專利名稱：一種利用番石榴脂肪氧化酶和氫過(guò)氧化物裂解酶制備天然香料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶法制備天然香料的方法，利用該方法可用于制備具有天然風(fēng)味的香料，它涉及一種利用脂肪氧化酶[lipoxygenase(LOX)，EC1.13.11.12]或氫過(guò)氧化物裂解酶將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為天然香料的方法。屬于生物香料制備 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及制備多元不飽和脂肪酸降解產(chǎn)物的過(guò)程。這些降解產(chǎn)物是揮發(fā)性 天然風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)主要包括反式-2 tzi烯醛，反-2-順-6壬二烯醇，順式-3 己烯醇等。這些物質(zhì)在植物果實(shí)，葉子，以及其它組織中廣泛存在。多元不飽 和脂肪酸經(jīng)脂肪氧化酶與過(guò)氧化物裂解后產(chǎn)生兩類物質(zhì)， 一類是C-6的醛類， 另一類是C-9的醛類。天然短鏈的C-6的醛類和醇類，這些化合物目前可以從植物或植物精油中提 取，也可以通過(guò)酶法合成。FR-A1 2696 192描述用脂肪氧化酶與天然的多元不 飽和脂肪酸反應(yīng)制備醛類物質(zhì)。WO 95/26413描述在脂肪氧化酶、過(guò)氧化氫物 裂解酶和酵母存在的情況下將亞麻酸轉(zhuǎn)化為順式-3-己烯醇，脂肪氧化酶是通過(guò) 在多元不飽和脂肪酸的順順雙鍵上的加氧反應(yīng)將這些不飽和脂肪酸降解，產(chǎn)生 脂肪酸過(guò)氧化氫物，這些氧化產(chǎn)物是很多重要的激素(前列腺激素等)與風(fēng)味 物質(zhì)的前體。在植物中，脂肪酸過(guò)氧化氫物的裂解主要是通過(guò)特異性的過(guò)氧化 氫物裂解酶的作用。天然的C-9的醛類和醇類(反-2-順-6壬二烯醛，反-2-順-6-壬二烯醇等)主 要是從紫羅蘭葉中提取出來(lái)，紫羅蘭葉提取物中還包括其它的化合物辛烯-3-醇 等。Galliard,T.， Phillips, D.R.， Reynolds,J.，等從黃瓜果實(shí)中提取的酶能夠?qū)?C-9的脂肪酸過(guò)氧化氫物裂解形成揮發(fā)性的醛類物質(zhì)，這些物質(zhì)主要是順-3-壬醛 和反-2-壬醛。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種制備亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸等具有順、順-1,4-戊二烯 結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸降解產(chǎn)物的方法，尤其是通過(guò)?；磻?yīng)將多元不飽和 脂肪酸降解產(chǎn)生天然香料物質(zhì)。即以多不飽和脂肪酸為原料，這些不飽和脂肪 酸主要是亞油酸，當(dāng)然不限制其它具有順、順-l,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸，如亞麻酸和花生四烯酸等。通過(guò)利用番石榴果實(shí)中提取的酶的催化反應(yīng)，將亞 油酸裂解為具有天然風(fēng)味的天然香料物質(zhì)，這些物質(zhì)主要天然的C-6的醛類和 醇類、C-9的醛類和醇類以及酸類物質(zhì)等，這些物質(zhì)在植物果實(shí)、葉子、蔬菜以 及其它植物組織中廣泛存在。正由于這些物質(zhì)具有各種的天然風(fēng)味，因此被廣 泛的用于食品添加劑行業(yè)。催化降解多元不飽和脂肪酸產(chǎn)生重要的風(fēng)味物質(zhì)的特異性酶在各種植物組 織中廣泛存在，當(dāng)前的發(fā)明將這些酶添加到多不飽和脂肪酸中以產(chǎn)生風(fēng)味化合 物，利用該方法產(chǎn)生的香料香氣純正、天然、安全。用于本發(fā)明的番石榴果實(shí)中包括具有降解脂肪酸前體物的酶類。多不飽和脂肪酸可以加入到植物組織中的酶的粗提液中，或者是酶純化的任 何一個(gè)階段，這些多不飽和脂肪酸可以是亞油酸，亞麻酸，花生四烯酸。可以按照已有的方法將多元不飽和脂肪酸添加到制備的酶液中，加入多元不 飽和脂肪酸的量取決于處理過(guò)程中的各種因素，如番石榴酶提取液中的酶活水 平，所需要的目的產(chǎn)物的量。
一般，多元不飽和脂肪酸的的加入量大約為粗酶液質(zhì)量的0.1%-10%，特別適合是1%-5%。本發(fā)明的處理過(guò)程可以產(chǎn)生大量的多元不飽和脂肪的降解產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以作為天然的香味成分。通過(guò)本發(fā)明可以制得的香味物質(zhì)有天然的C-6的醛類和醇類、C-9的醛類和醇類以及酸類物質(zhì)等。對(duì)于生化反應(yīng)，是將番石榴果實(shí)中提取的粗酶與多元不飽和脂肪酸混合，這 些不飽和脂肪酸可以是其溶液，水或緩沖液溶劑，不飽和脂肪酸溶液與粗酶溶液的比例可以是l: 1至10: 1，更好的是5: 1 (質(zhì)量比)。兩溶液通過(guò)攪拌混合均勻。作為溶液的緩沖液，典型的是10到100mM的磷酸鉀或磷酸鈉溶液。 在進(jìn)行生化反應(yīng)時(shí)應(yīng)通入空氣。為提高酶活，提高酶的純度是需要的，生化反應(yīng)非常迅速，多元不飽和脂肪 酸的降解通常持續(xù)10至60分鐘。典型的反應(yīng)是室溫15"C至25°C。粗酶的制 備可以是通過(guò)超聲波破碎，或利用冰凍反復(fù)融脹破碎細(xì)胞，或者通過(guò)其它物理 或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，以獲得更大量的酶，并保持高效的酶活力。目標(biāo)產(chǎn)物的提取可以采用通常的方法，利用氯仿或乙醚萃取生化反應(yīng)混合 液，在液相和有機(jī)相分層后，取有機(jī)相后將溶劑蒸干，殘留物用己烷提取，然 后蒸發(fā)溶劑，殘留物用甲醇溶解，不溶于甲醇的物質(zhì)在-l(TC放置10-24小時(shí)后析出，并通過(guò)離心去除。本發(fā)明提供一種利用番石榴果實(shí)中存在的脂肪氧化酶和氫過(guò)氧化物裂解酶 酶酶法降解多元不飽和脂肪酸從而產(chǎn)生天然香料方法，對(duì)所用的粗酶液通過(guò)純 化后與多元不飽和脂肪酸進(jìn)行生化反應(yīng)所獲得的產(chǎn)物有很大意義的提高。該發(fā) 明的過(guò)程提供了一種新的，有效獲得具有天然香料物質(zhì)，特別是天然的C-6的醛類和醇類、C-9的醛類和醇類以及酸類物質(zhì)等，通過(guò)進(jìn)一步的提純，可獲得純 化的產(chǎn)物。目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量取決于所用的酶的活力與其反應(yīng)的過(guò)程。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1天然香料的酶法制備I將20g番石榴果實(shí)去皮，機(jī)械破碎后，用石油醚脫脂后于室溫下真空度1.3 千帕真空干燥，取上述脫脂番石榴粉用300ml， 0.01mol/L、 pH6.5的磷酸緩沖液 溶解，fC下攪拌45分鐘，8000rpm離心5分鐘，上清液加入硫酸氨使之飽和度 為50%,離心(10000rpm,15min)，沉淀用50ml的0.01mol/L、 pH6.5的磷酸緩沖 液溶解，溶液即為粗酶液，將亞油酸(純度為60%) lml滴加入粗酶液中，4°C 下攪拌反應(yīng)5小時(shí)，然后加入兩體積的乙醚萃取，收集上層有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀去除溶劑，所得到的天然香料含有天然的C-6的醛類和醇類、C-9的醛類和醇 類以及酸類物質(zhì)。實(shí)施例2天然香料物質(zhì)的酶法制備II50g番石榴去皮后與60ml 0.1M Bis-tris (pH6.8，含0.1%Triton-X100)機(jī)械 攪碎后過(guò)濾，濾液離心25000g 4°C， 30分鐘，沉淀加入6.25ml、 20mM Bis-tris (pH6.8)攪拌lhr(4。C)， 4°C， 25000g離心30分鐘后，上清液作為粗酶液保 存?zhèn)溆?。?.5mL亞麻酸(純度為卯％)分散于15mL含0.05mL吐溫20的 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.8)中，然后與上述獲得的粗酶液混合，暴露在空 氣中4。C下攪拌5小時(shí)后加入兩體積的乙醚萃取，收集上層有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 去除溶劑，所得到的天然香料含有天然的C-6的醛類和醇類、C-9的醛類和醇類 以及酸類物質(zhì)。實(shí)施例3天然香料的酶法制備III2500g去皮的番石榴果實(shí)在1250mL O.lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.8)均質(zhì), 并用超聲波破碎15分鐘,10000 rpm離心30分鐘。上清液加入20mM的CaCl2， 4"C下攪拌1小時(shí)，然后加入硫酸氨使之飽和度為30%， 10000rpm離心獲得的 上清液繼續(xù)加入硫酸氨使之飽和度為60%，離心獲得的沉淀用200ml緩沖液溶 解，溶液既為酶液保存?zhèn)溆谩?50mL花生四烯酸(純度為85%)和5ml上述 制備的酶液混合，置酶反應(yīng)器中，通入氧氣，在4(TC下攪拌8小時(shí)，然后加入 兩體積的乙醚萃取，收集上層有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，即得所要求的天 然香料，內(nèi)含天然的C-6的醛類和醇類、C-9的醛類和醇類以及酸類物質(zhì)。
權(quán)利要求
1、一種利用番石榴中提取的具有高活性的酶用于降解亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸等多元不飽和脂肪酸以產(chǎn)生天然香料的方法。這些具有高活性的酶是指從番石榴果實(shí)中提取，這些高活性的酶是指番石榴果實(shí)中存在的脂肪氧化酶和過(guò)氧化氫物裂解酶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述，從番石榴中提取的酶與多元不飽和脂肪酸混合進(jìn)行 生化反應(yīng)以制備天然香料，操作步驟如下1) 番石榴果實(shí)中脂肪氧化酶和過(guò)氧化氫物裂解酶的提取從番石榴果實(shí)中提 取酶，這里的酶可以是從番石榴果實(shí)中提取的粗酶，也可以是采用色譜柱分離 或其他分離力'法提純后的酶。2) 將多元不飽和脂肪酸，如亞油酸，將0.25mL亞油酸分散于15mL含0.05mL 吐溫20的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.8)中，然后與提取的酶混合，暴露在 空氣中4'C下劇烈攪拌5小時(shí)后，加入兩體積的乙醚萃取，收集上層有機(jī)相，減 壓去除溶劑，即得天然香料。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述，不飽和脂肪酸可以是亞油酸、也可以是其它具有順、 順-l，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸，如亞麻酸和花生四烯酸等。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述，番石榴果實(shí)中所提取的酶含有脂肪氧化酶和過(guò)氧化 氫物裂解酶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述，制備的天然香料產(chǎn)物中包含一些C6-C9的醛類物質(zhì)、 烯醛類物質(zhì)、相應(yīng)醛的醇類物質(zhì)、酸類物質(zhì)等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用番石榴組織中存在的酶合成天然香料的方法，該方法提供一種以亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸等具有順、順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸的底物，利用番石榴組織中存在的酶降解底物，合成具有天然風(fēng)味香料的方法。
文檔編號(hào)C12P7/04GK101225406SQ200710172680
公開日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者于忠梅, 侯心剛, 高彥祥 申請(qǐng)人:華寶食用香精香料(上海)有限公司