專利名稱：：突變的檢測方法及用于該方法的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及突變的檢測方法及用于該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
：作為在基因水平分析所有疾病的病因、個體間的疾病易感性(易患病性)、個體間的藥效差異等的方法，廣泛進(jìn)行點突變即所謂的單核普酸多態(tài)性(SNP)的檢測。點突變的一^:^r測方法例如可以舉出(1)對于試樣的目標(biāo)DNA,對相當(dāng)于檢測對象序列的區(qū)域進(jìn)行擴增，對所得擴增產(chǎn)物的堿基序列進(jìn)行分析的直接測序(directsequencing)法；(2)焦石摔酸測序法(Pyrosequencing);(3)對相當(dāng)于4企測對象序列的區(qū)域進(jìn)行擴增，對所得擴增產(chǎn)物在溫度梯度柱中進(jìn)行HPLC，根據(jù)洗脫時間檢測有無突變的變性HPLC(DenaturingHPLC)法；(4)利用熒光探針結(jié)合于含有目標(biāo)突變的區(qū)域時發(fā)出熒光的現(xiàn)象，通過檢測上述熒光來檢測突變的Invader法；(5)使用目標(biāo)突變位于3，末端區(qū)域的引物進(jìn)行PCR,通過有無擴增來判斷突變的ASP-PCR法等。但是，上述(1)、(2)和(4)方法的靈敏度低,分別達(dá)到約20%、約5%、約5%左右，操作需要很多功夫和時間。上述(3)方法的靈敏度低，約10%,另外，僅能確認(rèn)有無突變，無法分析在何位點產(chǎn)生了何種突變，具有缺乏特異性的問題。另外，上述(5)的方法雖然靈敏度高、但特異性低，具有易于產(chǎn)生假陽性的問題。予以說明，數(shù)值(％)越小則靈敏度為越高。由該問題出發(fā)，近年作為點突變的檢測方法進(jìn)行利用Tm分析的檢測。該方法例如可以如下進(jìn)行。首先，y使用與含有檢測目標(biāo)點突變的檢測對象序列互補的探針，形成試樣中的目標(biāo)單鏈DNA和上述探針的雜交體(雙鏈DNA)。接著，對該雜交形成體實施加熱處理，利用吸光度等信號測定來檢測伴隨溫度上升的雜交體的解離(融解)。然后，根據(jù)該檢測結(jié)果確定Tm值，從而判斷有無點突變。在雜交形成體的同源性越高時Tm值越高，在同源性越低時Tm值越低。因此，對于由含有點突變的檢測對象序列和與其互補的探針形成的雜交形成體，預(yù)先求出其Tm值(評價基準(zhǔn)值)，測定目標(biāo)單鏈DNA和上述探針的Tm值(測定值)，則可以進(jìn)行以下的判斷。當(dāng)上述測定值與上述評價基準(zhǔn)值相同時，則可以判斷為匹配、即目標(biāo)DNA存在點突變。另一方面，上述測定值低于上述評價基準(zhǔn)值時，則可以判定為錯配、即目標(biāo)DNA不存在點突變。但是，使用這種Tm分析的檢測方法具有靈敏度低的問題。舉例來說，對于白血病患者的血細(xì)胞來源的DNA檢測點突變時存在問題(專利文獻(xiàn)l)。白血病是骨髓中的造血干細(xì)胞癌變所引起的疾病。其中，已知慢性粒細(xì)胞白血病(Chronicmyeloidleukemia,CML)的發(fā)病原因在于由第9號染色體和第22號染色體易位所形成的bcr-abl融合基因，在其治療中廣泛使用作為ABL酶抑制劑的伊馬替尼等。但是，存在如下的問題該abl基因(包括上述融合基因中的abl基因)存在點突變時，對伊馬替尼表現(xiàn)出耐受性。此時，治療中有必要進(jìn)行例如伊馬替尼給藥量的增加、換成其它治療藥、改為骨髓移植等。因此，在白血病、特別是CML的治療中，檢測abl基因上有無點突變非常重要。但是，即便是同一個CML患者的血液，在其血細(xì)胞中也包括abl基因中發(fā)生了點突變的序列(檢測對象序列)和未發(fā)生點突變的序列(非檢測對象序列)，兩者的不同僅為點突變、即一個堿基的序列。這樣，發(fā)生如下現(xiàn)象用于檢測點突變的探針與含有點突變的檢測對象序列雜交(匹配)，進(jìn)而還與不含點突變的非檢測對象序列雜交(錯配)。這種情況下，當(dāng)通過Tm分析制作表示信號強度和溫度間的關(guān)系的融解曲線時，匹配的檢測對象序列相應(yīng)的高溫側(cè)的峰因錯配的非檢測對象序列相應(yīng)的低溫側(cè)的峰的存在而難以檢測，進(jìn)而發(fā)生檢測靈敏度降低。專利文獻(xiàn)1:日本特表2004-537992號公報
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題因此，本發(fā)明的目的在于提供利用Tm分析的、檢測靈敏度優(yōu)異的突變檢測方法及用于該方法的檢測用探針試劑盒。用于解決問題的方法為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的突變檢測方法的特征在于，所述試樣為含有4全測位點已發(fā)生突變的4全測對象DNA和所述才企測位點未發(fā)生突變的非測對象DNA的試,所述方法包括下述(A)~(E)工序。(A)向含有上述DNA的試樣中添加包含與#企測對象序列互補的多核苷酸的檢測用探針、和與非;險測對象序列互補的多核苷酸(以下稱作"抑制用多核苷酸")的工序，所述工序中上述#全測對象序列為上述才全測對象DNA或其部分序列，其含有已發(fā)生突變的上述檢測位點，上述非;險測對象序列為上述非4企測對象DNA或其部分序列，其含有未發(fā)生突變的上述檢測位點；(B)使上述檢測用探針與上述DNA雜交的工序；(C)對上述DNA和上述檢測用探針的雜交形成體，測定伴隨溫度變化的信號改變的工序；(D)分析上述信號改變、確定Tm值的工序；(E)由上述Tm值確定上述檢測對象位點有無突變的工序。本發(fā)明的檢測用探針試劑盒，其特征在于，其為本發(fā)明的突變檢測方法中所使用的檢測用探針試劑盒，含有包含與檢測對象序列互補的多核苷酸的檢測用探針和與非檢測對象序列互補的抑制用多核苷酸，上述4企測對象序列為4企測位點已發(fā)生突變的#r測對象DNA或其部分序列，其含有已發(fā)生突變的上述檢測位點，上述非檢測對象序列為上述檢測位點未發(fā)生突變的上述非檢測對象DNA或其部分序列，其含有未發(fā)生突變的上述^r測位點。發(fā)明效果本發(fā)明的突變才企測方法為不僅向試沖羊中添加針對檢測位點已發(fā)生突變的上述檢測對象序列的檢測用探針，還添加針對檢測位點未發(fā)生突變的上述非檢測對象序列的抑制用多核苷酸。因此，可以抑制上述檢測用探針與非檢測對象序列雜交，結(jié)果可以以比以往優(yōu)異的靈敏度(約3%)檢測上述檢測位點的突變。這樣，能夠抑制檢測用探針與非檢測對象序列雜交的原因在于，與上述檢測用探針相比，上述抑制用多核香酸與上述非檢測對象序列的同源性高。因此，本發(fā)明的檢測方法例如對于試樣中含有檢測對象DNA和非檢測對象DNA兩者的試樣有用。特別是，對于白血病患者的試樣有用，其中，對于慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者，在檢測abl基因的突變(包括bcr-abl融合基因中的abl基因的突變)時有用。如上所述，由于能夠以高靈敏度檢測突變，因此能夠在基因水平上分析每個患者的白血病治療藥的適合性，是醫(yī)療領(lǐng)域中極為有用的方法。另外，使用本發(fā)明的檢測用探針試劑盒時，可以容易地進(jìn)行本發(fā)明的突變的檢測方法。圖l為表示本發(fā)明實施例1的、添加了抑制用多核苷酸的Tm分析結(jié)果的圖表。圖2為表示比較例1的、未添加抑制用多核苦酸時的Tm分析結(jié)果的圖表。圖3為表示本發(fā)明上述實施例l的、改變檢測用探針添加比例的Tm分析結(jié)果的圖表。圖4為表示本發(fā)明上述實施例1的、改變抑制用多核香酸添加比例的Tm分析結(jié)果的圖表。圖5為表示本發(fā)明實施例2的、添加抑制用多核苷酸的Tm分析結(jié)果的圖表。圖6為表示本發(fā)明實施例3的、添加抑制用多核普酸的Tm分析結(jié)果的圖表。圖7為表示本發(fā)明實施例4的、添加抑制用多核苷酸的Tm分析結(jié)果的圖表。具體實施例方式本發(fā)明的突變檢測方法如上所述為纟全測試樣中DNA的突變的方法，其特征在于，所述試樣為含有檢測位點已發(fā)生突變的檢測對象DNA和上述檢測位點未發(fā)生突變的非檢測對象DNA的試樣，所述方法包括下述(A)~(E)工序。(A)向含有上述DNA的試樣中，添加包含與^r測對象序列互補的多核苷酸的檢測用探針、和與非檢測對象序列互補的抑制用多核苷酸的工序；(B)使上述檢測用探針與上述DNA雜交的工序；(C)對于上述DNA和上述檢測用探針的雜交形成體，測定伴隨溫度變化的信號改變的工序；(D)分析上述信號改變、確定Tm值的工序；(E)由上述Tm值確定上述^r測對象位點有無突變的工序。上述(A)工序中，上述檢測對象序列是指上述檢測對象DNA或其部分序列，為含有已發(fā)生突變的上述一企測對象位點的序列。另外，上述非檢測對象序列是指上述非檢測對象DNA或其部分序列，為含有未發(fā)生突變的上述檢測對象位點的序列。本發(fā)明中，將檢測位點存在突變的上述檢測對象序列稱作"突變序列"、將含有上述檢測對象序列的檢測對象DNA稱作"突變DNA"、將檢測位點不存在突變的上述非檢測對象序列稱作"正常序列"、將含有上述非檢測對象序列的DNA稱作"正常DNA"。另外，將檢測位點的突變稱作"檢測目標(biāo)的突變"。將成為檢測有無突變的目標(biāo)的試樣中的DNA稱作"目標(biāo)DNA"。本發(fā)明中所4企測的突變例如可以舉出單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。本發(fā)明中，上述試樣中的DNA可以為單鏈DNA還可以是雙鏈DNA。上述DNA為雙鏈DNA時，優(yōu)選包括例如在上述(B)雜交工序之前，通過加熱4吏上述試樣中的雙《連DNA解離的工序。通過將雙鏈DNA解離為單鏈DNA，在之后的(B)雜交工序中，可以高效地進(jìn)行與檢測用探針或抑制用多核苷酸的雜交。本發(fā)明中，上述試樣中的DNA例如可以為基因或者基因的部分序列。另外，上述試樣中的DNA例如可以是生物試樣等試樣中原本含有的DNA,例如為了能夠提高檢測精度，優(yōu)選為通過基因擴增法擴增出的擴增產(chǎn)物。具體地說，可以列舉出例如以上述試樣原本含有的DNA為模板，通過基因擴增法擴增出的擴增產(chǎn)物、或者以cDNA為模板，利用基因擴增法擴增出的擴增產(chǎn)物，所述cDNA為由上述試樣原本所含的RNA(總RNA、mRNA等)通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(例如RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR))產(chǎn)生的。上述擴增產(chǎn)物的長度并無特別限定，例如為50~1000mer、優(yōu)選為80~200mer。應(yīng)用本發(fā)明檢測方法的試樣并無特別限定。本發(fā)明例如如上所述，對于以含有具有目標(biāo)突變的DNA(檢測對象DNA)和不具有目標(biāo)突變的DNA(非檢測對象DNA)兩者作為目標(biāo)DNA的試樣非常有用。上述DNA或RNA的來源并無特別限定，例如可以舉出各種癌細(xì)胞等細(xì)胞、病毒、線粒體等。特別是，如上所述，對于白血病患者的生物試樣(例如血液試樣)進(jìn)行突變細(xì)胞和具有未發(fā)生突變的DNA的細(xì)胞，因此易于發(fā)生如前所述的問題。因此，本發(fā)明的檢測方法特別優(yōu)選應(yīng)用于具有已發(fā)生突變的DNA和未發(fā)生突變的DNA的試樣，例如優(yōu)選應(yīng)用于白血病的生物試樣，具體例子為血液試樣、白細(xì)胞等。予以說明，本發(fā)明中，試樣的采集方法、DNA的制備方法等并無限定，可以采用目前已知的方法。本發(fā)明的檢測目標(biāo)的突變并無特別限定。如上所述，在檢測與白血病有關(guān)的突變時，已知檢測用探針與非檢測對象序列雜交。因此，舉例來說，在檢測與白血病相關(guān)的基因的突變時，本發(fā)明的方法有用。作為上述與白血病相關(guān)的基因的突變例如可以舉出abl基因的突變(包括bcr-abl融合基因中的abl基因的突變)。例如，可以舉出在序列號l所示的abl基因的cDNA序列(mRNA序歹'J)中，第756位堿基G、第758位堿基A、第763位堿基G的突變。這些堿基報道有例如向下述堿基的突變。予以說明，abl基因序列的NCBI登錄號No.NM—005157。突變G756C第756位堿基G突變?yōu)镃突變A758T第758位堿基A突變?yōu)門突變G763A第763位堿基G突變?yōu)锳本發(fā)明中，上述檢測用探針只要是與檢測位點已發(fā)生突變的上述檢測對象序列互補的序列即可，上述抑制用多核苷酸只要是與檢測位點未發(fā)生突變的上述非檢測對象序列互補的序列即可。上述探針和上述抑制用多核苷酸的長度并無特別限定，優(yōu)選為相同的長度。上述檢測用探針的序列與上述抑制用多核普酸的序列例如除了在形成雜交體時與上述檢測位點(發(fā)生目標(biāo)突變的位點)成對的位點(堿基)之外，優(yōu)選為90%~100%相同的序列，特別優(yōu)選為100%相同。另外，上述檢測用探針與上述抑制用多核苷酸例如只要為相同的鏈，則可以設(shè)計成與DNA正義鏈和反義鏈的任一個雜交。以下，舉出檢測abl基因的上述3種突變(G756C、A758T、G763A)所使用的檢測用探針和抑制用多核苷酸的組合。予以說明，各序列中，以大寫表示的堿基分別對應(yīng)于abl基因第756位、第758位、第763位堿基。本發(fā)明并非局限于這些。突變G756C(正鏈的檢測用)檢測用探針序列號25，國ccgtaGtggcccccgc-3，抑制用多核苷酸序列號35'-ccgtaCtggcccccgc-3'突變A758T(正鏈檢測用)檢測用探針序列號45，-ccgAactggcccccgc-3，抑制用多核苷酸序列號55'-cctccccgTactggcccccg-3'抑制用多核苷酸序列號65'-ccgTactggcccccgc-3'突變G763A(反鏈4企測用)檢測用探針序列號75,-ccagtacgggAaggtgt-3，抑制用多核苷酸序列號85，-ccagtacgggGaggtgt_3,本發(fā)明中，上述抑制用多核苷酸的添加比例并無特別限定，例如可以根據(jù)上述檢測用探針的長度、檢測對象序列的GC含量等檢測體系的條件適當(dāng)決定。抑制用多核苷的相對于上述檢測用探針的添加比例并無特別限定，以摩爾比計下限例如為O.l倍以上、優(yōu)選為l倍以上、更優(yōu)選為2倍以上。另外，以摩爾比計上限例如為IOO倍以下。上述抑制用多核苷酸的長度并無特別限定，例如為550mer、優(yōu)選為1030mer、優(yōu)選i殳定為與上述檢測用探針相同的長度。本發(fā)明中，與上述檢測對象序列互補的檢測用探針的添加比例并無特別限定，例如為了能夠充分地確保檢測信號，優(yōu)選相對于上述試樣中的DNA以摩爾比計為1倍以下。在添加上述抑制用多核苷酸的基礎(chǔ)上，還可以期待通過控制上述檢測用探針的添加比例進(jìn)一步提高檢測靈敏度。另外，由于僅設(shè)定上述檢測用探針的添加比例就足夠，因此操作極為簡單。上述檢測用探針的添加比例更優(yōu)選相對于上述DNA以摩爾比計為O.l倍以下。此時，試樣中的DNA例如可以是檢測對象DNA和非檢測對象DNA的合計，還可以是含有檢測對象序列的擴增產(chǎn)物和含有非檢測對象序列的擴增產(chǎn)物的合計。予以說明，試樣的DNA中的斗企測只于象DNA的比例通常不清楚，但結(jié)果上優(yōu)選上述檢測用探針的添加比例例如相對于纟企測對象DNA(或者含有纟企測對象的擴增產(chǎn)物)以摩爾比計為10倍以下、更優(yōu)選為5倍以下、進(jìn)一步優(yōu)選為3倍以下。另外，其下限也無特別限定，例如相對于上述檢測對象DNA等，以摩爾比計優(yōu)選為0.001倍以上、更優(yōu)選為0.01倍以上、進(jìn)一步優(yōu)選為0.1倍以上。予以說明，檢測用探針相對于上述DNA的添加比例例如可以是相對于雙鏈DNA的摩爾比，還可以是相對于單鏈DNA的摩爾比。另外，上述檢測用探針的長度并無特別限定，例如為5~50mer、優(yōu)選為1030mer。說明Tm值。持續(xù)加熱含有雙鏈DNA的溶液時，260nm的吸光度上升。這是由于雙鏈DNA的雙鏈間的氬鍵通過加熱而解開、解離成單鏈DNA(DNA的融解)。而且，當(dāng)所有雙鏈DNA解離、成為單鏈DNA時，其吸光度顯示為開始加熱時的吸光度(僅雙鏈DNA時的吸光度)的約1.5倍左右，由此可以判斷融解完成。根據(jù)該現(xiàn)象，融解溫度Tm—般定義為吸光度到達(dá)吸光度總上升量的50%時的溫度。本發(fā)明中，對用來確定Tm值的、隨著溫度上升的信號改變的測定，例如由上述原理出發(fā)，通過測定260nm的吸光度來進(jìn)行。更優(yōu)選使用用標(biāo)記物標(biāo)記的探針作為上述檢測用探針，進(jìn)行信號改變的測定。上述檢測用探針的標(biāo)記位點并無特別限定。另外，標(biāo)記物也無特別限定，但通?？梢越Y(jié)合于核苷酸的磷酸基上。上述標(biāo)記探針例如可以舉出單獨時顯示信號且通過雜交不顯示信號的標(biāo)記探針，或者單獨時不顯示信號且通過雜交顯示信號的標(biāo)記探針。為前者的探針時，在與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時不顯示信號，通過加熱而探針游離則顯示信號。另外，為后者的探針時，通過與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈DNA)顯示信號，通過加熱而探針游離則信號減弱(消失)。因此，例如通過在信號特有的條件(吸光度等)下檢測該標(biāo)記物所產(chǎn)生的信號，可以與上述260nm的吸光度測定同樣地進(jìn)行融解及Tm值的確定。上述標(biāo)記物并無限定，例如可以舉出熒光染料(熒光團)。上述標(biāo)記探針的具體例子優(yōu)選例如經(jīng)熒光染料標(biāo)記、單獨時顯示熒光且通過雜交熒光減弱(例如淬滅)的探針。利用這種熒光淬滅現(xiàn)象(Quenchingphenomenon)的揮:針^皮稱作熒光淬滅探針。其中，檢測用探針優(yōu)選寡核苷酸的3，末端或5，末端用熒光染料標(biāo)記，；故標(biāo)記的上述末端的石咸基優(yōu)選為C。此時，優(yōu)選如下設(shè)計上述檢測用探針的堿基序列在檢測用探針?biāo)s交的檢測對象DNA中，與上述檢測用探針的末端堿基C成對的堿基或距離上述成對堿基l~3個堿基的堿基為G。這種探針一般稱作鳥嘌呤淬滅探針，已知有所謂的QProbe(注冊商標(biāo))。當(dāng)這種鳥噪呤淬滅探針與檢測對象DNA雜交時，通過被熒光染料標(biāo)記的末端的C接近上述檢測對象DNA的G,顯示上述熒光染料的發(fā)光變?nèi)?熒光強度減弱)的現(xiàn)象。上述熒光染料并無特別限定，例如可以舉出熒光素、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等。市售的熒光染料例如可以舉出BODIPYFL(商標(biāo)名、MolecularProbes公司制)、FluorePrime(商品名、AmershamPharmacia公司制)、Fluoredite(商品名、Millipore社制)、FAM(ABI社制)、Cy3和Cy5(AmershamPharmacia公司制)、TARMA(MolecularProbes公司制)等。檢測條件并無特別限定，可以根據(jù)所用的熒光染料適當(dāng)決定。舉例來說，PacificBlue例如可以在檢測波長450~480nm下4企測、TAMRA例如可以在檢測波長585~700nm下檢測、BODIPYFL例如可以在檢測波長515~555nm下檢測。使用這種探針時，可以通過信號改變?nèi)菀椎卮_i/v雜交和解離。另夕卜，上述抑制用多核苷酸優(yōu)選未^C標(biāo)記。接著，以abl基因(序列號l)的第758位堿基A的點突變(A—T)為例，說明本發(fā)明的檢測方法。予以說明，本發(fā)明的特征在于添加抑制用多核苷酸，對于其它工序和條件并無任何限定。另外，檢測用探針?biāo)s交的檢測對象序列例如可以是序列號l的堿基序列中第758位堿基A突變成T的全長序列，但只要含有作為纟企測位點的第758位堿基(A—T),則優(yōu)選為部分序列。首先，從全血中分離基因組DNA。從全血分離基因組DNA可以通過目前已知的方法進(jìn)^亍，例如可以<吏用市售的基因組DNA分離試劑盒(商品名GFXGenomicBloodDNAPurificationkit;GEHealthcareBioScience公司制)等。接著，向含有所分離的基因組DNA的試樣中添加4企測用探針和抑制用多核苷酸。添加上述檢測用探針和抑制用多核苷酸時，如后所述并無任^T限定，在本實施方式中，作為一例可以舉出在添加斗全測用探針后添加抑制用多核香酸的方法。即，向含有所分離的基因組DNA的試樣中首先添加檢測用探針。上述檢測用探針例如可以舉出前面所述的探針，其中優(yōu)選QProbe。該QProbe如上所述，通常末端堿基為胞嘧，定、用熒光染料標(biāo)記上述末端的探針。而且，通過其與檢測對象序列雜交，上述熒光染料和檢測對象序列的鳥嘌呤相互作用，結(jié)果熒光減弱(或淬滅)。上述檢測用探針的序列如上所述，只要與含有點突變的檢測對象序列互補即可，可以根據(jù)上述檢測對象序列適當(dāng)設(shè)計。當(dāng)檢測abl基因(序列號l)的第758位堿基A的點突變(A—T)時，例如可以舉出包含上述序列號4的堿基序列的多核苷酸等。突變A758T的檢測用探針序列號45，-ccgaActggcccccgc-3，(GC含量81.3%)以上述試樣中的DNA或RNA為模板進(jìn)行基因擴增法時，上述檢測用探針的添加的時機并無特別限定。上述檢測用探針例如可以在后述的基因擴增處理后，向所得擴增產(chǎn)物中添加，但優(yōu)選在基因擴增處理之前添加。如此在基因擴增處理前添加上述檢測用探針時，例如為了預(yù)防探針本身的延伸，可以在其3，末端進(jìn)一步附加磷酸基，還可以用上述熒光染料標(biāo)記3，末端。上述檢測用探針例如可以添加于含有所分離的基因組DNA的液體試樣中，還可以在溶劑中與基因組DNA混合。上述溶劑并無特別限定，例如可以舉出THs-HCl等緩沖液，含有KC1、MgCl2、MgS04、甘油等的溶劑，PCR反應(yīng)液等目前已知的溶劑。接著，以所分離的基因組DNA為模板，利用基因擴增法進(jìn)行目標(biāo)序列的擴增。具體地說，對含有產(chǎn)生4企測目標(biāo)的點突變的堿基位點的序列即4企測對象序列、和非才企測對象序列進(jìn)行擴增?；驍U增法并無限定，例如可以舉出PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PolymeraseChainReaction)、NASBA(依賴核酸序列的擴增,Nucleicacidsequencebasedamplification)法、TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增,Transcription-mediatedamplification)法、SDA(鏈置換擴增，StrandDisplacementAmplification)法等，優(yōu)選PCR法。予以說明，下面以PCR法為例說明本發(fā)明，但本發(fā)明并非局限于此。PCR的條件并無特別限定，可以通過目前已知的方法進(jìn)行。PCR的引物序列例如只要是能夠擴增目標(biāo)檢測對象序列即可，可以根據(jù)目標(biāo)序列、利用目前已知的方法適當(dāng)設(shè)計。所擴增的區(qū)域例如可以僅為目標(biāo)4全測序列，還可以是含有上述沖企測對象序列的區(qū)域。引物的長度并無特別限定，可以設(shè)定為一般的長度，例如1030mer。如上所述，當(dāng)檢測abl基因(序列號1)的第758位堿基A的點突變(A—T)時，舉例來說，可以使用包含下述多核苷酸的引物。這些引物的組合并無特別限定。予以說明，當(dāng)將包含序列號9的堿基序列的多核苷酸(正向引物)和包含序列號10的堿基序列的多核普酸(反向引物)組合時，所得擴增產(chǎn)物的長度為103mer左右。(引物對1)正向引物序列號95，-ggagatggaacgcacggac-3，(GC含量63.2%)反向引物序列號105，畫ggccaccgtcaggctg畫3，(GGU:750/o)(引物對2)正向引物序列號115，-gacaagtgggagatggaacgc_3,反向引物序列號125'-cacggccaccgtcagg-3'接著，在后述的雜交工序之前，向含有上述擴增產(chǎn)物的試樣中添加上述抑制用多核苷酸。上述抑制用多核苷酸的添加比例如上所述。如上所述，添加的時才凡并非局限于此，例如可以在上述檢測用探針添加之前、之后或與添加上述檢測探針同時進(jìn)行。另外，上述抑制用多核苷酸的添加例如可以是上述基因擴增處理之前、之后的任一種，例如為了處理簡單，優(yōu)選在基因擴增處理之前預(yù)先添加。這樣在基因擴增處理前添加上述抑制用多核苷酸時，例如為了防止抑制用多核苷酸本身延伸，可以在其3，末端進(jìn)一步附加磷酸基。如上所述，檢測abl基因(序列號l)的第758位堿基A的點突變(A—T)時，作為抑制用多核苷酸例如可以舉出不含點突變的、包含序列號5的堿基序列的多核苷酸等。該抑制用多核苷曰久H迅巧突變A758T的抑制用多核苷酸序列號55，-cctccccgTactggcccccg畫3'(GC含量80%)接著，進(jìn)行所得擴增產(chǎn)物的解離以及使通過解離獲得的單鏈DNA與上述檢測用探針及抑制用多核普酸雜交。上述解離工序的加熱溫度只要是上述擴增產(chǎn)物能夠解離的溫度則無特別限定，例如為85。C以上、優(yōu)選為85。C~95°C。加熱時間也無特別限定，例如為l秒~10分鐘、優(yōu)選為l秒~5分鐘。另外，解離的單鏈DNA和上述檢測用探針的雜交以及上述單4連DNA和上述抑制用多核苷酸的雜交例如可以在上述解離工序后，通過降低上述解離工序的加熱溫度而進(jìn)行。溫度條件例如為40。C以下。雜交工序的反應(yīng)液中各組分的體積、濃度并無特別限定，舉例來說，在上述反應(yīng)液中，DNA濃度例如為O.Ol~lpM、優(yōu)選為O.l~0.5jiM,上述4企測用探針的濃度優(yōu)選為例如滿足上述檢測用探針對DNA的添加比例的范圍，例如為0.001~lO[iM、優(yōu)選為0.001~1(iM,上述抑制用多核苷酸的濃度例如為0.1nM~lmM、優(yōu)選為O.lnM~100|iM。本發(fā)明中，如上所述，抑制用多核苷酸的添加很重要，例如檢測對象DNA、檢測用探針、抑制用多核苷酸在反應(yīng)液中的濃度等并無特別限定。舉例來說，在后述的信號檢測中，例如所用裝置的檢測靈敏度相對越高則越可以降低反應(yīng)液中檢測對象DNA的濃度，所用裝置的檢測靈敏度相對越低則越應(yīng)增加反應(yīng)液中的檢測對象DNA的濃度。舉例來說，在后述的信號檢測中，使用市售裝置(商品名SmartCycler;Cepheid公司制)時，例如優(yōu)選反應(yīng)液中檢測對象DNA濃度為5~1000nM、上述檢測用探針濃度為501000nM、上述抑制用多核苷酸濃度為5nM100pM，更優(yōu)選檢測對象DNA濃度為10~500nM、上述檢測用探針濃度為100~500nM、上述抑制用多核苷酸濃度為10nM~50pM。而且，對所形成的、上述單鏈DNA與上述標(biāo)記探針或抑制用多核苷酸的雜交形成體進(jìn)行加熱，測定伴隨溫度上升的信號改變。例如，使用Q-Probe時，在與單鏈DNA雜交的狀態(tài)下熒光減弱(或淬滅)，在解離的狀態(tài)下發(fā)出熒光。因此，例如可以慢慢加熱熒光減弱(或淬滅)了的雜交形成體，測定伴隨溫度上升的焚光強度的增加。測定信號改變時的溫度范圍并無特別限定。開始溫度例如為室溫(例如10。C)~85°C、優(yōu)選為2570。C,終止溫度例如為40105t:。另外，溫度的上升速率并無特別限定，例如為(U2(TC/秒、優(yōu)選為0.3~5。C/秒。接著，分析上述信號改變，確定Tm值。具體地說，可以由所得熒光強度計算各溫度下的值(刁熒光強度增加量/&)，將顯示最低值的溫度作為Tm值。另外，還可以將每單位時間的熒光強度增加量(焚光強度增加量/t)最高的點作為Tm值。予以說明，不使用淬滅探針、而是使用單獨時不顯示信號且通過雜交顯示信號的探針作為檢測用探針時，相反地測定熒光強度的減弱量即可。上述Tm值例如可以用目前已知的MELTCALC軟件(http:〃www.meltcalc.com/)等計算，或者還可以用鄰接法(NearestNeighborMethod)確定。另外，本發(fā)明中，例如還可以測定雜交時的信號改變來代替如上所述的加熱雜交形成體并測定伴隨溫度上升的信號改變的方法。即，還可以在降低添加有上述探針的試樣溫度以形成雜交形成體時，測定伴隨上述溫度降低的信號改變。以下示出具體例子。使用單獨時顯示信號且通過雜交不顯示信號的標(biāo)記探針(例如Q-Probe)作為檢測用探針時，在將上述檢測用探針添加于試樣中時，上述探針為解離狀態(tài)，因此發(fā)出熒光，但通過降低溫度而形成雜交體時，上述熒光減弱(或淬滅)。因此，例如可以慢慢降低上述試樣的溫度，測定伴隨溫度降低的焚光強度的減弱。另外，使用單獨時不顯示信號且通過雜交顯示信號的標(biāo)記探針作為檢測用探針時，在將上述探針添加于試樣中時，由于上述探針為解離狀態(tài)，因此不會發(fā)出熒光，但通過降低溫度而形成雜交體時，則發(fā)出熒光。因此，例如可以慢慢降低上述試樣的溫度，測定伴隨溫度降低的焚光強度的增加。接著，本發(fā)明的檢測用探針試劑盒，如上所述，其特征在于，其為用于本發(fā)明的突變檢測方法的試劑盒，含有包含與檢測對象序列互補的多核苷酸的檢測用探針和、與非檢測對象序列互補的抑制用多核苷酸。本發(fā)明中，上述檢測對象序列如上所述為檢測位點已發(fā)生突變的檢測對象DNA或其部分序列，為含有已發(fā)生突變的上述檢測位點的序列。另外，上述非檢測對象序列如上所述為上述檢測位點未發(fā)生突變的上述非檢測對象DNA或其部分序列，為含有未發(fā)生突變的上述檢測位點的序列。本發(fā)明的檢測用探針試劑盒只要含有上述探針和上述抑制用多核苷酸即可，其它成分并無限定。上述探針和上述抑制用多核苷酸并無限定，可以使用與上述同樣的物質(zhì)，優(yōu)選組合也如上所述。本發(fā)明的檢測用探針試劑盒中，上述探針和上述抑制用多核苷酸可以混合成一個試劑，也可以獨立作為個別試劑。為前者時，優(yōu)選上述探針和上述抑制用多核苷酸以上述那樣的比例混合。為后者時，例如可以按照反應(yīng)液中的比例為上述那樣的范圍而使用。另外，本發(fā)明的檢測用探針試劑盒還可以具有用另外，本發(fā)明的數(shù)據(jù)分析方法，其特征在于，其為用于確定DNA有無突變的數(shù)據(jù)分析方法，具有下述(a)~(b)工序。(a)對本發(fā)明的突變檢測方法的(C)工序所獲得的信號改變進(jìn)行分析，演算Tm值的工序(b)由上述演算工序演算出的上述Tm值確定DNA有無突變的工序本發(fā)明的系統(tǒng)，其特征在于，其為用于檢測試樣中DNA有無突變的系統(tǒng)，具有以下單元輸入本發(fā)明的突變檢測方法的(C)工序中獲得的信號改變的輸入單元、由上述輸入單元輸入的上述信號改變演算Tm值的演算單元、以及根據(jù)上述演算單元演算出的Tm值確定DNA有無突變的確定單元。本發(fā)明的系統(tǒng)例如可以舉出通過計算機系統(tǒng)構(gòu)建的才企測裝置。上述系統(tǒng)的石更件結(jié)構(gòu)并無限定，例如在作為控制部的CPU上連接存儲裝置、鍵盤或鼠標(biāo)等輸入裝置，進(jìn)而，還可以連接結(jié)果的輸出裝置、顯示輸入數(shù)據(jù)或結(jié)果的顯示裝置(顯示器)等。另外，各單元例如可以為通過計算機的CPU執(zhí)行規(guī)定程序而實現(xiàn)的功能模塊。因此，各構(gòu)成單元例如可以不安裝成硬盤形式，還可以是網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。另外，本發(fā)明的系統(tǒng)例如可以具有用于執(zhí)行本發(fā)明的突變檢測方法的(B)工序、(C)工序的單元。用于執(zhí)行上述工序的單元例如可以舉出溫度控制單元、信號的4全測單元。通過上述溫度控制單元的執(zhí)行，例如可以進(jìn)行通過雜交形成雙鏈DNA(雜交形成體)、雜交形成體的解離。另外，通過上述信號檢測單元的執(zhí)行，例如可以檢測隨著溫度變化形成雜交形成體所產(chǎn)生的信號改變量、雜交形成體解離所產(chǎn)生的信號改變量。此時，例如除了上述輸入單元，還可以具有記錄單元，其記錄通過上述信號檢測單元檢測的信號改變。而且，本發(fā)明的系統(tǒng)還可以具有輸出單元，其輸出由上述確定單元所確定的DNA有無突變。本發(fā)明的程序為可以在計算機上執(zhí)行本發(fā)明的數(shù)據(jù)分析方法的計算機程序。另外，本發(fā)明的電子介質(zhì)為保存有本發(fā)明的計算機程序的計算機可讀取的電子介質(zhì)(也成為"記錄介質(zhì)")。接著，一并說明本發(fā)明的實施例和比l交例。但本發(fā)明并非局限于下述實施例和比較例。abl基因第758位石威基的點突變(A—T)(1)添加抑制用多核苷酸，對abl基因第758位堿基的點突變(A—T)進(jìn)行Tm分析。制備abl基因第758位堿基沒有突變的白細(xì)胞細(xì)胞抹的基因組DNA(序列號1)和abl基因第758位堿基具有突變的白細(xì)胞細(xì)胞抹的基因組DNA(序列號1中第758位石威基為T:abl酪氨酸激酶A758T(=Y253F))。以下，將沒有突變的前者稱作"wtDNA"、具有突變的后者稱作"mtDNA"。然后，將兩者制備成規(guī)定比例(mtDNA:wtDNA=100:0、50:50、10:90、5:95、3:97、0:100),將l()4copy/test(l(iL)添加于下述PCR反應(yīng)液50pL中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。上述PCR反應(yīng)液中，抑制用多核苷酸的終濃度為200nM、；險測用探針的終濃度為50nM。上述PCR反應(yīng)利用熱循環(huán)儀在95。C下處理60秒鐘后、以95。C下10秒鐘和60。C下30秒鐘為一個循環(huán)反復(fù)進(jìn)行50個循環(huán)，進(jìn)而在95。C下處理1秒鐘、40。c下處理6o秒鐘。然后使溫度的上升速率為rc/3秒，將上述PCR反應(yīng)液從40。C加熱至95。C,測定實時的熒光強度的變化。測定波長為585~700nm。予以說明，檢測用探針的添加比例相對于上述PCR擴增產(chǎn)物以摩爾比計為0.1倍，抑制用多核苷酸的添加比例相對于上述PCR擴增產(chǎn)物以摩爾比計為0.4倍和相對于上述探針以摩爾比計為4倍。予以說明，檢測用探針相對于檢測對象DNA(;險測對象序列的擴增產(chǎn)物)的添加比例如下所述。將這些結(jié)果作為實施例l-l。另外，比較例l-l除了將蒸餾水2jiL代替抑制用多核苷酸2pL添加于下述PCR反應(yīng)液之外，同樣進(jìn)行熒光強度的測定。表l樣品相對于檢測對象DNA(mtDNA:wtDNA)的添加比例表2(PCR反應(yīng)液單位(iL)蒸餾水34.37510xgeneTaqbuffer*540%甘油3.1252.5mMdNTPs4lOO^M正向引物0.5100|iM反向引物0.255|iM才企測用探針0.55pM抑制用多核苷酸25U/uLGeneTagFP*_^2i共計50pL*商品名GeneT叫FP:NIPPONGENECO.，LTD.制(以下同樣)倍倍丄2立口立n12倍-u-u.u57o正向引物序列號95，-ggagatggaacgcacggac-3，反向引物序列號105,-ggccaccgtcaggctg-3，檢測用探針序列號45，-(TARMA)-ccgAactggcccccgc-P-3，抑制用多核苷酸序列號55'-cctccccgTactggcccccg-3'將它們的結(jié)果示于圖l和圖2中。兩圖為表示伴隨溫度上升的熒光強度變化的Tm分析的圖表，縱軸的微分值表示"-d熒光強度增加量/dt"(以下相同)。圖l為實施例l-l的結(jié)果、圖2為比較例l-l的結(jié)果。圖l中，(A)為全基因組100%具有點突變的試樣的結(jié)果、(B)為全基因組中5%具有點突變的試樣的結(jié)果、(C)為全基因組中3%具有點突變的試樣的結(jié)果、(D)為全基因組沒有點突變的試樣的結(jié)果。圖2中，(A)為全基因組100%具有點突變的試樣的結(jié)果、(B)為全基因組中50%具有點突變的試樣的結(jié)果、(C)為全基因組中5%具有點突變的試樣的結(jié)果、(D)為全基因組中3%具有點突變的試樣的結(jié)果、(E)為全基因組沒有點突變的試樣的結(jié)果。如圖l的(A)和圖2的(A)所示，mtDNA在69.5。C檢測出信號峰，如圖l的(D)和圖2的(E)所示，wtDNA在61.5。C檢測出信號峰。以其為標(biāo)準(zhǔn)評價各試樣。結(jié)果，在未添加抑制用多核苷酸的比較例l-l中，當(dāng)mtDNA為50。/o時，如圖2的(B)所示，可檢測到mtDNA的信號；但當(dāng)mtDNA為少量(5%、3%)時，如圖2的(C)和(D)所示，完全檢測不到mtDNA的信號。與此相反，在添加抑制用多核苷酸的實施例l-l中，即1更mtDNA為少量(5%、3%)，如圖l的(B)和(C)所示，可檢測到mtDNA的信號。即，可以說通過添加抑制用多核苷酸，由于抑制了檢測用探針與沒有點突變的wtDNA雜交，結(jié)果，與mtDNA結(jié)合的檢測用探針的量增加，由此檢測靈敏度提高。(2)進(jìn)而，改變檢測用探針的添加比例，對abl基因第758位堿基的點突變(A—T)進(jìn)行Tm分析。使上述實施例1中PCR反應(yīng)液的檢測用探針添加量由0.5nL變成0.1(iL、使蒸餾水添加量由34.375pL變成34.775pL、將上述檢測用探針的終濃度設(shè)定為原來的l/5即10nM,除此之外，與上述實施例l同樣進(jìn)行Tm分析。將其結(jié)果作為實施例l-2，示于圖3。該圖中，(A)為全基因組100%具有點突變的試樣的結(jié)果、(B)為全基因組中10%具有點突變的試樣的結(jié)果、(C)為全基因組中5%具有點突變的試樣的結(jié)果、(D)為全基因組中3%具有點突變的試樣的結(jié)果。該結(jié)果如該圖所示，可以顯著地4全測到mtDNA的峰。例如與除了探針添加量之外在相同條件下進(jìn)行分析的實施例l-l的結(jié)果相比，如圖3的(C)和上述圖l的(B)、圖3的(D)和圖l的(C)所示，通過比實施例l-l減少探針的添加量(相對于PCR擴增產(chǎn)物以摩爾比計為0.02倍)，wtDNA的峰進(jìn)一步變小、mtDNA的峰相對增大。由此可知，通過調(diào)節(jié)纟笨針添加量，纟全測靈敏度進(jìn)一步提高。(3)增加抑制用多核苷酸的添加量，對abl基因第758位堿基的點突變(A—T)進(jìn)行Tm分析。使上述實施例1中PCR反應(yīng)液的抑制用多核苷酸添加量由2(iL變成3(iL、使蒸餾水添加量由34.375iiL變成33.775jiL,除此之外，與上述(2)的實施例l-2同樣地進(jìn)行Tm分析。上述PCR反應(yīng)液的抑制用多核苷酸的終濃度為3OOnM、檢測用探針的終濃度為10nM。將它們的結(jié)果作為實施例1-3,示于圖4。該圖中，(A)為全基因組100%具有點突變的試樣的結(jié)果、(B)為全基因組中10%具有點突變的試樣的結(jié)果、(C)為全基因組中5%具有點突變的試樣的結(jié)果、(D)為全基因組中3%具有點突變的試樣的結(jié)果。該結(jié)果如該圖所示，可以顯著地檢測到mtDNA的峰。特別是，與除了抑制用多核苷酸的添加量之外在相同條件下進(jìn)行分析的實施例l-2的結(jié)果相比，如圖4的(B)和上述圖3的(B)、圖4的(C)和圖3的(C)、圖4的(D)和圖3的(D)所示，通過比實施例1-2增加抑制用多核苷酸的添加量(相對于上述探針以摩爾比計為30倍)，wtDNA的峰進(jìn)一步變小、mtDNA的峰相對增大。由此可知，通過調(diào)節(jié)抑制用多核苷酸添加量，檢測靈敏度進(jìn)一步提高。abl基因第756位堿基的點突變(G—C)添加抑制用多核苷酸，對abl基因第756位堿基的點突變(G—C)進(jìn)行Tm分析。制備插入有序列號1所示的第756位堿基G沒有突變的正常abl基因序列的質(zhì)粒和插入有上述第756位石咸基G突變?yōu)镃的突變abl基因(abl酪氨酸激酶G756C(=Q250E))的質(zhì)粒。以下，將沒有突變的前者稱作"wtDNA"、具有突變的后者稱作"mtDNA"。然后，與上述實施例l的表l同樣，將兩者制備成規(guī)定比例(mtDNA:wtDNA=0:100、3:97、100:0),將104copy/test(lnL)添加于下述PCR反應(yīng)液49^L中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。上述PCR反應(yīng)液中的抑制用多核苷酸的終濃度為300nM、檢測用探針的終濃度為50nM。上述PCR反應(yīng)如下進(jìn)行利用熱循環(huán)儀在95"C下處理60秒鐘后、以95°C下1秒鐘和58°C下30秒鐘為1個循環(huán)反復(fù)進(jìn)行50個循環(huán)，進(jìn)而在95°C下處理1秒鐘、40°C下處理60秒鐘。然后使溫度的上升速率為rC/3秒，將上述PCR反應(yīng)液從40。C加熱至95"C,測定實時的熒光強度的變化。測定波長為585700nm。檢測用探針的添加比例相對于PCR擴增產(chǎn)物以摩爾比計為0.05倍，抑制用多核苷酸的添加比例相對于上述PCR擴增產(chǎn)物以摩爾比計為0.3倍和相對于上述探針以摩爾比計為6倍。另外，比較例2除了將蒸餾水3代替3抑制用多核苷酸添加于下述PCR反應(yīng)液中之外，同樣進(jìn)行熒光強度的測定。表3(PCR反應(yīng)液單位|iL)蒸餾水21.7510xgeneTaqbuffer*40%甘油12.52.5mMdNTPs4100mMMgCl20.5lOO(xM正向引物1100pM反向引物0,55pM檢測用探針0.55pM抑制用多核苷酸35德LGeneTaqFP*0.25共計49jiL正向引物序列號135,-gacaagtgggagatggaacgc-3，反向引物序列號145，-cacggccaccgtcagg-3，檢測用探針序列號25，國(BODIPYFL)-ccgtaGtggcccccgc—抑制用多核苷酸序列號35，-ccgtaCtggcccccgc-P-3，將它們的結(jié)果示于圖5中。該圖為表示伴隨溫度上升的熒光強度變化的Tm分析的圖表。圖5中，(A)為全部質(zhì)粒均沒有點突變的試樣的結(jié)果、(B)為全部質(zhì)粒100%具有點突變的試樣的結(jié)果、(C)和(D)為全部質(zhì)粒中3。/。具有點突變的試樣的結(jié)果。上述(C)為比較例2的結(jié)果，上述(D)為實施例2的結(jié)果。如該圖的(A)所示，wtDNA在61.0。C檢測出信號峰，如該圖的(B)所示，mtDNA在67.0。C檢測出信號峰。以其為標(biāo)準(zhǔn)，評價全部質(zhì)粒中3%具有點突變的試樣。結(jié)果，如該圖的(C)所示，在未添加抑制用多核苷酸的比較例2中，完全檢測不到mtDNA的信號。與此相反，在添加抑制用多核苷酸的實施例2中，如該圖的(D)所示，即便mtDNA為少量，也可檢測wtDNA和mtDNA兩者的信號。abl基因第763位堿基的點突變(G—A)添加抑制用多核苷酸，對abl基因第763位堿基的點突變(G—A)進(jìn)行Tm分析。制備插入有序列號1所示的第763位堿基G沒有突變的正常abl基因序列的質(zhì)粒和插入有上述第763位堿基G突變?yōu)锳的突變abl基因(abl酪氨酸激酶G763A(=E255K))的質(zhì)粒。以下，將沒有突變的前者稱作"wtDNA"、具有突變的后者稱作"mtDNA"。然后，與上述實施例l的表l同樣，將兩者制備成規(guī)定比例(mtDNA:wtDNA=0:100、3:97、100:0),^)奪104copy/test(l^L)添加于下述PCR反應(yīng)液49ixL中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。上述PCR反應(yīng)液的抑制用多核苷酸的終濃度為500nM、；險測用探針的終濃度為50nM。上述PCR反應(yīng)與上述實施例2同樣地進(jìn)行，測定實時的熒光強度的變化。測定波長為585~700nm。檢測用探針的添加比例相對于上述PCR擴增產(chǎn)物以摩爾比計為0.05倍，抑制用多核苷酸的添加比例相對于上述PCR擴增產(chǎn)物以摩爾比計為0.5倍和相對于上述探針以摩爾比計為10倍。另外，比較例3除了將蒸餾水5jliL代替5jiL抑制用多核苷酸添加于下述PCR反應(yīng)液中之外，同樣進(jìn)行焚光強度的測定。表4(PCR反應(yīng)液單位(iL)蒸餾水23.3751OxgeneTaqbuffer*540%甘油9.3752.5mMdNTPs4lOO^M正向引物0.5lOOjiM反向引物15pM檢測用^笨針0.55|iM抑制用多核苷酸55U/>LGeneTaqFP*_Qui!共計49nL正向引物序列號155，_gacaagtgggagatggaacgc-3，反向引物序列號165，-cacggccaccgtcagg-3，檢測用探針序列號75，-(BODIPYFL)國ccagtacgggAaggtgt-P-3，抑制用多核苷酸序列號85,-ccagtacgggGaggtgt-P-3，將它們的結(jié)果示于圖6中。該圖為表示伴隨溫度上升的熒光強度變化的Tm分析的圖表。圖6中，(A)為全部質(zhì)粒均沒有點突變的試樣的結(jié)果、(B)為全部質(zhì)粒100%具有點突變的試樣的結(jié)果、(C)和(D)為全部質(zhì)粒中3%具有點突變的試樣的結(jié)果。上述(C)為比較例3的結(jié)果，上述(D)為實施例3的結(jié)果。如該圖的(A)所示，wtDNA在50.0。C檢測出信號峰，如該圖的(B)所示mtDNA在59.0。C檢測出信號峰。以其為標(biāo)準(zhǔn)，評價全部質(zhì)粒中3%具有點突變的試樣。結(jié)果，如該圖的(C)所示，在未添加抑制用多核苷酸的比較例3中，完全檢測不到mtDNA的信號。與此相反，在添加抑制用多核苷酸的實施例3中，如該圖的(D)所示，即便mtDNA為少量，也可檢測wtDNA和mtDNA兩者的信號。abl基因第758位堿基的點突變(A—T)添加抑制用多核苷酸，對abl基因第758位堿基的點突變(A—T)進(jìn)行Tm分析。制備插入有序列號1所示的第758位堿基A沒有突變的正常abl基因序列的質(zhì)粒和插入有上述第758位堿基A突變?yōu)門的突變abl基因(abl酪氨酸激酶A758T(^Y253F))的質(zhì)粒。以下，將沒有突變的前者稱作"wtDNA"、具有突變的后者稱作"mtDNA"。然后，與上述實施例l的表l同樣，將兩者制備成規(guī)定比例(mtDNA:wtDNA=0:100、3:97、100:0),^!夸104copy/test(lpL)添加于下述PCR反應(yīng)液49pL中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。上述PCR反應(yīng)液中的抑制用多核苷酸的終濃度為500nM、檢測用探針的終濃度為50nM。上述PCR反應(yīng)與上述實施例2同樣地進(jìn)行，測定實時的熒光強度的變化。測定波長為585~700nm。4企測用4笨針的添加比例相對于上述PCR擴增產(chǎn)物以摩爾比計為0.05倍，抑制用多核苷酸的添加比例相對于上述PCR擴增產(chǎn)物以摩爾比計為0.5倍和相對于上述探針以摩爾比計為IO倍。另外，比較例4除了將蒸餾水5pL代替5(iL抑制用多核苷酸添加于下述PCR反應(yīng)液之外，同樣進(jìn)行熒光強度的測定。表5(PCR反應(yīng)液單位jiL)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>5，-(TARMA)國ccgAactggcccccgc-P-3，抑制用多核苷酸序列號65，-ccgTactggcccccgc-P-3，將它們的結(jié)果示于圖7中。該圖為表示伴隨溫度上升的熒光強度變化的Tm分析的圖表。圖7中，(A)為全部質(zhì)粒沒有點突變的試樣的結(jié)果、(B)為全部質(zhì)粒100%具有點突變的試樣的結(jié)果、(C)和(D)為全部質(zhì)粒中3%具有點突變的試樣的結(jié)果。上述(C)為比較例4的結(jié)果，上述(D)為實施例4的結(jié)果。如該圖的(A)所示，wtDNA在60.0。C檢測出信號峰，該圖的(B)所示，mtDNA在67.0。C檢測出信號峰。以其為標(biāo)準(zhǔn)，評價全部質(zhì)粒中3%具有點突變的試樣，結(jié)果，如該圖的(C)所示，在未添加抑制用多核苷酸的比較例4中，完全檢測不到mtDNA的信號。與此相反，在添加抑制用多核苷酸的實施例4中，如該圖的(D)所示，即便mtDNA為少量，也可檢測wtDNA和mtDNA兩者的信號。產(chǎn)業(yè)實用性如上所述，#^居本發(fā)明的突變才全測方法，通過添加上述這樣的抑制用多核苷酸，例如即使是白血病患者的白細(xì)胞試樣這樣的混合存在有具有點突變的檢測對象DNA和沒有上述點突變的非檢測對象DNA的試樣，也能夠以優(yōu)異的靈敏度檢測上述點突變。另外，由于突變的種類可以特定，因此是特異性也優(yōu)異的檢測方法。因而，該方法對于白血病患者的點突變檢測非常有用，例如還能夠在基因水平上分析白血病治療藥在不同個體間是否合適，可以說是醫(yī)療領(lǐng)域中才及為有用的方法。權(quán)利要求1.一種突變檢測方法，其為檢測試樣中的DNA的突變的方法，其特征在于，所述試樣為含有檢測位點已發(fā)生突變的檢測對象DNA和所述檢測位點未發(fā)生突變的非檢測對象DNA的試樣，所述方法包括下述(A)～(E)工序，(A)向含有所述DNA的試樣中，添加包含與檢測對象序列互補的多核苷酸的檢測用探針、和與非檢測對象序列互補的多核苷酸的工序，所述工序中所述檢測對象序列為所述檢測對象DNA或其部分序列，其含有已發(fā)生突變的所述檢測位點，所述非檢測對象序列為所述非檢測對象DNA或其部分序列，其含有未發(fā)生突變的所述檢測位點；(B)使所述檢測用探針與所述DNA雜交的工序；(C)對于所述DNA和所述檢測用探針的雜交形成體，測定伴隨溫度變化的信號改變的工序；(D)分析所述信號改變、確定Tm值的工序；(E)由所述Tm值確定所述檢測對象位點有無突變的工序。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其中，所述檢測用#笨針為用標(biāo)記物標(biāo)記的探針。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變檢測方法，其中，所述標(biāo)記探針為單獨時顯示信號且通過雜交不顯示信號的標(biāo)記探針；或者為單獨時不顯示信號且通過雜交顯示信號的標(biāo)記探針。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變檢測方法，其中，所述標(biāo)記光減弱的探針。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變檢測方法，其中，所述標(biāo)記探針是其3，末端的堿基為胞嘧啶且所述3，末端被標(biāo)記的探針。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變檢測方法，其中，所述標(biāo)記探針是其5，末端的堿基為胞嘧啶且所述3'末端被標(biāo)記的探針。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的突變檢測方法，其中，所述與檢測對象序列互補的檢測用探針和所述與非;險測對象序列互補的多核苷酸除了與所述4企測位點成對的位點之外序列相同。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其中，所述與非才企測對象序列互補的多核苷酸的添加比例相對于所述測用4笨4十以摩爾比計為0.1~100倍。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其中，所述才企測用探針的添加比例相對于所述DNA以摩爾比計為1倍以下。10.#^居權(quán)利要求1所述的突變;f企測方法，其中，所述DNA為來自白細(xì)胞的DNA。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其中，所述突變?yōu)閍bl基因的突變。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其中，所述突變?yōu)樾蛄刑?的堿基序列中第756位堿基G突變?yōu)镃。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的突變檢測方法，其中，所述檢測用探針為包含序列號2的堿基序列的探針，所述與非檢測對象序列互補的多核苷酸為包含序列號3的堿基序列的多核苷酸。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其中，所述突變?yōu)樾蛄刑?的堿基序列中第758位堿基A突變?yōu)門。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的突變檢測方法，其中，所述檢測用探針為包含序列號4的堿基序列的探針，所述與非檢測對象序列互補的多核苷酸為包含序列號5和序列號6中的至少一者的堿基序列的多核香酸。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其中，所述突變?yōu)樾蛄刑?的堿基序列中第763位堿基G突變?yōu)锳。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的突變檢測方法，其中，所述檢測用探針為包含序列號7的堿基序列的探針，所述與非檢測對象序列互補的多核苷酸為包含序列號8的石咸基序列的多核苷酸。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其中，所述試樣中的DNA為雙鏈DNA,所述方法包括在所述(B)工序之前通過加熱使所述試樣中的雙鏈DNA解離的工序。19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其中，所述DNA是以來自于所述試樣的DNA為模板、利用基因擴增法擴增出的擴增產(chǎn)物。20.根據(jù)^l利要求1所述的突變才全測方法，其中，所述DNA是以cDNA為模板、利用基因擴增法擴增出的擴增產(chǎn)物，所述cDNA為由來自于所述試樣的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的。21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其中，所述(C)工序中，將所述DNA和所述檢測用探針的雜交形成體加熱，測定伴隨溫度上升的信號改變。22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變檢測方法，其為同時進(jìn)行所述(B)工序和所述(C)工序的方法，降低所述試樣的溫度以形成所述雜交形成體，并測定伴隨所述溫度降低的信號改變。23.—種檢測用探針試劑盒，其特征在于，其為權(quán)利要求1所述的突變檢測方法中使用的檢測用探針試劑盒，含有包含與檢測對象序列互補的多核苷酸的檢測用探針、和與非檢測對象序列互補的多核苷酸，所述^r測對象序列為4企測位點已發(fā)生突變的^r測對象DNA或其部分序列，其含有已發(fā)生突變的所述檢測位點，所述非一企測對象序列為所述檢測位點未發(fā)生突變的所述非檢測對象DNA或其部分序列，其含有未發(fā)生突變的所述檢測位點。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的檢測用探針試劑盒，其中，所述檢測用纟冢針為用標(biāo)記物標(biāo)記的探針。25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的檢測用探針試劑盒，其中，與所述檢測對象序列互補的檢測用探針和與所述非檢測對象序列互補的多核苷酸除了與所述檢測位點成對的位點之外序列相同。26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的檢測用探針試劑盒，其中，所述突變?yōu)閍bl基因的突變。27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的檢測用探針試劑盒，其中，所述突變?yōu)樾蛄刑?的堿基序列中第756位堿基G突變?yōu)锳,所述檢測用探針為包含序列號2的堿基序列的探針，所述與非檢測對象序列互補的多核苷酸為包含序列號3的堿基序列的多核苷酸。28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的檢測用探針試劑盒，其中，所述突變?yōu)樾蛄刑?的^咸基序列中第758位》成基A突變?yōu)門,所述檢測用探針為包含序列號4的堿基序列的探針，所述與非檢測對象序列互補的多核苷酸為包含序列號5和序列號6中的至少一者的堿基序列的多核苷酸。29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的檢測用探針試劑盒，其中，所述突變?yōu)樾蛄刑?的堿基序列中第763位堿基G突變?yōu)锳，所述檢測用探針為包含序列號7的堿基序列的探針，所述與非檢測對象序列互補的多核苷酸為包含序列號8的堿基序列的多核苷酸。30.—種數(shù)據(jù)分析方法，其特征在于，其為用于確定DNA有無突變的數(shù)據(jù)分析方法，具有下述(a)~(b)工序，(a)由權(quán)利要求1所述的突變檢測方法的(C)工序中所獲得的信號改變，演算Tm值的工序，(b)由所述演算工序演算出的所述Tm值來確定DNA有無突變的工序。31.—種突變檢測系統(tǒng)，其特征在于，其為用于檢測試樣中的DNA有無突變的系統(tǒng)，其具有下述單元輸入權(quán)利要求1所述的突變檢測方法的(C)工序中獲得的信號改變的輸入單元、由所述輸入單元輸入的所迷信號改變演算Tm值的演算單元、以及#^據(jù)所述演算單元演算的Tm值確定DNA有無突變的確定單元。32.能夠在計算機上執(zhí)行權(quán)利要求30所述的數(shù)據(jù)分析方法的計算機程序。33.保存有權(quán)利要求32所述的計算機程序的電子介質(zhì)。全文摘要本發(fā)明提供利用Tm分析的、檢測靈敏度優(yōu)異的突變檢測方法。向含有檢測位點已發(fā)生突變的檢測對象DNA和上述檢測位點未發(fā)生突變的非檢測對象DNA的試樣中，添加檢測用探針以及抑制用多核苷酸，使上述檢測用探針與上述DNA進(jìn)行雜交，所述檢測用探針包含與含有已發(fā)生突變的上述檢測位點的檢測對象序列互補的多核苷酸，所述抑制用多核苷酸與含有未發(fā)生突變的所述檢測位點的非檢測對象序列互補。然后，加熱前述DNA和前述檢測用探針的雜交形成體，測定伴隨溫度上升的信號改變，對所述信號改變進(jìn)行分析以確定Tm值，從而確定突變的有無。文檔編號C12Q1/68GK101421420SQ200780013688公開日2009年4月29日申請日期2007年7月27日優(yōu)先權(quán)日2006年8月8日發(fā)明者前川平,平井光春,木村晉也,間島智史申請人:愛科來株式會社