專利名稱：用來測定激酶的活性的方法、顆粒和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及用來測定一種或多種激酶的活性的方法和組合物(例
如顆粒和試劑盒(kit))，更具體來說，本發(fā)明涉及在多重(multiplex)法中， 使用熒光檢測測定與顆粒結(jié)合的一種或多種激酶的一種或多種活性的方法 和組合物。
2. 現(xiàn)有技術(shù)描述
以下涉及的描述和實(shí)施例雖然包括在該背景部分中，但是并非因此承 認(rèn)其為現(xiàn)有技術(shù)。
蛋白激酶對活的生物體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)具有重要意義，在
自然界中很容易產(chǎn)生。例如，在人類基因組中存在超過500種蛋白激酶和
超過500,000種人類磷酸化位點(diǎn)。蛋白酶可以寬泛地定義為催化磷酸酯從
三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化為氨基酸殘基的酶。蛋白質(zhì)磷酸化的非正常表達(dá)可能
與活的生命體、特別是人類體內(nèi)的一些疾病和惡性腫瘤相關(guān)。因此，通過
對蛋白激酶活性進(jìn)行監(jiān)控，可能有益于檢測疾病和惡性腫瘤和/或鑒別用于
治療疾病和惡性腫瘤的治療藥劑(即用來促進(jìn)或抑制活生物體內(nèi)的蛋白激
酶活性的治療藥劑)。
對微陣列技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的是，如果能夠迅速地確 定在化學(xué)和生物被分析物中是否存在分析物以及/或者測定分析物的濃度，
將會是有益的。另外(或者)，如能同時(shí)對多種分析物進(jìn)行檢測，也將是有 益的。在本文中，將同時(shí)檢測單獨(dú)樣品中的多種分析物的操作稱為多重法 方案(multiplexing scheme)。用來測定激酶活性的常規(guī)技術(shù)通常不適于高產(chǎn) 量篩選和/或多重試驗(yàn)。具體來說，許多用來測定激酶活性的常規(guī)技術(shù)使用 放射性同位素，依賴于液相色譜和/或質(zhì)譜進(jìn)行分析，因此不適于快速檢測。另外，這些方法無法連續(xù)監(jiān)測激酶活性，因此無法精確測定激酶活性。其 它用來測定激酶活性的技術(shù)包括昂貴的特異化的生物試劑，例如磷酸肽-特 異化抗體。 一般來說，基于抗體的微陣列會產(chǎn)生大量的假陽性和假陰性， 這是因?yàn)榭贵w具有無法預(yù)期的交叉反應(yīng)性。因此，基于抗體的激酶活性技 術(shù)通常不適用于高通量的篩選和/或多重試驗(yàn)。另外的測定激酶活性的方法 使用熒光敏化劑，其在磷酸化的時(shí)候發(fā)生構(gòu)象變化。但是用于常規(guī)試驗(yàn)的 大多數(shù)熒光敏化劑在磷酸化的時(shí)候表現(xiàn)出非常有限的熒光變化，這限制了 其實(shí)用性。
因此，如果能夠開發(fā)一種新的、特別是適于高通量篩選和/或多重的試 驗(yàn)方法、顆粒和試劑盒來測定被分析物中的激酶活性，將會是非常有益的。

發(fā)明內(nèi)容
以下對于用來測定激酶活性的方法、顆粒和試劑盒的各種實(shí)施方式的 描述決不會以任何方式構(gòu)成對所附權(quán)利要求的主題的限制。
用來處理顆粒的方法的一個實(shí)施方式包括使得熒光顆粒接觸被分析 物，所述熒光顆粒包括載體基質(zhì)以及通過所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載
體基材連接的肽底物(peptide substrate),所述載體基質(zhì)包含一種或多種熒 光材料。該方法還包括在使得所述熒光顆粒接觸被分析物的過程中對所述 肽底物進(jìn)行磷酸化，然后對所述熒光顆粒進(jìn)行處理，使得所述肽底物去磷 酸化，在脫去磷酸化的位點(diǎn)產(chǎn)生極化的碳-碳雙鍵(在下文中稱為極化的雙 鍵)。另外，該方法包括通過所述極化的雙鍵將包含親核性端基的熒光指示 劑(reporter)與所述熒光顆粒連接。
顆粒的一個實(shí)施方式包括包含一種或多種熒光材料的載體基質(zhì)，以 及通過所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載體基質(zhì)連接的肽底物。
用來測定樣品內(nèi)的激酶活性量的試劑盒的一個實(shí)施方式包含大量熒光 顆粒以及一種或多種激酶特異性的肽底物。所述大量的熒光顆粒各自包括 載體基質(zhì)，所述載體基質(zhì)包含一種或多種設(shè)計(jì)用來發(fā)射在第一波長范圍的 熒光的熒光材料。
用來測定樣品中激酶活性量的方法的一個實(shí)施方式包括使得熒光顆粒的不同亞組的集合群體接觸所述樣品。所述熒光顆粒中的至少一部分包含 載體基質(zhì)，該載體基質(zhì)包含設(shè)計(jì)成能發(fā)射第一波長范圍內(nèi)的熒光的一種或 多種熒光材料，所述熒光顆粒的不同亞組中的至少一部分分別包含一種或 多種熒光材料的不同構(gòu)型。另外，至少一部分的所述熒光顆粒包含通過所 述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載體基質(zhì)連接的肽底物，所述熒光顆粒的不同 亞組中的至少一部分分別包含不同的肽底物。所述方法還包括對所述樣品 和所述集合群體進(jìn)行磷酸化處理，所述磷酸化處理用來為所述肽底物的接
收殘基添加磷酸基團(tuán)(phosphate group)。
另外，所述方法包括隨后對大量所述熒光顆粒進(jìn)行處理，使得如果所 述大量熒光顆粒中存在任何磷酸化的肽底物，則所述磷酸化的肽底物會去 磷酸化，在所述肽底物的脫去磷酸化的位點(diǎn)生成極化的雙鍵。另外，所述 方法包括對所述大量熒光顆粒進(jìn)行進(jìn)一步處理，使得如果所述肽底物的脫 去磷酸化的位點(diǎn)存在任何極化的雙鍵，則熒光指示劑會通過其親核性端基 在所述極化雙鍵的位置與所述熒光顆粒連接。這些熒光指示劑設(shè)計(jì)成用來 發(fā)射在不同于所述第一波長范圍的第二波長范圍內(nèi)的熒光。該方法還包括 隨后測量所述大量熒光顆粒的熒光發(fā)射，根據(jù)測定的在所述第一波長范圍 內(nèi)的熒光發(fā)射來確定樣品中顆粒的亞組類別。另外，該方法包括在所述樣 品和集合群體經(jīng)受所述脫去磷酸工藝處理的時(shí)候，根據(jù)是否存在測定的第
二波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射，確定樣品中激酶活性量。 附圖簡述
結(jié)合附圖，通過以下對本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的詳述，本領(lǐng)域技術(shù)人員
可以很明顯地看出本發(fā)明的其它益處，在附圖中


圖1顯示了用來對熒光顆粒進(jìn)行處理以進(jìn)行激酶檢測的方法的流程
圖2顯示了使用多重試驗(yàn)的方案測量樣品內(nèi)的激酶活性的方法的流程圖。
盡管本發(fā)明可以進(jìn)行各種改變和采用替代形式，但在附圖以示例的方 式顯示了本發(fā)明的特定實(shí)施方式，并在本文中詳細(xì)描述。附圖可能不是按照比例繪制的。但是應(yīng)當(dāng)理解，附圖和詳述并不是將本發(fā)明的范圍限制在所 揭示的特定形式，本發(fā)明應(yīng)包括所附權(quán)利要求書定義的本發(fā)明范圍內(nèi)的所 有變化、等同形式和替代形式。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述
一般來說，在本文中，術(shù)語"顆粒"應(yīng)表示任意用來對化學(xué)和生物被 分析物進(jìn)行分析的基材，可具體表示用來提供和/或支持相關(guān)分析物(包括 但不限于激酶活性)的定性和/或定量的分子反應(yīng)的物體。另外，術(shù)語"顆 粒"可表示具有很寬的粒度范圍的顆粒，包括但不限于尺寸約為1納米至
300微米的物體。因此，術(shù)語"顆粒"應(yīng)表示大量不同的材料和構(gòu)型，包括但 不限于微球體、珠粒、聚苯乙烯珠粒、微型顆粒、金納米顆粒、量子點(diǎn) (quantum dot)、納米點(diǎn)、納米顆粒、復(fù)合顆粒(例如金屬-聚合物顆?；虼判?-聚合顆粒)、納米殼體、納米棒、納米管、納米珠粒、膠乳顆粒、膠乳珠粒、 熒光珠粒、熒光顆粒、彩色顆粒、彩色珠粒、組織、細(xì)胞、微生物、孢子、 有機(jī)物、任意非有機(jī)物或者它們的任意組合。因此，在本文中，任意的所 述術(shù)語均可與術(shù)語"顆粒"互換地使用。
參見附圖，圖1中顯示了用來對熒光顆粒進(jìn)行處理，以進(jìn)行激酶檢測 的方法的流程圖。如圖1所示，所述方法可包括框IO，其中使得熒光顆粒 接觸被分析物。所述被分析物可以是生物被分析物或化學(xué)被分析物?？騣o 顯示，所述熒光顆粒包括含有一種或多種熒光材料的載體基質(zhì)，以及通過 所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載體基質(zhì)連接的肽底物。如上所述，在本文 中，術(shù)語"顆粒"可表示任何用于對化學(xué)被分析物和生物被分析物進(jìn)行分析 的基質(zhì)，因此術(shù)語"熒光顆粒"可包括包含一種或多種光致發(fā)光材料(例如熒 光團(tuán)、熒光染料或其它熒光材料)的這些基質(zhì)中的任何一種。盡管關(guān)于熒光 染料描述了實(shí)施方式，但是應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的這些實(shí)施方式可以利用 任意的光致發(fā)光材料(例如熒光團(tuán)或量子點(diǎn))。所述光致發(fā)光材料可以結(jié)合 入所述載體基質(zhì)中和/或連接于所述載體基質(zhì)的表面。在一些實(shí)施方式中， 可以特別有益地使得所述載體基質(zhì)交聯(lián)，以便將多種光致放光材料結(jié)合入 所述載體基質(zhì)內(nèi)。這些實(shí)施方式特別適用于多重的試驗(yàn)，使得顆粒的分類可達(dá)到等于或大于100的量級。所述熒光顆粒的載體基質(zhì)可以包含任意的
用于對化學(xué)被分析物和生物被分析物進(jìn)行分析的材料，包括但不限于聚苯 乙烯、金屬或芯-殼材料的復(fù)合體。
如上所述，除了包含一種或多種熒光材料的所述熒光顆粒的載體基質(zhì)
以外，所述熒光顆粒包含通過所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)(例如COOH, NH2, OH等)與所述載體基質(zhì)連接的激酶底物。更具體來說，所述熒光顆粒可以 包含與所述載體基質(zhì)連接的激酶特異性肽底物，在一些情況下，所述激酶 特異性肽底物通過共價(jià)鍵與所述載體基質(zhì)連接。在此情況下，肽底物可能 如圖1的流程圖中的框12所述容易發(fā)生磷酸化。具體來說，圖1中的框12 說明該方法包括在所述熒光顆粒與被分析物接觸的步驟中使得肽底物磷酸 化。這樣的磷酸化過程可以在存在ATP以及激酶的情況下進(jìn)行。所述激酶 可能很容易地從樣品中得到，或者可以是加入的，用于進(jìn)行所述磷酸化處 理。對于激酶特異性的決定因素尚未充分為人們所知，但是應(yīng)當(dāng)理解，肽 底物的絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸殘基周圍的氨基酸序列的基序以及所述底物 的三維結(jié)構(gòu)都對該特異性有貢獻(xiàn)。
在任意的情況下，所述磷酸化過程可以在所述肽底物的絲氨酸、蘇氨 酸或酪氨酸殘基上觀察到。在一些實(shí)施方式中，所述磷酸化過程可以在存 在離子型液體的情況下進(jìn)行。從理論上來說，離子型液體可以加快磷酸化 速率，縮短該方法的操作時(shí)間，并且/或者減少可能阻礙所述熒光顆粒后續(xù) 的操作(特別是下面對框14和16所述的操作)的副產(chǎn)物的產(chǎn)生。在一些情 況下，用來促進(jìn)所述磷酸化過程的離子型液體可以通過微波加熱。 一般來 說，微波加熱可進(jìn)一步提高磷酸化的速率。更具體來說，使用通過微波加 熱的離子型液體可以將完成所述磷酸化過程所需的時(shí)間從數(shù)小時(shí)縮短到數(shù) 分鐘。
在使得肽底物磷酸化之后，可以將所述熒光顆粒從所述樣品中移出， 使得所述熒光顆?？梢赃M(jìn)行隨后的操作，以測定激酶活性(如下文詳細(xì)描 述)。在一些實(shí)施方式中，所述熒光顆粒的載體基質(zhì)可以是磁性的，所述移 出的操作可包括施加磁場，在移出上清液的同時(shí)使顆粒固定不動。這樣的 實(shí)施方式可以有益地簡化從樣品中移出顆粒的過程，可能能夠因此避免耗時(shí)的過濾步驟。但是，在任意的其他的情況中，所述熒光顆粒的載體基質(zhì) 可能不是磁性的，所述顆?？梢酝ㄟ^過濾移出。
再來看圖1中的框14，該方法包括對所述熒光顆粒進(jìn)行處理，使得所 述肽底物脫去磷酸化，在肽底物脫去磷酸的位點(diǎn)產(chǎn)生極化的雙鍵。所述脫
去磷酸的過程可以通過堿催化的l3-消除工藝進(jìn)行。 一般來說，所述p-消除
工藝可使用任何足以催化所述工藝的堿。堿的例子包括但不限于氫氧化鈉
和氫氧化四甲基銨(TMA)。在一些情況下，可以有益地使用較弱的堿(即pH 小于14的堿)，例如TMA,已減少該過程產(chǎn)生的副產(chǎn)物的量。在一些實(shí)施 方式中，可以將離子型液體與較弱的堿相結(jié)合，以進(jìn)一步減少副產(chǎn)物的生 成。在另一個實(shí)施方式中，所述堿和離子型液體可以通過微波加熱以加快 所述p-消除反應(yīng)的速率。在任意的情況下，所述p-消除反應(yīng)設(shè)計(jì)用來從肽 底物除去磷酸基團(tuán)(phosphate gro叩)并用極化的雙鍵代替該磷酸基團(tuán)。所 述極化的雙鍵可以稱為邁克爾受體，其可用于下文對框16的更詳細(xì)描述的 邁克爾加成反應(yīng)。
如圖1所示，該方法包括框16，其中通過所述極化的雙鍵將包含親核 性端基的熒光指示劑與所述熒光顆粒連接。該反應(yīng)一般稱為邁克爾類反應(yīng)， 大體上可定義為親核原子加成到包含極化的雙鍵的化合物。包含親核原子 的化合物通常被稱為"邁克爾給體"，包含極化的雙鍵的化合物通常被稱 為"邁克爾受體"。如上所述，在對框14所述的卩-消去反應(yīng)產(chǎn)生的極化的 雙鍵可以作為邁克爾受體。包含親核性端基的熒光指示劑可以作為邁克爾 給體，可與所述熒光顆粒的極化的雙鍵反應(yīng)，使得熒光指示劑通過所述親 核性端基與所述熒光顆粒相連。上面對框12描述的磷酸化和p-消去步驟， 在一些實(shí)施方式中，將熒光指示劑與熒光顆粒相連的過程可以在存在離子 型液體的情況下進(jìn)行，在一些實(shí)施方式中，可以在存在通過微波加熱的離 子型液體的情況下進(jìn)行。通過采用離子型液體可以有益地減少連接過程中 副產(chǎn)物的生成，提高隨后的顆粒復(fù)合物的產(chǎn)率。另外，通過微波加熱可以 加快連接過程的反應(yīng)速率，縮短生產(chǎn)時(shí)間。
一般來說，熒光指示劑可以包括以下化合物連有親核性端基的任意 光致發(fā)光材料(例如熒光團(tuán)、熒光染料或其它熒光材料)。另外，所述親核性端基可包括任意的親核性基團(tuán)，例如但不限于巰基和氨基。在一些實(shí)施 方式中，可能需要在所述熒光指示劑中使用親水性熒光化合物，以確保以 后可以測量到強(qiáng)熒光信號。具體來說，試驗(yàn)通常在水性介質(zhì)中進(jìn)行。如果 在水性介質(zhì)中使用疏水性染料，則會發(fā)生猝滅，熒光信號會受到影響。在 一些實(shí)施方式中，巰基的存在會使得具有親水性，因此在一些情況下優(yōu)選 巰基作為熒光指示劑的親核性端基。盡管在化學(xué)領(lǐng)域中對親水性化合物和 疏水性化合物的界定不夠明確，但是本文所述的親水性化合物可具體表示 為不會溶解在有機(jī)溶劑(例如乙酸乙酯)中的化合物。
除了具有親水性以外，所述熒光指示劑的熒光化合物還可以設(shè)計(jì)成在 不同于所述熒光顆粒的載體基質(zhì)內(nèi)的一種或多種熒光材料的波長范圍內(nèi)發(fā) 射熒光。按照這種方式，載體結(jié)構(gòu)和熒光指示劑中的不同熒光材料發(fā)射的 熒光互相不重疊。這樣的特征對于使用載體結(jié)構(gòu)內(nèi)的熒光材料來區(qū)分樣品 內(nèi)的顆粒的實(shí)施方式來說是特別有益的。更具體來說，熒光材料中的各種 熒光范圍可以在不影響對樣品中激酶活性檢測的前提下，區(qū)分待測樣品內(nèi) 的不同顆粒類別。在一些情況下，所述熒光指示劑的熒光化合物可以設(shè)計(jì)
成在大于約500納米的波長范圍內(nèi)發(fā)射熒光，這是因?yàn)樵S多被分析物包含 本征熒光波長約小于450納米的分子。在一些實(shí)施方式中，試驗(yàn)可能不會 設(shè)計(jì)成具有這樣的普遍性，因此在不同的應(yīng)用中，熒光指示劑的熒光發(fā)射
的波長范圍可能會變化。例如，在一些實(shí)施方式中，所述熒光指示劑的熒 光化合物可以設(shè)計(jì)成發(fā)射在大約400-580納米的波長范圍的熒光。
在一些實(shí)施方式中，所述熒光指示劑可以包含位于所述親核性端基與 所述熒光化合物之間的一種或多種間隔基化合物。通過使用一種或多種間 隔基化合物，可以減輕對激酶活性劑檢測以及酶和底物之間的識別過程的 干擾。在一些實(shí)施方式中，可以使用總共包含約1-25個原子的間隔基以在 親核性端基和熒光化合物之間提供足夠的間隔。在更具體的情況下，可以 使用總共包含約5-25個原子的間隔基化合物。注意在一些應(yīng)用中，根據(jù)對 熒光顆粒和/或熒光指示劑的說明，可以使用總共包含大于25個原子的間 隔基化合物。下面列出了可以與用于熒光指示劑的熒光化合物一起使用的 包含親核性端基的一些間隔基化合物的例子。注意這些列舉是示例性的，而不會排除本文所述用于熒光指示劑的其它化合物。下面在可用于本文所 述方法的示例性熒光指示劑的列表中列出了間隔基化合物的其它例子。 邁克爾給體的例子
1)<formula>formula see original document page 14</formula>
2)<formula>formula see original document page 14</formula>
3.) <formula>formula see original document page 14</formula>
下面列出了可用于本文所述方法的一些熒光指示劑的例子。注意這些 列舉是示例性的，而不會排除用于本文所述方法的其它熒光指示劑。熒光指示劑的例子
<formula>formula see original document page 15</formula>
l.)指示劑染料一SA-
<formula>formula see original document page 15</formula><formula>formula see original document page 15</formula>下面揭示了圖1所示的實(shí)施該方法的示例性方案。應(yīng)當(dāng)注意的是，該 歷程是示例性的，不應(yīng)排除可用來對熒光顆粒進(jìn)行處理以進(jìn)行激酶檢測的 其它歷程。因此，本文所述的方法不一定僅限于下面所列的方案。如下文 所述，激酶特異性肽底物可以通過所述熒光顆粒的羧酸官能團(tuán)與熒光顆粒 連接。如上面圖1中的框IO所示，本文所述的方法可用于包含其它官能團(tuán) 的熒光顆粒。所述連接操作可以在存在乙基-二甲基氨基丙基-碳二亞胺 (EDC)和磺酸化的n-羥基琥珀酰亞胺的情況下進(jìn)行，但是也可使用其他的 試劑。在將所述激酶特異性肽底物與所述熒光顆粒連接之后，可以在肽底 物上進(jìn)行磷酸化過程。如所列的方案所述，所述磷酸化過程可以在存在激 酶和ATP的情況下進(jìn)行，在一些情況下，存在離子型液體。在將磷酸基加入到所述肽底物之后，繼續(xù)進(jìn)行p-消除步驟，在此步驟中，使得肽底物脫 去磷酸化，在肽底物脫去磷酸的位點(diǎn)產(chǎn)生極化的雙鍵。如上所述，這樣的P-消除步驟可以是堿催化的，在一些實(shí)施方式中，還可在存在離子型液體的 情況下進(jìn)行。如下面列出的歷程所示，所述極化的雙鍵可具有氨基酸-絲氨 酸。但是，本文所述的方法可以設(shè)計(jì)成產(chǎn)生其他的氨基酸殘基，例如氨基 酸蘇氨酸和酪氨酸。
在(3-消除過程之后，熒光指示劑通過極化的雙鍵與所述熒光顆粒連接。 下面的歷程列出了兩個示例性的用來將熒光指示劑與熒光顆粒連接的邁克
爾反應(yīng)。 一種邁克爾反應(yīng)包括通過酰胺鍵(CONH鍵)與一種或多種間隔基化 合物(稱為"間隔基")結(jié)合的熒光化合物(稱為"指示劑染料")。CONH 鍵是熒光化合物與一種或多種間隔基化合物連接形成的，具體來說是所述 熒光化合物的羧酸官能團(tuán)與所述一種或多種間隔基化合物的氨基酸官能團(tuán) 連接形成的。包含CONH鍵是示例性的，因此，本文所述的方法不一定限于 此。下列歷程中所述的其它邁克爾反應(yīng)包括使得示例性的生物素取代的邁 克爾給體和抗生物素蛋白鏈菌素共軛的熒光化合物(稱為"指示劑染料") 與所述熒光顆粒連接。特別適合用于該反應(yīng)的示例性的熒光化合物是藻紅 蛋白(PE)。但是，其它熒光化合物以及其它生物素取代的邁克爾受體可用 于本文所述的方法。<image>image see original document page 17</image>
由于圖1所示的方法，本文中描述了大量熒光顆粒。具體來說，由于 該方法的各個處理步驟，提供了大量不同的熒光顆粒構(gòu)型。例如，提供了 一種顆粒，其包括包含一種或多種熒光材料的載體基質(zhì)，以及通過所述
載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載體基質(zhì)連接的肽底物。在一些實(shí)施方式中，所 述肽底物可以設(shè)計(jì)成用于特定的激酶活性，例如用于圖1中框io所述的顆 粒。在其他的情況下，所述肽底物可以是磷酸化的肽底物，其通過圖1中 框12所示的磷酸化步驟制得。在其他的情況下，所述肽基材可以包含通過 圖1中的框14所述的操作步驟制得的邁克爾受體。另外，所述熒光顆?？?br> 以包含通過圖1中的框16所述的操作步驟制得的與肽底物連接的熒光指示 劑。所述熒光指示劑可以包括上面框16中所述的任意實(shí)施方式，出于簡潔 的目的，此處不再重復(fù)描述。除了圖1所示的方法以及所得的顆粒，還提供了用來進(jìn)行圖1所示方 法的各種試劑盒。具體來說，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含大量熒 光顆粒以及一種或多種激酶特異性肽底物。所述大量的熒光顆粒各自包括 載體基質(zhì)，所述載體基質(zhì)包含一種或多種設(shè)計(jì)用來在第一波長范圍發(fā)射熒 光的熒光材料。在一些情況下，所述一種或多種激酶特異性肽底物通過所 述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載體基質(zhì)連接。在具體的實(shí)施方式中，所述一 種或多種激酶-特異性肽底物可以分別與所述大量熒光顆粒中的不同亞組 連接。在此情況下，可以對樣品中大量不同的激酶活性進(jìn)行評價(jià)，從而激 酶活性的測定可以多重化。但是在其他的情況下，所述一種或多種激酶-特 異性肽底物與所述多種熒光顆粒隔離開。在這樣的實(shí)施方式中，在一些情 況下，所述試劑盒還可包含設(shè)計(jì)用來將所述一種或多種激酶-特異性肽底物 與所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)相連接的試劑。在此形式中，所述試劑盒可以用
來制備具有圖1中的框IO所述特征的顆粒。
在一些情況下，所述試劑盒還可包含磷酸化試劑，所述磷酸化試劑設(shè) 計(jì)用來使得所述一種或多種激酶-特異性肽底物磷酸化，以制備具有圖1中
的框12所示特征的顆粒。另外，所述試劑盒還可包括|3-消除試劑，該(3-消除試劑設(shè)計(jì)用來使得所述一種或多種激酶-特異性肽底物脫去磷酸化，在 所述一種或多種激酶-特異性肽底物的脫去磷酸位點(diǎn)生成邁克爾受體，以制 得具有圖1中框14所述特征的顆粒。另外，所述試劑盒可包括一種或多種 各自包含親核性端基和一種或多種熒光化合物的熒光指示劑試劑，以制備 具有圖1中的框16所述特征的顆粒。所述熒光指示劑試劑的熒光化合物可 以包括上面框16中所述的任意實(shí)施方式，出于簡潔的目的，此處不再重復(fù) 描述。除了上述組分以外，本文所述的試劑盒可以設(shè)計(jì)成使得所述磷酸化 試劑、p-消除試劑和所述一種或多種熒光指示劑試劑中的至少一種包含離 子型液體?；蛘哒f，所述試劑盒可以設(shè)計(jì)成任意一種或多種所述試劑可以 在存在或不存在離子型液體的情況下使用。在任意的情況下，所述試劑盒 可以包含作為被分析物制備的標(biāo)準(zhǔn)的其它組分，例如但不限于熒光標(biāo)記、 競爭分子、參比材料、洗滌緩沖劑、塑料器皿等。
如上所述，在圖2的流程圖中顯示了利用多重試驗(yàn)的方案測定樣品中的激酶活性的方法。如圖2所示，所述方法可包括框20，其中熒光顆粒的 不同亞組的集合群體接觸樣品。所述樣品可包括任何其中有多種需要進(jìn)行 分析的被測物的生物或化學(xué)被分析物。所述集合群體中的至少一部分熒光 顆粒包含載體基質(zhì)和通過所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載體基質(zhì)相連接的 肽底物，所述載體基質(zhì)包含一種或多種設(shè)計(jì)成在第一波長范圍內(nèi)發(fā)射熒光 的熒光材料。這些顆?？梢耘c圖1的框10中所述的熒光顆粒相類似。
為了實(shí)施對樣品中的多種被測物進(jìn)行檢測和/或定量的多重的方案；所 述熒光顆粒設(shè)計(jì)成可區(qū)分的組。在一些情況下，這些組由吸收入顆粒內(nèi)和/ 或結(jié)合在顆粒表面上的熒光材料的不同種類和/或濃度來區(qū)別。因此，在一 些實(shí)施方式中，所述集合群體中的熒光顆粒的不同亞組中的至少一部分可 以分別包含所述一種或多種熒光材料的不同配置。在一個實(shí)施方式中，通 過在一組顆粒中以十種不同濃度使用兩種不同染料，得到了一百種可通過 熒光區(qū)別的顆粒類別?？赏ㄟ^增加染料的數(shù)量和/或不同的染料濃度來增加 顆粒的類別數(shù)量。在許多的情況下，設(shè)計(jì)用來分析數(shù)種被測物的試驗(yàn)，例 如約包含一百種或更多不同被測物的試驗(yàn)，使得在評價(jià)樣品的時(shí)候可以將 時(shí)間和工藝成本最小化。注意顆粒分類可以通過其他的方式(例如粒度)實(shí) 施，因此，圖2所述的方法不一定限于具有不同熒光材料配置的顆粒的亞
組。除了具有不同的分類參數(shù)以外，在一些情況下，所述熒光顆粒的不同 亞組中的至少一部分可以分別包含不同的肽底物。在此情況下，可以對樣 品中大量不同的激酶活性進(jìn)行評價(jià)，從而可以在對樣品中的顆粒進(jìn)行鑒別 時(shí)，使得激酶活性的測定多重化。
繼續(xù)來看框22，該方法包括對所述樣品和集合群體進(jìn)行磷酸化過程， 所述磷酸化過程設(shè)計(jì)用來為肽底物的接受殘基(例如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨 酸殘基)加入磷酸基團(tuán)。這些方法與對圖1中框12所述的磷酸化過程類似， 因此為了簡潔可以參考。框22與框12中所述的過程略微的不同之處在于， 框22中，對樣品和集合群體進(jìn)行磷酸化操作。肽底物是否被磷酸化取決于 樣品抑制或促進(jìn)激酶活性的性質(zhì)。具體來說，應(yīng)當(dāng)注意的是，在一些實(shí)施 方式中，由于樣品中的激酶抑制劑，所述肽可能不會被框22中所述的過程 磷酸化。在此情況下，圖2中描述的方法可以用來確定樣品中的激酶活性為可以忽略或者無激酶活性。與之相反的是，在一些實(shí)施方式中，樣品中
的激酶活性不會受到抑制(或者甚至受到促進(jìn))，圖2所述的方法可以用來 測定激酶活性度。因此，盡管圖2中列出的方法的操作步驟設(shè)計(jì)成按照與 圖1所述類似的方式處理熒光顆粒，但是圖2中的方法的略微不同，即所述 顆?？赡懿粫凰霾僮鞑襟E改變。相反的是，對于存在激酶活性的情況， 圖2中的方法僅僅對所述顆粒進(jìn)行操作步驟以改變顆粒。通過這種方式， 所述方法可以用來測定樣品中的激酶活性度，包括其中不存在活性或者僅 存在可以忽略的活性的實(shí)施方式。圖2的框24和26(下文中進(jìn)行詳細(xì)描述) 與框14和16之間也可能有類似的差異。
如圖2所示，所述用來測定樣品中激酶活性的方法繼續(xù)進(jìn)行至框24， 其中對大量熒光顆粒進(jìn)行處理，使得如果所述大量熒光顆粒中存在磷酸化 的肽底物，則所述磷酸化的肽底物會被脫去磷酸，在所述肽底物的脫去磷酸 的位點(diǎn)產(chǎn)生極化的雙鍵。這些操作可以與圖1中框14所述的操作類似，因 此為了簡潔而可以參考。另外，所述方法包括框26，用于對所述大量熒光 顆粒進(jìn)行進(jìn)一步處理，使得如果所述肽底物的脫去磷酸的位點(diǎn)存在任何極 化的雙鍵，則熒光指示劑會通過其親核性端基在所述極化雙鍵的位置與所 述熒光顆粒相連。這些操作可以與圖1中框16所述的操作類似，因此為了 簡潔而可以參考。關(guān)于框16所述的熒光指示劑的不同實(shí)施方式的描述也適 用于框26。在一些實(shí)施方式中，框26可包括使得不同的熒光指示劑與熒光 顆粒中不同的亞組相連接。在這些情況下，所述不同的熒光指示劑可以設(shè) 計(jì)成在不同的波長范圍(即互不相同，也不同于熒光顆粒的載體結(jié)構(gòu)中包含 的熒光材料的波長范圍)發(fā)射熒光。在此形式中，不同的熒光指示劑可以設(shè) 計(jì)成用來檢測不同的激酶活性，因此在試驗(yàn)中激酶活性檢測可以多重化。
所述方法另外的步驟包括框28，其中測量了大量熒光顆粒的熒光發(fā)射。 這樣的測量操作可通過任意已知的測量方法進(jìn)行，例如通過流式細(xì)胞儀或 熒光成像進(jìn)行。所述方法還包括框30，其中根據(jù)測得的第一波長范圍內(nèi)的 熒光發(fā)射測定顆粒類別，所述第一波長范圍按所述熒光顆粒的載體結(jié)構(gòu)內(nèi) 包含的熒光材料所決定的。更具體來說，顆粒的載體結(jié)構(gòu)內(nèi)的熒光材料發(fā) 射的熒光所產(chǎn)生的輸出信號可以用來將顆粒鑒別為不同的類別組。另外，如框32所示，該方法包括根據(jù)是否存在在第二波長范圍內(nèi)測得的熒光發(fā)射， 確定在所述樣品和集合群體進(jìn)行所述磷酸處理時(shí)樣品中的激酶活性量。具 體來說，因?yàn)榧っ富钚缘拇嬖诳梢酝ㄟ^對肽底物進(jìn)行磷酸化來表明，本文 所述的方法通過在預(yù)先磷酸化的位點(diǎn)設(shè)置熒光指示劑而識別這些活性，從 熒光指示劑發(fā)射的熒光可以表示樣品中的激酶活性度。相反的是，在樣品 中的激酶活性受到抑制的實(shí)施方式中，熒光顆粒上的肽底物將不會發(fā)生磷 酸化，也不會有熒光指示劑連接在熒光顆粒上。因此，在熒光指示劑的波 長范圍內(nèi)不會檢測到熒光發(fā)射，表明樣品中的激酶活性可以忽略，或者不 存在激酶活性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員通過閱讀本說明書，可以顯而易見地了解本發(fā)明各種 方面地其它改進(jìn)和另外的實(shí)施方式。例如，盡管在多通路歷程地一個例子 中具體描述了用來確定激酶活性地方法、顆粒和試劑盒，但是所述方法、
顆粒和試劑盒也可用于單通路歷程地激酶檢測。因此，本說明書僅僅用于 說明，用來使得本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明地大體實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)理解本 文所述的本發(fā)明形式作為優(yōu)選實(shí)施方式?？梢詫Ρ疚娘@示和描述地要素和 材料進(jìn)行替換，組成和操作可以電導(dǎo)，本發(fā)明地某些特征可以獨(dú)立使用， 本領(lǐng)域技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明的說明書，可以很容易地了解這些變化。 可以在不背離所附權(quán)利要求書描述的本發(fā)明精神和范圍的前提下對本文中 描述的要素進(jìn)行改變。
權(quán)利要求
1. 一種方法，該方法包括使得熒光顆粒接觸被分析物，所述熒光顆粒包含包含一種或多種熒光材料的載體基質(zhì)；通過所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載體基質(zhì)連接的肽底物；在使得所述熒光顆粒接觸所述被分析物的步驟中使得所述肽底物磷酸化；對所述熒光顆粒進(jìn)行處理，使得所述肽底物脫去磷酸，并在脫去磷酸的位點(diǎn)產(chǎn)生極化的雙鍵；使得包含親核性端基的熒光指示劑通過所述極化的雙鍵與所述熒光顆粒相連接。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述熒光指示劑包含-熒光化合物；位于所述親核性端基以及所述熒光化合物之間的一種或多種間隔基化 合物。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述一種或多種間隔基化 合物總體上包含約1-25個原子。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述使得熒光指示劑與熒 光顆粒相連接的步驟包括連接一種熒光指示劑，所述熒光指示劑設(shè)計(jì)成在 不同于所述載體基質(zhì)的一種或多種熒光材料的波長范圍內(nèi)發(fā)射熒光。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述熒光指示劑設(shè)計(jì)成在 大于約500納米的波長范圍內(nèi)發(fā)射熒光。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述使得肽底物磷酸化的 步驟包括使得所述熒光顆粒接觸通過微波加熱的離子型液體。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對熒光顆粒進(jìn)行處理 的步驟包括使得所述熒光顆粒接觸離子型液體。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述對熒光顆粒進(jìn)行處理 的步驟還包括對所述熒光顆粒和離子型液體進(jìn)行微波加熱。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述連接熒光指示劑的步 驟包括使所述熒光顆粒接觸離子型液體。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述連接熒光指示劑的 步驟還包括對所述熒光顆粒和離子型液體進(jìn)行微波加熱。
11. 一種顆粒，其包含包含一種或多種熒光材料的載體基質(zhì)；通過所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載體基質(zhì)連接的肽底物。
12. 如權(quán)利要求11所述的顆粒，其特征在于，所述肽底物是磷酸化 的肽底物。
13. 如權(quán)利要求11所述的顆粒，其特征在于，所述肽底物包括邁克 爾受體。
14. 如權(quán)利要求11所述的顆粒，其特征在于，所述顆粒還包含熒光 指示劑，所述熒光指示劑通過其親核性端基與所述肽底物連接。
15. 如權(quán)利要求14所述的顆粒，其特征在于，所述熒光指示劑包含 熒光化合物；位于所述親核性端基以及所述熒光化合物之間的一種或多種間隔基化 合物。
16. 如權(quán)利要求15所述的顆粒，其特征在于，所述一種或多種間隔 基化合物總體上包含約1-25個原子。
17. 如權(quán)利要求15所述的顆粒，其特征在于，所述一種或多種間隔 基化合物總體上包含約5-25個原子。
18. 如權(quán)利要求15所述的顆粒，其特征在于，所述熒光化合物設(shè)計(jì) 成在不同于所述載體基質(zhì)的一種或多種熒光材料的波長范圍內(nèi)發(fā)射熒光。
19. 如權(quán)利要求18所述的顆粒，其特征在于，所述熒光化合物設(shè)計(jì) 成在約400-580納米的波長范圍內(nèi)發(fā)射熒光。
20. 如權(quán)利要求18所述的顆粒，其特征在于，所述熒光化合物設(shè)計(jì) 成在大于約500納米的波長范圍內(nèi)發(fā)射熒光。
21. 如權(quán)利要求15所述的顆粒，其特征在于，所述熒光化合物包括 親水性熒光化合物。
22. 如權(quán)利要求11所述的顆粒，其特征在于，所述載體基質(zhì)是交聯(lián) 的載體基質(zhì)。
23. —種方法，該方法包括使得熒光顆粒的不同亞組的集合群體與樣品接觸，所述熒光顆粒中的至少一部分包含載體基質(zhì)，包含一種或多種設(shè)計(jì)用來在第一波長范圍內(nèi)發(fā)射熒光的熒 光材料，熒光顆粒的不同亞組中的至少一部分分別包含所述一種或多種熒 光材料的不同配置；通過所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載體基質(zhì)相連接的肽底物，熒光顆 粒的不同亞組的至少一部分分別包含不同的肽底物；對所述樣品和所述集合群體進(jìn)行磷酸化處理，所述磷酸化處理用來加 入磷酸基團(tuán)以接收所述肽底物的殘基；在對所述樣品和集合群體進(jìn)行過磷酸化處理之后，對大量熒光顆粒進(jìn) 行處理，使得如果所述大量熒光顆粒中存在任何磷酸化的肽底物，則所述磷 酸化的肽底物被脫去磷酸，在所述肽底物脫去磷酸的位點(diǎn)生成極化的雙鍵;對大量熒光顆粒進(jìn)行進(jìn)一步的處理，使得如果肽底物的脫去磷酸的位 點(diǎn)中存在任何極化的雙鍵，熒光指示劑通過其親核性端基在所述極化雙鍵 的位置與所述熒光顆粒相連接，所述熒光指示劑設(shè)計(jì)成發(fā)射在不同于所述第一波長范圍的第二波長范圍內(nèi)的熒光；在對大量熒光顆粒進(jìn)行進(jìn)一步處理之后，測量所述大量熒光顆粒的熒光發(fā)射；根據(jù)測定的在第一波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射鑒別樣品中顆粒的亞組類 別； .根據(jù)是否存在在第二波長范圍內(nèi)測得的熒光發(fā)射，確定對所述樣品和 集合群體進(jìn)行所述磷酸處理時(shí)樣品中的激酶活性量。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，對所述顆粒的亞組類 別進(jìn)行鑒別的步驟包括測定超過約ioo個亞組類別的種類。
25. 如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述對大量熒光顆粒 進(jìn)行進(jìn)一步處理的步驟包括使第一熒光指示劑與所述大量熒光顆粒的第一亞組中的熒光顆粒相連接；使不同的熒光指示劑與所述大量熒光顆粒的第二亞組中的熒光顆粒連 接，所述不同的熒光指示劑設(shè)計(jì)成用來在不同于所述第一熒光指示劑設(shè)計(jì) 的發(fā)射波長的波長范圍內(nèi)發(fā)射熒光。
26. —種試劑盒，其包含大量的熒光顆粒，所述大量的熒光顆粒各自包括載體基質(zhì)，所述載體 基質(zhì)包含一種或多種設(shè)計(jì)用來在第一波長范圍發(fā)射熒光的熒光材料； 一種或多種激酶-特異性肽底物。
27. 如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其特征在于，所述一種或多種激 酶-特異性肽底物通過所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述大量熒光顆粒的載體 基質(zhì)相連接。
28. 如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其特征在于，所述一種或多種激 酶-特異性肽底物分別與大量熒光顆粒的不同亞組相連接。
29. 如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其特征在于，所述一種或多種激 酶-特異性肽底物與所述大量熒光顆粒隔離開。
30. 如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還可包 含設(shè)計(jì)用來將所述一種或多種激酶-特異性肽底物與所述載體基質(zhì)的官能 團(tuán)相連接的試劑。
31. 如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包含 設(shè)計(jì)用來使得所述一種或多種激酶-特異性肽底物磷酸化的磷酸化試劑；p-消除試劑，其設(shè)計(jì)用來使得所述一種或多種激酶-特異性肽底物脫去 磷酸，在所述一種或多種激酶-特異性肽底物的脫去磷酸的位點(diǎn)產(chǎn)生邁克爾 受體；一種或多種熒光指示劑試劑，其各自包含親核性端基以及一種或多種 熒光化合物，所述熒光化合物設(shè)計(jì)成用來在不同于所述第一波長范圍的第 二波長范圍發(fā)射熒光。
32. 如權(quán)利要求31所述的試劑盒，其特征在于，所述磷酸化試劑、|3-消除試劑以及所述一種或多種熒光指示劑試劑中的至少一種包含離子型液 體。
33.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，其特征在于，所述一種或多種熒 光指示劑試劑中的至少一種包含親水性熒光化合物。
全文摘要
提供了用來測定樣品中激酶活性的方法、顆粒和試劑盒。一種方法的一個實(shí)施方式包括使得熒光顆粒接觸被分析物，所述熒光顆粒包括載體基質(zhì)以及通過所述載體基質(zhì)的官能團(tuán)與所述載體基質(zhì)相連的肽底物，所述載體基質(zhì)包含一種或多種熒光材料。該方法還包括在使所述熒光顆粒接觸被分析物的過程中對所述肽底物進(jìn)行磷酸化，然后對所述熒光顆粒進(jìn)行處理，使得所述肽底物脫去磷酸，在脫去磷酸的位點(diǎn)產(chǎn)生極化的雙鍵。另外，該方法包括通過所述極化的雙鍵將包含親核性端基的熒光指示劑與所述熒光顆粒相連。
文檔編號C12Q1/48GK101421414SQ200780013700
公開日2009年4月29日 申請日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月17日
發(fā)明者A·G·魯加德, J·W·雅各布森, M·R·霍夫邁耶 申請人:盧米尼克斯股份有限公司