專利名稱：：鱗翅目轉(zhuǎn)座子基因tpa及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于昆蟲基因工程領(lǐng)域，具體的說涉及鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)座子(transposase，tpa)基因片段分離，還涉及tpa基因在鱗翅目害蟲抗藥性檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鱗翅目害蟲危害后常造成茶葉減產(chǎn)和品質(zhì)下降，因此它們是主要茶園蟲害防治對象，而擬除蟲菊酯類是普遍應(yīng)用于防治鱗翅目害蟲的農(nóng)藥種類。但是由于多年連續(xù)使用，鱗翅目害蟲對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥耐受性越來越強，部分甚至出現(xiàn)了抗藥性。害蟲的農(nóng)藥抗性評價指標(biāo)尚不明確，害蟲抗藥性遺傳機制也有待研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種鱗翅目轉(zhuǎn)座子基因片段tpa，該基因片段tpa可用于評價和測定鱗翅目害蟲對農(nóng)藥的抗藥性。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種鱗翅目轉(zhuǎn)座子基因片段tpa，其具有SEQIDNo:l所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了上述基因片段tpa的用途，用于評價和測定鱗翅目害蟲對農(nóng)藥的抗藥性。作為本發(fā)明的基因片段tpa的用途的改進農(nóng)藥為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。本發(fā)明主要針對生產(chǎn)中鱗翅目茶樹害蟲的抗藥性問題，通過分子生物學(xué)手段分析鱗翅目害蟲抗藥性原因，并提出鱗翅目害蟲抗藥性程度檢測新技術(shù)。本發(fā)明是采用cDNA-AFLP技術(shù)分離與鱗翅目害蟲對擬除蟲菊酯類抗藥性有關(guān)的基因；并提供了鱗翅目害蟲基因轉(zhuǎn)移有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶tps3，端基因序列，具體如SEQIDNo:l所示。本發(fā)明還提供了該基因在具有不同抗藥性的茶樹鱗翅目中的表達，證明該基因表達對鱗翅目抗藥性表現(xiàn)有非常重要的影響，該基因可能通過其轉(zhuǎn)座行為影響其下游結(jié)構(gòu)基因活性，從而影響害蟲的抗藥性。實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下一、茶樹鱗翅目害蟲tap基因片段分離和分析取對擬除蟲菊酯有不同抗性的茶尺蠖幼蟲各若干頭，適當(dāng)稀釋后進行噴霧。0.2-6小時之內(nèi)，在不同抗藥性群體中各選取2-3頭幼蟲。上述幼蟲樣品分別置于不同研缽中液氮研磨，以TRIZOL(Invitrogen公司)試劑提取總RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)分離mRNA。分別取l-5|igmRNA進行cDNA合成，雙鏈cDNA合成采用TakaRaMMLVRTasecDNASynthesisKit(寶生物工程[大連]有限公司)進行。雙鏈cDNA經(jīng)異丙醇沉淀純化后，以TakaRaBamHI/HhaI(寶生物工程[大連]有限公司)組合酶切消化。消化后的片段與事先設(shè)計的2個接頭SEQIDNo:2禾HSEQIDNo:3，以T4DNA連接酶(上海生工生物工程有限公司)連接。以連接完成的cDNA片段為模板，以預(yù)擴增引物SEQIDNo:4和SEQIDNo:5進行PCR預(yù)擴增，PCR程序如表第1列所示，將預(yù)擴增產(chǎn)物適當(dāng)稀釋后，以選擇性擴增引物組合SEQIDNo:6和SEQIDNo:7，以及SEQIDNo:8禾nSEQIDNo:9，分別進行PCR選擇性擴增，PCR程序如表第2列所示。擴增產(chǎn)物以6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分析，以核酸銀染試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進行顯帶。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注本發(fā)明中未做特別說明的PCR或PCR擴增均指PCR常規(guī)擴增從凝膠上割取與脅迫規(guī)律相吻合的差異條帶，即抗藥性強條帶也強，以純水浸提過夜后，取適量浸提液作為模板，以選擇性引物組合進行PCR，產(chǎn)物進行電泳。電泳結(jié)束后割取目標(biāo)條帶，以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進行片段回收，并插入pUCm-T載體(上海生工生物工程有限公司)，陽性克隆委托Invitrogen公司進行序列分析，確定了其中一個436bp的顯著差異序列與茶尺蠖抗藥性有關(guān)，其核苷酸順序見SEQIDNo:1，經(jīng)與美國生物信息數(shù)據(jù)庫http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov比對，證實該序列與家蠶等Bmmar轉(zhuǎn)座子具有80%左右的同源性。因此定名為茶尺蠖tpa。二、茶樹鱗翅目害蟲tpa基因表達與抗藥性的關(guān)系取對擬除蟲菊酯有不同抗性的鱗翅目幼蟲2-3種，將農(nóng)藥適當(dāng)稀釋后進行噴霧。0.2-6小時后，在非抗群體幼蟲中選取出現(xiàn)明顯中毒癥狀的1-2頭，同時在抗性群體中選取1-2頭表現(xiàn)正常的幼蟲。以TRIZOL(Invitrogen公司)法提取RNA，以MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA。采用引物SEQIDNo:10(由于本發(fā)明的tpa基因中具有反向重復(fù)序列，以該重復(fù)序列作為引物時，只需1條引物，該引物的擴增產(chǎn)物為434bp)進行PCR。結(jié)果顯示，對擬除蟲菊酯敏感的鱗翅目害蟲，經(jīng)過殺蟲劑處理后中毒癥狀明顯，同時tpa不表達或者表達很弱；而抗藥性茶尺蠖幼蟲在噴施殺蟲劑后并不表現(xiàn)出中毒癥狀，而且tpa基因表達比較強烈。說明tpa基因的表達與鱗翅目害蟲的抗藥性有很強的相關(guān)性。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1是實施例1中的擴增產(chǎn)物電泳分析后，以核酸銀染試劑盒進行顯帶所得的圖；注M為DNA分子量標(biāo)記，l為非抗藥性茶尺蠖幼蟲，2為中等抗藥性茶尺蠖幼蟲，3為強抗藥性茶尺蠖幼蟲；圖2是實施例2中，不同抗藥性的害蟲經(jīng)農(nóng)藥處理后的tpa基因表達差異圖；注M為分子量標(biāo)記，l為抗性茶尺蠖幼蟲，2為敏感型茶尺蠖幼蟲，3為抗藥性茶毛蟲幼蟲，4為敏感型茶毛蟲幼蟲。具體實施方式實施例1取對功夫菊酯有中等抗性和強抗藥性的3齡茶尺蠖幼蟲各30頭，另取無抗藥性的3齡茶尺蠖30頭，分別飼養(yǎng)在3個2L的燒杯中，正常飼喂茶葉新梢(5-8個/杯)后，將市售濃度為2.5%的功夫菊酯乳劑以水稀釋5000倍后進行噴霧處理。于噴藥后20分鐘，在不同抗藥性幼蟲中各選取2-3頭幼蟲。上述幼蟲樣品分別置于不同研缽中液氮研磨，以TRIZOL(Invi加gen公司)試劑提取總RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)分離mRNA。分別取l嗎mRNA進行cDNA合成，雙鏈cDNA合成采用TakaRaMMLVRTasecDNASynthesisKit(寶生物工程[大連]有限公司)進行。雙鏈cDNA經(jīng)異丙醇沉淀純化后，以TakaRaBamHI/HhaI(寶生物工程[大連]有限公司)組合酶切消化。消化后的片段與事先設(shè)計的2個接頭SEQIDNo:2禾QSEQIDNo:3，以T4DNA連接酶(上海生工生物工程有限公司)連接。以連接完成的cDNA片段為模板，以預(yù)擴增引物SEQIDNo:4禾卩SEQIDNo:5進行PCR預(yù)擴增，將預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋15倍后，以選擇性擴增引物組合SEQIDNo:6和SEQIDNo:7進行PCR選擇性擴增。擴增產(chǎn)物以6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分析，以核酸銀染試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進行顯帶，結(jié)果見圖1。由于抗性強的個體在較高農(nóng)藥劑量時，仍能正常生長，說明抗性個體在某些基因表達上存在強勢，即條帶選擇的標(biāo)準(zhǔn)是隨著個體抗性增強而條帶亮度增加的條帶。從凝膠上割取與脅迫規(guī)律相吻合的差異條帶，以純水浸提過夜后，取3PL浸提液作為模板，以選擇性引物組合SEQIDNo:6和SEQIDNo:7進行PCR，產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。電泳結(jié)束后割取與篩選條帶大小一致的目標(biāo)條帶，以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進行片段回收，并插入pUCm-T載體(上海生工生物工程有限公司)，陽性克隆委托Iiwitrogen公司進行序列分析，獲得了其中一個445bp的產(chǎn)物，其核苷酸順序見SEQIDNo:1。該序列隨著個體抗藥性增強，其表達強度增加，即該序列與茶尺蠖抗藥性相關(guān)。經(jīng)與美國生物信息數(shù)據(jù)庫http:/Avww.ncbi.nlm.nih.gov比對，證實該序列與家蠶等Bmmar轉(zhuǎn)座子具有80。/。左右的同源性。定名為茶尺蠖tpa。進一步分析顯示，該序列中包含有多個重復(fù)單元，具體的說包含一個具有20bp的反向重復(fù)序列"5，-GTCGCCTTTTGCAGCCAATG"，以及多個5-7bp的重復(fù)單元"5，-TCAAACT"，"5，-TAATAT"，"5，-TTTAAA"，"5，-AAGTT"禾卩"5，-ATTTA"。這些重復(fù)與該基因的功能有關(guān)。因為已有的研究昆蟲以及其它生物轉(zhuǎn)座子基因的3'端常具有多個長短不等重復(fù)序列，這些重復(fù)單元與轉(zhuǎn)座識別和轉(zhuǎn)座行為有密切的關(guān)系。從這一點可以證明，本發(fā)明分離到的是茶尺蠖轉(zhuǎn)座子基因的3'端序列。實施例2取對功夫菊酯有不同抗性的茶尺蠖和茶毛蟲3齡幼蟲各40頭，每種害蟲按照抗藥性不同分成2組，即敏感組和抗藥組。將市售濃度2.5%功夫菊酯乳劑用水稀釋10000倍后進行噴霧。2小時后，在敏感和抗性組中各選取1-2頭幼蟲用于tpa表達研究。以TRIZOL(Invitrogen公司)法提取RNA，以MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA。以liaLcDNA為模板，采用引物SEQIDNo:10(由于目標(biāo)序列為反向重復(fù)序列，所以只需1條引物，產(chǎn)物長度為434bp)進行PCR。PCR結(jié)束后以1.5%的瓊脂糖凝膠進行恒壓電泳，電泳結(jié)束后進行照相，如圖2。從圖2中可以看出，對功夫菊酯敏感的茶尺蠖和茶毛蟲在殺蟲劑處理后出現(xiàn)明顯中毒癥狀，同時tpa表達量非常低，條帶吸光度幾乎為0;而對殺蟲劑具有抗性的茶尺蠖和茶毛蟲幼蟲，農(nóng)藥處理后不表現(xiàn)出中毒癥狀，tpa基因表達強烈，條帶吸光度超過0.90-0.95。說明tpa基因活躍表達與鱗翅目害蟲的抗藥性增強是相關(guān)的。因此，我們可以得知將擬除蟲菊酯類農(nóng)藥經(jīng)稀釋5000-10000倍后，按照等同于實施例2的方法處理后；tpa條帶強度為>=0.5的為抗藥性害蟲，且該值越大，表明抗性越強；tpa條帶強度0.5的為對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥敏感的害蟲。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。序列表SEQIDNo:1cgtacgttgtcgccttttgcagccaatggaaattgttatat已tttatgtatgtsctaaacagtagataaaaaaaatgttttttctatattaaactggaccagtaagatattagtggccagtgctgttggcttgtaatattttaaatgcgattgctcaatcacgtcggaacgtctgaacgggtctatgtgttccaaacttc犯ttaatctaatcattggctgcaaaaggcgacgcg445gaccacctcgaataagctttacatactttt60t3已aagt^tt犯tgttttei120acaatat11atggc犯gactttatttactc180gcgcatgttacettcctacta240朋gtttgaatgtt已g3tgtttggttgtttg300attgggttgaaatttggaacacatacctgc360atttatagtctggaataacacagacttttc420SEQIDNo:2(BamHI接頭)SEQIDNo:3(Hhal接頭)5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'3'-CATCTGACGCATGGCATG-5'5-CGATGAG丁CCTGAGCG-3'3'-TACGCTACTCAGGACTC-5'SEQIDNo:4(預(yù)擴增上游引物)5'-GTAGACTGCGTACCGATCC-3，SEQIDNo:5(預(yù)擴增下游引物)5，-GATGAGTCCTGAGCGC-3，SEQIDNo:6(選擇性擴增上游引物)5，-GACTGCGTACCGATCCAC-3'SEQIDNo:7(選擇性擴增下游引物)5，-GATGAGTCCTGACGCGCGG-3，SEQIDNo:8(選擇性擴增上游引物)5，-GACTGCGTACCGATCCAT-3，SEQIDNo:9(選擇性擴增下游引物)5'-GATGAGTCCTGACGCGCGT-3，SEQIDNo:10(基因特異性引物)5，-GTCGCCTTTTGCAGCCAATG-3，權(quán)利要求1、一種鱗翅目轉(zhuǎn)座子基因片段tpa，其特征是具有SEQIDNo1所示的核苷酸序列。2、如權(quán)利要求l所述的基因片段tpa的用途，其特征是用于評價和測定鱗翅目害蟲對農(nóng)藥的抗藥性。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因片段tpa的用途，其特征是所述農(nóng)藥為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。全文摘要本發(fā)明公開了一種鱗翅目轉(zhuǎn)座子基因片段tpa，其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了上述基因片段tpa的用途用于評價和測定鱗翅目害蟲對農(nóng)藥的抗藥性。文檔編號C12N15/12GK101210245SQ200710164809公開日2008年7月2日申請日期2007年12月24日優(yōu)先權(quán)日2007年12月24日發(fā)明者晨林,梁月榮,董俊杰,董占波,鄭新強,陸建良申請人:浙江大學(xué)