專利名稱：：用人工轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用人工轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增棒狀桿菌染色體中的所需基因的方法，所述人工轉(zhuǎn)座子在所述的棒狀桿菌中是可轉(zhuǎn)座的，本發(fā)明還涉及用本方法得到的棒狀桿菌。若所需的基因是參于氨基酸或核酸的生物合成的基因，則用由此得到的棒狀桿菌可以生產(chǎn)氨基酸或核酸。擴(kuò)增染色體中的所需基因的方法，對(duì)于改進(jìn)棒狀桿菌的育種是很重要的，因?yàn)樵诎被峄蚝怂岬墓I(yè)化生產(chǎn)中要使用所述的棒狀桿菌。到目前為止，過艱苦的努力，已經(jīng)完成了改進(jìn)棒狀桿菌的育種和有效生產(chǎn)氨基酸或核酸的研究。已經(jīng)報(bào)告了使用基因工程的許多育種方法。用質(zhì)?；蚴删w已經(jīng)系統(tǒng)地開發(fā)了用于棒狀桿菌育種的基因操作方法。例如使用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化之方法的建立(J.Bacteriol.，byKatsumataR.，OzakiA.，OkaT.andFuruyaA.，159，306-311，(1984)；andJ.Bacteriol，bySantamariaR.I.，GilJ.A.andMartinJ.F.，161，463-467(1985))，各種載體的研制(Agric.Biol.Chem.，byMiwaK.，MatsuiH.，TerabeM.，NakamoriS.，SanoK.andMomoseh，48，2901-2903(1984)；J.，Bacteriol.，byKatsumataR.，OzakiA.，OkaT.andFuruyaA.，159，306-311(1984)；J.Gen.Microbiol.，bySantamariaR.I.，GilJ.A.，MesasJ.M.andMartinJ.F.，130，2237-2246(1984)；Gene，byYehP.，OregliaJ.，PrevotosF.andScicardA.M.，47，301-306(1986)；andAppl.Microbiol.Biotechbol.，bypatekM.，NesveraJ.andHochmannovaJ.，31，65-69(1989))，控制基因表達(dá)方法的研究(Bio/Technology，bytsuchiyaM.andMorinagaY.，6，428-430(1988)，粘粒的研究[Gene，byNakamoriS.andSanoK.，39，281-286(1985)].在NucleicAcidsRes.，(MatsueK.，SanoK.andOhtsuboE.，14，10113-10114(1986))；J.Bacteriol(follettieM.T.andShinskeyA.H.，167，695-702(1986))，NuclercAcidsRes.，(MateosL.M.，DelR.G.，AguelarA.andMartinH.F.，15，10598(1987))；NuclercAcidsRes.，(MateosL.M.，DelR.G.，AuilarA.andmartinJ.F.，15，3922(1987))；NuclercAcidsRes.，(MelumbresM.，MateosL.M.，GuerreroC.andMartinJ.F.，16，9859(1988))；Agric.Biol.Chem.，(MatsuiK.，MiwaK.andSanoK.，52，525-531(1988))；Mol.Microbiol(byPeoplesO.P.，LieblW.，bodisM.，MaengP.J.，F(xiàn)ollettieM.T.，ArcherJ.A.andSinskeyA.J.，2，63-72(1988))；Mol.Gen.Genet.，(byEikamannsB.J.，F(xiàn)ollettieM.T.，GriotM.U.，Martinu.andShinskeyA.J.，218，330-339(1989)；和Gene(byO′ReganM.，ThierbachG.，BachmannB.，VgillevalD.，LepageP.，ViretJ.F.andLemoineY.，77，237-251(1989))中報(bào)告了得自棒狀桿菌的基因的克隆。在Agric.Biol.Chem.，(by/sanoK.，MiwaK.andNakamoriS.，51，597-599(1987))中報(bào)告了各種氨基酸產(chǎn)率的增加。最近，報(bào)告了棒狀桿菌的轉(zhuǎn)座因子[WO92/02627；WO93/18151；EP0445385；日本特許公開專利申請(qǐng)(下文稱為″日本Kokai″)No.46，867/1994；Mol.Microbiol.byVertesA.A.，InuiM.，KobayashiM.，KurusrY.andYukawaH.，11，739-746(1994)；Mol.Microbiol.，byBonamyC.，LabarreJ.，reyerO.andLeblonG.，14，571-581(1994)；Mol.gen.Genet.，byVertesA.a.，AsaiY.，InuiM.，KobayashiM.，KurusrY.andYukawaH.，245，397-405(1994)；FRMSMicrobiologyLetters，byJagarW.，SchaferA.，KalinowkiJ.andPuehlerA.，126，1-6；(1995)；和日本KokaiNo.107，976/1995]。轉(zhuǎn)座因子是可在染色體中轉(zhuǎn)座的DNA片段，而且已知這種轉(zhuǎn)座因子廣泛地存在于包括原核生物和真核生物的各種生物中。已經(jīng)得到了有關(guān)真核生物，例如玉米，果蠅，酵母等，以及原核生物，例如大腸桿菌等的詳細(xì)知識(shí)[MobileDNA，AmericanSocietyforMicrobiology，WashingtonD.C(1989)]。細(xì)菌的轉(zhuǎn)座因子被分成兩類，即插入序列和轉(zhuǎn)座子。插入序列是大小約為760-2000bp的DNA片段，在其兩個(gè)末端均有約8-20bp的反向重復(fù)序列，而且編碼轉(zhuǎn)座酶，即在其中轉(zhuǎn)座所必需的酶。而轉(zhuǎn)座子是含有反向重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座酶以及不直接參與轉(zhuǎn)座過程的基因，例如藥物抗性基因的轉(zhuǎn)座因子。轉(zhuǎn)座子通常包括一個(gè)位于兩個(gè)插入序列之間的藥物抗性基因，和一個(gè)插入在插入序列中的藥物抗性基因。插入序列和轉(zhuǎn)座子的特征均在于在導(dǎo)入于插入序列或轉(zhuǎn)座子的靶基因位點(diǎn)中觀察到約10bp核苷酸序列的復(fù)制[MobileGeneticElements，AcademicPress，NewYork，pp.159-221(1983)]。目前已知的轉(zhuǎn)座因子包括大腸桿菌和Mu噬菌體轉(zhuǎn)座子Tn10和Tn5，它們?cè)谌旧w基因工程中是非常有用的。例如，認(rèn)為(1)將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座到染色體基因中，從而破壞了所述的基因，抑制了該染色體基因的表達(dá)，(2)將啟動(dòng)子序列插入到轉(zhuǎn)座子中以表達(dá)在插入位點(diǎn)存在的染色體基因，和(3)將異源所需基因或同源所需基因包含在用于轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子中以便將新基因?qū)氲饺旧w中[MobileDNA，AmericanSocietyforMicrobiolgy，WashingtonS.C.pp.879-925(1989)]。最近已在棒狀桿菌中發(fā)現(xiàn)了作為插入序列的轉(zhuǎn)座因子，但尚未發(fā)現(xiàn)作為含有藥物抗性基因等轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座因子。已經(jīng)可能生產(chǎn)其中人工插入有卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)座子[WO93/18151；JapaneseKokaiNo.107，976/1995；andMol.Gen.Genet.，byVertesA.A.，AsaiY.，InuiM.，KobayashiM.，KurusuY.andYukawaH，245，397-405(1994)]，并且將所述的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座到染色體中。其中生產(chǎn)的人工轉(zhuǎn)座子包括一個(gè)插入在兩個(gè)插入序列之間的藥物抗性基因(WO93/18151)和一個(gè)插入在插入序列中的藥物抗性基因[JapaneseKokaiNo.107，976/1995；andMol.Gen.Genet.，byVertesA.A.，asaiY.，InuiM.，KobayashiM.，KurusuY.andYukawaH.，245，397-405(1994)]。通過多拷貝所述的人工轉(zhuǎn)座子而進(jìn)行的轉(zhuǎn)座并未觀察到，或者說拷貝數(shù)的增加不能令人滿意。因此，目前尚未確立用在氨基酸或核酸工業(yè)化生產(chǎn)中有用的這種轉(zhuǎn)座子來擴(kuò)增基因的技術(shù)。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種方法，包括在棒狀桿菌插入序列的基礎(chǔ)上形成含有藥物抗性基因和所需有用基因的人工轉(zhuǎn)座子，用上述的人工轉(zhuǎn)座子在工業(yè)化生產(chǎn)氨基酸或核酸所用的棒狀桿菌的染色體中擴(kuò)增所需的基因。本發(fā)明的另一目的是提供所需的有用基因在染色體中擴(kuò)增的棒狀桿菌。本發(fā)明的另一目的是提供利用棒狀桿菌生產(chǎn)物質(zhì)的方法，在所述的棒狀桿菌中所需的有用基因在染色體中擴(kuò)增。為了解決上述問題，本發(fā)明申請(qǐng)人注意到可以轉(zhuǎn)座大腸桿菌等的已知轉(zhuǎn)座子，具有不參與轉(zhuǎn)座過程的藥物抗性基因的結(jié)構(gòu)被插入到在其兩個(gè)末端均有插入序列的反向重復(fù)序列之間。本發(fā)明人人工構(gòu)建了各種不同的轉(zhuǎn)座子樣序列，所述序列有這樣一種結(jié)構(gòu)，即不參與轉(zhuǎn)座過程的藥物抗性基因和所需基因被插入到插入序列兩端的反向重復(fù)序列之間，所述的插入序列來自棒狀桿菌的染色體DNA，而且已努力完成這些研究。結(jié)果，轉(zhuǎn)座子樣序列(人工轉(zhuǎn)座子)以良好的效率被轉(zhuǎn)座，而且適當(dāng)選擇藥物抗性基因并確定藥物濃度，可以以良好的效率形成擴(kuò)增基因的微生物，在所述的微生物中，多拷貝的人工轉(zhuǎn)座子被轉(zhuǎn)座到其染色體中。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。即本發(fā)明如下1導(dǎo)入并在染色體上擴(kuò)增所需基因的方法，包括形成人工轉(zhuǎn)座，所述人工轉(zhuǎn)座含有在反向重復(fù)系列之間插入了藥物抗性基因和所需的基因的結(jié)構(gòu)并且在棒狀桿菌細(xì)胞內(nèi)是可轉(zhuǎn)座的，將所述的人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入棒狀桿菌細(xì)胞，將所述轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座到所述棒狀桿菌的染色體中。2發(fā)明1的方法，其中，所述人工轉(zhuǎn)座子還有一個(gè)轉(zhuǎn)座酶位于反向重復(fù)序列之間的結(jié)構(gòu)。3發(fā)明1或2的方法，其中所述反向重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座酶基因來自棒狀桿菌的插入序列。4發(fā)明3的方法，其中所述插入序列含有序列表中SequcenceNos.1、5或9的任一個(gè)所代表的堿基序列。5發(fā)明1-4的任一方法，其中藥物抗性基因是氯霉素抗性基因或四環(huán)素抗性基因。6發(fā)明1-5的任一方法，其中所需的基因是參與氨基酸生物合成的基因。7發(fā)明6的方法，其中所需的基因是天冬氨酸激酶基因和/或二氫吡啶羧酸合成酶基因。8棒狀桿菌，是通過將所需基因用發(fā)明1-7中的任一方法轉(zhuǎn)座到染色體中而形成的。9生產(chǎn)氨基酸的方法，包括培養(yǎng)用發(fā)明6的方法將參與氨基酸生物合成的基因轉(zhuǎn)座到染色體中而形成的棒狀桿菌，以便在培養(yǎng)基中形成并積累氨基酸，然后回收所述的氨基酸。10發(fā)明9的方法，其中參與氨基酸生物合成的基因是天冬氨酸激酶基因和/或二氫吡啶羧酸合成酶基因，所述氨基酸是賴氨酸。本發(fā)明中所述的反向重復(fù)序列可能是存在于從棒狀桿菌分離的轉(zhuǎn)座因子的兩個(gè)末端的反向重復(fù)序列。作為得自棒狀桿菌的轉(zhuǎn)座因子的實(shí)例，在序列表中1，5和9所列的插入序列是已知的(WO93/18151)。在序列1中的插入序列IS714在5′端含有序列3的序列，在反向鏈的5′端含有序列4的序列，從而形成了反向重復(fù)序列。在序列5中的插入序列IS719在5′端含有序列7的序列，在反向鏈的5′端含有序列8的序列，從而形成了反向重復(fù)序列。通過在5′端和反向鏈的5′端均加入選自序列3，4，7和8的一種序列，可以形成反向重復(fù)序列。通過在5′端和反向鏈的5′端均加入選自序列3，4，7和8的兩種序列，可以形成反向重復(fù)序列。在序列9中的插入序列IS903在5′端含有序列10的序列，在反向鏈的5′端含有序列11的序列，從而形成了反向重復(fù)序列。通過在5′端和反向鏈的5′端均加入選自序列10和11的一種序列，可以形成反向重復(fù)序列。通過在5′端和反向鏈的5′端均加入選自序列10和11的兩種序列，可以形成反向重復(fù)序列。用除序列3，4，7，8，10和11所列序列外，可以在轉(zhuǎn)座因子中起作用的任何其它序列，也可以形成本發(fā)明的反向重復(fù)序列。被插入插入序列中的藥物抗性基因包括卡那霉素抗性基因，氯霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因以及對(duì)各種藥物有抗性的基因，例如氨芐青霉素抗性基因，氨甲蝶呤抗性基因等。藥物抗性程度和藥物抗性基因的拷貝數(shù)之間有關(guān)系的藥物抗性基因是優(yōu)選的。由于要擴(kuò)增所需的基因，因此，可以使用參與各種氨基酸和核酸生物合成的基因。其實(shí)例包括用于谷氨酸生物合成的谷氨酸脫氫酶基因，用于谷氨酰胺生物合成的谷氨酰胺合成酶基因，用于賴氨酸生物合成的天冬氨酸激酶基因(下文稱天冬氨酸激酶為″AK″，如果需要，編碼AK蛋白質(zhì)的基因在下文中被稱為″lysC″)，二氫二吡啶羧酸鹽合成酶基因(下文將二氫二吡啶羧酸鹽合成酶稱為″DDPS″，如果需要，編碼DDPS蛋白質(zhì)的基因在下文中被稱為″dapA″)，二氫二吡啶羧酸鹽還原酶基因(下文將二氫二吡啶羧酸鹽還原酶稱為″DDPR″，如果需要，編碼DDPR蛋白質(zhì)的基因在下文中被稱為″dapB″)，二氨基庚二酸脫羧酶基因(下文將二氨基庚二酸脫羧酶稱為″DDC″，如果需要，編碼DDC蛋白質(zhì)的基因在下文中被稱為″lysA″)，和二氨基庚二酸脫氫酶基因(下文將二氨基庚二酸脫氫酶稱為″DDH″，如果需要，編碼DDH蛋白質(zhì)的基因在下文中被稱為″ddh″)，用于蘇氨酸生物合成的同絲氨酸脫氫酶基因，用于異亮氨酸或纈氨酸生物合成的acetohydroxyacid合成酶基因，用于亮氨酸生物合成的2-異丙基蘋果酸合成酶基因，用于脯氨酸或精氨酸生物合成的谷氨酸激酶基因，用于組氨酸生物合成的磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶基因，用于芳香族氨基酸，例如色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸生物合成的脫氧阿拉伯庚糖醛酸磷酸(DAHP)合成酶基因，用于核酸，例如肌苷酸和鳥苷酸生物合成磷酸核糖焦磷酸(PRPP)酰氨基轉(zhuǎn)移酶基因，肌苷鳥苷激酶基因，肌苷酸(IMP)脫氫酶基因和鳥苷酸(GMP)合成酶基因。此外，也可以使用編碼生理學(xué)活性蛋白質(zhì)例如白介素2，白介素6等的基因。按Bergey′sManualofDeterminativeBacteriology，8thed.，p.599(1974)中的描述，本發(fā)明中涉及的棒狀桿菌包括需氧革蘭氏陽性桿菌，分為棒狀桿菌屬的細(xì)菌，曾經(jīng)分到短桿菌屬中，但現(xiàn)在分到棒狀桿菌屬中的細(xì)菌[Int.j.Syst.Bacteriol.，41，255(1981)]，很接近棒狀桿菌屬的短桿菌屬的細(xì)菌，和微桿菌屬的細(xì)菌?？偟膩碇v，在棒狀細(xì)菌中包括下列已知作為L(zhǎng)-谷氨酸-生產(chǎn)菌的微生物。嗜乙酰乙酸棒狀桿菌醋各棒狀桿菌頸棒狀桿菌谷氨酸棒狀桿菌百合棒狀桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)棲糖蜜棒狀桿菌擴(kuò)展短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)黃色短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)不嗜海水短桿菌乳酸發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)玫瑰色短桿菌解糖短桿菌生硫短桿菌產(chǎn)氨短桿菌(產(chǎn)氨棒狀桿菌)MicrobacteriumammoniaphilumCorynebacteriumthermoaninogenes具體地，提到下列野生型和從其得到的突變菌株。嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷棒狀桿菌ATCC15806頸棒狀桿菌ATCC15991谷氨酸棒狀桿菌ATCC13020百合棒狀桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC15990棲糖蜜棒狀桿菌ATCC17965擴(kuò)展短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC14020黃色短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC14067不嗜海水短桿菌ATCC14068乳酸發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產(chǎn)氨短桿菌(產(chǎn)氨棒狀桿菌)ATCC6871MicrobacteriumammoniaphilumATCC15354CorynebacteriumthermoaninogenesAJl2340(FERMBP-1539)本發(fā)明的人工轉(zhuǎn)座子含有在反向重復(fù)序列之間插入了藥物抗性基因和所需基因的結(jié)構(gòu)，而且具有在棒狀細(xì)菌中轉(zhuǎn)座的能力。本發(fā)明的轉(zhuǎn)座酶是例如具有序列表中序列2或6所列的核苷酸序列的轉(zhuǎn)座酶。然而本發(fā)明的轉(zhuǎn)座酶還包括在上述序列中有一個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸殘基缺失，插入，增加，取代或倒位，但只要還具有轉(zhuǎn)座酶活性的轉(zhuǎn)座酶。本發(fā)明的轉(zhuǎn)座酶基因具有例如含有序列1核苷酸序列中第130-1437的序列，或含有序列5核苷酸序列中第130-1437的序列。但是本發(fā)明的轉(zhuǎn)座酶基因還包括在上述序列中有一個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸殘基缺失，插入，增加，取代或倒位，但只要所述基因產(chǎn)物具有轉(zhuǎn)座酶活性的轉(zhuǎn)座酶?？梢詫⑥D(zhuǎn)座酶基因放在人工轉(zhuǎn)座子內(nèi)。即，將轉(zhuǎn)座子基因放在反向重復(fù)序列之間，而且放在不會(huì)影響藥物抗性基因和所需基因的功能的位置?？梢詫⑥D(zhuǎn)座酶基因放在人工轉(zhuǎn)座子外?？梢栽谝粋€(gè)質(zhì)粒上用含有人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒攜帶轉(zhuǎn)座酶基因。也可以用兩個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)含有人工轉(zhuǎn)座子，另一個(gè)質(zhì)粒攜帶轉(zhuǎn)座子基因。轉(zhuǎn)座子基因可以在染色體上存在。以轉(zhuǎn)座因子為起始材料，可以很容易地構(gòu)建本發(fā)明的人工轉(zhuǎn)座子。在本發(fā)明中，可以使用任何插入序列，只要它存在于上述棒狀桿菌的染色體中，大小為約760-2000bp，有約8-20bp的反向重復(fù)序列，并且其中編碼轉(zhuǎn)座所需的轉(zhuǎn)座酶。按照WO93/18151中公開的方法，可以得到所述的插入序列。即，可以經(jīng)下列方法得到含有插入序列的DNA片段(1)將質(zhì)粒pEC701導(dǎo)入棒狀細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，(2)用卡那霉素抗性為標(biāo)記篩選用pEC701轉(zhuǎn)化的菌株，(3)在含有異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)的瓊脂平板上涂布含有質(zhì)粒pEC701的棒狀細(xì)菌，然后篩選由此生長(zhǎng)的菌株，(4)分析所篩選的菌株所含的質(zhì)粒中氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因的調(diào)節(jié)基因區(qū)或結(jié)構(gòu)基因區(qū)，和(5)找到在該基因中的插入的序列。另外，可以經(jīng)下列方法得到上述的DNA片段(1)將質(zhì)粒pEC901導(dǎo)入棒狀細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，(2)用卡那霉素抗性作為標(biāo)記篩選用pEC901轉(zhuǎn)化的菌株，(3)在30℃培養(yǎng)含有pEC901的棒狀細(xì)菌，甚至在30℃篩選表達(dá)氯霉素抗性的菌株，(4)分析所選菌株所含的質(zhì)粒中的cI阻遏基因，和(5)找到在該基因中的插入序列。棒狀細(xì)菌插入序列的實(shí)例包括由序列表中的SequenceNos.1，5和9，即IS714，IS719和IS903所代表的三種插入序列。這些核苷酸序列不必是嚴(yán)格的，在構(gòu)建人工轉(zhuǎn)座子時(shí)，可以使用包括反向重復(fù)序列的插入序列，只要它可以作為插入序列，在所述的反向重復(fù)系列中，部分堿基被其他堿基取代或缺失，或者新的系列被插入或加人在這些插入序列的基礎(chǔ)上可以構(gòu)建各種人工轉(zhuǎn)座子。這些人工轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)示于圖1。其中本發(fā)明所用的人工轉(zhuǎn)座子含有所擴(kuò)增的藥物抗性基因和所需基因被插入到插入序列中的結(jié)構(gòu)。在示于序列1的IS714中，限制性酶NheI位點(diǎn)位于37-42。由于在該位置的插入并不會(huì)影響反向重復(fù)系列和轉(zhuǎn)座酶的功能，因此該位置適于插入待擴(kuò)增的藥物抗性基因和所需的基因。在示于序列5的IS719中，限制性酶NheI位點(diǎn)位于37-42。由于在該位置的插入并不會(huì)影響反向重復(fù)系列和轉(zhuǎn)座酶的功能，因此該位置適于插入待擴(kuò)增的藥物抗性基因和所需的基因。在示于序列9的IS903中，限制性酶XcmI位點(diǎn)位于34-48。由于在該位置的插入并不會(huì)影響反向重復(fù)系列和轉(zhuǎn)座酶的功能，因此該位置適于插入待擴(kuò)增的藥物抗性基因和所需的基因。下文將以IS714為例，描述構(gòu)建其中插入有藥物，例如卡那霉素(新霉素)，氯霉素或四環(huán)素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子的方法，以及構(gòu)建其中插入了藥物抗性基因和用于生產(chǎn)氨基酸或核酸(如天冬氨酸激酶)的所需基因的人工轉(zhuǎn)座子的方法。IS714的核苷酸序列示于序列表中的SeqenceNo.1。(1)構(gòu)建含有卡那霉素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII和EcoRI裂解含有IS714序列的質(zhì)粒pEC701-IS14，IS714是乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036(FERMBP-734)的插入序列，所述乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036(FERMBP-734)是棒狀細(xì)菌的野生型菌株(見WO93/18151)。同時(shí)，將含有IS714的片段插入到質(zhì)粒pHSC4的限制性內(nèi)切核酸酶SalI位點(diǎn)以構(gòu)建質(zhì)粒pHIS714，所述的質(zhì)粒pHSC4含有得自棒狀細(xì)菌(日本KokaiNo.7，491/1993)的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)。將上述所得的含IS714的1.6kb片段插入到pHIS714的SmaI位點(diǎn)。因此，按圖2構(gòu)建了含有相反方向的IS714的質(zhì)粒pHTN7141和pHTN7142。然后用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII型解pHTN7141和pHTN7142，以便切出含有IS714和pHSC4溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)序列的這兩個(gè)序列的片段。同時(shí)，質(zhì)粒載體pHSG298(由TakaraShuzo制造)還含有兩個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶PvuII位點(diǎn)。通過用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII裂解該質(zhì)粒載體可以得到含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(卡那霉素抗性基因)的2.3kb片段。用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII裂解pHTN7141和pHSG298，然后連接所得的片段以轉(zhuǎn)化乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036。如圖3所示，從具有卡那霉素抗性的菌株得到質(zhì)粒pHTN7143。如圖4所示，用上述方法，從質(zhì)粒pHTN7142和pHSG298得到質(zhì)粒pHTN7144。pHTN7143和pHTN7144含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因位于兩個(gè)IS714系列之間的結(jié)構(gòu)。如圖5所示，用上述方法從質(zhì)粒pHIS714構(gòu)建質(zhì)粒pHIS714K1和pHIS714K2，pHSG298作為對(duì)照質(zhì)粒。在pHIS714K1和pHIS714K2中，含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的插入片段的方向彼此相反。為了使人工轉(zhuǎn)座子最小化，構(gòu)建了其中將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因插入到一個(gè)IS714中的人工轉(zhuǎn)座子。在IS714中，限制性內(nèi)切核酸酶NheI位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)座子功能不受干擾的位置。用限制性內(nèi)切核酸酶NheI裂解質(zhì)粒pHIS714，然后平截其末端。另一方面，用限制性內(nèi)切核酸酶PstI從質(zhì)粒pUC4K(由PharmaciaBiotech制造)切出新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因區(qū)。按圖6所示，連接兩個(gè)片段以得到所需的質(zhì)粒pHTN7145。(2)構(gòu)建含有氯霉素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子用限制性內(nèi)切核酸酶AccII裂解質(zhì)粒載體pHSG398(由TakaraShuzo制造)得到含有氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶基因的約1.1kb的片段。然后將所述的AccII片段插入到pUC18(由TakaraShuzo制造)的SmaI位點(diǎn)，克隆由此所得的質(zhì)粒。篩選所得的克隆以得到質(zhì)粒pUC18-CM。此外，在上述構(gòu)建的pHIS714K2中，平截位于不影響轉(zhuǎn)座酶功能的位置的IS714的限制性內(nèi)切核酸酶NheI的位點(diǎn)。將用EcoRI和HindIII從pUC18-CM切出的含氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因的約1.1kb片段與pHIS714K2的限制性內(nèi)切核酸酶NheI平端位點(diǎn)相連，以轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后篩選其中插入了氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因片段的克隆。按圖7所示，從所得的克隆可以得到所需的質(zhì)粒pHTN7151。(3)構(gòu)建含四環(huán)素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和AvaI裂解質(zhì)粒載體pBR322(由TakaraShuzo制造)可以得到含有四環(huán)素抗性基因的約1.4kb片段。在上述構(gòu)建的pHIS714K2中，平截位于不影響轉(zhuǎn)座酶功能的位置的IS714的限制性內(nèi)切核酸酶NheI位點(diǎn)。將上述形成的DNA片段與該限制性內(nèi)切核酸酶NheI平端位點(diǎn)相連，以轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后篩選其中插入了四環(huán)素抗性基因片段的克隆。按圖8所示從所得的克隆可以得到所需的質(zhì)粒pHTN7152。(4)將賴氨酸生物合成基因之一的天冬氨酸激酶基因插入到含有四環(huán)素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子中由于圖8中構(gòu)建的pHTN7152沒有適于天冬氨酸激酶基因插入的適宜的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，按如下構(gòu)建新導(dǎo)入一個(gè)插入位點(diǎn)的pHTN7156。用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和AvaI裂解質(zhì)粒載體pBR322(由TakaraShuzo制造)可以得到含有四環(huán)素抗性基因的約1.4kb片段。將該片段與經(jīng)用限制性內(nèi)切核酸酶SmaI裂解質(zhì)粒載體pHY300PLK(由TakaraShuzo制造)而得到的片段相連以轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后篩選其中插入了四環(huán)素抗性基因片段的克隆。從所得的克隆得到質(zhì)粒pHY300-TC。此外，在上述構(gòu)建的pHIS714K2中，平截位于不影響轉(zhuǎn)座酶功能之位置的IS714的限制性內(nèi)切核酸酶NheI位點(diǎn)。將經(jīng)用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和XbaI裂解pHY300-TC而得到的含有四環(huán)素抗性基因的片段與該限制性內(nèi)切核酸酶NheI平端位點(diǎn)相連以轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選其中插入了四環(huán)素抗性基因的克隆。按圖9所示從所得的克隆得到所需的質(zhì)粒pHTN7156。隨后，將賴氨酸生物合成基因之一的天冬氨酸激酶基因按如下所述插入到質(zhì)粒pHTN7156中。用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI裂解質(zhì)粒p399AK9B，該質(zhì)粒含有天冬氨酸激酶基因，所述基因得自棒狀細(xì)菌乳酸發(fā)酵短桿菌的賴氨酸-生產(chǎn)突變體，并經(jīng)過了脫敏，從而同時(shí)抑制賴氨酸和蘇氨酸(參見WO94/25605)，然后自身連接以構(gòu)建pHSG399AK，但從中除去了在棒狀細(xì)菌中起作用的復(fù)制起點(diǎn)。用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和SphI裂解pHSG399AK以得到約1.7kb的天冬氨酸激酶基因片段。將該片段插入到質(zhì)粒pHTN7156的限制性內(nèi)切核酸酶Bg1II平端位點(diǎn)以便按圖9所示構(gòu)建質(zhì)粒pHTN7156-C，質(zhì)粒pHTN7156含有攜帶四環(huán)素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子。(5)構(gòu)建含有四環(huán)素抗性基因，但在轉(zhuǎn)座子單元中沒有轉(zhuǎn)座酶的人工轉(zhuǎn)座子用限制性內(nèi)切核酸酶NheI和XbaI裂解質(zhì)粒pHIS714以得到含有編碼轉(zhuǎn)座酶基因的片段。將所述的DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒載體pUC19的XbaI位點(diǎn)以構(gòu)建質(zhì)粒TnpL/pUC19。然后，用限制性內(nèi)切核酸酶MroI和XbaI裂解TnpL/pUC19以缺失含有IS714終止密碼子和3′反向重復(fù)(IR)的序列。將被設(shè)計(jì)用來再導(dǎo)入終止密碼子的合成的雙鏈DNA經(jīng)連接插入到上述的裂解部分。用所述的方法，得到未插入反向重復(fù)序列之間的轉(zhuǎn)座酶基因。隨后，用限制性內(nèi)切核酸酶SmaI和XbaI裂解所述的ORFL/pUC19以得到含有轉(zhuǎn)座酶的約1.5kb的基因片段。將該轉(zhuǎn)座酶基因片段插入到通過除去其SmaI和XbaI位點(diǎn)之間的序列而得到的質(zhì)粒載體pHY300PLK部分，然后用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和KpnI切割。EcoRI和KpnI片段是平整末端。同時(shí)，用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII部分消化質(zhì)粒載體pHSG398以缺失含有多克隆位點(diǎn)的片段，然后與上述得到的轉(zhuǎn)座酶基因片段相連。由此構(gòu)建質(zhì)粒pORF1(圖10)。另一方面，得到含有轉(zhuǎn)座酶基因的質(zhì)粒pHIS714的NheI-XbaI裂解片段，使其末端平整，然后轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體pUC19的末端鈍化的PstI位點(diǎn)以構(gòu)建質(zhì)粒Tnp(Pst)/puc19。用U.S.E.Mutagensis試劑盒(PharmaciaBiotech)使所述Tnp(Pst)/pUC19的轉(zhuǎn)座酶基因經(jīng)部分堿基取代。被取代的堿基是IS714序列中第288位上的G。用C取代所述的堿基G。經(jīng)堿基取代的質(zhì)粒稱為Tnp(Pst)M/pUC19。Tnp(Pst)M/pUC19的結(jié)構(gòu)示于圖11中。*表示導(dǎo)入的突變。用各種系統(tǒng)控制轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座。所述控制的實(shí)例包括下列系統(tǒng)(MobileDNA，AmericanSocietyforMicrobiology，WashingtolnD.C.(1989))。(1)在轉(zhuǎn)座因子內(nèi)與轉(zhuǎn)座酶基因鄰接的轉(zhuǎn)座酶抑制基因或阻遏基因(例如Tn3)。(2)在一個(gè)框架內(nèi)存在兩個(gè)ORF。一個(gè)靠近3′末端編碼區(qū)。在兩個(gè)ORF之間的轉(zhuǎn)譯移框的發(fā)生頻率很低，從而使得表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的兩個(gè)ORF被完全轉(zhuǎn)譯，(例如IS1)。(3)在編碼轉(zhuǎn)座酶的ORF中存在另一個(gè)轉(zhuǎn)譯起始密碼子(ATG，GTG)，而且轉(zhuǎn)譯從所述的密碼子開始以表達(dá)抑制劑(例如Tn5(IS50))。同時(shí)，在IS714中存在一個(gè)幾乎相當(dāng)于全長(zhǎng)IS714的ORF，但未發(fā)現(xiàn)另一個(gè)ORF。這表明可能是IS714含有編碼轉(zhuǎn)座酶樣Tn5的ORF，而抑制劑是從所述ORF中的另一個(gè)起始密碼子開始轉(zhuǎn)譯的。尋查啟動(dòng)子樣序列的結(jié)果表明從286-288的序列GTG可能是抑制劑的起始密碼子。設(shè)計(jì)在質(zhì)粒Tnp(Pst)M/pUC19上導(dǎo)入的突變，使其不會(huì)引發(fā)抑制劑的轉(zhuǎn)譯。從pORF1中缺失在轉(zhuǎn)座酶前一半基因中限制性內(nèi)切核酸酶SmaI和NaeI位點(diǎn)之間的序列。將用限制性內(nèi)切核酸酶SmaI和NaeI裂解Tnp(Pst)M/pUC19而得到的轉(zhuǎn)座酶前一半基因片段插入到上述缺失的部分，通過連接構(gòu)建pORF2。從pORF2缺失SmaI和XbaI位點(diǎn)之間的序列，使所得的片段末端鈍化。用限制性內(nèi)切核酸酶NaeI和HindIII裂解pBSF2-SD7得到含有色氨酸操縱子弱化子的DNA片段，然后使之成為平端，將前一個(gè)片段與后一個(gè)片段相連。由此構(gòu)建的質(zhì)粒稱為pORF3。用限制性內(nèi)切核酸酶SalI和Bpu1102I裂解pORF3以缺失轉(zhuǎn)座酶的前半段基因片段。將用限制性內(nèi)切核酸酶SalI和Bpu1102I裂解Tnp(Pst)/pUC19而得到的轉(zhuǎn)座酶前半段基因片段插入到上述缺失的部分，連接后構(gòu)建圖11所示的pORF4。用SacI裂解TnpL/pUC19，然后用BAL31核酸酶于30℃消化20分鐘以便從上游側(cè)缺失靠近轉(zhuǎn)座酶基因起始密碼子的序列。此后，用SphI位點(diǎn)切出轉(zhuǎn)座酶基因片段，然后與用SmaI和SphI裂解的pHSG398相連。由此構(gòu)建的質(zhì)粒稱為delTnp5/398。用限制性內(nèi)切核酸酶KnpI和HindIII裂解delTnp5/398，然后使轉(zhuǎn)座酶前半段基因片段成為平端。然后，用NcoI和HindIII裂解質(zhì)粒載體pKK233-2(由PharmaciaBiotech制備)，使之成為平端。將前一個(gè)片段與后一個(gè)片段相連以構(gòu)建pTrc-ORF。用SspI和Bpu1102I裂解pTrc-ORF以形成含有Trc啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)座酶前半段基因的片段。用XbaI裂解pORF3，使之成為平端，然后再用Bpu1102I裂解以缺失轉(zhuǎn)座酶前半段基因片段。將上述形成的片段與所缺失的pORF3相連以便如圖12所示構(gòu)建pORF7。將用限制性內(nèi)切核酸酶KpnI和HindIII裂解delTnp5/39而得到的轉(zhuǎn)座酶前半段基因片段克隆到質(zhì)粒載體pUC18的KpnI和HindIII之間。缺失所述質(zhì)粒delTnp5/18的BsmI和NaeI位點(diǎn)之間部分，將該片段與通過用限制性內(nèi)切核酸酶BsmI和NaeI裂解Tnp(Pst)M/pUC19而得到的轉(zhuǎn)座酶前半段基因片段相連以構(gòu)建delTnp5M/18。用KpnI和HindIII裂解delTnp5M/18，使所得的轉(zhuǎn)座酶前半段基因片段成為平端。用NcoI和HindIII裂解pKK233-2，使所得的片段成為平端。將這些片段彼此相連以構(gòu)建pTrc-TnpM。通過用從pTrc-Tnp構(gòu)建pORF7相同的方法，從pTrc-TnpM和ORF3構(gòu)建pORF8(圖13)。用上述質(zhì)粒pORF3，pORF4，pORF7和pORF8構(gòu)建導(dǎo)入到棒狀細(xì)菌中的質(zhì)粒。下面描述從pORF3構(gòu)建pORF41。首先，用NheI和SacII裂解pHIS714以缺失轉(zhuǎn)座酶基因的主要部分。將被設(shè)計(jì)的以導(dǎo)入克隆位點(diǎn)的雙鏈合成DNA插入到上述缺失的部分以構(gòu)建pHTN7160。用限制性內(nèi)切核酸酶KpnI裂解pHTN7160，使之成為平端，然后再用BglI裂解以得到含有IS714兩端的反向重復(fù)(IR)序列和在棒狀細(xì)菌中起作用的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的片段。用限制性內(nèi)切核酸酶EarI裂解pORF3，使之成為平端，然后再用BglI裂解。將pHTN7160的上述片段插入其中，以構(gòu)建pORF41-pre。用EcoRV裂解位于IS714兩個(gè)末端IR之間的pORF41-pre。使含有pBR322的Tc抗性基因的EcoRI-AvaI片段成為平端，與EcoRV-裂解的片段連接以便按圖14所示構(gòu)建pORF41。重復(fù)上述方法，以便從pORF4經(jīng)pORF31-pre，從pORF7經(jīng)pORF71-pre，從pORF8經(jīng)pORF81-pre分別構(gòu)建pORF31，pORF71，pORF81。用XbaI和EarI裂解pORF3，使之成為平端，然后自身連接以構(gòu)建不含轉(zhuǎn)座酶基因的pORFCO(圖15)。用相同于從pORF3構(gòu)建pORF41的方法，從pORFCO經(jīng)pORFC2-pre構(gòu)建pORFC2。這些最終構(gòu)建的質(zhì)粒含有轉(zhuǎn)座酶的結(jié)構(gòu)基因，Cm抗性基因，在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起點(diǎn)，在棒狀細(xì)菌中起作用的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)，位于IS714的IR之間的Tc抗性基因，使得pORFC2不含有轉(zhuǎn)座酶的結(jié)構(gòu)基因。含有IS714兩個(gè)末端上的IR和Tc抗性基因的單元被稱為轉(zhuǎn)座子單元Tn7162。IS714本身或上述Tn7152等具有在一個(gè)可轉(zhuǎn)座的區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)基因，而Tn7162的特征在于在可轉(zhuǎn)座的區(qū)域內(nèi)沒有轉(zhuǎn)座酶的結(jié)構(gòu)基因。認(rèn)為Tn7162是通過由位于該單元外并在攜帶Tn7162的載體上的轉(zhuǎn)座子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)座子而轉(zhuǎn)座的(圖16)?；蛘哒J(rèn)為，由染色體上的轉(zhuǎn)座酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶來轉(zhuǎn)座Tn7162。其次，說明如何構(gòu)建用于棒狀細(xì)菌，含有轉(zhuǎn)座酶基因，但沒有轉(zhuǎn)座子單元的質(zhì)粒。用EcoO109I和MroI裂解質(zhì)粒pHIS714K1以缺失IS714，然后將其自身連接以構(gòu)建pHIS714Kdel。同時(shí)，用限制性內(nèi)切核酸酶EarI裂解pORF3，使之成為平端，然后，再用BglI裂解。用限制性內(nèi)切核酸酶KpnI裂解pHIS714Kdel，使之成為平端，然后再用BglI裂解以形成含有在棒狀細(xì)菌中起作用的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的片段。將由此形成的片段彼此連接，以便按圖17所示構(gòu)建pORF40。重量所述的方法，以便從pORF4，pORF7，pORF8和pORFCO分別構(gòu)建pORF30，pORF70，pORF80，pORFC1。就棒狀細(xì)菌的插入序列，例如IS719和IS903而言，它們含有由序列表中序列5和9所代表的序列，而且不同于上述的IS714，通過將藥物抗性基因。例如氯霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因以及所需的基因，例如天冬氨酸激酶基因插入到插入序列中轉(zhuǎn)座酶基因的調(diào)節(jié)基因區(qū)和結(jié)構(gòu)基因區(qū)外的適宜限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，可以構(gòu)建人工轉(zhuǎn)座子。若在轉(zhuǎn)座酶基因的調(diào)節(jié)基因區(qū)和結(jié)構(gòu)基因區(qū)外，沒有適宜的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，則在不抑制轉(zhuǎn)座酶功能的區(qū)域，通過利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的部分特異性堿基突變，經(jīng)修飾插入序列，或者用合成DNA寡核苷酸(銜接子)進(jìn)行基因插入，可以首先制備適宜的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。將由此構(gòu)建的人工座子通過適當(dāng)?shù)妮d體，例如質(zhì)粒導(dǎo)入宿主棒狀細(xì)菌中。對(duì)含有人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒沒有特別限定。通常使用來自棒狀細(xì)菌的質(zhì)粒。質(zhì)粒的實(shí)例包括pHM1519[Agric.Biol.chem.，48，2901-2903(1984)]，AM330[Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)]，和通過改進(jìn)上述質(zhì)粒而得到的含有藥物抗性基因的質(zhì)粒。為了以良好的效率擴(kuò)增導(dǎo)入到染色體中的人工轉(zhuǎn)座子，推薦使用在(1)中提到的含有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒(參見日本KokaiNo.7，491/1993)。用原生質(zhì)體方法[Gene，39，281-286(1985)]或電穿孔方法[Bio/Technology，7，1067-1070(1989)]可以將含有人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒導(dǎo)入到棒狀細(xì)菌中。用構(gòu)建的質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化棒狀細(xì)菌，在25℃溫育轉(zhuǎn)化體，在所述的溫度，可以復(fù)制質(zhì)粒以擴(kuò)增含人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒達(dá)到每細(xì)胞數(shù)百拷貝，并導(dǎo)入到染色體中，再在34℃下保溫以除去額外的質(zhì)粒，這樣通過溫度敏感型質(zhì)粒即可將人工轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入到棒狀細(xì)菌的染色體中。用所述的方法，可以以良好的效率完成基因在染色體中的擴(kuò)增。可以用正常質(zhì)粒代替溫度敏感型質(zhì)粒。但是，在許多情況下，在將人工轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入到染色體中后，很難除去額外的質(zhì)粒。此外，還有一種方法，只用人工轉(zhuǎn)座子的DNA片段或不能在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體(例如，在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體)，而將人工轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入到棒狀細(xì)菌中[JapaneseKokaiNo.107，976/1955；andMol.Gen.Genet.，byWertesA.A.，AsaiY.，InuiM.，KobausshiM.，KurusuY.andYukawaH.，245，397-405(1994)]。然而，用該方法不能在轉(zhuǎn)化后的宿主菌株中擴(kuò)增DNA片段，而且轉(zhuǎn)座到宿主染色體中的效率很差。用與所需基因一起導(dǎo)入的藥物抗性基因的藥物抗性程度，來篩選所需基因被導(dǎo)入染色體中的菌株或在染色體中擴(kuò)增的所需基因的菌株。所用的藥物抗性基因包括卡那霉素抗性基因，氯霉素抗性基因，四環(huán)素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因，氨甲蝶呤抗性基因等。抗性程度與藥物抗性基因的拷貝數(shù)相關(guān)的藥物抗性基因是最優(yōu)選的。即，從存在高濃度藥物的情況下可以生長(zhǎng)的克隆可以達(dá)到所需基因在染色體中擴(kuò)增的菌株。用含有藥物抗性基因。例如四環(huán)素抗性基因等和所需基因，例如脫敏的天冬氨酸激酶基因等的質(zhì)粒(例如pHTN7156-C)轉(zhuǎn)化棒狀細(xì)菌，并且人工轉(zhuǎn)座子被轉(zhuǎn)座到宿主染色體中后，可以用下列方法評(píng)估轉(zhuǎn)座后在染色體中形成的轉(zhuǎn)座拷貝數(shù)。在25℃，于含適當(dāng)濃度(用Tc時(shí)，從1-20μg/ml)藥物，例如四環(huán)素(Tc)等，10g/L酵母提取物，10g/L胰胨，5g/L葡萄糖和5g/LNaCl的CM2G液體培養(yǎng)基中，將轉(zhuǎn)化子溫育過夜。用0.9％NaCl溶液適當(dāng)稀釋培養(yǎng)液，然后以100μl的量涂布在含適當(dāng)濃度藥物的CM2G瓊脂培養(yǎng)基上。將所得的培養(yǎng)物在34℃溫育。從形成的許多克隆中隨機(jī)篩選數(shù)個(gè)克隆。制備染色體DNA，用包括PvuII的不同限制性內(nèi)切核酸酶完全消化，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。在硝酸纖維素，尼龍或聚偏氟乙烯(PVDF)濾紙上印跡片段。用32P-標(biāo)記的四環(huán)素抗性基因片段作為探針，使所述濾紙經(jīng)Southern雜交，以檢測(cè)與該探針雜交的帶的數(shù)目。用常規(guī)使用的方法和條件可以溫育所需基因在由此得到的染色體中擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化子。溫育所用的培養(yǎng)基是含有碳源，氮源，無機(jī)離子等的常規(guī)培養(yǎng)基?？梢园葱枰尤胗袡C(jī)微量營養(yǎng)物質(zhì)，例如維生素，氨基酸等。碳源的實(shí)例包括碳水化合物，例如葡萄糖和蔗糖，有機(jī)酸，例如乙酸，和醇例如乙醇。氮源的實(shí)例包括氨氣，液氨，胺鹽。無機(jī)離子的實(shí)例包括鎂離子，磷酸離子，鉀離子和鐵離子。根據(jù)需要使用這些物質(zhì)。需氧培養(yǎng)1-7天，同時(shí)將pH的范圍控制在5.0-8.5，溫度控制在15℃-37℃。用人工轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增基因，其結(jié)果是生產(chǎn)有用物質(zhì)的效率得到提高，并且在培養(yǎng)菌株內(nèi)或外生產(chǎn)并積累所需的物質(zhì)。用已知方法，可以從培養(yǎng)液中收集所需的物質(zhì)。實(shí)施例參考下列實(shí)施例將更詳細(xì)地說明本發(fā)明。實(shí)施例1用IS714構(gòu)建含有卡那霉素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII和EcoRI裂解含有IS714的序列的質(zhì)粒pEC701-IS14以得到含IS714的1.6kb片段，所述的IS714的序列是棒狀細(xì)菌的插入序列。含質(zhì)粒pEC701-IS14的乳酸發(fā)酵短桿菌于1992年3月10日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，HigashilChomeTsukuba-shiIbaraki-Ken305，Japan)，保藏號(hào)為No.FERMP-12863，然后于1993年3月9日轉(zhuǎn)變?yōu)楦鶕?jù)布達(dá)佩斯條約的保藏證書。保藏號(hào)為BP-4232。同時(shí)，用限制性內(nèi)切核酸酶SalI消化溫度敏感型質(zhì)粒pHSC4，用Klenow片段處理成平端。溫度敏感型質(zhì)粒pHSC4的限制性內(nèi)切核酸酶SalI位點(diǎn)位于不參與復(fù)制的區(qū)域。用Klenow片段處理成平端。然后通過連接將所得的片段插入到限制性內(nèi)切核酸酶SalI位點(diǎn)，得到如圖2所示的質(zhì)粒pHIS714。含質(zhì)粒pHSC4的大腸桿菌AJ12571于1990年10月11日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-Ken305，Japan)，保藏號(hào)為FERMP-11763，然后于1991年8月26日轉(zhuǎn)變?yōu)楦鶕?jù)布達(dá)佩斯條約的保藏證書。保藏號(hào)為BP-3524。通過Klenow片段處理將上述含IS714的1.6kb片段制成平端，然后插入到所述pHIS714的SmaI位點(diǎn)，通過連接構(gòu)建如圖2所示的質(zhì)粒pHTN7141和pHTN7142。限制性內(nèi)切核酸酶裂解分析表明，將兩個(gè)IS714片段以相同的方向插入到質(zhì)粒pHTN7141中，以相反的方向插入到質(zhì)粒pHTN7142中。用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII裂解pHTN7141和pHTN7142，可以切出在棒狀細(xì)菌pHSC4中的含兩個(gè)IS714序列的片段和溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的序列。另一方面，質(zhì)粒載體pHSG298(由Takarashuzo制備)還含有兩個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶PvuII位點(diǎn)。因此，用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII裂解pHSG298可以得到含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(卡那霉素抗性基因)的2.3kb片段。用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII裂解pHTN7141和pHSG298，然后將其彼此相連以轉(zhuǎn)化乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036。如圖3所示，從對(duì)25μg/ml卡那霉素(km)有抗性的轉(zhuǎn)化子菌株得到質(zhì)粒pHTN7143。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，含質(zhì)粒pHTN7143的乳酸發(fā)酵短桿菌于1993年3月9日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-ken305，Japan)。保藏號(hào)為BP-4231。按圖4所述，用上述方法，從pHTN7142和pHSG298得到質(zhì)粒pHTN7144。pHTN7143和pHTN7144具有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶位于兩個(gè)IS714序列之間的結(jié)構(gòu)。此外，按圖5所示，用pHSG298為對(duì)照，從質(zhì)粒pHIS714制備質(zhì)粒pHIS714K1和pHISK2。在pHIS714K1和pHISK2中，含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的插入片段位于相反的位點(diǎn)。為了使人工轉(zhuǎn)座子最小化，構(gòu)建新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因插入到一個(gè)IS714序列中的人工轉(zhuǎn)座子。限制性內(nèi)切核酸酶NheI位于IS714中不影響轉(zhuǎn)座酶功能的位置。因此，用限制性內(nèi)切核酸酶NheI裂解質(zhì)粒pHIS714，使其末端平整。同時(shí)，用限制性內(nèi)切核酸酶PstI從質(zhì)粒pUC4K(由PharmaciaBiotech制備)中切出新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因區(qū)，然后使其末端平整。將這些片段彼此相連，如圖6所示，所得質(zhì)粒稱為pHTN7145。含質(zhì)粒pHTN7145的大腸桿菌AJ12036于1995年6月29日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，HigashilChomeTsukuba-shiIbauaki-ken305，Japan)，并于1996年5月16日轉(zhuǎn)變?yōu)楦鶕?jù)布達(dá)佩斯條約的保藏證書，保藏號(hào)為BP-5537。評(píng)估人工轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座性能按如下評(píng)估由此得到的人工轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座性能。用含有氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒pAJ43轉(zhuǎn)化乳酸發(fā)酵短桿菌以產(chǎn)生乳酸發(fā)酵短桿菌AJ11882。用含有人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pHTN7145轉(zhuǎn)化乳酸發(fā)酵短桿菌AJ11882，以便質(zhì)粒pAJ43和質(zhì)粒pHTN7145共存于所述的乳酸發(fā)酵短桿菌中。含質(zhì)粒pAJ43的大腸桿菌AJ11882于1982年4月28日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-shiIbauaki-ken305，Japan)，并于1982年5月22日轉(zhuǎn)變?yōu)楦鶕?jù)布達(dá)佩斯條約的保藏證書，保藏號(hào)為BP-136。在含有25μg/ml卡那霉素(Km)，5μg/ml的氯霉素(Cm)，10g/L酵母提取物，10g/L胰胨，5g/L葡萄糖和5g/LNaCl的CM2G培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)上述得到的含pHTN7145和pAJ43的乳酸發(fā)酵短桿菌過夜，同時(shí)攪拌。然后將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋，涂布在含25μg/ml卡那霉素(Km)和5μg/ml氯霉素(Cm)的CG2M瓊脂培養(yǎng)基中，于34℃培養(yǎng)。在形成的菌落中從100個(gè)菌株提取質(zhì)粒，然后通過電泳檢測(cè)其大小。其中，質(zhì)粒pHTN7145和pAJ43的分子量不同。它們是其分子量為pAJ43和人工轉(zhuǎn)座子的總分子量的質(zhì)粒。通過限制內(nèi)切酶裂解分析這些質(zhì)粒時(shí)，發(fā)現(xiàn)pHTN7145中的序列被插入到pAJ43中。就這些質(zhì)粒中的一個(gè)來看，用雙脫氧法確定插入在pAJ43部分附近和插入片段核苷酸序列。結(jié)果，鑒定出人工轉(zhuǎn)座子兩個(gè)末端的序列，經(jīng)過插入的pAJ43上的靶序列GGTTTATT(SequenceNo.12)是雙份的。從這些結(jié)果發(fā)現(xiàn)若采用一種轉(zhuǎn)座子結(jié)果，其中在一個(gè)IS714序列中插入不參與轉(zhuǎn)座性能的基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)，則它可以象有所述結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座子一樣轉(zhuǎn)座。評(píng)價(jià)人工轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座頻率用pHTN714K1、對(duì)照質(zhì)粒、pHTN7143、pHTN7144和pHTN7145轉(zhuǎn)化乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036，評(píng)價(jià)人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座到宿主染色體內(nèi)的頻率。pHTN7143、pHTN7144和pHTN7145都含有人工轉(zhuǎn)座子。于25℃，在含有25μg/mlKm的上述CM2G液體培養(yǎng)基中將每個(gè)轉(zhuǎn)化子溫育過夜，然后用0.9％NaCl溶液大致稀釋培養(yǎng)物，以100μl的量將之涂布于含25μg/mlKm的CM2G瓊脂培養(yǎng)基上。在34℃和25℃保溫所得物質(zhì)，由菌落數(shù)目測(cè)量每個(gè)溫度Km抗性菌株出現(xiàn)的頻率，用34℃時(shí)的菌落數(shù)除以25℃時(shí)的菌落數(shù)，將所得數(shù)值定義為轉(zhuǎn)座頻率。結(jié)果示于表1。表1<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="553">轉(zhuǎn)座因子或人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座頻率比率IS714Tn7143Tn7144Tn71451.85×10-33.52×10-32.38×10-32.08×10-211.91.311.2</table></tables>從上述結(jié)果中發(fā)現(xiàn)人工轉(zhuǎn)座子Tn7143(包含于pHTN7143中)和Tn7144(包含于pHTN7144中)轉(zhuǎn)座到宿主染色體內(nèi)的頻率僅為作為對(duì)照質(zhì)粒的IS714(包含于pHIS714K1中)的1或2倍，但是人工轉(zhuǎn)座子Tn7145(包含于pHTN7145中)的轉(zhuǎn)座頻率大約為對(duì)照的11倍，因此它是一個(gè)十分有效的人工轉(zhuǎn)座子。實(shí)施例2使用IS714構(gòu)建含有氯霉素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子用限制性內(nèi)切核酸酶ACCII切割質(zhì)粒載體pHSG398(由TakaraShuzo制備)，得到含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的約為1.1kb的片段，用T4DNA聚合酶處理以使此ACCII片段的末端鈍化，將之插入pUC18(由TakaraShuzo制備)的SmaI位點(diǎn)并克隆之，即從已在含有25μg/mlCm、100μg/ml氨芐西林(Ap)、10g/l胰胨、5g/l酵母提取物和5g/lNall的L-培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的E.coli轉(zhuǎn)化子中選擇所需的克隆。將此質(zhì)粒稱為pUC18-CM。另外，用EcoRI和HindIII從pUC18-CM上切下含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的大約為1.1kb的片段，并使其末端鈍化。在實(shí)施例1所構(gòu)建的pHIS714K2中，通過用Klenow片段處理，可使位于不會(huì)損害轉(zhuǎn)座酶功能之位置處的IS714的限制性內(nèi)切核酸酶NheI位點(diǎn)的末端鈍化。將上述片段與此限制性內(nèi)切核酸酶NheI位點(diǎn)連接以轉(zhuǎn)化E.coli，挑選在含有25μg/mlCm和50μg/mlKm的L-瓊脂-培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，選擇其中已插入了氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因片段的克隆，如圖7所示，將此克隆中所含的質(zhì)粒稱為pHTN7151。用質(zhì)粒pHTN7151轉(zhuǎn)化E.coliHB101可得到E.coliAJ13129，1995年6月29日將之保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3、Higashi1chomeTsukuba-shiIbaraki-ken305，Japan)，保藏目錄號(hào)為FERMP-15012，1996年5月16日變成根據(jù)布達(dá)佩斯條約的保藏證書，指定保藏號(hào)為No.BP-5538。評(píng)價(jià)染色體中經(jīng)人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座而形成的拷貝數(shù)用pHTN7151轉(zhuǎn)化乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036，用下述方法評(píng)價(jià)經(jīng)人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座到宿主染色體內(nèi)形成的染色體中人工轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)。于25℃，在上述含有3μg/mlCm的CM2G液體培養(yǎng)基中將所得轉(zhuǎn)化子溫育過夜，用0.9％NaCl溶液大致稀釋，以100μl的量涂布于含有3μg/mlCm的CM2G瓊脂培養(yǎng)基中，將所得物質(zhì)在34℃中保溫。從長(zhǎng)出的菌落中選擇卡那霉素敏感克隆，于30℃，在上述含有3μg/mlCm的CM2G液體培養(yǎng)基中將此克隆溫育過夜，用0.9％NaCl溶液大致稀釋，以100μl的量涂布于含有6μg/mlCm的上述CM2G瓊脂培養(yǎng)基中，將所得物質(zhì)在30℃中保溫，從形成的菌落中隨機(jī)選擇一些克隆，制備每個(gè)克隆的染色體DNA，用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII完全消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜上印跡，使用經(jīng)32P-標(biāo)記的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因片段作為探針，使濾膜經(jīng)受Southern雜交，測(cè)量與探針雜交的帶的數(shù)目。結(jié)果，鑒定出隨機(jī)選擇的四個(gè)克隆中有三個(gè)，其兩拷貝具有氯霉素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子被轉(zhuǎn)座到宿主染色體內(nèi)。實(shí)施例3使用IS714構(gòu)建含有四環(huán)素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和AvaI裂解質(zhì)粒載體pBR322(由TakaraShnzo制備)以得到含有四環(huán)素抗性基因的大約為1.4kb的片段。再用T4DNA聚合酶處理使此EcoRI-AvaI-裂解片段的末端鈍化。在實(shí)施例1所構(gòu)建的pHIS714K2中，通過用Klenow片段處理，可使位于不會(huì)損害轉(zhuǎn)座酶功能之位置處的IS714的限制性內(nèi)切核酸酶NheI位點(diǎn)的末端鈍化，將上述片段與此限制性內(nèi)切核酸酶NheI位點(diǎn)連接以轉(zhuǎn)化E.coli。得到在含有25μg/mlTc的L-瓊脂-培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，選擇其中已插入了四環(huán)素抗性基因的克隆，如圖8所示，將此克隆中所含的質(zhì)粒稱為pHTN7152。用質(zhì)粒pHTN7152轉(zhuǎn)化E.coli可得到E.coliAJ13130，1995年6月29日將之保藏于工業(yè)貿(mào)易和工業(yè)部、工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)的國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所(1-3、Higazhi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-Ken305、Japan)，保藏目錄號(hào)為FERMP-15013，1996年5月16日變成根據(jù)布達(dá)佩斯條約的保藏證書，其指定保藏號(hào)為BP-5539。評(píng)價(jià)染色體中經(jīng)人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座而形成的拷貝數(shù)用pHTN7152轉(zhuǎn)化乳酵發(fā)酵短桿菌AJ12036，按下述方法評(píng)價(jià)經(jīng)人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座而形成的染色體中的拷貝數(shù)。于25℃，在含有1.5μg/mlTc的上述CM2G液體培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化子溫育過夜，再用0.9％NaCl溶液大致稀釋，涂布于含有1.5μg/ml至5μg/mlT的上述CM2G瓊脂培養(yǎng)基中。將所得物質(zhì)在34℃中保溫，從形成的菌落中隨機(jī)選擇一些克隆，制備每個(gè)菌落的染色體DNA，用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII完全消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜上印跡，使用經(jīng)32P-標(biāo)記的四環(huán)素抗性基因片段作為探針，使濾膜經(jīng)受Southern雜交，測(cè)量與探針雜交的帶的數(shù)目。結(jié)果，如表2所示，以高頻率檢測(cè)到具有四環(huán)素抗性基因的兩或三拷貝人工轉(zhuǎn)座子。因此；鑒定出使用四環(huán)素抗性基因作為選擇性藥物抗性基因可以高頻率得到所需的多拷貝型轉(zhuǎn)化子。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="630">Tc濃度(μg/ml)檢測(cè)的克隆數(shù)檢測(cè)的克隆數(shù)1拷貝2拷貝3拷貝1.52.03.04.04.064466443252013100010</table></tables>根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1996年5月14日將抗4μg/mlTc且染色體上具有了拷貝人工轉(zhuǎn)座子的乳酸發(fā)酵短桿菌AJ13188保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，Higazhi1ChomeTsukuba-ShiIbaraki-Ken305，Japan)，指定保藏號(hào)為No.BP-5536。實(shí)施例4使用IS714構(gòu)建含有四環(huán)素抗性基因和天冬氨酸激酶基因的人工轉(zhuǎn)座子按下述方法將天冬氨酸激酶基因(賴氨酸生物合成基因之一)插入含有四環(huán)素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子中。用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和AvaI裂解質(zhì)粒載體pBR322(內(nèi)TakaraShuzo制備)以得到含有四環(huán)素抗性基因的約為1.4kb的DNA片段，用T4DNA聚合酶處理使此經(jīng)過EcoRI-AuvI裂解的片段末端鈍化，將所得DNA片段與用限制性內(nèi)切核酸酶SmaI切割質(zhì)粒載體pHY300PLK(由TakaraShuzo制備)所得的片段連接，并轉(zhuǎn)化E.coli，得到在含有25μg/mlTc的L-瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，選擇其中已插入四環(huán)來抗性基因片段的克隆，將此克隆的質(zhì)粒稱為pHY300-Tc。另外，可通過用Klenow片段處理，使得通過用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和XbaI裂解pHY300-Tc得到的、并含有pBR322的四環(huán)素抗性基因的片段的末端鈍化。在以上構(gòu)建的pHIS714K2中，通過用Klenow片段處理，可使位于不會(huì)損害轉(zhuǎn)座酶功能之位置處的IS714的限制性內(nèi)切核酸酶NheI位點(diǎn)的末端鈍化。將上述片段與此限制性內(nèi)切核酸酶NheI位點(diǎn)連接以轉(zhuǎn)化E.coli，得到在含有25μg/mlTc的L-瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，選擇其中已插入四環(huán)來抗性基因片段的克隆，如圖9所示，將此克隆中所含有質(zhì)粒稱作pHTN7156。在另一方面，于1992年4月10日將E.coliAJ12691(WO94/25605)保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3、Higachi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-Ken305、Japan)，保藏號(hào)為FERMP-12198，1995年2月10日將之變?yōu)楦鶕?jù)布達(dá)佩斯條約的保藏證書，其指定保藏號(hào)為NO.FERMBP-4999。E.coliAJ12691中具有質(zhì)粒p399AK9B，此質(zhì)粒含有來自乳酸發(fā)酵短桿菌產(chǎn)賴氨酸突變體的天冬氨酸激酶基因，此基因?qū)嚢彼岷吞K氨酸的協(xié)同抑制作用脫敏感。用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI裂解此p399AK9B，并自身連接到已從中去除了在棒狀桿菌中起作用的復(fù)制起點(diǎn)的構(gòu)建體PHSG399AK中。用EcoRI和SphI裂解PHSG399AK以得到約為1.7kb的天冬氨酸激酶基因片段。用T4DNA聚合酶處理使此片段的末端鈍化，用Klenow片段片理使質(zhì)粒pHTN7156的限制性內(nèi)切核酸酶BglII位點(diǎn)的末端鈍化，所述質(zhì)粒具有含四環(huán)素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子。然后將以上形成的片段插入此限制性內(nèi)切核酸酶BglII位點(diǎn)，以此方式構(gòu)建了如圖9所示的質(zhì)粒pHTN7156-C。用質(zhì)粒pHTN7156-C轉(zhuǎn)化E.coli可得到E.coliAJ13131，1995年6月29日將之保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3、Higashi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-ken305、Japan)，指定保藏號(hào)為No.FERMP-15014，1996年5月16日將E.coliAJ13131變成根據(jù)布達(dá)佩斯條約的保藏，其指定保藏號(hào)為No.BP-5540。評(píng)價(jià)染色體中經(jīng)人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座而形成的拷貝數(shù)用pHTN7156-C轉(zhuǎn)化乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036或乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3445。評(píng)價(jià)經(jīng)人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座到宿主染色體中而形成的染色體中轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)。AJ12036菌株的染色體上具有野生型天冬氨酸激酶基因，而AJ3445菌株表現(xiàn)出S-2-戊基乙基-L-半胱氨酸抗性，并且具有對(duì)賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同抑制作用脫敏的天冬氨酸激酶基因。1984年3月26日將乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-ShiIbaraki-ken305.Japan)，指定保藏號(hào)為No.FERMP-7559，1985年3月13日將乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036變成根據(jù)布達(dá)佩斯條約的保藏證書，其指定保藏號(hào)為No.BP-734。1973年3月2日將乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3445保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-shiIbaraki-Ken305，Japan)，指定保藏號(hào)為No.FERMP-1944，1996年5月17日將乳酶發(fā)酵短桿菌AJ3445變成根據(jù)布達(dá)佩斯條約的保藏證書，其指定保藏號(hào)為No，BP-5541。首先，于25℃，在CM2G培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化子溫育過夜，所述培養(yǎng)基含有0.7μg/mlTc10g/l酵母提取物，10g/l胰化蛋白胨，5g/l葡萄糖和15g/lNaCl。用0.9％NaCl溶液大致稀釋培養(yǎng)物，以100μl的量涂布于含1.5μg/ml至5μg/mlTc的上述CM2G瓊脂培養(yǎng)基中，將所得培養(yǎng)物保溫于34℃，從形成的菌落中隨機(jī)選擇一些克隆，并在含有25μg/mlKm的CM2G瓊脂培養(yǎng)基中復(fù)制，然后選擇Km-敏感菌株，制備選定的Km-敏感菌株的染色體DNA，用限制性內(nèi)切核酸酶GblII完全消化，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜上印跡，使用經(jīng)32P標(biāo)記的天冬氨酸激酶基因片段(從基因后一半的HindIII位點(diǎn)至EcoRI位點(diǎn)，為440bp)作為探針，對(duì)此濾膜進(jìn)行Southern雜交，檢測(cè)與探針雜交的帶的數(shù)目，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)AJ12036用作宿主時(shí)，10個(gè)分析菌株中的4個(gè)有兩拷貝的轉(zhuǎn)座子Tn7156-C被轉(zhuǎn)座，當(dāng)AJ3445用作宿主時(shí)，22個(gè)分析菌株中的8個(gè)有兩拷貝的轉(zhuǎn)座子Tn7156-C被轉(zhuǎn)座。這證明通過使用四環(huán)素抗性基因作為選擇性藥物抗性基因，可以高頻率將多拷貝有用基因引入染色體。評(píng)價(jià)使用人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座天冬氨酸激酶基因的菌株中所產(chǎn)生的賴氨酸的量評(píng)價(jià)其中轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子的上述菌株中產(chǎn)生的賴氨酸的量。將含有轉(zhuǎn)座子的菌株涂布于含有0.7μg/mlTc的CM2G瓊脂培養(yǎng)基的整個(gè)表面，于34℃溫育過液，將其量為原始量1/6的細(xì)胞接種于20ml賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有100g/l葡萄糖，55g/l硫酸銨，50ml/lMamenon(AjinomotoCO.，Inc.)，1/gl磷酸二氫鉀、1g/l硫酸鎂、2mg/l維生素B1、0.5mg/l生物素、5ml/l煙酸酰胺、2mg/l硫酸鐵和2mg/l硫酸錳(將此培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至7.5，然后以115℃高壓滅菌15分鐘，然后向其中加入50g/l的碳酸鈣)。于30℃將培養(yǎng)物溶液在Sakaguchi三角錐瓶中溫育72小時(shí)，分析培養(yǎng)物溶液中所形成的賴氨酸含量，評(píng)價(jià)含有人工轉(zhuǎn)座子的菌株中所產(chǎn)生的賴氨酸的量，結(jié)果，如表3和表4所示，當(dāng)AJ12036和AJ3445用作親本菌株時(shí)，與無轉(zhuǎn)座子的菌株相比，在Tn7156-C的轉(zhuǎn)座中觀察到所產(chǎn)生賴氨酸的量有所增加，另外，轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座拷貝數(shù)越大(1拷貝和2拷貝)，所產(chǎn)生賴氨酸的量越多。這證明通過使用四環(huán)素抗性基因作為選擇性藥物抗性基因來引入有用基因的拷貝，可增加此菌株中產(chǎn)生的氨基酸的量。表3使用AJ12036作為親本菌株，其中轉(zhuǎn)座了轉(zhuǎn)座因子的菌株中所產(chǎn)生的賴氨酸的量<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="602">菌株Tn7156-C的轉(zhuǎn)座拷貝數(shù)所產(chǎn)生賴氨酸的量(g/l)AJ12306Tn7156-Cint-Y1Tn7156-Cint-Y20120.012.818.8</table></tables>表4使用AJ13445作為親本菌株，其中轉(zhuǎn)座了轉(zhuǎn)座因子的菌株中所產(chǎn)生的賴氨酸的量<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="627">菌株Tn7156-C的轉(zhuǎn)座拷貝數(shù)所產(chǎn)生賴氨酸的量(g/l)AJ13445Tn7156-Cint-06Tn7156-Cint-01901218.721.325.2</table></tables>實(shí)施例5穿梭載體pVK7的構(gòu)建如日本專利公開No.11，280/1989和USP4,788,762中所述，乳酸發(fā)酵短桿菌中存在隱蔽性質(zhì)粒pAM330。此pAM330產(chǎn)生于乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869，它可用作能在短桿菌原中擴(kuò)增的穿梭載體復(fù)制起點(diǎn)。通過將pHSG299(由TakaraShnzo制備)與pAM330結(jié)合可構(gòu)建一個(gè)新的穿梭載體，所述pHXG299是E、coli的多功能載體。用限制性內(nèi)切核酸酶HindIII在一個(gè)位點(diǎn)處切割pAM330，用T4DNA聚合酶使裂解的表面末端鈍化。另外，用限制性內(nèi)切核酸酶AvaII在一個(gè)位點(diǎn)處切割pHSG299，用T4DNA聚合酶使裂解的表面末端鈍化。將所得片段相互連接可得到pAM330與pHSG299相結(jié)合的值粒，pVK7的構(gòu)建圖示于圖18中，pVK7可在大腸桿菌和短桿菌中復(fù)制，并可將卡那霉素抗性傳遞給宿主。此載體具有PstI、SalI、BamHI、KpnI、SalI和EcoRI克隆位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)都允許在一個(gè)位點(diǎn)處裂解，它們都來自pHSG299的多克隆位點(diǎn)。穿梭載體pVC7的構(gòu)建與pVK7類似，將pHSG399(由TakaraShnzo制備)與pAM330聯(lián)合可構(gòu)建一種新的穿梭載體pVC7，所述pHSG399是E.Coli的多功能載體。用限制性內(nèi)切核酸酶HindIII在一個(gè)位點(diǎn)處切割pAM330，用T4DNA聚合酶使裂解的表面末端鈍化，另外用限制性內(nèi)切核酸酶BsaI在一個(gè)位點(diǎn)處切割pHSG399，并用T4DNA聚合酶使之未端鈍化將所得片段互相連接可得到pAM330和pHSG399相聯(lián)合的質(zhì)粒。pVC7的構(gòu)建圖示于圖19中。pVC7在大腸桿菌和短桿菌中都可復(fù)制，并可將卡那霉素抗性傳遞給宿主，此載體具有PstI.SalI.BamHI、KpnI、SacI、EcoRI、SmaI和HindIII克隆位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)都允許在一個(gè)位點(diǎn)處裂解，它們都來自pHSG399的多克隆位點(diǎn)。含有dapA、dapB和lysA的質(zhì)粒的產(chǎn)生(1)lysA的制備及含有l(wèi)ysA質(zhì)粒的構(gòu)建使用乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869的野生型菌株作為染色體DNA的供體，根據(jù)一般方法從ATCC13869菌株中制備染色體DNA，根據(jù)PCR從染色體DNA中擴(kuò)增含有argS、lysA的DNA片段以及含有它們的操縱子的啟動(dòng)子DNA片段。分別使用具序列表中SEQIDNOs13和14所示核苷酸序列的23-聚體合成DNA作為擴(kuò)增所用的DNA引物，以根據(jù)谷氨酸棒狀桿菌(Corynebalterinmglutamicum)的已知序列(見MolecularMicrobiology，4(11)，1819-1830(1990)；MolecularandGeneralGenetics，212，112-119(1988))擴(kuò)增編碼精氨酰-tRNA合酶和DDC的約為3.6kb的區(qū)域。用常規(guī)方法進(jìn)行DNA的合成和PCR，即根據(jù)一般方法，通過使用AppliedBiosystems生產(chǎn)的380B型DNA合成儀并使用亞磷酰胺法(見Tetrahedronletters(1981)，22，1859)以合成DNA。根據(jù)供應(yīng)商指定的方法，使用PJ2000型DNA熱循環(huán)儀(由TakaraShuzo生產(chǎn))以及TaqDNA聚合酶，經(jīng)PCR擴(kuò)增基因。經(jīng)擴(kuò)增的DNA片段的序列示于第15號(hào)序列中。使用pHSG399作為克隆載體以擴(kuò)增3,579bp的基因片段，用限制件酶SmaI消化pHSG399，此載體上連接有含經(jīng)擴(kuò)增的lysA的DNA片段。按上述方法得到的質(zhì)粒被稱為p399LYSA，它具有來源于ATCC13869的lysA。用KpnI和BamHI消化p339LYSA可提取到含有l(wèi)ysA的DNA片段，將此DNA片段連接到已被KpnI和BamHI消化的pHSG299上，所得質(zhì)粒被稱作p299LYSA。p299LYSA的構(gòu)建過程示于圖20中。用限制性內(nèi)切核酸酶KpnI和BamHI裂解p399LYSA以提取lysA片段，將此片段連接到已被KpnI和BamHI裂解的pVK7中，由此產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱作pLYSAm(圖21)。(2)dapA的制備以及含有dapA的質(zhì)粒的構(gòu)建使用乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869的野生型菌株作為染色體DNA供體，根據(jù)一般方法從ATCC13869菌株中制備染色體DNA，根據(jù)PCR從染色體DNA中擴(kuò)增含有dapA的DNA片段。分別合成具有序列表中SEQIDNOs16和17所示核苷酸序列的20-聚體DNA以作為擴(kuò)增所用的DNA引物，從而根據(jù)各氨酸棒狀桿菌的已知序列(見NueleicAcidsResearch，18(21)，6421(1990)；EMBL登記號(hào)為No、X53993)擴(kuò)增編碼DDPS的約為1.5kb的區(qū)域。用常規(guī)方法進(jìn)行DNA合成和PCR，經(jīng)擴(kuò)增的DNA片段的序列示于第18號(hào)序列中。將pCR1000(由Invitrogen生產(chǎn)，見Bio/Technology，9，657-663(1991))用作1.411bp的擴(kuò)增基因片段的克隆載體，所述基因上連接有經(jīng)擴(kuò)增的dapA片段，根據(jù)指定的方法使用DNA連接試劑盒(由TakaraShuzo生產(chǎn))以進(jìn)行DNA的連接，從而構(gòu)建出一質(zhì)粒，其中擴(kuò)增自乳發(fā)酵短桿菌染色體的1，411bp的dapA片段插入到pCR1000上。將接上述方法制得的質(zhì)粒稱為pCRDAPA(圖22)，它具有來源于ATCC13869的dapA。將pCRDAPA導(dǎo)入E.coli菌株中可得到轉(zhuǎn)化子菌株AJ13106，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1995年5月26日將此菌株國際保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵編305.1-3，Higazhi1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibaraki-Ken，Japan)，保藏號(hào)為FERMBP-5113。用KpnI和EcoRI消化含有dapA的質(zhì)粒pCRDAPA，并分離含有dapA的DNA片段，將此片段與已被KpnI和EcoRI消化的pHSG399連接可得到p399DPS(圖23)。(3)野生型和突變體lysC的制備以及含有它們的質(zhì)粒的制備將乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869的菌株，得自ATCC13869菌株并經(jīng)突變處理的可生產(chǎn)L-賴氨酸的突變體菌株AJ3445用作染色體DNA供體，AJ3445菌株已經(jīng)過突變以使lysC變成對(duì)賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同抑制作用基本上脫敏(JournalofBiochemistry、68，701-710(1970))。根據(jù)PCR法(聚合酶鏈反應(yīng)；見WhiteT.J.etal.TrendsGenet.，5.185(1989))，從染色體DNA中擴(kuò)增含有l(wèi)ysC的DNA片段，合成具有SEQIDNOs19和20所示核苷酸序列的23-聚體和21-聚體單鏈DNA以作為擴(kuò)增所用的DNA引物，從而可根據(jù)各氨酸棒狀桿菌的已知序列(見MoleadarMicrobiology(1991)，5(5)，1197-1204；和MolGen.Genet.(1990)224317-324)擴(kuò)增編碼lysC的約為1,643bp的區(qū)域。使用常規(guī)方法進(jìn)行DNA合成和DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增DNA的序列示于序列21號(hào)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)1,643bp的擴(kuò)增基因片段，然后根據(jù)一般方法從凝膠中純化切下的片段，用限制性酶NruI和EcoRI消化此片段。將pHSG399用作基因片段的克隆載體，用限制性酶SmaI和EcoRI消化pHSG399，并將之與擴(kuò)增的lysC片段相連接，根據(jù)指定方法使用DNA連接試劑盒以連接DNA，因而制備了一種質(zhì)粒，其中擴(kuò)增自乳酸發(fā)酵短桿菌的染色體的lysC片段分別與pHSG399連接，將含有ATCC13869(野生型菌株)之lysC的質(zhì)粒稱為p399AKY，含有AJ3445(可生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌)之lysC的質(zhì)粒稱為p399AK9(圖24)。(4)dapB的制備以及含有dapB的質(zhì)粒的構(gòu)建將乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869的野生型菌株用作染色體DNA供體，根據(jù)一般方法從ATCC13869菌株中制備染色體DNA，根據(jù)PCR從染色體DNA中擴(kuò)增含有dapB的DNA片段。合成分別具有序列表中SEQIDNOs22和23所示核苷酸序列的23-聚體DNA以作為擴(kuò)增所用的DNA引物，從而根據(jù)乳酸發(fā)酵短桿菌的已知序列(見JournalofBacteriology，157(9)，2743-2749(1993))擴(kuò)增編碼DDPR的約為2.0kb的區(qū)域。用常規(guī)方法進(jìn)行DNA合成和PCR，經(jīng)擴(kuò)增的DNA序列示于序列24號(hào)中。將pCR-Script(由Invitrogen制備)用作2,001bp擴(kuò)增基因片段的克隆載體，所述基因片段上連接有擴(kuò)增的dapB片段，由此構(gòu)建了一個(gè)質(zhì)粒，其中擴(kuò)增自乳酸發(fā)酵短桿菌染色體的2,001bp的dapB片段插入到pCR-Script上，將按上述方法得到的質(zhì)粒稱作pCRDAPB(圖25)，它具有來源于ATCC13869的dapB。將pCRDAPB導(dǎo)入E.coli菌株可得到轉(zhuǎn)化子菌株AJ13107，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1995年5月26日將此菌株國際保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵編305，103，Higashi1-Chme，Tsukuba-ShiIbaraki-KenJapan)，保藏號(hào)為FERMBP-5114。(5)含有突變體lysC、dapA和dapB聯(lián)合的質(zhì)粒的構(gòu)建用EcoRI和SphI裂解p399DPS以形成鈍端，然后提取dapA基因片段，將此片段與已被SalI消化并鈍端化的p399AK9連接以構(gòu)建其中同時(shí)存在突變體lysC和dapA的質(zhì)粒p399CA。用EcoRI消化含有dapB的質(zhì)粒pCRDAPB并使之鈍端化，然后用SacI消化以提取含有dapB的2.0kbDNA片段。用SpeI消化含有dapA和突變體lysC的質(zhì)粒p399CA并使之鈍端化，然后用SacI消化之并與以上提取出的2.0kb的dapB片段連接以得到含有突變體lysC、dapA和dapB的質(zhì)粒，此質(zhì)粒被稱作p399CAB(圖26)。隨后，用SacII裂解p399CAB，使裂解片段的末端鈍化，再從中提取含有dapA和dapB片段，同時(shí)用BamHI裂解pLYSAm，使裂解片段的末端鈍化，將這些片段相互連接以產(chǎn)生含有dapA、dapB和lysA的質(zhì)粒，此質(zhì)粒在棒狀細(xì)菌中可自我增殖，將此質(zhì)粒稱作pABLm，pABLm的構(gòu)建示于圖21中。將含有dapA、dapB和lysA的質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌Tn7156-Cint-Y2中使用電脈沖洗[日本特許公開專利申請(qǐng)(Kokai)no、207，791/1990，Sugimoto等人]將含有dapA、dapB和lysA的以上產(chǎn)生的質(zhì)粒pABLm導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌Tn7156-Cint-Y2中。通過藥物抗性標(biāo)記，即質(zhì)粒的卡那霉素抗性基因以及染色體中擴(kuò)增的四環(huán)素抗性基因來選擇轉(zhuǎn)化子，因此，轉(zhuǎn)化子的選擇在含有25μg/ml卡那霉素和1.5-μg/ml四環(huán)素的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行，將此轉(zhuǎn)化子稱為Tn7156-Cint-Y2/PABLm。將含有l(wèi)ysC、dapA、dapB和lysA的質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌野生型菌株中將具有可使質(zhì)粒在棒狀桿菌屬所屬細(xì)菌中自主復(fù)制之能力的DNA片段(下文稱為″Brevi.-ori″)導(dǎo)入p399CAB中。從含有Brevi.-Ori的質(zhì)粒載體pHK4中制備Brevi-Ori，所述質(zhì)粒在大腸桿菌細(xì)胞和棒狀桿菌屬所屬細(xì)菌細(xì)胞中都可以自主復(fù)制。用限制性酶BamHI消化pHK4，使裂解片段的末端鈍化，根據(jù)指定的方法使用DNA鈍端化試劑盒以進(jìn)行鈍端的形成。鈍端形成之后，在其上連接一個(gè)磷酸化的KpnI接頭(由TakaraShnzo生產(chǎn))以引進(jìn)修飾，以使僅用KpnI消化即可從pHK4中切割下相應(yīng)于Brevi、-Ori部分的DNA片段。用KpnI消化此質(zhì)粒，將產(chǎn)生的Brevi、-OriDNA片段與已被KpnI消化的p399CAB連接以制備含有l(wèi)ysC、dapA和dapB基因并可在棒狀桿菌屬所屬細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒。此質(zhì)粒被稱作pCAB，構(gòu)建pCAB的流程示于圖26中。用KpnI和BamHI消化pHC4、提取Brevi.-Ori片段，將之與已被KpnI和BamHI消化的pHSG298相連接，即可構(gòu)建出pHK4(見日本專利特許公開No.5-7491)。pHK4可將卡那霉素抗性賦予宿主，將含有pHK4的E.coli稱作E.coliAJ13136，1995年8月1日將之通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵編305，1-3，Higashi1-Chome，Tsukuba-ShiIbaraki-KenJapan)，保藏號(hào)為FERMBP-5186。(2)用Kpni和BamHI消化含有l(wèi)ysA的質(zhì)粒p299LYSA并使其末端鈍化，再提取lysA基因片段，將此片段與已被HpaI消化的PCAB連接以構(gòu)建含有突變體lysC、dapA、dapB和lysA的聯(lián)合并可在棒狀細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒。將構(gòu)建出的質(zhì)粒稱作pCABL，pCABL的構(gòu)建過程示于圖27中。已注意到pCABL中含有dapB基因的DNA片段的HpaI位點(diǎn)插入了lysA基因片段，然而，HpaI位點(diǎn)位于dapB基因啟動(dòng)子的上游(SEQIDNO24中的核苷酸數(shù)611至616處)，dapB基因不能脫偶聯(lián)。將以上產(chǎn)生的含有l(wèi)ysC、dapA、dapB和lysA的質(zhì)粒pCABL導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌野生型菌株AJ12036中，在含有5μg/ml氯霉素的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的選擇，將此轉(zhuǎn)化子稱為AJ12036/PCABL。對(duì)以上構(gòu)建的菌株培養(yǎng)作評(píng)價(jià)在L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌野生型菌株AJ12036的轉(zhuǎn)化子AJ12036/pCABL和Tn7156-Cint-Y2/pABLm，評(píng)價(jià)其中產(chǎn)生的L-賴氨酸的量。L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基組成如下所示。L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基溶解除碳酸鈣以外的下列成分(每升中的量)，用KOH將溶液的ph調(diào)至8.0，將所得溶液在115℃滅菌15分鐘，加入50g已單獨(dú)干熱滅菌過的碳酸鈣。葡萄糖100g(NH4)2SO455gKH2PO41gMgSO4·7H2O1g生物素500μg維生素B12000μgFeSO4·7H2O0.01gMnSO4·7H2O0.01g煙酰胺5mg蛋白水解物(Mamenon)30ml碳酸鈣50g將親本菌株和轉(zhuǎn)化子接種于具有上述組成的培養(yǎng)基中，在31.5℃往復(fù)振蕩培養(yǎng)。表5中顯示了培養(yǎng)72小時(shí)后產(chǎn)生的L-賴氨酸的量，培養(yǎng)完成時(shí)的生長(zhǎng)量(OD562)和穩(wěn)定性。通過將溶液稀釋101倍并測(cè)量OD562即可評(píng)價(jià)生長(zhǎng)量，另外，對(duì)穩(wěn)定性而言，稀釋后在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述培養(yǎng)完成時(shí)的培養(yǎng)物溶液，將形成的菌落涂布于含有藥物的平板中，穩(wěn)定性表現(xiàn)為在藥物平板上形成之菌落的生長(zhǎng)率表5如表5所示，當(dāng)使用其中質(zhì)粒上增加了lysC的菌株時(shí)以及當(dāng)使用其中染色體上增加了lysC的菌株時(shí)，所產(chǎn)生的賴氨酸的量有所增加。另外，AJ12036/PCABL的穩(wěn)定性為90％，而Tn7156-Cint-Y2/pABLm的穩(wěn)定性為100％。實(shí)施例6構(gòu)建質(zhì)粒pHTN7150由于以上構(gòu)建出的攜有卡那霉素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子Tn7145上不具有適于二氫2，6-吡啶二羧酸合酶基因插入的位點(diǎn)，故可按下述方法構(gòu)建其中引入了新的插入位點(diǎn)的新質(zhì)粒pHTN7150。用限制性酶PstI從質(zhì)粒載體Puc4K(由PharmaciaBiotech制備)上切下卡那霉素抗性基因并使之末端鈍化。將含有卡那霉素抗性基因的片段插入pHY300PLK(由TakaraShuzo制備)的SmaI位點(diǎn)以構(gòu)建pHY300-KM，再用限制性酶EcoRI和XbaI消化pHY300-KM以切下含有卡那霉素抗性基因的片段，使此片段的末端鈍化并插入位于質(zhì)粒pHIS714上的IS714的鈍端化NheI位點(diǎn)以構(gòu)建質(zhì)粒pHTN7150。pHTN7150上的人工轉(zhuǎn)座子Tn7150具有卡那霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，基BglII位點(diǎn)可用作基因克隆位點(diǎn)。聯(lián)合pHTN7150和乳酸發(fā)酵短桿菌的dapA基因按下述方法將編碼二氫2，6-吡啶二羧酸合酶的基因(賴氨酸生物合成酶基因)插入含有卡那霉素抗性基因的人工轉(zhuǎn)座子pHTN7150中。用EcoRI裂解含有dapA的質(zhì)粒p399DPS后，通過用T4DNA聚合酶處理使所得片段的末端鈍化，將磷酸化的BamHI接頭(由TakaraShnzo制備)與之結(jié)合以修飾片段，致使僅用BamHI即可切下dapA基因。此質(zhì)粒被稱作p399DPSZ，將經(jīng)用BamHI裂解此質(zhì)粒形成的1.4kb的dapA片段與用BglII裂解的pHTN7150聯(lián)合，BglII可給出與BamHI相同的粘性末端。由此構(gòu)建的質(zhì)粒被稱為pHTN7150A，pHTN7150A的構(gòu)建示于圖28中。人工轉(zhuǎn)座子TN7150A轉(zhuǎn)座到乳酸發(fā)酵短桿菌的染色體中按下述方法，使用pHTN7150A可得到經(jīng)過將含有dapA的人工轉(zhuǎn)座子Tn7150A轉(zhuǎn)座到乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036菌株中所形成的菌株。用pHTN7150A轉(zhuǎn)化AJ12036菌株，于25℃，在含有25μg/ml卡那霉素、10g/l酵母提取物、10g/l胰胨、5g/l蔗糖和15g/lNall的CM2S液體培養(yǎng)基中將所得轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)過夜，用0.9％NaCl溶液大致稀釋培養(yǎng)物，將稀釋物涂布于含有25μg/mlCm的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基上，于34℃下培養(yǎng)。從形成的菌落中選擇氯霉素敏感菌株，隨機(jī)選擇這些菌株中的一些。從中制備染色體DNA，使用dapA片段作為探針進(jìn)行Southern雜交以鑒定人工轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座，將以上得到的其中轉(zhuǎn)座了人工轉(zhuǎn)座子的菌株稱為AJ2036A。PCBLmc的構(gòu)建以及菌株的產(chǎn)生按下述方法，使用pAM330和pHSG399的穿梭載體pVC7構(gòu)建含有變體lysC、capB和lysA的質(zhì)粒。用SacI處理含有dapB的pCRDAPB之后，通過用T4DNA聚合酶處理使所得片段的末端鈍化，從而構(gòu)建了與磷酸化的PstI接頭(由TakaraShnzo制備)聯(lián)合的質(zhì)粒，由此得到的質(zhì)粒被稱作PCRDAPB2。用BamHI和PstI裂解該質(zhì)粒，將所得dapB片段(2.0Kb)插入已被BamHI和PstI裂解的PVC7中，此質(zhì)粒被稱為PBmc。用BamHI和EcoRI裂解含有l(wèi)ysC的PAK9，將所得1.6kb的lysC片段與也經(jīng)BamHI和EcoRI裂解的pBmc連接以構(gòu)建含有dapB和lysC的質(zhì)粒，此質(zhì)粒被稱為pBCmc。用EcoRI裂解含有l(wèi)ysA的p399LYSA之后，通過用T4DNA聚合酶處理使所得片段的末端鈍化，將之與磷酸化的KpnI接頭結(jié)合以修飾之，從而可用KpnI裂解lysA。此質(zhì)粒被稱為p399LYSAZ，用KpnI裂解p399LYSA2，將所得的3.6kblysA片段與已被EcoRI消化的pBCmc連接，通過用T4DNA聚合酶處理使其末端鈍化，并與磷酸化的KpnI接頭結(jié)合。由此得到的質(zhì)粒被稱作pCBLmc。此質(zhì)粒在大腸桿菌和棒狀細(xì)菌中可自我復(fù)制，并可將氯霉素抗性傳遞給宿主，它含有突變體lysC、dapB和lysA。PCBLmc的構(gòu)建示于圖29中。使用電脈沖法[Sugimoto等人的日本特許公開專利申請(qǐng)(Kokai)No，207，791/1990]將上文構(gòu)建的pCBLm導(dǎo)入AJ12036A菌株，此菌株中的染色體上已轉(zhuǎn)座了人工轉(zhuǎn)座子Tn7150A。在含有5μg/ml氯霉素和25μg/ml卡那霉素的上述CM2S培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的選擇。將如此構(gòu)建的菌株稱為AJ12036∷A/pCBLmc。評(píng)價(jià)構(gòu)建菌株的培養(yǎng)在L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本菌株和轉(zhuǎn)化子AJ12036/pCABL和AJ12036∷A/pCBLmc，評(píng)價(jià)所產(chǎn)生的賴氨酸的量，結(jié)果示于表6中。表6如表6中可明顯看出，在其染色體上增加了dapA的菌株中以及其質(zhì)粒上增加了lysC的菌株中，所產(chǎn)生的賴氨酸量有所增加。另外，AJ12036/PCABL的穩(wěn)定性為90％，而AJ12036∷A/pCBLm的穩(wěn)定性為100％。實(shí)施例7轉(zhuǎn)座子單元中不含轉(zhuǎn)座酶的人工轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建使用E.coliTrc啟動(dòng)子或類似物構(gòu)建轉(zhuǎn)座酶表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切核酸酶NheI和XbaI裂解質(zhì)粒pHIS714，得到含有編碼轉(zhuǎn)座酶之基因的片段，其中缺失了IS714的5′端反向重復(fù)(IR)序列。將此DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒載體PNC19的XbaI位點(diǎn)以構(gòu)建質(zhì)粒TnPL/pUC19。另外，用限制性內(nèi)切核酸酶MroI和XbaI裂解TnpL/pUC19以缺失包括IS714終止密碼子和3′端反向重復(fù)(IR)的序列，通過連接將具有下列序列的合成雙鏈DNA插入以上裂解的部分。5′-CCGGACAGCTCACCCACAAAATCAATGCACTCTAAAAAGGTACCT-3′3′-TGTCGAGTGGGTGTTTTAGTTACGTGAGATTTTCCATGGAGATC-5′(序列25和26)用此方法構(gòu)建了質(zhì)粒ORFL/pUC19，其中TnPL/pUC19轉(zhuǎn)座酶3′端存在的IR已經(jīng)缺失。隨后，用限制性內(nèi)切核酸酶SmaI和XbaI裂解此ORFL/pUC19以得到含有轉(zhuǎn)座酶的約為1.5kb的基因片段，將此轉(zhuǎn)座酶基因片段插入質(zhì)粒載體pHY300PLK(由TakaraShnzo制備)的部分中，該部分是通過除去質(zhì)粒中SmaI和XbaI位點(diǎn)之間的序列，再用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和KpnI切割而得到的。用T4DNA聚合酶使此EcoRI-KpnI轉(zhuǎn)座酶基因片段的末端印化，同時(shí)，用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII部分消化質(zhì)粒載體pHSG398(由TakaraShuzo制備)以缺失含有多克隆位點(diǎn)的約為0.3kb的片段。將以上得到的轉(zhuǎn)座酶基因片段插入質(zhì)粒載體pHSG398的已消化部分以構(gòu)建圖10所示的質(zhì)粒pORF1。另一方面，使較容易得到的、質(zhì)粒pHIS714的NheI-XbaI裂解片段的末端鈍化，并導(dǎo)入質(zhì)粒載體pUC19的末端鈍化的PstI位點(diǎn)以構(gòu)建質(zhì)粒Tnp(Pst)/pUC19。使用U.S.E.誘變?cè)噭┖?內(nèi)PharmaciaBiotech制備)對(duì)此Tnp(Pst)/Puc19的轉(zhuǎn)座酶基因進(jìn)行部分堿基取代。被取代的堿基是LS714序列中第288位堿基G，用C取代此堿基G，這是由GTG變?yōu)镚TC的變化，而不是氨基酸水平上的變化，將此堿基被取代的質(zhì)粒稱為Tnp(Pst)M/puc19。從pORF1中缺失轉(zhuǎn)座酶前一半基因中存在的限制性內(nèi)切核酸酶SmaI和NaeI位點(diǎn)之間的序列，通過連接將經(jīng)用限制性由切核酸酶SmaI和NaeI裂解Tnp(Pst)M/puc19所得的轉(zhuǎn)座酶前一半基因片段(包括GTG→GTC的變化)插入以上經(jīng)缺失的部分以構(gòu)建PORF2。從pORF2中缺失SmaI和XbaI位點(diǎn)之間的序列，使所得片段的末端鈍化，通過用限制性內(nèi)切核酸酶NaeI和HindIII裂解pBSF2-SD7，再使其末端鈍化可得到含有色氨酸操縱子衰減子的DNA片段。將前一片段與后一片段相連接，由此構(gòu)建的質(zhì)粒被稱為pORF3。1989年6月1日將用質(zhì)粒pBSF2-SD7轉(zhuǎn)化的E.coliHB101(AJ12448)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3、Higashi1ChomeTsukuba-ShiIbaraki-Ken305、Japan)，保藏號(hào)為No.FERMP-10758，1992年2月19日將此菌株變成根據(jù)布達(dá)佩斯條約的保藏證書，指定保藏號(hào)為No，BP-3753。用限制性由切核酸酶SalI和Bpu1102I裂解pORF3以缺失轉(zhuǎn)座酶前半個(gè)基因片段。通過連接將經(jīng)用限制性內(nèi)切核酸酶SalI和Blu1102I裂解Tnp(Pst)/pUC19所得的轉(zhuǎn)座酶前半個(gè)基因片段插入以上已缺失的部分以構(gòu)建如圖11所示的pOFR4。用SacI裂解TnPL/pUC19，再于30℃中，用BAL31核酸酶消化20分鐘以從轉(zhuǎn)座酶基因起始密碼子上游附近缺失序列，當(dāng)經(jīng)過缺失的末端鈍化之后，使用SphI位點(diǎn)切下轉(zhuǎn)座酶基因片段，并插入已被SmaI和SphI裂解的pHSG398位點(diǎn)，將由此構(gòu)建的質(zhì)粒稱為delTnp5/398。用限制性由切核酸酶KnpI和HindIII裂解此delTnp5/398，使所得的轉(zhuǎn)座酶前半個(gè)基因片段的末端鈍化，然后用NcoI和HindIII裂解質(zhì)粒載體PKK233-2(由PharmaciaBiotech制備)，并使其末端鈍化，通過連接反應(yīng)將前一片段與后一片段相連接以構(gòu)建pTrc-ORF。用SspI和Bpu1102I裂解PTrc-ORF以形成含有Trc啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)座酶前一半基因的片段，用XbaI裂解pORF3，末端鈍化，再用Bpu1102I進(jìn)一步裂解以缺失轉(zhuǎn)座酶的前一半基因片段，將以上形成的片段插入此pORF3的已缺失部分以構(gòu)建如圖12所示的pORF7。將經(jīng)用限制性由切核酸酶KpnI和HindIII裂解delTnp5/398所得的轉(zhuǎn)座酶的前一半基因片段克隆到質(zhì)粒載體pUC18的KpnI和HindIII位點(diǎn)之間，此質(zhì)粒的BsmI和NaeI位點(diǎn)之間的部分已缺失，將此片段與經(jīng)用限制性內(nèi)切核酸酶BsmI和NacI裂解Tnp(Pst)M/pUC19所得的轉(zhuǎn)座酶前半個(gè)基因片段(G→C取代型)相連接以構(gòu)建delTnp5M/18。用KpnI和HindIII裂解此delTnp5M/18，使所得的轉(zhuǎn)座酶前一半基因片段的末端鈍化。用NooI和HindIII裂解pKK233-2，使所得片段的末端鈍化。將這些片段相互連接以構(gòu)建pTrc-TnpM。使用由pTrc-Tnp構(gòu)建pORF7的方法(圖13)由pTrc-TnPM構(gòu)建pORF8。構(gòu)建質(zhì)粒以導(dǎo)入含有人工轉(zhuǎn)座子單元以及此單元外部的轉(zhuǎn)座酶表達(dá)系統(tǒng)的棒狀細(xì)菌中使用上述質(zhì)粒pORF3、pORF4、pORF7和pORF8構(gòu)建質(zhì)粒，以下描述的是由pORF3構(gòu)建pORF41。首先用NheI和SacII裂解pHIS714以缺失轉(zhuǎn)座酶基因的主要部分，將具有下列序列的雙鏈合成DNA插入以上已缺失的部分以構(gòu)建pHTN7160。5′-CTAGCTCGAGATATCAGATCTACTAGTCGACCGC-3′(序列27)3′-AGCTCTATAGTCTAATGATCAGCTGG-5′(序列28)用限制性內(nèi)切核酸酶KpnI裂解pHTN7160，使之末端鈍化，再用BglI裂解以得到含有IS714兩條側(cè)鏈上的反向重復(fù)(IR)序列以及在棒狀細(xì)菌中起作用的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的片段。用限制性內(nèi)切核酸酶EarI裂解pORF3，使之末端鈍化，再用BglI裂解，將上述pHTN7160的片段插入其中以構(gòu)建pURF41-Pre。然后，用EcoRV裂解pORF41-pre，將含有pBR322的Tc抗性基因并且已末端鈍化的EcoRI-AvaI片段插入經(jīng)EcoRV裂解的片段以構(gòu)建圖14所示的pORF41。重復(fù)上述方法以分別通過pORF31-Pre由pORF4構(gòu)建pORF31，通過pORF71-Pre由pORF7構(gòu)建pORF71，通過pORF81-Pre由pORF8構(gòu)建pORF81。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1996年6月3日將含有質(zhì)粒pORF81的E.coliAJ13208保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，Higashi1ChomeTsukuba-ShiIbaraki-Ken305，Japan)，其指定保藏號(hào)為No.BP-5557。用XbaI和EarI裂解pORF3，使之末端鈍化，并自身連接以構(gòu)建不含轉(zhuǎn)座酶基因的pORFCO(圖15)。使用與由pORF3構(gòu)建pURF41相同的方法通過pORFC2-Pre由pORFCO構(gòu)建僅含有一個(gè)轉(zhuǎn)座子單元(不含轉(zhuǎn)座酶基因)的pORFC2。假如pURFC2不具有轉(zhuǎn)座酶的結(jié)構(gòu)基因，則這些最終構(gòu)建出的質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)座酶的結(jié)構(gòu)基因、Cm抗性基因，在E.coli中起作用的復(fù)制起點(diǎn)，在棒狀細(xì)菌中起作用的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)，以及IS714的IR之間所包含的Tc抗性基因。將含有IS714兩個(gè)末端上的IR并含有Tc抗性基因的單元稱為轉(zhuǎn)座子單元Tn7162。評(píng)價(jià)染色體上內(nèi)轉(zhuǎn)座子單元轉(zhuǎn)座而形成的具有Tc抗性基因的轉(zhuǎn)座子單元的拷貝數(shù)使用以上構(gòu)建的質(zhì)粒pORF31、pORF41、pORF81和pORFC2進(jìn)行轉(zhuǎn)座試驗(yàn)，認(rèn)為可被轉(zhuǎn)座的單元是轉(zhuǎn)座單元Tn7162。用上述每個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌AJ12036，評(píng)價(jià)內(nèi)轉(zhuǎn)座子單元Tn7162轉(zhuǎn)座到宿主染色體中而形成的宿主染色體中的轉(zhuǎn)座子單元Tn7162的拷貝數(shù)。即于25℃，在含有5μg/mlCm的上述CM2G液體培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)過夜，用0.9％NaCl溶液大致稀釋，將稀釋物以100μl的量涂布于含有1.5μg/ml至4μg/mlTc的上述CM2G瓊脂培養(yǎng)基中，于34℃培養(yǎng)，從形成的菌落中挑選Cm敏感克隆，于34℃培養(yǎng)，從形成的菌落中隨機(jī)選擇一些克隆，從中制備染色體DNA，用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII完全消化，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電際，印跡于硝酸纖維素(或尼龍或PVDF)濾膜上，使用經(jīng)32-P或ECL直接標(biāo)記系統(tǒng)(由Amersham制備)標(biāo)記的Tc抗性基因片段作為探針，對(duì)此濾膜進(jìn)行Southern雜交，檢測(cè)與此探針雜交的帶的數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如表7所示，具有Tc抗性標(biāo)記基因的多拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)座子單元m7162以某些頻率被轉(zhuǎn)座。這表明表達(dá)型的轉(zhuǎn)座酶基因可以在質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子單元之外起作用(pORF31、41和81)，也可以在染色體本身存在的轉(zhuǎn)座酶內(nèi)起作用(pORFC2)。表7</tables>實(shí)施例8構(gòu)建僅含有轉(zhuǎn)座酶表達(dá)系統(tǒng)的棒狀細(xì)菌的質(zhì)粒以及將轉(zhuǎn)座子單元轉(zhuǎn)座到染色體上構(gòu)建僅含有轉(zhuǎn)座酶表達(dá)系統(tǒng)的棒狀細(xì)菌的質(zhì)粒用EcoO109I和MroI裂解質(zhì)粒pHIS714K1以缺失IS714，然后使之自身連接以構(gòu)建pHIS714Kdel。同時(shí)，用限制性由切核酸酶EarI裂解pORE3，使之末端鈍化，再用BglI裂解，用限制性由切核酸酶KpnI裂解pHIS714Kdel，使之末端鈍化，再用BglI裂解以形成含有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)并在棒狀細(xì)菌中起作用的片段。將如此形成的片段互相連接以構(gòu)建如圖17所示的pORF40。重復(fù)此方法以分別由pORF4構(gòu)建pORF30、由pORF7構(gòu)建pORF70、由pORF8構(gòu)建pORF80以及由pORFCO構(gòu)建pORFC1。評(píng)價(jià)染色體中內(nèi)轉(zhuǎn)座子單元轉(zhuǎn)座而形成的具有Tc抗性基因的轉(zhuǎn)座子單元的拷貝數(shù)使用以上構(gòu)建的質(zhì)粒pORF80和pORFC1進(jìn)行轉(zhuǎn)座試驗(yàn)，認(rèn)為可被轉(zhuǎn)座的單元是轉(zhuǎn)座子單元Tn7162。在實(shí)施例7中闡明用含有轉(zhuǎn)座子單元Tn7162的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12036，多拷貝數(shù)的Tn7162被轉(zhuǎn)座到宿主染色體中。通過對(duì)染色體DNA進(jìn)行Southern雜交分析來檢測(cè)當(dāng)以上構(gòu)建的質(zhì)粒pORF80和pORFC1被進(jìn)一步導(dǎo)入作為宿主的有一拷貝染色體轉(zhuǎn)座的菌株以增加轉(zhuǎn)座酶活性時(shí)，染色體中的Tn7162是否會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)座或復(fù)制，然后評(píng)價(jià)拷貝數(shù)。即在25℃下，于含有5μg/mlCm的上述CM2G液體培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)過夜，用0.9％Nacl溶液大致稀釋，以100μl的量將稀釋物涂布于含有6μg/ml至20μg/mlT的上述DM2G瓊脂培養(yǎng)基上，于34℃培養(yǎng)，從所形成的菌落中挑選Cm-敏感克隆。從這些Cm-敏感克隆中隨機(jī)選擇一些克隆，從中制備染色體DNA，用限制性內(nèi)切核酸酶PvuII完全消化，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，印跡于硝酸纖維素(或尼龍或PVDF)濾膜上，使用經(jīng)32-P或ECL直接標(biāo)記系統(tǒng)(由Amersham制備)標(biāo)記的Tc抗性基因片段作為探針，對(duì)濾膜進(jìn)行Southern雜交，檢測(cè)與此探針雜交的帶的數(shù)目。結(jié)果、多拷貝數(shù)的具有Tc抗性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)座子單元Tn7162以某些頻率被轉(zhuǎn)座和復(fù)制。序列表(1)SEQIDNO1的資料1(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1453個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(vi)來源(A)生物乳酸發(fā)酵短桿菌(B)菌株AJ12036(ix)特征描述(A)名稱/關(guān)鍵詞(B)定位130..1440(ix)特征描述(A)名稱/關(guān)鍵詞.重復(fù)區(qū)域(B)定位1..15(ix)特征描述(A)名稱/關(guān)鍵詞.重復(fù)區(qū)域(B)定位1439..1453(ix)特征描述(A)名稱/關(guān)鍵詞-35信號(hào)(B)定位71..76(ix)特征描述(A)名稱/關(guān)鍵詞-10信號(hào)(B)定位92..97(xi)序列描述SEQIDNO1GGCCCTTCCGGTTTTGGGGTACATCACAGAACCTGGGCTAGCGGTGTAGACCCGAAAATA60AACGAGCCTTTTGTCAGGGTTAAGGTTTAGGTATCTAAGCTAACCAAACACCAACAAAAAG120GCTCTACCCATGAAGTCTACCGGCAACATCATCGCTGACACCATCTGC168MetLysSerThrGlyAsnIleIleAlaAspThrIleCys1510CGCACTGCGGAACTAGGACTCACCATCACCGGCGCTTCCGATGCAGGT216ArgThrAlaGluLeuGlyLeuThrIleThrGlyAlaSerAspAlaGly152025GATTACACCCTGATCGAAGCAGACGCACTCGACTATACCTCCACCTGC264AspTyrThrLeuIleGluAlaAspAlaLeuAspTyrThrSerThrCys30354045CCAGAATGCTTCCAACCTGGGGTGTTTCGTCATCACACCCACCGGATG312ProGluCysPheGlnProGlyValPheArgHisHisThrHisArgMet505560CTCATTGATTTACCCATCGTCGGGTTTCCCACCAAACTGTTTATCCGT360LeuIleAspLeuProIleValGlyPheProThrLysLeuPheIleArg657075CTACCTCGCTACCGCTGCACCAACCCGACATGTAAGCAAAAGTATTTC408LeuProArgTyrArgCysThrAsnProThrCysLysGlnLysTyrPhe808590CAAGCAGAACTAAGCTGCGCTGACCACGGTAAAAAGGTCACCCACCGG456GlnAlaGluLeuSerCysAlaAspHisGlyLysLysValThrHisArg95100105GTCACCCGCTGGATTTTGCAACGCCTTGCTATTGACCGGATGAGTGTT504ValThrArgTrpIleLeuGlnArgLeuAlaIleAspArgMetSerVal110115120125CACGCAACTGCGAAAGCACTTGGGCTAGGGTGGGATTTAACCTGCCAA552HisAlaThrAlaLysAlaLeuGlyLeuGlyTrpAspLeuThrCysGln130135140CTAGCCCTCGATATGTGCCGTGAGCTGGTCTATAACGATCCTCACCAT600LeuAlaLeuAspMetCysArgGluLeuValTyrAsnAspProHisHis145150155CTTGATGGAGTGTATGTCATTGGGGTGGATGAGCATAAGTGGTCACAT648LeuAspGlyValTyrValIleGlyValAspGluHisLysTrpSerHis160165170AATAGGGCTAAGCATGGTGATGGGTTTGTCACCGTGATTGTCGATATG696AsnArgAlaLysHisGlyAspGlyPheValThrValIleValAspMet175180185ACCGGGCATCGGTATGACTCACGGTGTCCTGCCCGGTTATTAGATGTC744ThrGlyHisArgTyrAspSerArgCysProAlaArgLeuLeuAspVal190195200205GTCCCAGGTCGTAGTGCTGATGCTTTACGGTCCTGGCTTGGCTCCCGC792ValProGlyArgSerAlaAspAlaLeuArgSerTrpLeuGlySerArg210215220GGTGAACAGTTCCGCAATCAGATACGGATCGTGTCCATGGATGGATTC840GlyGluGlnPheArgAsnGlnIleArgIleValSerMetAspGlyPhe225230235CAAGGCTACGCCACAGCAAGTAAAGAACTCATTCCTTCTGCTCGTCGC888GlnGlyTyrAlaThrAlaSerLysGluLeuIleProSerAlaArgArg240245250GTGATGGATCCATTCCATGTTGTGCGGCTTGCTGGTGACAAGCTCACC936ValMetAspProPheHisValValArgLeuAlaGlyAspLysLeuThr255260265GCCTGCCGGCAACGCCTCCAGCGGGAGAAATACCAGCGTCGTGGTTTA984AlaCysArgGlnArgLeuGlnArgGluLysTyrGlnArgArgGlyLeu270275280285AGCCAGGATCCGTTGTATAAAAACCGGAAGACCTTGTTGACCACGCAC1032SerGlnAspProLeuTyrLysAsnArgLysThrLeuLeuThrThrHis290295300AAGTGGTTGAGTCCTCGTCAGCAAGAAAGCTTGGAGCAGTTGTGGGCG1080LysTrpLeuSerProArgGlnGlnGluSerLeuGluGlnLeuTrpAla305310315TATGACAAAGACTACGGGGTGTTAAAGCTTGCGTGGCTTGCGTATCAG1128TyrAspLysAspTyrGlyValLeuLysLeuAlaTrpLeuAlaTyrGln320325330GCGATTATTGATTGTTATCAGATGGGTAATAAGCGTGAAGCGAAGAAG1176AlaIleIleAspCysTyrGlnMetGlyAsnLysArgGluAlaLysLys335340345AAAATGCGGACCATTATTGATCAGCTTCGGGTGTTGAAGGGGCCGAAT1224LysMetArgThrIleIleAspGlnLeuArgValLeuLysGlyProAsn350355360365AAGGAACTCGCGCAGTTGGGTCGTAGTTTGTTTAAACGACTTGGTGAT1272LysGluLeuAlaGlnLeuGlyArgSerLeuPheLysArgLeuGlyAsp370375380GTGTTGGCGTATTTCGACGTAGGAGTCTCCAACGGACCAGTCGAAGCC1320ValLeuAlaTyrPheAspValGlyValSerAsnGlyProValGluAla385390395ATCAATGGACGCCTAGAACACCTCCGCGGAATCGCGCTTGGATTCCGC1368IleAsnGlyArgLeuGluHisLeuArgGlyIleAlaLeuGlyPheArg400405410AACCTCACCCACTACATCCTTCGATGCCTCATCCACTCCGGACAGCTC1416AsnLeuThrHisTyrIleLeuArgCysLeuIleHisSerGlyGlnLeu415420425ACCCACAAAAATCAATGCACTCTAAAAACGGAAGAGCC1453ThrHisLysIleAsnAlaLeu*430435(2)INFORMATIONFORSEQIDNO2(i)SEQUENCECHARRACTERISTICS(A)LENGTH437aminoacids(B)TYPEaminoacid(D)TOPOLOGYlinear(2)SEQIDNO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度437個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO2MetLysSerThrGlyAsnIleIleAlaAspThrIleCysArgThrAla151015GluLeuGlyLeuThrIleThrGlyAlaSerAspAlaGlyAspTyrThr202530LeuIleGluAlaAspAlaLeuAspTyrThrSerThrCysProGluCys354045PheGlnProGlyValPheArgHisHisThrHisArgMetLeuIleAsp505560LeuProIleValGlyPheProThrLysLeuPheIleArgLeuProArg65707580TyrArgCysThrAsnProThrCysLysGlnLysTyrPheGlnAlaGlu859095LeuSerCysAlaAspHisGlyLysLysValThrHisArgValThrArg100105110TrpIleLeuGlnArgLeuAlaIleAspArgMetSerValHisAlaThr115120125AlaLysAlaLeuGlyLeuGlyTrpAspLeuThrCysGlnLeuAlaLeu130135140AspMetCysArgGluLeuValTyrAsnAspProHisHisLeuAspGly145150155160ValTyrValIleGlyValAspGluHisLysTrpSerHisAsnArgAla165170175LysHisGlyAspGlyPheValThrValIleValAspMetThrGlyHis180185190ArgTyrAspSerArgCysProAlaArgLeuLeuAspValValProGly195200205ArgSerAlaAspAlaLeuArgSerTrpLeuGlySerArgGlyGluGln2l0215220PheArgAsnGlnIleArgIleValSerMetAspGlyPheGlnGlyTyr225230235240AlaThrAlaSerLysGluLeuIleProSerAlaArgArgValMetAsp245250255ProPheHisValValArgLeuAlaGlyAspLysLeuThrAlaCysArg260265270GlnArgLeuGlnArgGluLysTyrGlnArgArgGlyLeuSerGlnAsp275280285ProLeuTyrLysAsnArgLysThrLeuLeuThrThrHisLysTrpLeu290295300SerProArgGlnGlnGluSerLeuGluGlnLeuTrpAlaTyrAspLys305310315320AspTyrGlyValLeuLysLeuAlaTrpLeuAlaTyrGlnAlaIleIle325330335AspCysTyrGlnMetGlyAsnLysArgGluAlaLysLysLysMetArg340345350ThrIleIleAspGlnLeuArgValLeuLysGlyProAsnLysGluLeu355360365AlaGlnLeuGlyArgSerLeu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GGCATCGACGCACCAACCGTGCTT3078ValGlyLysMetAlaAlaGluLeuGlyIleAspAlaProThrValLeu285290295GTTGAGCCCGGCCGCGCTATCGCAGGCCCCTCCACCGTGACCATCTAC3126ValGluProGlyArgAlaIleAlaGlyProSerThrValThrIleTyr300305310GAAGTCGGCACCACCAAAGACGTCCACGTAGACGACGACAAAACCCGC3174GluValGlyThrThrLysAspValHisValAspAspAspLysThrArg315320325CGTTACATCGCCGTGGACGGAGGCATGTCCGACAACATCCGCCCAGCA3222ArgTyrIleAlaValAspGlyGlyMetSerAspAsnIleArgProAla330335340345CTCTACGGCTCCGAATACGACGCCCGCGTAGTATCCCGCTTCGCCGAA3270LeuTyrGlySerGluTyrAspAlaArgValValSerArgPheAlaGlu350355360GGAGACCCAGTAAGCACCCGCATCGTGGGCTCCCACTGCGAATCCGGC3318GlyAspProValSerThrArgIleValGlySerHisCysGluSerGly365370375GATATCCTGATCAACGATGAAATCTACCCATCTGACATCACCAGCGGC3366AspIleLeuIleAsnAspGluIleTyrProSerAspIleThrSerGly380385390GACTTCCTTGCACTCGCAGCCACCGGCGCATACTGCTACGCCATGAGC3414AspPheLeuAlaLeuAlaAlaThrGlyAlaTyrCysTyrAlaMetSer395400405TCCCGCTACAACGCCTTCACACGGCCCGCCGTCGTGTCCGTCCGCGCT3462SerArgTyrAsnAlaPheThrArgProAlaValValSerValArgAla410415420425GGCAGCTCCCGCCTCATGCTGCGCCGCGAAACGCTCGACGACATCCTC3510GlySerSerArgLeuMetLeuArgArgGluThrLeuAspAspIleLeu430435440TCACTAGAGGCATAACGCTTTTCGACGCCTGACCCCGCCCTTCACCTTCGCC3562SerLeuGluAla445GTGGAGGGCGGTTTTGG3579(16)SEQIDNO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他..合成的DNA(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO16GTCGACGGATCGCAAATGGCAAC23(17)SEQIDNO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iv)反義有(xi)序列描述SEQIDNO17GGATCCTTGAGCAUTTGCGCAG(18)SEQIDNO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(iv)反義無(vi)來源(A)生物乳酸發(fā)酵短桿菌(B)菌株ATCC13869(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置311..1213(xi)序列描述SEQIDNO18CTCTCGATATCGAGAGAGAAGCAGCGCCACGGTTTTTCGGTGATTTTGAGATTGAAACTT60TGGCAGACGGATCGCAAATGGCAACAAGCCCGTATGTCATGGACTTTTAACGCAAAGCTC120ACACCCACGAGCTAAAAATTCATATAGTTAAGACAACATTTTTGGCTGTAAAAGACAGCC180GTAAAAACCTCTTGCTCATGTCAATTGTTCTTATCGGAATGTGGCTTGGGCGATTGTTAT240GCAAAAGTTGTTAGGTTTTTTGCGGGGTTGTTTAACCCCCAAATGAGGGAAGAAGGTAAC300CTTGAACTCTATGAGCACAGGTTTAACAGCTAAGACCGGAGTAGAGCAC349MetSerThrGlyLeuThrAlaLysThrGlyValGluHis1510TTCGGCACCGTTGGAGTAGCAATGGTTACTCCATTCACGGAATCCGGA397PheGlyThrValGlyValAlaMetValThrProPheThrGluSerGly152025GACATCGATATCGCTGCTGGCCGCGAAGTCGCGGCTTATTTGGTTGAT445AspIleAspIleAlaAlaGlyArgGluValAlaAlaTyrLeuValAsp30354045AAGGGCTTGGATTCTTTGGTTCTCGCGGGCACCACTGGTGAATCCCCA493LysGlyLeuAspSerLeuValLeuAlaGlyThrThrGlyGluSerPro505560ACGACAACCGCCGCTGAAAAACTAGAACTGCTCAAGGCCGTTCGTGAG541ThrThrThrAlaAlaGluLysLeuGluLeuLeuLysAlaValArgGlu657075GAAGTTGGGGATCGGGCGAACGTCATCGCCGGTGTCGGAACCAACAAC589GluValGlyAspArgAlaAsnValIleAlaGlyValGlyThrAsnAsn808590ACGCGGACATCTGTGGAACTTGCGGAAGCTGCTGCTTCTGCTGGCGCA637ThrArgThrSerValGluLeuAlaGluAlaAlaAlaSerAlaGlyAla95100105GACGGCCTTTTAGTTGTAACTCCTTATTACTCCAAGCCGAGCCAAGAG685AspGlyLeuLeuValValThrProTyrTyrSerLysProSerGlnGlu110115120125GGATTGCTGGCGCACTTCGGTGCAATTGCTGCAGCAACAGAGGTTCCA733GlyLeuLeuAlaHisPheGlyAlaIleAlaAlaAlaThrGluValPro130135140ATTTGTCTCTATGACATTCCTGGTCGGTCAGGTATTCCAATTGAGTCT781IleCysLeuTyrAspIleProGlyArgSerGlyIleProIleGluSer145150155GATACCATGAGACGCCTGAGTGAATTACCTACGATTTTGGCGGTCAAG829AspThrMetArgArgLeuSerGluLeuProThrIleLeuAlaValLys160165170GACGCCAAGGGTGACCTCGTTGCAGCCACGTCATTGATCAAAGAAACG877AspAlaLysGlyAspLeuValAlaAlaThrSerLeuIleLysGluThr175180185GGACTTGCCTGGTATTCAGGCGATGACCCACTAAACCTTGTTTGGCTT925GlyLeuAlaTrpTyrSerGlyAspAspProLeuAsnLeuValTrpLeu190195200205GCTTTGGGCGGATCAGGTTTCATTTCCGTAATTGGACATGCAGCCCCC973AlaLeuGlyGlySerGlyPheIleSerValIleGlyHisAlaAlaPro210215220ACAGCATTACGTGAGTTGTACACAAGCTTCGAGGAAGGCGACCTCGTC1021ThrAlaLeuArgGluLeuTyrThrSerPheGluGluGlyAspLeuVal225230235CGTGCGCGGGAAATCAACGCCAAACTATCACCGCTGGTAGCTGCCCAA1069ArgAlaArgGluIleAsnAlaLysLeuSerProLeuValAlaAlaGln240245250GGTCGCTTGGGTGGAGTCAGCTTGGCAAAAGCTGCTCTGCGTCTGCAG1117GlyArgLeuGlyGlyValSerLeuAlaLysAlaAlaLeuArgLeuGln255260265GGCATCAACGTAGGAGATCCTCGACTTCCAATTATGGCTCCAAATGAG1165GlyIleAsnValGlyAspProArgLeuProIleMetAlaProAsnGlu270275280285CAGGAACTTGAGGCTCTCCGAGAAGACATGAAAAAAGCTGGAGTTCTA1213GlnGluLeuGluAlaLeuArgGluAspMetLysLysAlaGlyValLeu290295300TAAATATGAATGATTCCCGAAATCGCGGCCGGAAGGTTACCCGCAAGGCGGCCCACCAGA1273AGCTGGTCAGGAAAACCATCTGGATACCCCTGTCTTTCAGGCACCAGATGCTTCCTCTAA1333CCAGAGCGCTGTAAAAGCTGAGACCGCCGGAAACGACAATCGGGATGCTGCGCAAGGTGC1393TCAAGGATCCCAACATTC1411(19)SEQIDNO19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO19TCGCGAAGTAGCACCTGTCACTT23(20)SEQIDNO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iv)反義有(xi)序列描述SEQIDNO20ACGGAATTCAATCTTACGGC21(21)SEQIDNO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1643個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(iv)反義無(vi)來源(A)生物乳酸發(fā)酵短桿菌(B)菌株ATCC13869(xi)序列描述SEQIDNO21TCGCGAAGTAGCACCTGTCACTTTTGTCTCAAATATTAAATCGAATATCAATATACGGTC60TGTTTATTGGAACGCATCCCAGTGGCTGAGACGCATCCGCTAAAGCCCCAGGAACCCTGT120GCAGAAAGAAAACACTCCTCTGGCTAGGTAGACACAGTTTATAAAGGTAGAGTTGAGCGG180GTAACTGTCAGCACGTAGATCGAAAGGTGCACAAAGGTGGCCCTGGTCGTACAGAAATAT240GGCGGTTCCTCGCTTGAGAGTGCGGAACGCATTAGAAACGTCGCTGAACGGATCGTTGCC300ACCAAGAAGGCTGGAAATGATGTCGTGGTTGTCTGCTCCGCAATGGGAGACACCACGGAT360GAACTTCTAGAACTTGCAGCGGCAGTGAATCCCGTTCCGCCAGCTCGTGAAATGGATATG420CTCCTGACTGCTGGTGAGCGTATTTCTAACGCTCTCGTCGCCATGGCTATTGAGTCCCTT480GGCGCAGAAGCTCAATCTTTCACTGGCTCTCAGGCTGGTGTGCTCACCACCGAGCGCCAC540GGAAACGCACGCATTGTTGACGTCACACCGGGTCGTGTGCGTGAAGCACTCGATGAGGGC600AAGATCTGCATTGTTGCTGGTTTTCAGGGTGTTAATAAAGAAACCCGCGATGTCACCACG660TTGGGTCGTGGTGGTTCTGACACCACTGCAGTTGCGTTGGCAGCTGCTTTGAACGCTGAT720GTGTGTGAGATTTACTCGGACGTTGACGGTGTGTATACCGCTGACCCGCGCATCGTTCCT780AATGCACAGAAGCTGGAAAAGCTCAGCTTCGAAGAAATGCTGGAACTTGCTGCTGTTGGC840TCCAAGATTTTGGTGCTGCGCAGTGTTGAATACGCTCGTGCATTCAATGTGCCACTTCGC900GTACGCTCGTCTTATAGTAATGATCCCGGCACTTTGATTGCCGGCTCTATGGAGGATATT960CCTGTGGAAGAAGCAGTCCTTACCGGTGTCGCAACCGAGAAGTCCGAAGCCAAAGTAACC1020GTTCTGGGTATTTCCGATAAGCCAGGCGAGGCTGCCAAGGTTTTCCGTGCGTTGGCTGAT1080GCAGAAATCAACATTGACATGGTTCTGCAGAACGTCTCCTCTGTGGAAGACGGCACCACC1140GACATCACGTTCACCTGCCCTCGCGCTGACGGACGCCGTGCGATGGAGATCTTGAAGAAG1200CTTCAGGTTCAGGGCAACTGGACCAATGTGCTTTACGACGACCAGGTCGGCAAAGTCTCC1260CTCGTGGGTGCTGGCATGAAGTCTCACCCAGGTGTTACCGCAGAGTTCATGGAAGCTCTG1320CGCGATGTCAACGTGAACATCGAATTGATTTCCACCTCTGAGATCCGCATTTCCGTGCTG1380ATCCGTGAAGATGATCTGGATGCTGCTGCACGTGCATTGCATGAGCAGTTCCAGCTGGGC1440GGCGAAGACGAAGCCGTCGTTTATGCAGGCACCGGACGCTAAAGTTTTAAAGGAGTAGTT1500TTACAATGACCACCATCGCAGTTGTTGGTGCAACCGGCCAGGTCGGCCAGGTTATGCGCA1560CCCTTTTGGAAGAGCGCAATTTCCCAGCTGACACTGTTCGTTTCTTTGCTTCCCCGCGTT1620CCGCAGGCCGTAAGATTGAATTC1643(22)SEQIDNO22的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO22GGATCCCCAATCGATACCTGGAA23(23)SEQIDNO23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iv)反義有(xi)序列描述SEQIDNO23CGGTTCATCGCCAAGTTTTTCTT23(24)SEQIDNO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2001個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(iv)反義無(vi)來源(A)生物乳酸發(fā)酵短桿菌(B)菌株ATCC13869(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置730..1473(xi)序列描述SEQIDNO24GGATCCCCAATCGATACCTGGAACGACAACCTGATCAGGATATCCAATGCCTTGAATATT60GACGTTGAGGAAGGAATCACCAGCCATCTCAACTGGAAGACCTGACGCCTGCTGAATTGG120ATCAGTGGCCCAATCGACCCACCAACCAGGTTGGCTATTACCGGCGATATCAAAAACAAC180TCGCGTGAACGTTTCGTGCTCGGCAACGCGGATGCCAGCGATCGACATATCGGAGTCACC240AACTTGAGCCTGCTGCTTCTGATCCATCGACGGGGAACCCAACGGCGGCAAAGCAGTGGG300GGAAGGGGAGTTGGTGGACTCTGAATCAGTGGGCTCTGAAGTGGTAGGCGACGGGGCAGC360ATCTGAAGGCGTGCGAGTTGTGGTGACCGGGTTAGCGGTTTCAGTTTCTGTCACAACTGG420AGCAGGACTAGCAGAGGTTGTAGGCGTTGAGCCGCTTCCATCACAAGCACTTAAAAGTAA480AGAGGCGGAAACCACAAGCGCCAAGGAACTACCTGCGGAACGGGCGGTGAAGGGCAACTT540AAGTCTCATATTTCAAACATAGTTCCACCTGTGTGATTAATCTCCAGAACGGAACAAACT600GATGAACAATCGTTAACAACACAGACCAAAACGGTCAGTTAGGTATGGATATCAGCACCT660TCTGAATGGGTACGTCTAGACTGGTGGGCGTTTGAAAAACTCTTCGCCCCACGAAAATGA720AGGAGCATAATGGGAATCAAGGTTGGCGTTCTCGGAGCCAAAGGCCGT768MetGlyIleLysValGlyValLeuGlyAlaLysGlyArg1510GTTGGTCAAACTATTGTGGCAGCAGTCAATGAGTCCGACGATCTGGAG816ValGlyGlnThrIleValAlaAlaValAsnGluSerAspAspLeuGlu152025CTTGTTGCAGAGATCGGCGTCGACGATGATTTGAGCCTTCTGGTAGAC864LeuValAlaGluIleGlyValAspAspAspLeuSerLeuLeuValAsp30354045AACGGCGCTGAAGTTGTCGTTGACTTCACCACTCCTAACGCTGTGATG912AsnGlyAlaGluValValValAspPheThrThrProAsnAlaValMet505560GGCAACCTGGAGTTCTGCATCAACAACGGCATTTCTGCGGTTGTTGGA960GlyAsnLeuGluPheCysIleAsnAsnGlyIleSerAlaValValGly657075ACCACGGGCTTCGATGATGCTCGTTTGGAGCAGGTTCGCGCCTGGCTT1008ThrThrGlyPheAspAspAlaArgLeuGluGlnValArgAlaTrpLeu808590GAAGGAAAAGACAATGTCGGTGTTCTGATCGCACCTAACTTTGCTATC1056GluGlyLysAspAsnValGlyValLeuIleAlaProAsnPheAlaIle95100105TCTGCGGTGTTGACCATGGTCTTTTCCAAGCAGGCTGCCCGCTTCTTC1104SerAlaValLeuThrMetValPheSerLysGlnAlaAlaArgPhePhe110115120125GAATCAGCTGAAGTTATTGAGCTGCACCACCCCAACAAGCTGGATGCA1152GluSerAlaGluValIleGluLeuHisHisProAsnLysLeuAspAla130135140CCTTCAGGCACCGCGATCCACACTGCTCAGGGCATTGCTGCGGCACGC1200ProSerGlyThrAlaIleHisThrAlaGlnGlyIleAlaAlaAlaArg145150155AAAGAAGCAGGCATGGACGCACAGCCAGATGCGACCGAGCAGGCACTT1248LysGluAlaGlyMetAspAlaGlnProAspAlaThrGluGlnAlaLeu160165170GAGGGTTCCCGTGGCGCAAGCGTAGATGGAATCCCAGTTCACGCAGTC1296GluGlySerArgGlyAlaSerValAspGlyIleProValHisAlaVal175180185CGCATGTCCGGCATGGTTGCTCACGAGCAAGTTATCTTTGGCACCCAG1344ArgMetSerGlyMetValAlaHisGluGlnValIlePheGlyThrGln190195200205GGTCAGACCTTGACCATCAAGCAGGACTCCTATGATCGCAACTCATTT1392GlyGlnThrLeuThrIleLysGlnAspSerTyrAspArgAsnSerPhe210215220GCACCAGGTGTCTTGGTGGGTGTGCGCAACATTGCACAGCACCCAGGC1440AlaProGlyValLeuValGlyValArgAsnIleAlaGlnHisProGly225230235CTAGTCGTAGGACTTGAGCATTACCTAGGCCTGTAAAGGCTCATTTCAGCAGC1493LeuValValGlyLeuGluHisTyrLeuGlyLeu240245GGGTGGAATTTTTTAAAAGGAGCGTTTAAAGGCTGTGGCCGAACAAGTTAAATTGAGCGT1553GGAGTTGATAGCGTGCAGTTCTTTTACTCCACCCGCTGATGTTGAGTGGTCAACTGATGT1613TGAGGGCGCGGAAGCACTCGTCGAGTTTGCGGGTCGTGCCTGCTACGAAACTTTTGATAA1673GCCGAACCCTCGAACTGCTTCCAATGCTGCGTATCTGCGCCACATCATGGAAGTGGGGCA1733CACTGCTTTGCTTGAGCATGCCAATGCCACGATGTATATCCGAGGCATTTCTCGGTCCGC1793GACCCATGAATTGGTCCGACACCGCCATTTTTCCTTCTCTCAACTGTCTCAGCGTTTCGT1853GCACAGCGGAGAATCGGAAGTAGTGGTGCCCACTCTCATCGATGAAGATCCGCAGTTGCG1913TGAACTTTTCATGCACGCCATGGATGAGTCTCGGTTCGCTTTCAATGAGCTGCTTAATGC1973(25)SEQIDNO25的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO25CCGGACAGCTCACCCACAAAATCAATGCACTCTAAAAAGGTACCT45(26)SEQIDNO26的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iv)反義有(xi)序列描述SEQIDNO26CTAGAGGTACCTTTTTAGAGTGCATTGATTTIGTGGGGTGAGCTGT45(27)SEQIDNO27的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO27CTAGCTCGAGATATCAGATCTACTAGTCGACCGC34(28)SEQIDNO28的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iv)反義有(xi)序列描述SEQIDNO28GGTCGACTAGTAGATCTGATATCTCGAG28圖1表示各種人工轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)。Kmr表示新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(卡那霉素抗性基因)，Tnp表示轉(zhuǎn)座酶基因。黑色部分表示反向重復(fù)序列。圖2說明分別含有人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pHTN7141和pHTN7142的構(gòu)建。圖3說明含人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pHTN7143的構(gòu)建。圖4說明含人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pHTN7144構(gòu)建。圖5說明質(zhì)粒pHTN714K1和pHTN714K2構(gòu)建。圖6說明含人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pHTN7145構(gòu)建。圖7說明含人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pHTN7151構(gòu)建。圖8說明含人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pHTN7152構(gòu)建。圖9說明含人工轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pHTN7156-C構(gòu)建。圖10說明質(zhì)粒pORF1的構(gòu)建。圖11說明質(zhì)粒pORF3和pORF4的構(gòu)建。圖12說明質(zhì)粒pORF7的構(gòu)建。圖13說明質(zhì)粒pORF8的構(gòu)建。圖14說明含轉(zhuǎn)座子單元的質(zhì)粒pORF41的構(gòu)建。圖15說明質(zhì)粒pORFCO的構(gòu)建。圖16說明插入序列，人工轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座子單元之間的差異。TCr指四環(huán)素抗性基因，Tnp指轉(zhuǎn)座酶基因，黑框指反向重復(fù)序列(IR)。在結(jié)構(gòu)圖下劃線的點(diǎn)部分表示被轉(zhuǎn)座的部分。圖17說明質(zhì)粒pORF40的構(gòu)建。圖18說明質(zhì)粒pVK7的構(gòu)建。圖19說明質(zhì)粒pVC7的構(gòu)建。圖20說明質(zhì)粒p399LYSA和質(zhì)粒p299LYSA的構(gòu)建。圖21說明質(zhì)粒pABLm的構(gòu)建。圖22說明質(zhì)粒pCRDAPA的構(gòu)建。圖23說明質(zhì)粒p399DPS的構(gòu)建。圖24說明質(zhì)粒p399AK9的構(gòu)建。圖25說明質(zhì)粒pCRDAPB的構(gòu)建。圖26說明質(zhì)粒p399CAB和pCAB的構(gòu)建。圖27說明質(zhì)粒pCABL的構(gòu)建。圖28說明質(zhì)粒pHTN150A的構(gòu)建。圖29說明質(zhì)粒pCBLmc的構(gòu)建。圖30說明質(zhì)粒pHTN7150的構(gòu)建。權(quán)利要求1擴(kuò)增所需基因的方法，包括形成人工轉(zhuǎn)座，所述人工轉(zhuǎn)座含有在反向重復(fù)系列之間插入了藥物抗性基因和所需的基因的結(jié)構(gòu)并且在棒狀桿菌細(xì)胞內(nèi)是可轉(zhuǎn)座的，將所述的人工轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入棒狀桿菌細(xì)胞，將所述轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座到所述棒狀桿菌的染色體中，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)并擴(kuò)增在所述染色體中的所述基因。2權(quán)利要求1的方法，其中所述人工轉(zhuǎn)座子還含有轉(zhuǎn)座酶位于反向重復(fù)序列之間的結(jié)構(gòu)。3權(quán)利要求1或2的方法，其中所述反向重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座酶基因來自棒狀桿菌的插入序列。4權(quán)利要求3的方法，其中所述插入序列為序列表中SequenceNo.1、5或9中任一個(gè)所代表的堿基序列。5權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述藥物抗性基因是氯霉素抗性基因或四環(huán)素抗性基因。6權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所需基因是參與氨基酸生物合成的基因。7權(quán)利要求6的方法，其中所需基因是天冬氨酸激酶基因和/或二氫吡啶羧酸合成酶基因。8用權(quán)利要求1至7中的任一方法，將所需基因?qū)肴旧w而形成的棒狀桿菌。9生產(chǎn)氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用權(quán)利要求6的方法，將參與氨基酸生物合成的基因?qū)肴旧w而形成的棒狀桿菌，以便在培養(yǎng)基中形成并積累氨基酸，然后回收所述氨基酸。10權(quán)利要求9的方法，其中參與氨基酸生物合成的基因是天冬氨酸激酶基因和/或二氫吡啶羧酸合成酶基因，而且所述氨基酸是賴氨酸。全文摘要構(gòu)建擴(kuò)增在棒狀細(xì)菌染色體中的所需基因的方法，包括，形成藥物抗性基因和所需基因插入棒狀細(xì)菌的插入序列中的人工轉(zhuǎn)座子，將所說的人工轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入棒狀細(xì)菌中。效果根據(jù)本發(fā)明的方法，可以在工業(yè)化生產(chǎn)氨基酸或核酸的棒狀細(xì)菌的染色體中擴(kuò)增所需的基因，可以改善所說的棒狀細(xì)菌的育種。文檔編號(hào)C12N1/21GK1163937SQ96111709公開日1997年11月5日申請(qǐng)日期1996年6月29日優(yōu)先權(quán)日1995年6月30日發(fā)明者守屋美加,松井裕,橫關(guān)健三,平野圣子,早川敦,泉井正子,杉本雅一申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社