專利名稱：在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，為獲得可溶性融合表達(dá)蛋白研究提供便利，具有廣泛的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
腸埃希氏菌(E. coli)通常稱為大腸桿菌，是細(xì)菌的一種，由Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)。根據(jù)不同的生物學(xué)特性將致病性大腸桿菌分為5類致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)。大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛、最成功的表達(dá)體系，常做高效表達(dá)的首選體系。肌酸激酶(Creatine Kinase, CK) (ATP -Creatine N-phosphotransferase EC2. 7. 3. 2)通常存在于動(dòng)物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)，可作為研究蛋白質(zhì)折疊的理想模型。肌酸激酶在心肌梗塞和骨骼肌疾病等的臨床診斷方面是一個(gè)很重要的指標(biāo)。由于肌酸激酶具有的重要的生理功能，所以其得到廣泛關(guān)注和深入研究。斑馬魚(zebra fish)，又名藍(lán)條魚、花條魚、斑馬擔(dān)尼魚(Brachydanio rerio)，原產(chǎn)于印度、孟加拉國(guó)。斑馬魚由于個(gè)體小，養(yǎng)殖花費(fèi)少，能大規(guī)模繁育，其基因與人類87%相似，且具許多優(yōu)點(diǎn)，吸引了眾多研究者的注意。經(jīng)過30多年的研究應(yīng)用和系統(tǒng)發(fā)展，斑馬魚的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)、組織移植技術(shù)、突變技術(shù)、單倍體育種技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因活性抑制技術(shù)等已經(jīng)成熟，且有數(shù)以千計(jì)的斑馬魚胚胎突變體，是研究胚胎發(fā)育分子機(jī)制的優(yōu)良資源，有的還可作為人類疾病模型。斑馬魚已經(jīng)成為最受重視的脊椎動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)模式之一，在其它學(xué)科上的利用也顯示很大的潛力。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，能夠誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，普遍應(yīng)用于原核表達(dá)系統(tǒng)，使其表達(dá)量增高，產(chǎn)物穩(wěn)定，具有易鑒定，易純化的優(yōu)點(diǎn)因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種低溫、低速、低誘導(dǎo)劑、高效地在大腸桿菌中使由ckmt2基因所編碼蛋白可溶性表達(dá)的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，包括以下步驟1)、將導(dǎo)入ckmt2基因的大腸桿菌的菌液于M 沈°C、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度為0. 15 0. 25mM,轉(zhuǎn)速150 250rpm的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4 6小時(shí)(較佳為5小時(shí))；所述菌液的OD600nm為0. 4 0. 6 ；2)、上述步驟1)所得的誘導(dǎo)表達(dá)所得的產(chǎn)物經(jīng)破碎處理后，再離心，所得的破碎后產(chǎn)物上清中含有可溶性的斑馬魚肌酸激酶融合蛋白。作為本發(fā)明的在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法的改進(jìn)步驟2)為誘導(dǎo)表達(dá)所得的產(chǎn)物先離心，棄上清；所得的菌體中加入PBS重懸后，再經(jīng)破碎處理直至未見有白色菌體(此時(shí)呈澄清的淡黃色均質(zhì)溶液)；將破碎后所得的產(chǎn)物離心，所得的破碎后產(chǎn)物上清中含有可溶性的斑馬魚肌酸激酶融合蛋白。一般而言每Iml步驟1)所得的誘導(dǎo)表達(dá)所得的產(chǎn)物配用80 120yL的PBS (PBS緩沖液)進(jìn)行重懸。作為本發(fā)明的在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟1)為將導(dǎo)入ckmt2基因的大腸桿菌的菌液于25°C、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度為0. 2mM，轉(zhuǎn)速200rpm的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)。在本發(fā)明中，采用誘導(dǎo)表達(dá)后，破碎大腸桿菌后，通過離心、加熱等預(yù)處理方法，從而獲得蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)方法得出以下結(jié)論，證明了低溫、低速、低誘導(dǎo)劑，能在大腸桿菌中高效使由ckmt2基因所編碼的蛋白可溶性表達(dá)。此方法具有良好的效果，操作簡(jiǎn)便，可大規(guī)模使用。本發(fā)明的有益效果如下(1)本發(fā)明優(yōu)化得到一種在大腸桿菌中高效的表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶蛋白的方法，解決了形成包涵體不利于蛋白活性測(cè)試的問題，同時(shí)操作起來方便快速；( 通過SDS-PAGE檢測(cè)破碎后的細(xì)胞總蛋白，由該方法獲得的蛋白中，溶于上清的是活性蛋白，減少包涵體蛋白變性復(fù)性過程的損失，為直接純化、活性的檢測(cè)等進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)材料。( 、用大腸桿菌表達(dá)斑馬魚的肌酸激酶是首次，為研究該酶在斑馬魚體內(nèi)的作用以及在分子毒理學(xué)，環(huán)境毒理學(xué)等其他方面的研究提供便利。G)、在此條件下，總蛋白含量表達(dá)較高，目的蛋白較高，目的蛋白中可溶性蛋白較高。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明?？扇苄缘鞍字饕芙庠谏锨逯校灾饕容^上清電泳檢測(cè)。圖1為IPTG至終濃度1福，220印111，371培養(yǎng)511，1和3為上清中的蛋白，2和4為沉淀中的蛋白，克隆表達(dá)的肌酸激酶融合蛋白大小在47KD左右(M表示maker，用來指示蛋白大小，M中第一條帶(即M)為最小，分子量為14. 4KD，M中第五條帶為45KD)，由圖可見蛋白基本在沉淀中。圖2為30°C培養(yǎng)釙沉淀電泳圖，200rpm，IPTG終濃度1為0. ImM，2為0. 2mM，可見沉淀中還是有目的蛋白。該圖中1和2都為沉淀中蛋白電泳結(jié)果。圖3為30°C培養(yǎng)釙上清電泳圖；200rpm，IPTG終濃度1為0. ImM，2為0. 2mM，可見上清中開始出現(xiàn)有目的蛋白。該圖中1和2都為上清中蛋白電泳結(jié)果。
圖4為上清蛋白電泳圖；轉(zhuǎn)速都為200rpm，5h，1為IPTG濃度為0. 4mM，2和3為IPTG濃度為0. 8mM(說明由于設(shè)置2時(shí)有氣泡，所以在旁邊重新上樣品電泳作為3)，這三個(gè)溫度都為30°C ；4為IPTG濃度為0. lmM，5為IPTG濃度為0. 2mM，這二個(gè)溫度為；6為IPTG濃度為0. ImM, 7為IPTG濃度為0. 2mM,誘導(dǎo)溫度為20°C。可見在上清都開始表達(dá)，且條帶也開始變濃，在^°C，IPTG濃度為0. 2mM時(shí)上清濃度最高。圖5為沉淀蛋白電泳；轉(zhuǎn)速都為200rpm，5h，l為IPTG濃度為0.4mM，2為IPTG濃度為0. 8mM,這二個(gè)溫度都為30°C ;3為IPTG濃度為0. ImM, 4為IPTG濃度為0. 2mM,這二個(gè)溫度為;5為IPTG濃度為0. ImM, 6為IPTG濃度為0. 2mM,誘導(dǎo)溫度為20°C?？梢娫谏锨宥奸_始表達(dá)，且條帶也開始變濃，在，IPTG濃度為0. 2mM時(shí)上清濃度最高。可見在沉淀中濃度明顯還是高于上清，在上清濃度最高的其沉淀里面含量也是比較高的，可知在目的蛋白產(chǎn)量比較高。圖6為轉(zhuǎn)速都為200rpm電泳圖；1、3為IPTG濃度為0. 2mM，2、4為IPTG濃度為0. lmM，l和2為16°C處理，3、4為18°C處理，都為上清，可見3有表達(dá)；5和6為16°C沉淀，5、7為IPTG濃度為0. 2mM，6、8為IPTG濃度為0. ImM，7和8為18°C處理，都為沉淀，可見7
和8沉淀還是存在有表達(dá)，但是含量明顯減少。圖 7 為 16°C處理，200rpm，5h ；其中 1 為 16°C、IPTG 濃度為 0. ImM，2 為 16°C、IPTG濃度為0. 2M，都為沉淀中蛋白，7和8分別是其對(duì)應(yīng)上清中蛋白；3為IPTG濃度為0. 4mM,沉淀中蛋白，9為IPTG濃度為0. 4mM，上清；可見在上清和沉淀都有表達(dá)，但是沉淀比較多，不過上清濃度較30°C有提高，較同樣溫度處理下，上清濃度增多。4、5、6分別對(duì)應(yīng)1、2、3相同處理但不加IPTG處理后的沉淀蛋白，10、11、12對(duì)應(yīng)和1、2、3相同處理但不加IPTG處理后的上清中的蛋白，200rpm,釙。圖 8 為 25°C處理，200rpm, 5h。1 為 25°C IPTG 濃度為 0. ImM, 2 為 25°C IPTG 濃度為0. 2mM，都為沉淀中蛋白，5到6為對(duì)應(yīng)1到2，都是上清。雖然上清和沉淀都有表達(dá)，但是沉淀明顯增多，其中6沉淀中目的蛋白明顯少于5，在上清中則稍多。3、4對(duì)應(yīng)1、2相同處理，但是不加IPTG的沉淀蛋白，7、8對(duì)應(yīng)1、2相同處理，但不加IPTG的上清中的蛋白。綜合濃度和實(shí)驗(yàn)操作如調(diào)溫等方便，在25°C，IPTG濃度為0. 2M，轉(zhuǎn)速200rpm為最經(jīng)濟(jì)高效方法。圖9為鎳柱純化上清蛋白后進(jìn)行west-blot檢測(cè)獲得的克隆的蛋白，同全魚提取的作為對(duì)照(如圖中1-6所示，為全魚提取的蛋白做west-blot檢測(cè)，共提取6條魚做的重復(fù)，顯示條帶為肌酸激酶蛋白)，7-9為大腸柑橘克隆表達(dá)并且有那個(gè)鎳柱純化后的蛋白，驗(yàn)證克隆表達(dá)的為目的所需蛋白，因克隆表達(dá)后純化需要，克隆蛋白上有組氨酸標(biāo)簽，比全魚提取大十幾KD。(m為maker，圖上第4條帶大小為40KD，第5條帶為55KD)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中使用的均為以構(gòu)建好的表達(dá)菌種樣本。實(shí)驗(yàn)試劑均為常用的分子生物學(xué)試劑，主要有IPTG，聚丙烯酰胺等常用試劑均購(gòu)于上海生工公司，寧波新芝kientz-II D超聲波破碎儀，純化鎳柱購(gòu)自北京中科院過程研究所，一抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。實(shí)施前處理操作(依次進(jìn)行以下步驟)(1)提取斑馬魚totalRNA，根據(jù)下述設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增斑馬魚ckmt2基因，引物的兩端加入合適的雙酶切酶切位點(diǎn)，對(duì)擴(kuò)增后片段和質(zhì)粒PETjSa同時(shí)進(jìn)行雙酶切、割膠回收等操作后16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5ci感受態(tài)，在含kana終濃度為50μ g/ml的固體LB培養(yǎng)基上涂板挑斑驗(yàn)證，提取質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證后進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21感受態(tài)，在含kana終濃度為50 μ g/ml的固體LB培養(yǎng)基上涂板挑斑驗(yàn)證，同樣提取質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，比對(duì)結(jié)果后對(duì)已驗(yàn)證的菌種，在含有終濃度為50 μ g/ml kana (卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上劃線涂板，37°C過夜。CKMT2Forward primer (弓 |物)CCGGATCCATGTTCAGTCGAGTGT,CKMT2Reserve primer (弓 |物)ATTTGCGGCCGCTTTCTTGAACTGGGAC ；加的雙酶切位點(diǎn)為Bam HI Not I。(2)從平板中挑取1環(huán)單菌落加入5mL含有50 μ g/ml kana的LB液體培養(yǎng)基中。(3)放入37°C培養(yǎng)搖床振蕩培養(yǎng)，220rpm培養(yǎng)過至OD6tltlnm約為0. 5 (0D是optical density (光密度)的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度，nanodrop儀器檢測(cè))。(4)取50 μ L培養(yǎng)液(上述步驟(3)所得)加入5mL含有50 μ g/ml kana的LB培養(yǎng)基中。(5)放入37°C培養(yǎng)搖床振蕩培養(yǎng)，220rpm培養(yǎng)至OD6tltlnm約為0. 5 (大約2到3小時(shí))。得處理菌液(即構(gòu)建好的表達(dá)菌種)。實(shí)施例1、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、取上述處理菌液2. 5ml加入IPTG至IPTG的終濃度ImM ；于220rpm，37°C，繼續(xù)培養(yǎng)5h，收集菌液。取Iml所收集的菌液進(jìn)行12000g離心lOmin，棄上清，菌體加100 μ L PBS重懸， 采用寧波新芝kientz-II D超聲波破碎儀破碎，具體為于200w的功率下破碎，破碎2s, 停3s，如此反復(fù)約8分鐘，此時(shí)溶液為淡黃色均質(zhì)溶液澄清，未見有白色菌體，12000g離心 5min,吸取上清，使上清和沉淀分離，沉淀再加100 μ L PBS重懸。2)、如上處理后，上清和重懸后的沉淀中分別加入IOOyL 2XSDS凝膠載樣緩沖液(艮P，2X SDS-PAGE Loading buffer)，混勻，沸水中煮 lOmin，后 12000rpm 離心 5min， SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，1和3為上清，2和4為沉淀，克隆表達(dá)的肌酸激酶融合蛋白大小在47KD左右(M表示maker，用來指示蛋白大小，圖中第一條帶(即M)為最小，分子量為14. 4KD，圖中第五條帶為45KD)，由圖可見蛋白基本在沉淀中。實(shí)施例2、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 1福，301，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。沉淀如圖2中1所示結(jié)果，上清如圖3中1所示結(jié)果。由此可見沉淀中還是有目的蛋白，上清中開始出現(xiàn)有目的蛋白。實(shí)施例3、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 2福，301，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。沉淀如圖2中2所示結(jié)果，上清如圖3中2所示結(jié)果由此可見沉淀中上清中蛋白檢測(cè)結(jié)果和IPTG至終濃度0. ImM檢測(cè)結(jié)果相差不大。實(shí)施例4、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 4福，301，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清如圖4中1所示結(jié)果，沉淀如圖5中1所示結(jié)果。由此可見沉淀和上清中蛋白都有增加。實(shí)施例5、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 8福，301，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清如圖4中2和3所示結(jié)果，沉淀如圖5中2所示結(jié)果；由此可見沉淀和上清中蛋白都有增加。實(shí)施例6、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 1福，201，200卯111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清如圖4中6所示結(jié)果，沉淀如圖5中5所示結(jié)果；由此可見上清和沉淀中都有目的蛋白，但是含量不高。實(shí)施例7、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 2福，201，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清如圖4中7所示結(jié)果，沉淀如圖5中6所示結(jié)果；由此可見上清和沉淀中都有目的蛋白，但是含量不高。實(shí)施例8、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 1福，觀1，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清如圖4中4所示結(jié)果，沉淀如圖5中3所示結(jié)果；由此可見沉淀蛋白多于上清蛋白。實(shí)施例9、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 2福，觀1，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清如圖4中5所示結(jié)果，沉淀如圖5中4所示結(jié)果。由此可見沉淀蛋白少于上清蛋白。實(shí)施例10、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 1福，161，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清如圖6中2所示結(jié)果，沉淀如圖6中6所示結(jié)果；由此可見沉淀和上清都無目的蛋白。實(shí)施例11、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 2福，161，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。
上清如圖6中1所示結(jié)果，沉淀如圖6中5所示結(jié)果；由此可見沉淀和上清都無目的蛋白。實(shí)施例12、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 4mM, 16°C,200rpm,繼續(xù)培養(yǎng)釙，步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清為圖7中9所示結(jié)果，沉淀為圖7中3所示結(jié)果；由此可見上清和沉淀中出現(xiàn)目的蛋白，但含量都不高，且沉淀蛋白多于上清。實(shí)施例13、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 1福，181，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，收集菌液其余同實(shí)施例1。步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清如圖6中4所示結(jié)果，沉淀如圖6中8所示結(jié)果；由此可見沉淀中有蛋白，上清中基本沒有。實(shí)施例14、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 2福，181，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，收集菌液其余同實(shí)施例1。步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清如圖6中3所示，沉淀如圖6中7所示結(jié)果；由此可見上清中出現(xiàn)蛋白，但沉淀還是有。實(shí)施例15、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 1福，251，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，收集菌液其余同實(shí)施例1。步驟1)的其余內(nèi)容和步驟2)同實(shí)施例1。上清如圖8中1所示結(jié)果，沉淀如圖8中5所示結(jié)果；由此可見總蛋白含量都有增加，沉淀蛋白稍多于上清。實(shí)施例16、在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，將步驟1)的預(yù)處理改成以下內(nèi)容上述處理菌液加入IPTG至終濃度0. 2福，251，200印111，繼續(xù)培養(yǎng)釙，收集菌液。其余同實(shí)施例1。步驟1)的其余內(nèi)容和步驟幻同實(shí)施例1。上清如圖8中2所示結(jié)果，沉淀如圖8中6所示結(jié)果，該上清中斑馬魚肌酸激酶融合蛋白的濃度為8mg/ml。由此可見總蛋白含量都有增加，上清稍多于沉淀。對(duì)所有的實(shí)例圖進(jìn)行分析，bandSCan5. 0(條帶分析軟件)分析可溶性蛋白在總蛋白中的含量，和目的蛋白在總蛋白的含量發(fā)現(xiàn)，如表1，在實(shí)施例16的條件下，上清蛋白含量最多，總的目的蛋白在總蛋白含量中占近22. 4% (上清和沉淀中目的蛋白比值相加/2)， 同時(shí)對(duì)比圖1-8條帶總條帶情況，在此條件下總蛋白含量大(顏色較深條帶多)。表 權(quán)利要求
1.在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，其特征是包括以下步驟1)、將導(dǎo)入ckmt2基因的大腸桿菌的菌液于M ^rc、異丙基硫代半乳糖苷濃度為0. 15 0. 25mM，轉(zhuǎn)速150 250rpm的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4 6小時(shí)；所述菌液的0D600nm為0. 4 0. 6 ；2)、誘導(dǎo)表達(dá)所得的產(chǎn)物經(jīng)破碎處理后，再離心，所得的破碎后產(chǎn)物上清中含有可溶性的斑馬魚肌酸激酶融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，其特征是所述步驟2)為誘導(dǎo)表達(dá)所得的產(chǎn)物先離心，棄上清；所得的菌體中加入PBS重懸后，再經(jīng)破碎處理直至未見有白色菌體；將破碎后所得的產(chǎn)物離心，所得的破碎后產(chǎn)物上清中含有可溶性的斑馬魚肌酸激酶融合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，其特征是所述步驟1)為將導(dǎo)入ckmt2基因的大腸桿菌的菌液于25°C、異丙基硫代半乳糖苷濃度為0. 2mM，轉(zhuǎn)速200rpm的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性斑馬魚肌酸激酶的方法，包括以下步驟1)、將導(dǎo)入ckmt2基因的大腸桿菌的菌液于24～26℃、異丙基硫代半乳糖苷濃度為0.15～0.25mM，轉(zhuǎn)速150～250rpm的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4～6小時(shí)；所述菌液的OD600nm為0.45～0.55；2)、誘導(dǎo)表達(dá)所得的產(chǎn)物經(jīng)破碎處理后，再離心，所得的破碎后產(chǎn)物上清中含有可溶性的斑馬魚肌酸激酶融合蛋白。采用本發(fā)明的方法，能在大腸桿菌中高效使由ckmt2基因所編碼的蛋白可溶性表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N9/12GK102559629SQ20121003521
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者丁先鋒, 趙鐵軍, 郭江峰, 馬琴琴, 黃涵年 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)