專利名稱：：從人微量b細(xì)胞中擴(kuò)增人抗體重鏈及輕鏈基因片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)、基因工程和免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及從人微量B細(xì)胞中擴(kuò)增人抗體重鏈及輕鏈基因片段的方法。
背景技術(shù)：
：抗體類藥物以其安全有效，特異性高的優(yōu)點(diǎn)，已成為國(guó)際藥品市場(chǎng)上的一大類新型的診斷和治療劑。到目前為止，美國(guó)FDA已批準(zhǔn)了24個(gè)抗體藥物上市，全球有超過(guò)200家公司正在研發(fā)單抗治療藥物，約有360個(gè)產(chǎn)品正在研發(fā)之中，全球抗體類藥物市場(chǎng)銷售額在2000年時(shí)為17億美元，2004年達(dá)103億美元，預(yù)計(jì)到2010年全球市場(chǎng)將達(dá)300億美元。目前國(guó)內(nèi)抗體藥物市場(chǎng)尚未形成，年銷售額不足億元。由于鼠源性抗體不僅受到人體免疫系統(tǒng)的排斥，而且Fc片段不能有效地激活人體效應(yīng)系統(tǒng)，所以用人抗體取代鼠抗體是克服鼠單抗在臨床應(yīng)用障礙的關(guān)鍵，而雜交瘤技術(shù)又不能提供穩(wěn)定分泌人抗體的細(xì)胞株。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展為人源化抗體的研制提供了基礎(chǔ)，特別是用人抗體恒區(qū)置換鼠抗體相應(yīng)部位的人鼠嵌合抗體。這類抗體分子70%-卯％為人源，在抗原特異性和親和力方面都較好地保留了親代抗體的特征，而免疫源性降低了12%左右，在體內(nèi)的半衰期和效應(yīng)功能也有所提高。完全人單克隆抗體則是最理想的選擇。目前生產(chǎn)人抗體的方法主要包括抗體庫(kù)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，但這兩類技術(shù)均尚處在實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段，不夠成熟。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足而提供一種從人微量B細(xì)胞中擴(kuò)增人抗體重鏈及輕鏈基因片段的方法。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)從人微量B細(xì)胞中擴(kuò)增人抗體重鏈及輕鏈基因片段的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)從人全血中分離B細(xì)胞及B細(xì)胞的保存1)人全血預(yù)處理EDTA或檸檬酸進(jìn)行抗凝處理的人全血加入二倍體積的緩沖液(含有0.1%BSA，2mMEDTA的PBS緩沖液)離心后，去上清，在血細(xì)胞中加入等體積上述溶液混勻后，用于B細(xì)胞的分離；2)人B細(xì)胞的分離用包被抗CD19抗體的磁珠方法從人全血中分離人B細(xì)胞；該方法具體為-使用DYNAL公司的DynabeadsCD19(PanB)細(xì)胞分離試劑盒及DETACHaBEADCD19試劑盒按操作說(shuō)明書分離B細(xì)胞；3)人B細(xì)胞的保存分離得到的B細(xì)胞用凍存液(含10%胎牛血清，10%DMSO的DMEM)凍存于液氮中，該凍存方法至少在2年內(nèi)可保持細(xì)胞膜及RNA的完整；(2)集群引物來(lái)源和設(shè)計(jì)1)搜尋Y重鏈及X、k輕鏈的基因序列應(yīng)用生物信息學(xué)的方法從基因庫(kù)獲得文獻(xiàn)已報(bào)導(dǎo)的所有的人抗體的Y重鏈及X、k輕鏈的基因序列；2)分揀，歸類各Y重鏈及X、k輕鏈的基因序列將上述搜索到的基因分類為Y、X、k三組基因序列，在各組序列中進(jìn)行一系列對(duì)比，并將相似的序列進(jìn)行兼并；3)人抗體Y重鏈及乙k輕鏈的集群引物設(shè)計(jì)由于是用微量的B細(xì)胞擴(kuò)增人Y重鏈及X、k輕鏈的基因序列，所得到的模板的量十分稀少，因此設(shè)計(jì)了nest-PCR:即通過(guò)兩次PCR的方法來(lái)擴(kuò)增目的y重鏈及Lk輕鏈的基因片段，為此設(shè)計(jì)了兩組集群引物a.第一次PCR引物長(zhǎng)21bp，Y重鏈引物為18對(duì)，X輕鏈引物為35對(duì)，k輕鏈引物為33對(duì)；b.第二次PCR引物長(zhǎng)49bp，在第一次PCR引物的基礎(chǔ)上，5'引物加上Ascl酶切位點(diǎn)及信號(hào)肽序列，3，引物向上游移動(dòng)了20bp，形成巢式結(jié)構(gòu)，并引入了Notl酶切位點(diǎn)，這使PCR效率及穩(wěn)定性大為提高，減少了PCR反應(yīng)的非特異性產(chǎn)物，并使所獲得的人抗體的輕、重鏈功能性片段可直接進(jìn)行克隆及表達(dá)；(3)人B細(xì)胞中抗體相關(guān)基因的擴(kuò)增1)從IO個(gè)人B細(xì)胞中獲取微量mRNA用裂解緩沖液(LysisBufferwithLysisEnhancer,Invitrogen公司)逐級(jí)稀釋B細(xì)胞，準(zhǔn)確地取10個(gè)B細(xì)胞，置于200微升薄壁PCR管中，并配置裂解反應(yīng)體系，體系中含oligo-d(T)2o3.85uM及RNaseOUT3.08U,輕柔混合后，置PCR儀中75。C保溫IO分鐘，立即插入冰中至完全冷卻；2)用上述微量mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)上述樣品離心，置于冰上，配置RT反應(yīng)體系，反應(yīng)體系中含5XRT緩沖液，0.33mMdNTP，1.33URNaseOUT(Invitrogen)，6.67USuperScriptIII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)，3mMDTT，用重蒸水(RNaseFreeTAKARA)補(bǔ)足體積，混勻，短暫離心，置于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下50°C50分鐘，85'C10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后4'C保持；3)從上述cDNA產(chǎn)物中擴(kuò)增Y重鏈及X、k輕鏈的可變區(qū)基因片段應(yīng)用nest-PCR的方法，用兩次PCR擴(kuò)增出y重鏈及人、k輕鏈的基因片段a.第一次PCR反應(yīng)將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(15微升)用重蒸水稀釋5倍，各取PCR反應(yīng)終體積(30微升)的1/5分別置于三個(gè)200微升PCR管中，用于擴(kuò)增Y重鏈及X、k輕鏈的基因片段；PCR反應(yīng)體系中每管含0.2uM各自的3'引物，10XPCR緩沖液，0.2mMdNTP(Invitrogen)，1.5mMMgC12，0.04UPlateinumTaqDNAPolymerase(聚合酶Invitrogen)及0.4uM各自5'集群引物，用重蒸水補(bǔ)足體積；反應(yīng)條件94°Cl分鐘，94°C15秒，55°C30秒，72°C1分鐘，然后共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后4'C(冰浴)保存；b.第二次PCR反應(yīng)將上述產(chǎn)物分別置于三個(gè)200微升PCR管中，擴(kuò)增Y重鏈及X、K輕鏈的目的基因序列；每管含模板(30微升反應(yīng)終體積的1/5)，0.2uM各自的3'引物，10XPCR緩沖液，0.2mMdNTP(Invitrogen)，1.5mMMgC12，0.04UPlateinumTaqDNAPolymerase(聚合酶Invitrogen)及0.4uM各自5'引物，用重蒸水補(bǔ)足體積；反應(yīng)程序94°Cl分鐘，然后94'C15秒，60°C30秒，72°C1分鐘共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后4'C(冰浴)保存，取部分產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。所述的步驟(2)設(shè)計(jì)的集群引物如表l所示表l:5'端集群引物及3'端引物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>SH5-18atggggtcaaccgccatcctcH5-18Y重鏈3'引物HC3-PHC3-PCCR2R1ggtgtccttgggmtg卿g(linker)A輕鏈5'引物SL5-013tg333t3CCt3ttgCCt3CgL5-01SL5-023tgaccgggtccctctctggcL5-02SL5-033tg3cctgctcccctctcctcL5-03SL5-043tg3cttggsicccc3ctcctcL5-04SL5-05atgccctgggctctgctcctcL5-05SL5-063tggc3tggstccctctcttcL5-06SL5-07atggcstgggccacactcctgL5-07SL5-08atggccagcttccctctcctcL5-08SL5-08a3tggccggcttccctctcctcL5-08aSL5-09stggccgggscccctctctggL5-09SL5-103tggcctggsccc33ctcctcL5-10SL5-11stggcctggscccctctcctcL5-11SL5-123tggcctggscccctctcctgL5-12SL5-13atggcctggacccctctccttL5-13SL5-14stggcctggscccctctctggL5-14SL5-153tggcctgg3ccgctctccttL5-15SL5-16atggcctggaccgttctcctcL5-16SL5-17atggcctggactcctctcctcL5-17SL5-183tggcctggsctcctctctttL5-18SL5-19atggcctggactctgctattcL5-19SL5-203tggcctgg3ctcttctccttL5-20SL5-213tggcctgg3t3cctct3cttL5-21SL5-22atggcctggatccctctacttL5-22SL5-233tggcctggatccctctcctgL5-23SL5-24atggcctggatgatgcttcccL5-243agaattcggcgcgccg33ggagcc3ccatggggtcaaccgccatcctcsagaattcggcgcgccgasggagccsccatgaccgggtccctctctggca3gaattcggcgcgccgaagg3gcc3ccatg3cttggaccccactcctcaag33ttcggcgcgccgaaggagccaccatgccctgggctctgctcctcaagaattcggcgcgccgaaggagcc3ccatggcatggatccctctcttcaag33ttcggcgcgccg33ggagcc3ccatggc3tgggccacactcctgaag33ttcggcgcgccg33ggagcc3CC3tggccggcttccctctcctcaagaattcggcgcgccgaaggagccsccatggcctggacccctctcctcaagaattcggcgcgccg33gg3gcc3ccatggcctggacccctctcctg33gaattcggcgcgccg33ggagcc3ccatggcctggacccctctccttaagaattcggcgcgccgaaggagccsccatggcctggacccctctctgg33gaattcggcgcgccg33ggagcc3ccatggcctggaccgttctcctcaagaattcggcgcgccg33gg3gcc3ccatggcctggactcctctcctcaagaattcggcgcgccgaaggagccaccatggcctggactcctctctttaagaattcggcgcgccgadggagccaccstggcctggactctgctattcaagaattcggcgcgccgaaggagccsccatggcctggactcttctccttaagaattcggcgcgccgasggagccaccatggcctggatacctctacttaagaattcggcgcgccgaaggagccsccatggcctggatccctctcctgaagaattcggcgcgccgasggagccaccatggcctggatgatgcttccc12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>SK5-17atggaagccccagcgcsctggK5-17SK5-183tggaagccccagcgcagcttK5-18SK5-19atggaagccccagctcagcttK5-19SK5-20atggaagctccagctcagcttK5-20SK5-21atggaagtcctcgtgcagcttK5-21SK5-22atggacacgagggtccctgctK5-22SK5-23atggacatgaagaccctagttK5-23SK5-24atggacatgagagtcctcgctK5-24SK5-253tgg3C3tgagggtccccgctK5-25SK5-26atggacatgagggtccctgctK5-26SK5-27atggacatgagggtctctgctK5-27SK5-28atggacatgsgggtgcccgctK5-28SK5-293tgg3c3tggg3gtcct3gttK5-29SK5-30atggacatgggggcccaggttK5-30SK5-31atggacatggggttcctcgtgK5-31SK5-323tgggggccccggcgcagcttK5-32SK5-333tggtgttgc3gsccc3ggtcK5-33k輕鏈3'引物KC-6aaKC-3'-PC-3'-PCRR1ctaacactctcccctgttgaagct2aagaattcggcgcgccgsaggagccaccatggaagccccagcgcactggaagaattcggcgcgccgaaggagccsccatggaagccccagcgcagcttaagaattcggcgcgccgaaggagccaccatggaagccccagctcagcttaagaattcggcgcgccga柳agccaccatgga3gctcc3gctc3gcttaagaattcggcgcgccgasggagccaccstggaagtcctcgtgcagctt3agaattcggcgcgccgaaggagccaccatggacacgagggtccctgct33g33ttcggcgcgccg33gg3gcc3cc3tgg3c3tg33g3ccct3gtta3gaattcggcgcgccg33ggagccaccatgg3catgagggtccctgctaagaattcggcgcgccgaaggagccaccatggacatgagggtctctgctaagaattcggcgcgccgaaggagccaccatggacatgagggtgcccgctaagaattcggcgcgccgaaggsgccaccstggacatgggagtcctagttaagaattcggcgcgccgasggagccaccatggacatgggggcccaggttaagaattcggcgcgccgaaggagccaccatggacatggggttcctcgtgaagaattcggcgcgccgaaggagccsccatgggggccccggcgcagcttaagaattcggcgcgccgaaggagccaccatggtgttgcagacccaggtctctcccctgcggccgctctttgtgacgggcgagctcagg本發(fā)明是用人的微量B細(xì)胞總mRNA作為模板，根據(jù)目前文獻(xiàn)發(fā)表的數(shù)百種人的抗體輕、重鏈基因序列，利用生物信息學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)，合成了多達(dá)20-30種的集群引物，同時(shí)發(fā)展了從微量B細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄總mRNA的方法，發(fā)明了獨(dú)特的RT-PCR方法，保證在此基礎(chǔ)上能擴(kuò)增出已報(bào)導(dǎo)的人抗體基因庫(kù)中人抗體的輕、重鏈基因片段而不被遺漏。由于10個(gè)人B細(xì)胞的總mRNA量及經(jīng)RT-PCR獲得的cDNA模板量均極低，加上集群引物的使用，一般的PCR方法均無(wú)法擴(kuò)增出所設(shè)計(jì)的人抗體的輕、重鏈片段。我們發(fā)展了一套有特色的、有效的PCR擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是使用二次擴(kuò)增的Nest-PCR方法，即在第一次PCR的引物基礎(chǔ)上在5'引物上加上28bp核酸片段，而3'端向上游移動(dòng)20bp，從而使PCR方法的效率及穩(wěn)定性大為提高，并減少了反應(yīng)的非特異性產(chǎn)物，使微量模板的擴(kuò)增獲得成功。本發(fā)明根據(jù)目前文獻(xiàn)上已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的人抗體基因的基因庫(kù)序列，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)，分別設(shè)計(jì)了針對(duì)人抗體的重鏈及二條輕鏈的功能性片段的集群引物。使用這些集群引物，不僅可以擴(kuò)增基本涵蓋目前己發(fā)表的人抗體基因庫(kù)中的所有基因的片段，而且?guī)в羞m合于Nest-PCR的設(shè)計(jì)特點(diǎn)，又發(fā)展了一套高效的PCR擴(kuò)增技術(shù)，解決了模板量低，引物種類多的擴(kuò)增難題。所獲得的PCR產(chǎn)物，即人抗體的輕、重鏈功能性片段，因而，他們可表達(dá)和重組成有活力的抗體片段，可為多種制備人單克隆抗體的生物工程技術(shù)提供理想的模板，所以本發(fā)明是生物工程技術(shù)研制單克隆抗體的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。圖1為人抗體Y重鏈基因片段及人輕鏈基因片段電泳圖1中，1:DNAMarker(DL2，000TAKARA)，2:人抗體y重鏈基因片段，3:人抗體X輕鏈基因片段，4:陰性對(duì)照。圖2為人抗體X輕鏈基因片段及k輕鏈基因片段電泳圖2中，1:人抗體X輕鏈基因片段，2:人抗體k輕鏈基因片段，3:陰性對(duì)照，4:DNAMarker(DL2，000TAKARA)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。一種從人微量B細(xì)胞中擴(kuò)增人抗體重鏈及輕鏈基因片段的方法，該方法包括以下步驟一、從人全血中分離B細(xì)胞及B細(xì)胞的保存l.人全血預(yù)處理取人全血2毫升于EDTA處理過(guò)的試管內(nèi)，加入4毫升緩沖液I(含有0.1%BSA，2mMEDTA的PBS，pH7.4)600g離心10分鐘，小心地將上層清液棄去，加入與血球等體積上述溶液混勻。2.人B細(xì)胞的分離將上述預(yù)處理的全血分裝入2個(gè)2毫升離心管中，每管加入25微升磁性微珠(DynabeadsCD19(PanB)DYNAL)，將試管置于慢速旋轉(zhuǎn)的微量混合器上室溫孵育45分鐘然后將試管置于專用磁鐵上，移去未吸附的血球懸液，用緩沖液I洗吸有B細(xì)胞的磁珠4次。用300微升含有1%胎牛血清的DMEM分三次將磁珠轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中，加入30微升分離液(DETACHaBEAD0019，0，八1^)在混合器上室溫孵育1小時(shí)后試管置于磁鐵架上上，吸取€019+的B細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，共獲1.6X1()s個(gè)B細(xì)胞。3.人B細(xì)胞的保存將上述B細(xì)胞懸液離心，棄去上清，沉淀中加入500微升凍存液(DMEM內(nèi)含10%胎牛血清及10%DMSO)混勻后，分裝，凍存于液氮中。凍存2年后，顯微鏡下觀察細(xì)胞完整，PCR仍可獲得抗體重鏈和輕鏈的基因片段。二、集群引物來(lái)源和設(shè)計(jì)運(yùn)用生物信息學(xué)的方法設(shè)計(jì)了集群引物，見(jiàn)表l。上述引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用重蒸水溶解引物，即得到100uM的儲(chǔ)存液。各取Y重鏈第一次PCR的18條5'引物2微升，混合得36微升混合引物(總濃度為100uM)，同樣的方法得36微升Y重鏈第二次PCR的5，混合引物(總濃度為100uM)和X輕鏈兩次PCR的35條5，混合引物各70微升(總濃度均為100uM)，及k輕鏈兩次PCR的33條5'引物各66微升(總濃度均為100uM)。上述100uM混合引物各取IO微升(剩余作為儲(chǔ)存液保存于-2(TC)分別加入90微升重蒸水，即得10uM5，引物混合物。三、B細(xì)胞中抗體相關(guān)基因的擴(kuò)增l.從10個(gè)B細(xì)胞中獲取微量mRNA用裂解緩沖液(LysisBufferwithLysisEnhancer,Invitrogen)逐級(jí)稀釋B細(xì)胞，準(zhǔn)確地取IO個(gè)B細(xì)胞(5微升，每微升2個(gè)細(xì)胞)，置于200微升薄壁16PCR管中，加入1微升oligod(T)20(50uM)，0.5微升RNaseOUT(40U/ul)，輕輕混合，置于PCR儀上75。C保溫IO分鐘，立即插入冰中至完全冷卻。2.用上述微量mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)上述樣品離心，置于冰中，加入3微升5XRT緩沖液，0.5微升dNTP(10mM),0.5微升RNaseOUT(40U/ul)，0.5微升SuperScriptIII反轉(zhuǎn)錄酶(200U/ul，Invitrogen)，0.5微升DTT(0.1M)，3.5微升重蒸水(RNaseFreeTAKARA)?；靹?，短暫離心，置于PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下5(TC50分鐘，85'C10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后4'C保持。3.從上述cDNA產(chǎn)物中擴(kuò)增Y重鏈及X、K輕鏈的基因序列(1)第一次PCR反應(yīng)將上述產(chǎn)物用重蒸水稀釋5倍，各取6微升分別置于三個(gè)200微升PCR管中，每管分別加入1.2微升各自已配置好的第一次PCR5，引物(10uM)，0.6微升各自的第一次PCR3'引物(10uM)，3微升10XPCR緩沖液，0.6微升dNTP(10mM，Invitrogen)，0.9微升MgCl2(50mM)，0.24微升PlateinumTaqDNAPolymerase(DNA聚合酶5U/ul，Invitrogen)，17.46微升重蒸水，反應(yīng)總體積為30微升。反應(yīng)程序94°Cl分鐘，然后94"15秒，55°C30秒，72°C1分鐘共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后4'C(冰浴)保存。(2)第二次PCR反應(yīng)將上述產(chǎn)物各取6微升分別于三個(gè)200微升PCR管中，每管分別加入1.2微升各自已配置好的第二次PCR5'引物(10uM)，0.6微升各自的第二次PCR3，引物(lOuM)，3微升10XPCR緩沖液，0.6微升dNTP(10mM,Invitrogen)，0.9微升MgCl2(50mM)，0.24微升PlateinumTaqDNAPolymerase(DNA聚合酶5U/ul，Invitrogen)，17.46微升重蒸水，反應(yīng)總體積為30微升。反應(yīng)程序94°Cl分鐘，然后94。C15秒，60°C30秒，72°C1分鐘共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后4'C(冰浴)保存。取5ul產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。用本實(shí)施例方法得到的人抗體Y重鏈750bp基因片段及入、k輕鏈700bp基因片段如圖1、圖2所示。權(quán)利要求1.從人微量B細(xì)胞中擴(kuò)增人抗體重鏈及輕鏈基因片段的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)從人全血中分離B細(xì)胞及B細(xì)胞的保存1)人全血預(yù)處理EDTA或檸檬酸進(jìn)行抗凝處理的人全血加入二倍體積的緩沖液(含有0.1％BSA，2mMEDTA的PBS緩沖液)離心后，去上清，在血細(xì)胞中加入等體積上述溶液混勻后，用于B細(xì)胞的分離；2)人B細(xì)胞的分離用包被抗CD19抗體的磁珠方法從人全血中分離人B細(xì)胞；3)人B細(xì)胞的保存分離得到的B細(xì)胞用凍存液(含10％胎牛血清，10％DMSO的DMEM)凍存于液氮中，該凍存方法至少在2年內(nèi)可保持細(xì)胞膜及RNA的完整；(2)集群引物來(lái)源和設(shè)計(jì)1)搜尋γ重鏈及λ、K輕鏈的基因序列應(yīng)用生物信息學(xué)的方法從基因庫(kù)獲得文獻(xiàn)已報(bào)導(dǎo)的所有的人抗體的γ重鏈及λ、κ輕鏈的基因序列；2)分揀，歸類各γ重鏈及λ、K輕鏈的基因序列將上述搜索到的基因分類為γ、λ、κ三組基因序列，在各組序列中進(jìn)行一系列對(duì)比，并將相似的序列進(jìn)行兼并；3)人抗體γ重鏈及λ、K輕鏈的集群引物設(shè)計(jì)由于是用微量的B細(xì)胞擴(kuò)增人γ重鏈及λ、κ輕鏈的基因序列，所得到的模板的量十分稀少，因此設(shè)計(jì)了nest-PCR即通過(guò)兩次PCR的方法來(lái)擴(kuò)增目的γ重鏈及λ、κ輕鏈的基因片段，為此設(shè)計(jì)了兩組集群引物a.第一次PCR引物長(zhǎng)21bp，γ重鏈引物為18對(duì)，λ輕鏈引物為35對(duì)，K輕鏈引物為33對(duì)；b.第二次PCR引物長(zhǎng)49bp，在第一次PCR引物的基礎(chǔ)上，5’引物加上AscI酶切位點(diǎn)及信號(hào)肽序列，3’引物向上游移動(dòng)了20bp，形成巢式結(jié)構(gòu)，并引入了NotI酶切位點(diǎn)，這使PCR效率及穩(wěn)定性大為提高，減少了PCR反應(yīng)的非特異性產(chǎn)物，并使所獲得的人抗體的輕、重鏈功能性片段可直接進(jìn)行克隆及表達(dá)；(3)人B細(xì)胞中抗體相關(guān)基因的擴(kuò)增1)從10個(gè)人B細(xì)胞中獲取微量mRNA用裂解緩沖液(LysisBufferwithLysisEnhancer，Invitrogen公司)逐級(jí)稀釋B細(xì)胞，準(zhǔn)確地取10個(gè)B細(xì)胞，置于200微升薄壁PCR管中，并配置裂解反應(yīng)體系，體系中含oligo-d(T)203.85uM及RNaseOUT3.08U，輕柔混合后，置PCR儀中75℃保溫10分鐘，立即插入冰中至完全冷卻；2)用上述微量mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)上述樣品離心，置于冰上，配置RT反應(yīng)體系，反應(yīng)體系中含5×RT緩沖液，0.33mMdNTP，1.33URNaseOUT(Invitrogen)，6.67USuperScriptIII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)，3mMDTT，用重蒸水(RNaseFreeTAKARA)補(bǔ)足體積，混勻，短暫離心，置于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下50℃50分鐘，85℃10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后4℃保持；3)從上述cDNA產(chǎn)物中擴(kuò)增γ重鏈及λ、κ輕鏈的可變區(qū)基因片段應(yīng)用nest-PCR的方法，用兩次PCR擴(kuò)增出γ重鏈及λ、κ輕鏈的基因片段a.第一次PCR反應(yīng)將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(15微升)用重蒸水稀釋5倍，各取PCR反應(yīng)終體積(30微升)的1/5分別置于三個(gè)200微升PCR管中，用于擴(kuò)增γ重鏈及λ、κ輕鏈的基因片段；PCR反應(yīng)體系中每管含0.2uM各自的3’引物，10×PCR緩沖液，0.2mMdNTP(Invitrogen)，1.5mMMgCl2，0.04UPlateinumTaqDNAPolymerase(聚合酶Invitrogen)及0.4uM各自5’集群引物，用重蒸水補(bǔ)足體積；反應(yīng)條件94℃1分鐘，94℃15秒，55℃30秒，72℃1分鐘，然后共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后4℃(冰浴)保存；b.第二次PCR反應(yīng)將上述產(chǎn)物分別置于三個(gè)200微升PCR管中，擴(kuò)增γ重鏈及λ、κ輕鏈的目的基因序列；每管含模板(30微升反應(yīng)終體積的1/5)，0.2uM各自的3’引物，10×PCR緩沖液，0.2mMdNTP(Invitrogen)，1.5mMMgCl2，0.04UPlateinumTaqDNAPolymerase(聚合酶Invitrogen)及0.4uM各自5’引物，用重蒸水補(bǔ)足體積；反應(yīng)程序94℃1分鐘，然后94℃15秒，60℃30秒，72℃1分鐘共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后4℃(冰浴)保存，取部分產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳檢測(cè)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從人微量B細(xì)胞中擴(kuò)增人抗體重鏈及輕鏈基因片段的方法，其特征在于，所述的步驟(2)設(shè)計(jì)的集群引物如表l所示表l:5'端集群引物及3'端引物<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>入輕鏈5'引物SL5-01atgsaatscctattgcctscgL5-01SL5-02atgaccgggtccctctctggcL5-02SL5-03stgacctgctcccctctcctcL5-03SL5-04stgacttggaccccactcctcL5-04SL5-05atgccctgggctctgctcctcL5-05SL5-06stggcatggatccctctcttcL5-06SL5-07stggcstgggccacsctcctgL5-07SL5-08atggccagcttccctctcctcL5-08SL5-08aatggccggcttccctctcctcL5-08aSL5-09stggccgggacccctctctggL5-09SL5-10atggcctggacccaactcctcL5-10SL5-11atggcctggacccctctcctcL5-11SL5-12atggcctggacccctctcctgL5-12SL5-13atggcctggacccctctccttL5-13SL5-14stggcctggscccctctctggL5-14SL5-15stggcctggsccgctctccttL5-15SL5-163tggcctgg3ccgttctcctcL5-16SL5-17atggcctggsctcctctcctcL5-17SL5-18atggcctggactcctctctttL5-18SL5-19stggcctggsctctgct3ttcL5-19SL5-20atggcctggactcttctccttL5-20SL5-213tggcctggst3CCtcUcttL5-21SL5-22atggcctggstccctctscttL5-22SL5-23atggcctggstccctctcctgL5-23SL5-24stggcctggatgatgcttcccL5-24SL5-25stggcctggstgstgcttctcL5-25SL5-26atggcctgggctccactacttL5-26SL5-27atggcctgggctcctctgctcL5-27SL5-28atggcctgggctctgct3ttcL5-28SL5-29atggcctgggctctgctcctcL5-29SL5-30atggcctgggctctgctgctcL5-30SL5-31atggcctgggctcttctgctcSL5-32stggcctggtcccctctcttcL5-32SL5-333tggcctggtctcctctcctcL5-33aagaattcggcgcgccgsaggsgccaccstgaccgggtccctctctggc3ag3attcggcgcgccg33ggagccacc3tg3cctgctcccctctcctcaagaattcggcgcgccgsaggsgccaccstgccctgggctctgctcctcaag3attcggcgcgccg33gg3gccaccatggcatgggcc3c3ctcctg33g33ttcggcgcgccg33gg3gcc3cc3tggccagcttccctctcctcaagaaUcggcgcgccgasggagccsccstggccggcttccctctcctcaagaattcggcgcgccgssggsgccsccstggcctggacccsactcctcaagaattcggcgcgccg3aggagccacc3tggcctgg3cccctctcctc33g33ttcggcgcgccg33ggagccacc3tggcctggacccctctcctgaagsattcggcgcgccg33ggagccacc3tggcctgg3ccgctctccttaagaattcggcgcgccgaaggagccaccatggcctggaccgttctcctcaagaattcggcgcgccgaaggsgccaccstggcctggsctcctctcctcaagaattcggcgcgccgssggagccsccatggcctggactctgctattc3ag3attcggcgcgccg3agg3gcc3cc3tggcctggactcttctcctt33gaattcggcgcgccgaagg3gccacc3tggcctggatacctcUctts3g33ttcggcgcgccg33gg3gcc3ccatggcctgg3tccctctacU33gaattcggcgcgccg3agg3gccacc3tggcctggstccctctcctgaagaattcggcgcgccgaaggagccsccatggcctggstgatgcttcccaag33ttcggcgcgccg33gg3gccacc3tggcctggatg3tgcttctcaagaattcggcgcgccgaaggagccaccatggcctgggctccactscttaagaattcggcgcgccgaaggagccaccatggcctgggctcctctgctcaagaattcggcgcgccgaaggagccaccstggcctgggctctgctattcaagaattcggcgcgccgaaggagccaccstggcctgggctctgctcctcaagaattcggcgcgccgsaggagccaccstggcctgggctctgctgctc33g33Ucggcgcgcxg33gg3gcc3cc3tggcctgggctcUctgctcaagaattcggcgcgccgsaggagccaccatggcctggtcccctctcttc33g33ttcggcgcgccg33gg3gcc3cc3tggcctggtctcctctcctc<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>全文摘要本發(fā)明涉及從人微量B細(xì)胞中擴(kuò)增人抗體重鏈及輕鏈基因片段的方法，該方法應(yīng)用獨(dú)創(chuàng)的RT-Nest-PCR技術(shù)和基于生物信息學(xué)基礎(chǔ)上的集群引物的設(shè)計(jì)，從人的微量(10個(gè))B細(xì)胞中擴(kuò)增出人抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段能涵蓋目前所有已報(bào)導(dǎo)的人抗體的基因。本發(fā)明有利于克隆，表達(dá)和重組出人抗各類腫瘤相關(guān)抗原和傳染病抗原的人單克隆抗體，是一條創(chuàng)新的用基因工程方法研制人單克隆抗體的關(guān)鍵技術(shù)。文檔編號(hào)C12N15/09GK101451134SQ20071017128公開日2009年6月10日申請(qǐng)日期2007年11月29日優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日發(fā)明者吳建華,吳鴻菲,姚亞媄,張奉武,張祖?zhèn)?沈菊英,龔祖塤申請(qǐng)人:上海凱勃生物技術(shù)有限公司