的任何延伸臂片段。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于用于胃癌組織的微小RNA探針，探針的序列由化學修飾過的寡聚核苷酸編碼片段和延伸臂片段組成，寡聚核苷酸編碼片段包括上述微小RNA，探針能對胃癌組織的微小RNA進行雜交檢測，能檢測出胃癌組織中低表達的微小RNA，在胃癌組織中探針組成的每種微小RNA的量就比正常的胃組織的每種微小RNA的量低出許多，微小RNA探針從而就檢測出胃組織發(fā)生癌變時微小RNA的異常變異，作為胃組織發(fā)生癌變的一種診斷標志，微小RNA進一步可作為設(shè)計定向胃癌組織藥物的靶點，因此本發(fā)明為胃癌組織的診斷和定向治療提供了有利的依據(jù)。圖1為胃癌組織的微小RNA探針檢測照片；圖2為胃癌組織旁組織的微小RNA探針檢測照片；圖3為胃癌組織與胃癌旁組織的微小RNA探針檢測差異比較照片。具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例1一種用于胃癌組織的微小RNA探針，探針的序列由化學修飾過的寡聚核苷酸編碼片段和延伸臂片段組成，寡聚核苷酸編碼片段包括下述微小RNA:hsa-miR-375、hsa-miR-34c-3p、hsa-miR-141、hsa隱miR-7、hsa-miR-200a、hsa-miR國l、hsa誦miR-29b、hsa-miR-200b*、hsa-miR-31、hsa-miR-497、hsa-miR-146a、hsa-miR-200b、hsa-miR-378、hsa-miR-148a、hsa-miR-203、hsa-miR陽34a、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-215、hsa-miR-29c、hsa-miR-429、hsa-miR-155、hsa-miR-768-3p、hsa-miR-200c、hsa-miR-768-5p、hsa-miR-936、hsa-miR-195、hsa-miR-1Oa、hsa-miR-192、hsa-let-7b、hsa-miR-98、hsa-let-7c、hsa-miR-16、hsa陽let陽7f、hsa-let隱7d、hsa-miR-320、hsa-let-7e、hsa-miR-29a、hsa-let-7a、hsa-miR-26b、hsa-let-7g和hsa-miR-145，寡聚核苷酸編碼片段能與靶微小RNA互補，延伸臂片段能使與它連接的編碼片段離片基有一定的距離，減少雜交空間阻礙，探針雜交的Tm值是通過化學修飾來平衡的，探針是由光敏試劑原位合成為微流體芯片。實施例2一種檢測胃癌組織的微小RNA的方法，依次包括總RNA提取各自稱取100mg胃癌組織組織和胃癌組織旁組織，分別加入到液氮中研磨至干粉狀一加lmlTrizo1—繼續(xù)研磨至勻漿一轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中一12000Xg離心10min—收集上清至新離心管中一室溫放置5min—加入0.2ml氯仿一渦旋15-30s—室溫放置3min—12000Xg離心15min—收集上清一加兩倍上清體積的異丙醇一-20°0沉淀過夜一12000乂8離心15min，去上清一加lml含有DEPC水75。/。乙醇(預冷)一7500Xg離心5min—倒盡液體，輕微離心，除去管底殘液一自然干燥3min—沉淀重溶于50plDEPCH20，得到各自的總RNA;總RNA質(zhì)量分析通過A230、A260、A280檢測，以及對各自的總RNA釆用瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)18SrRNA和28SrRNA的比值分析總RNA質(zhì)量；微離心過濾得到小RNA樣品對各自的總RNA用微離心過濾柱過濾，分別得到片段小于300nt的胃癌組織組織小RNA樣品和胃癌組織旁組織小RNA樣品；在胃癌組織組織小RNA樣品和胃癌組織旁組織小RNA樣品中分別添加Poly(A)聚合酶使小RNA3'端加上poly(A)尾巴；用Cy3和Cy5特異性熒光標記分別標記胃癌組織組織小RNA樣品和胃癌組織旁組織小RNA樣品先用一個寡聚核苷酸與這個poly(A)尾巴連接，然后加入Cy3和Cy5特異性熒光標記；用實施例1的探針分別對熒光標記的胃癌組織組織小RNA樣品和胃癌組織旁組織小RNA樣品進行雜交檢測把各自的小RNA樣品加入至含有25%的甲酰胺的100U16xSSPE緩沖液中(0.90MNaCl,60mMNa2HP04,6mMEDTA,pH6.8)，然后置于用實施例1的探針合成的微流體芯片上進行雜交檢測，雜交反應儀器為微循環(huán)泵雜交儀器，雜交溫度為34°C，雜交時間為過一夜后采集雜交圖像；雜交圖象用激光掃描儀(GenePix4000B,MolecularDevice)采集，分別得到如附圖1和附圖2的照片，對兩種樣品雜交圖象組合差異比較得到如附圖3的照片，雜交圖像數(shù)據(jù)處理和分析用Array-Pro(MediaCybemetics)軟件，數(shù)據(jù)處理和分析首先是扣除背景，計算重復點平均值和標準偏差，然后通過LOWESS(Locally-WeightedRegression)過濾進行標準化，數(shù)據(jù)處理結(jié)果采用Hierarchicalclustering、K-means/mediansclustering或者ANOVA(analysisofvariance)等方法，得到如表1的結(jié)果；從附圖1、附圖2和附圖3的比較可以看出胃癌組織組織的有些微小RNA的量比胃癌組織旁組織的微小RNA的量要高，從表1數(shù)據(jù)處理結(jié)果進一步說明了胃癌組織組織的微小RNA的量比胃癌組織旁組織的微小RNA的量要高許多，因此從胃組織的有些微小RNA的量的異常提高就可以得出胃組織發(fā)生癌變的結(jié)果，本發(fā)明就為胃癌組織的診斷提供了依據(jù)，進一步可以選用這些微小RNA作為對胃癌組織進行定向靶點治療。表1:胃癌組織組織和胃癌組織旁組織的微小RNA的量及其相互比較對數(shù)值<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種用于胃癌組織的微小RNA探針，探針的序列由化學修飾過的寡聚核苷酸編碼片段和延伸臂片段組成，其特征在于所述的寡聚核苷酸編碼片段包括下述微小RNAhsa-miR-375、hsa-miR-34c-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-7、hsa-miR-200a、hsa-miR-1、hsa-miR-29b、hsa-miR-200b*、hsa-miR-31、hsa-miR-497、hsa-miR-146a、hsa-miR-200b、hsa-miR-378、hsa-miR-148a、hsa-miR-203、hsa-miR-34a、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-215、hsa-miR-29c和hsa-miR-429。2如權(quán)利要求1所述的一種用于胃癌組織的微小RNA探針，其特征在于所述的寡聚核苷酸編碼片段還包括下述微小RNAhsa-miR-155，hsa-miR-768-3p,hsa-miR-200c,hsa-miR-768-5p,hsa-miR-936,hsa-miR-195,hsa-miR-10a,hsa-miR-192,hsa-let-7b,hsa-miR-98,hsa-let-7c,hsa-miR-16,hsa-let-7f,hsa-let-7d,hsa-miR-320,hsa-let-7e,hsa-miR-29a,hsa-let-7a,hsa-miR-26b,hsa-let-7g,hsa-miR-145.3一種利用權(quán)利要求1或2所述的探針檢測胃癌組織的微小RNA的方法，依次包括總RNA提取，總RNA質(zhì)量分析，微離心過濾得到小RNA樣品，添加POLY(A)聚合酶和用CY3和CY5特異性熒光標記小RNA樣品步驟，其特征在于用所述的探針對熒光標記的小RNA樣品雜交檢測。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于胃癌組織的微小RNA探針及其檢測方法，探針的序列由化學修飾過的寡聚核苷酸編碼片段和延伸臂片段組成，寡聚核苷酸編碼片段包括下述微小RNAhsa-miR-375、hsa-miR-34c-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-7、hsa-miR-200a、hsa-miR-1、hsa-miR-29b、hsa-miR-200b^*、hsa-miR-31、hsa-miR-497、hsa-miR-146a、hsa-miR-200b、hsa-miR-378、hsa-miR-148a、hsa-miR-203、hsa-miR-34a、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-215、hsa-miR-29c和hsa-miR-429；對胃癌組織的微小RNA進行雜交檢測，能檢測出胃癌組織低表達的微小RNA的量比胃組織的微小RNA的量低，可作為胃組織發(fā)生癌變的一種診斷標志，這些微小RNA進一步可作為設(shè)計定向胃癌組織藥物的靶點，因此本發(fā)明為胃癌組織的診斷和定向治療提供了有利的依據(jù)。文檔編號C12Q1/68GK101182577SQ20071015690公開日2008年5月21日申請日期2007年11月19日優(yōu)先權(quán)日2007年11月19日發(fā)明者肖丙秀,英苗,郭俊明申請人:寧波大學