專利名稱：一種融合基因以及基因工程菌及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)，具體涉及一種融合基因以及基因工程菌及其制備方法， 基因工程菌所編碼表達(dá)的融合蛋白及其蛋白疫苗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
I型糖尿病也叫胰島素依賴性糖尿病(IDDM)，目前普遍認(rèn)為它是一種具有一定遺 傳基礎(chǔ)、在多種環(huán)境因子(如病毒、細(xì)菌、藥物等)觸發(fā)下由T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異 性的自身免疫性疾病(Diabetes, 1994， 43: 613)。 口服蛋白質(zhì)抗原能產(chǎn)生一種特異性 的針對(duì)該抗原的免疫無(wú)反應(yīng)性，這樣的生理現(xiàn)象就是口服耐受(Semin Immunol, 2001， 13: 177)， 口服耐受可能是一種潛在的治療自身免疫疾病的策略。目前胰島素和谷氨酸 脫羧酶(gad65)己成為IDDM免疫干預(yù)療法的主要靶點(diǎn)，而且作為人體自身抗原，胰 島素和谷氨酸脫羧酶對(duì)機(jī)體無(wú)明顯毒副作用，通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)性Th2細(xì)胞，進(jìn)而 產(chǎn)生大量Th2型細(xì)胞因子，抑制Thl細(xì)胞克隆活性，阻斷Thl型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最 終對(duì)自身免疫性糖尿病和胰島炎發(fā)揮保護(hù)作用，從而延緩IDDM的發(fā)展或降低其發(fā)生 率(Nature, 1993， 366: 69; NatMed， 1997， 3: 793)。研究亦表明霍亂毒素B亞基(CTB) 常被作為一種粘膜載體分子通過(guò)口服方式誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受(ProcNatlAcadSciUSA ， 1994， 91:10795; Clin Exp Immunol, 2003， 134: 38)，同時(shí)大大地降低了自身抗原的 口服劑量。這些都暗示CTB偶聯(lián)自身抗原不僅使應(yīng)用口服耐受防治I型糖尿病等自身免 疫性疫病更具實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，而且還有潛在的治療前景(ProcNatlAcadSciUSA, 1997, 94: 4610)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能編碼表達(dá)針對(duì)I型糖尿病具有治療作用的 生物活性蛋白的融合基因。
本發(fā)明還提供一種含有上述融合基因的基因工程菌及其制備方法。
本發(fā)明同時(shí)提供一種用上述基因工程菌制備的針對(duì)I型糖尿病具有治療作用的生物 活性蛋白及其蛋白疫苗的應(yīng)用。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為 一種融合基因CTB-(gad 531-545)3， 該融合基因由霍亂毒素B亞基(CTB)和三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位肽(gad5;u-545)3 融合而成，具有如序列表中SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。
一種基因工程菌，為具有所述的融合基因與載體pGEX4T-l構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pGEX4T-CTB-( gad 531-545)3的大腸桿菌BL21 。
一種制備所述的基因工程菌的方法，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原 表位肽(gad53l-545)3的基因片斷，與pBac — CTB質(zhì)粒(該質(zhì)粒已經(jīng)由中國(guó)專利號(hào)為 01144502.5，公告號(hào)為CN1157405C，公告日為20040714的"霍亂毒素B亞基的制法" 的發(fā)明專利所公開，并且在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存， 保藏編號(hào)為CGMCC No.0594)進(jìn)行"三引物PCR"擴(kuò)增反應(yīng)，構(gòu)建得到融合基因 CTB-(gad531.545)3 ，通過(guò)亞克隆入表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-l中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒 pGEX4T-CTB-( gad 531—545)3，然后轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中，制備得到所述的基因工程菌。
一種融合蛋白，由所述的融合基因編碼表達(dá)，具有如序列表中SEQIDN0.2所示的 氨基酸序列。
所述的融合蛋白，由所述的融合基因的霍亂毒素B亞基部分作為編碼表達(dá)所述的融 合蛋白的載體分子，三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位肽部分作為編碼表達(dá)所述的融合蛋 白的活性部分。
所述的融合蛋白經(jīng)Sepharosebead純化后為具有生物學(xué)活性的融合蛋白。 一種蛋白疫苗，由所述的融合蛋白經(jīng)冷凍干燥后，與藥學(xué)認(rèn)可的輔料配制成藥學(xué)上 認(rèn)可的任一種藥劑。
所述的藥劑為口服液。
口服液的用法為每周2 20次，每次用量為活性成份10ug 10000ug。 具體地說(shuō)本發(fā)明通過(guò)下述步驟實(shí)現(xiàn)
(1) 構(gòu)建三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位基因片斷:根據(jù)已報(bào)道的gad分子中人和 鼠完全相同的抗原表位531-545肽段序列(Immunogenetics， 2000, 51: 538)并結(jié)合 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好性設(shè)計(jì)2條引物P- gad -F和P- gad -R。通過(guò)"自身
引物一模板"的PCR方法獲得三拷貝的同向(gad53i.545)3的串聯(lián)體。
P-gad -F< SEQ ID N0.3〉 5， ggctctccggttatcaaagctcgtatgatggaat3，； P-gad -R< SEQ ID N0.4>: 5， agagccaaccatggtagtaccgtattccatcata3，。
(2) 構(gòu)建融合基因CTB-(gad53L545)3:設(shè)計(jì)3條引物P-F、 P-I和P-R，其中引物 P-F和CTB基因的5末端互補(bǔ)，中間引物P-I 5'端和CTB基因3'末端編碼序列互補(bǔ)(去
除CTB基因的原有終止密碼子)，3'端禾口(gad53L545)3基因片斷的5'末端互補(bǔ)，弓I物P-R
與(gads3L545)3基因片斷的3，端互補(bǔ)(含終止密碼子)，以pBac—CTB質(zhì)粒和上述步驟 (1)所得(gad53L545)3基因片斷為模板，進(jìn)行"三引物PCR"擴(kuò)增，獲得大小約為534bp 左右的上述的融合基因CTB-(gad5M.545)3，融合基因序列如SEQIDNO.l所示；其編碼 的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
P-F< SEQIDN0.5〉 5， cgggatccatgattaaattaaaatttgg3，；
P-1〈 SEQIDN0.6〉 5， ttgccgcaattagtatggcaaatggccccggccccccggttatcaaagctcgtatgat3，； P-R< SEQ ID N0.7〉 5 ， gggaattcttaaaccatggtagtaccgta3 ，。
(3) 構(gòu)建含有融合基因的表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-CTB-( gad 531-545)3:將PCR獲得的目 的片段(CTB-( gad 53M45)3)經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后，連接在同樣被BamH I和 EcoR I雙酶切的載體pGEX4T-l上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，酶切和PCR構(gòu)建含融合基因 的表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-CTB-(gad53！.545)3，其構(gòu)造見(jiàn)圖1。
(4) 制備含表達(dá)質(zhì)粒的基因工程菌將表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-CTB-( gad 531-545)3轉(zhuǎn)化 大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)過(guò)雜交篩選，篩選出含該重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆即獲得基因工 程菌。
(5) 表達(dá)純化CTB與三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位融合蛋白基因工程菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，重懸超聲破菌離心收集沉淀。用含1% Triton的PBS緩沖液 將包含體洗滌3次，將沉淀溶解于8mol/L尿素的0. lmol/L甘氨酸緩沖液(pH9. 3)中， 使用稀釋復(fù)性的方法復(fù)性目的蛋白，離心棄去沉淀收集上清。將復(fù)性的蛋白過(guò)Sepharose bead純化，經(jīng)Hitmp Desahing脫鹽處理后用超濾濃縮管濃縮，此時(shí)該蛋白帶有GST純 化標(biāo)簽，經(jīng)凝血酶切割去除GST標(biāo)簽后得到目的蛋白CTB-( gad 531.545)3;取樣進(jìn)行 SDS-PAGE和Wersten印跡分析從圖2和圖3所示結(jié)果可以看出，CTB與三拷貝谷氨 酸脫羧酶抗原表位融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物為20KD左右，與預(yù)測(cè)大小一致； 對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫活性鑒定，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物具有很強(qiáng)的免疫活性，通過(guò)CTB 標(biāo)準(zhǔn)品可以計(jì)算得出表達(dá)量達(dá)到10mg每升細(xì)菌培養(yǎng)液，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。
(6) 制備融合蛋白口服疫苗表達(dá)純化的CTB與三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位 融合蛋白，經(jīng)過(guò)過(guò)濾、離心、冷凍干燥后，以來(lái)源于玉米淀粉的低聚糖填充料配制成 口服疫苗。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由霍亂毒素B亞基(CTB)和三拷貝谷氨酸脫 羧酶抗原表位肽(gad53L545)3融合而成的融合基因，具有如序列表中SEQIDNO.l所示 的核苷酸序列，該融合基因通過(guò)大腸桿菌BL21能高效表達(dá)CTB與三拷貝谷氨酸脫羧酶抗 原表位融合蛋白，其表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)率較高；且大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定，后期蛋白純化變 復(fù)性條件成熟，應(yīng)用十分廣泛；經(jīng)純化的融合蛋白經(jīng)檢驗(yàn)具有生物學(xué)活性，可以制備成 為融合蛋白疫苗，融合蛋白疫苗能預(yù)防和治療I型糖尿病，也對(duì)胰島炎等疾病有效，因 此本發(fā)明為I型糖尿病和胰島炎等自身免疫性疫病的治療開辟了新的途徑，也為患者解 除了注射帶來(lái)的痛苦。


圖1為是含CTB與三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位融合基因的表達(dá)質(zhì)粒 pGEX4T-CTB-(gad 531.545)3 (圖注說(shuō)明GST :谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶編碼序列BamH I、 EcoR I:限制性酶切位點(diǎn)；CTB-( gad 531—545)3 : CTB與三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位融合基
因；Ampicillin: 氨節(jié)青霉素基因；pBR322-origin: pBR322復(fù)制起始點(diǎn)；lacl、 lacZ-a: e —半乳糖苷酶基因I和Z-a; lac-promoter: e —半乳糖苷酶基因啟動(dòng)子；tac- promoter: 由lac和tip啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子)；
圖2為是表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖譜，其中M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量Marker
(97. 4， 66.2， 43， 31， 20.1， 14.4KDa); 1:重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)的菌體總蛋白；2: ImM
IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌體總蛋白；3:菌體裂解液沉淀；4:菌體裂解液上清；5:菌體裂解液
上清經(jīng)純化后洗脫液；6:酶切去除GST后的目的融合蛋白(約20KDa);
圖3為是表達(dá)產(chǎn)物的Wersten分析，其中1:純化后目的蛋白CTB- (gad 531.545)3;
2:不含目的蛋白的陰性對(duì)照；
圖4為是NOD小鼠口服疫苗后的病理切片分析，其中A表示正常的胰島沒(méi)有出現(xiàn) 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象，B表示口服融合蛋白疫苗的小鼠胰島出現(xiàn)2級(jí)炎癥浸潤(rùn)，C、 D 分別表示對(duì)照組中口服不含該融合蛋白的小鼠胰島炎癥浸潤(rùn)程度達(dá)到3和4級(jí)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 實(shí)施例1
構(gòu)建三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位基因片斷
根據(jù)已報(bào)道的gad分子中人和鼠完全相同的抗原表位531-545肽段序列 (Immunogenetics， 2000， 51: 538)并結(jié)合大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好性設(shè)計(jì)2條 引物P- gad -F和P- gad -R。通過(guò)"自身引物一模板"的PCR方法獲得三拷貝的同 向GADsM.545的串聯(lián)體。PCR反應(yīng)體系中兩引物互為引物一模板；
具體反應(yīng)條件如下94°C 30秒，25°C 60秒，72°C 30秒，10個(gè)循環(huán)，然后94°C 45秒，45 °C 60秒，72 °C 90秒，25個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10分鐘。純化所得PCR 產(chǎn)物備用；
構(gòu)建融合基因CTB-(gad 531-545^3:
設(shè)計(jì)3條引物P-F、 P-I和P-R，其中引物P-F和CTB基因的5'末端互補(bǔ)，中間引 物P-1 5'端與CTB基因3'末端編碼序列互補(bǔ)(去除CTB基因的原有終止密碼子)，3'
端與(§&(1 531-545)3基因片斷的5，末端互補(bǔ)，弓l物P-R與(gad53W45)3基因片斷的3，端互
補(bǔ)(含終止密碼子)，以與CTB基因的片段pBac—CTB質(zhì)粒與實(shí)施例1所得(gad 531-545)3 基因片斷為模板，進(jìn)行"三引物PCR"擴(kuò)增，獲得大小約為534bp左右的融合基因 CTB-( gad 531-545)3;
具體PCR反應(yīng)條件為94°C 45秒，56°C 60秒，72°C卯秒，30個(gè)循環(huán)，最后72 'C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)自動(dòng)測(cè)序確認(rèn)堿基序列正確后備用。 實(shí)施例2
構(gòu)建含有融合基因的表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-CTB-( gad 531-545)3:
將實(shí)施例1獲得融合基因CTB-( gad531.545)3經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后，連接在 同樣被BamH I和EcoR I雙酶切的載體pGEX4T- 1上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，酶切和PCR
構(gòu)建含融合基因的表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-CTB-(gad53,.545)3，其構(gòu)造見(jiàn)圖1;
制備含表達(dá)質(zhì)粒的基因工程菌
將表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-CTB-( gad 531.545)3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3 )，經(jīng)過(guò)雜交篩選， 篩選出含該重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆即獲得基因工程菌。 實(shí)施例3
表達(dá)純化的CTB與三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位融合蛋白
基因工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，重懸超聲破菌離心收集沉淀。用含 1% Triton的PBS緩沖液將包含體洗滌3次，將沉淀溶解于8mol/L尿素的0. lmol/L甘 氨酸緩沖液(pH9.3)中，使用稀釋復(fù)性的方法復(fù)性目的蛋白，離心棄去沉淀收集上清。 將復(fù)性的蛋白過(guò)Sepharose bead純化，經(jīng)Hitrap Desahing脫鹽處理后用超濾濃縮管濃縮， 此時(shí)該蛋白帶有GST純化標(biāo)簽，經(jīng)凝血酶切割去除GST標(biāo)簽后得目的蛋白CTB-(gad 531-545)3，取樣進(jìn)行SDS-PAGE和Wersten印跡分析。從圖2和圖3所示結(jié)果可以看出， CTB與三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物為20KD左右， 與預(yù)測(cè)大小一致。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫活性鑒定，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物具有很強(qiáng)的免疫 活性，通過(guò)CTB標(biāo)準(zhǔn)品可以計(jì)算得出表達(dá)量達(dá)到lOmg每升細(xì)菌培養(yǎng)液，實(shí)現(xiàn)了高 效表達(dá)。
實(shí)施例4
制備融合蛋白口服疫苗
表達(dá)純化的CTB與三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位融合蛋白，經(jīng)過(guò)過(guò)濾、離心、 冷凍干燥后，與來(lái)源于玉米淀粉的低聚糖填充料配制成融合蛋白口服疫苗。 實(shí)施例5
融合蛋白口服疫苗對(duì)抑制NOD小鼠胰島炎實(shí)驗(yàn)
將4周齡的NOD雌鼠分成兩組，實(shí)驗(yàn)組口服含有20ixg活性成份的融合蛋白的 疫苗；對(duì)照組口服等體積的不含該融合蛋白的安慰劑，從5周齡開始給藥，每周3—4 次，持續(xù)到10周齡。10周齡鼠用來(lái)做胰腺組織病理切片觀察(每組各5只)，每個(gè)胰腺 組織樣品置于10%福爾馬林溶液固定后經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、切片(5um)、粘片、 脫蠟，HE (蘇木素一伊紅)染色、封片。鏡檢時(shí)采用雙盲方式以半定量法對(duì)小鼠胰島 組織炎性浸潤(rùn)程度進(jìn)行判定。
如圖4所示，正常的胰島沒(méi)有出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象(圖4A)， 口服融合蛋白的 小鼠胰島出現(xiàn)2級(jí)炎癥浸潤(rùn)(圖4B)，而對(duì)照組中口服不含該融合蛋白的小鼠胰島炎癥 浸潤(rùn)程度達(dá)到3 4級(jí)(圖4C， D)。統(tǒng)計(jì)分析表明，與對(duì)照組相比，口服融合蛋白的實(shí) 驗(yàn)組在炎癥浸潤(rùn)程度上有顯著性的降低(實(shí)驗(yàn)組胰島炎分值VS.對(duì)照組胰島炎分值二l. 5 士0.4VS. 3.4±0. 2， P< 0.0001)，這些結(jié)果表明口服家蠶表達(dá)的CTB-INS融合蛋
白在NOD小鼠中能顯著抑制其胰島炎的發(fā)生。 實(shí)施例6
融合蛋白口服疫苗降低NOD小鼠糖尿病發(fā)病率實(shí)驗(yàn)
為評(píng)價(jià)在NOD小鼠中長(zhǎng)期口服CTB-INS融合蛋白對(duì)治療糖尿病的效果，實(shí)驗(yàn)組和 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需連續(xù)每日口服20y g活性成份的融合蛋白的疫苗，日服30周以上， 從10周齡起，每周對(duì)各組小鼠進(jìn)行監(jiān)測(cè)，方法是每周使用半定量尿糖試紙檢測(cè)尿糖含 量，對(duì)于尿糖陽(yáng)性的小鼠，從小鼠尾巴采血1 2滴，用Roche公司樂(lè)康全I(xiàn)I血糖儀檢 測(cè)血糖，如果連續(xù)兩周小鼠血糖M6.7mmol/L，即判定小鼠患糖尿病。
結(jié)果表明，口服實(shí)驗(yàn)早期實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的飲食和體重都沒(méi)有顯著性差異；實(shí) 驗(yàn)后期小鼠陸續(xù)患病，出現(xiàn)體重減輕和飲食增加的現(xiàn)象。在35周齡時(shí)，口服不含融合 蛋白的對(duì)照組小鼠糖尿病患病率達(dá)93% (n=12)，而口服融合蛋白的實(shí)驗(yàn)組小鼠發(fā)病率 僅為53%(n=15)。盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明口服含融合蛋白疫苗并不能完全治療NOD小鼠糖 尿病的發(fā)生，但其發(fā)病率顯著低于對(duì)照組，能很好地延緩糖尿病癥狀的加劇。這些結(jié)果 表明，口服家蠶表達(dá)的CTB-INS融合蛋白可能是治療糖尿病的有效途徑。
<120〉 CTB與三三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位融合基因、其蛋白質(zhì)及其應(yīng)用
〈160〉 7
〈170> Patentln version 3.1
〈210〉 1
〈211〉 534
〈212〉 DNA
<213> Artificial
〈220〉
〈221> CDS
〈222〉 (1)…(533)
〈400〉 1
atg stttttggtgttttttttgttttaitct45
Met lie!Lys!LeuLysPheGlyValPhePheThrVal:Leu!LeuSer
11015
tea gest3tgcaestggscctsaitsetgstttgtgt90
Ser AlaTyrAlaHis 20GlyThi:ProGinAsn 25lieThrAspLeuCys 30
estscgctaigait135
Ala GluTyrHisAsn 35ThrGinlieHisThr 40LeuAsnAspLys工le 45
ttt tegt3ttctctsgetggs3tgget180
Phe SerTyrThrGlu 50SerLeuAlaGlyLys 55ArgGluMetAlalie 60
att settttggtgc3settttgt3gt3CC3ggt225
lie ThrPheLysAsn 65GlyAlaThrPheGin 70ValGluValProGly 75
3gt C33C3tgsttC3gcg3ttatgsag270
Ser GinHis工leAsp 80SerGinLysLysAla 85工leGluArgMetLys 90
g3t 3CCctg3ttgest3tcttgasget33agtc33g315
Asp Thr!LeuArglie 95AlaTyrlieuThrGlu 100AlaLysValGluLys 105
tta tgtgtatggscgcctC3tgcg3ttgecges3tt360
Leu CysValAsnAsn!LysThrProHisAlalieAlaAlalie
110115120
gceiggccccggccccccggttaitcgetcgt405
Ser MetAlaAsnGlyProGlyProProVallieLysAlaMet
9 3tg gas t3c ggt Met Glu Tyr Gly
cgt atg stg gaa Arg Met Met Glu
asa get cgt 3tg Lys Ala Arg Met
〈211〉 177 〈212〉 PRT 〈213〉 Artificial 〈400> 2
Met lie Lys Leu
Ala Tyr Ala His 20
Tyr His Asn Thr 35
Thr Glu Ser !Leu 50
Asn Gly Ala Thr 65
Ser Gin Lys !Lys
Tyr Leu Thr Glu 100
Thr Pro His Ala 115
Pro Val lie Lys 130
Ser Pro Val lie 145
Gly Ser Pro Val
125 130 135
act acc atg gtt ggc tct ccg gtt ate aaa get 450 Thr Thr Met Val Gly Ser Pro Val lie Lys Ala
140 145 150
tac ggt act acc atg gtt ggc tct ccg gtt ate 495 Tyr Gly Thr Thr Met Val Gly Ser Pro Val lie 155 160 165
stg gaa tac ggt act acc atg gtt taa 534 Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met Val 170 175
Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu
5 10 Gly Thr Pro Gin Asn lie Thr Asp 25
Leu Asn Asp Lys
Gin lie His Thr 40
Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala工le 55 60 Val Glu Val Pro Gly Ser
Phe
!Leu Cys
30 lie Phe 45
lie Thr Gin His
Gin Val Glu Val Pro Gly 70 75 lie Glu Arq Met Lys Asp Thr Leu Arg
Ala lie Glu Arg Met Lys
85 90 Ala Lys Val Glu Lys !Leu 105
lie Ala Ala lie Ser Met 120
Ala Arg Met Met Glu Tyr 135
Arg Met Met Glu
Ser Ser 15
Ala Glu
Ser Tyr
Phe Lys
lie Asp
80 lie Ala 95
Asn Lys
Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr 150 155 lie Lys Ala Arg Met Met Glu 165 170
Cys Val Trp Asn 110
Ala Asn Gly Pro Gly Pro 125
Gly Thr Thr Met Val Gly 140
Gly Thr Thr
Met Val 160
Tyr Gly Thr Thr Met 175
10
Val
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權(quán)利要求
1.一種融合基因，其特征在于該融合基因由霍亂毒素B亞基和三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位肽(gad 531-545)3融合而成，具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2. —種含有權(quán)利要求1所述的融合基因的基因工程菌，其特征在于為具有所述的融合基因與載體pGEX4T-l構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX4T-CTB-( gad 531.545)3的大腸桿菌 BL21。
3. —種制備權(quán)利要求2所述的基因工程菌的方法，其特征在于設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增 三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位肽(gad 531.545)3的基因片斷，與CTB基因的片段pBac— CTB質(zhì)粒進(jìn)行"三引物PCR"擴(kuò)增反應(yīng)，構(gòu)建得到融合基因CTB-(gad 531.545)3，通過(guò)亞 克隆入表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-l中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX4T-CTB-( gad 531.545)3，然后轉(zhuǎn)化 到宿主菌BL21中，制備得到所述的基因工程菌。
4. 一種利用權(quán)利要求2所述的基因工程菌制備的融合蛋白，其特征在于由所述的 融合基因編碼表達(dá)，具有如序列表中SEQIDNa2所示的氨基酸序列。
5. 如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合基因的霍亂毒素B亞基 部分作為編碼表達(dá)所述的融合蛋白的載體分子，三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位肽部分 作為編碼表達(dá)所述的融合蛋白的活性部分。
6. 如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白經(jīng)Sepharosebead 純化后為具有生物學(xué)活性的融合蛋白。
7. —種利用權(quán)利要求6所述的融合蛋白制備的蛋白疫苗，其特征在于由所述的融 合蛋白經(jīng)冷凍干燥后，與藥學(xué)認(rèn)可的輔料配制成藥學(xué)上認(rèn)可的任一種藥劑。
8. 如權(quán)利要求7所述的蛋白疫苗，其特征在于所述的藥劑為口服液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合基因以及基因工程菌及其制備和應(yīng)用，該融合基因由霍亂毒素B亞基和三拷貝谷氨酸脫羧酶抗原表位肽融合而成，具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，該基因工程菌為具有重組質(zhì)粒pGEX4T-CTB-(gad_531-545)₃的大腸桿菌BL21，該基因工程菌能編碼表達(dá)具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的融合蛋白，融合蛋白經(jīng)純化制備得到具有活性的融合蛋白疫苗，融合蛋白疫苗能預(yù)防和治療I型糖尿病，也對(duì)胰島炎等疾病有效，因此本發(fā)明為I型糖尿病和胰島炎等自身免疫性疫病的治療開辟了新的途徑，也為患者解除了注射帶來(lái)的痛苦。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101182529SQ20071015705
公開日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日
發(fā)明者樂(lè)燕萍, 龍香娥, 龔朝輝 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)