專利名稱：：新腫瘤抗原肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新腫瘤抗原蛋白和由其獲得的的肽以及它們在癌癥免疫領(lǐng)域中的用途。
背景技術(shù)：
：已知免疫系統(tǒng)，尤其是T細(xì)胞，在清除活體癌(腫瘤)方面發(fā)揮重要作用。實(shí)際上，已在人癌癥病灶中觀察到對癌細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性的淋巴細(xì)胞浸潤(非專利文獻(xiàn)1)，并在沒有多大困難的情況下從黑色素瘤中分離到識別自體腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)(非專利文獻(xiàn)2、3、4)。此外，通過轉(zhuǎn)移CTL對黑色素瘤的臨床治療結(jié)果也表明了T細(xì)胞在癌癥清除方面的重要性(非專利文獻(xiàn)5)。盡管在很長時(shí)間內(nèi)并不清楚CTL攻擊自體腫瘤細(xì)胞的靶分子，但近年來隨著免疫學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展，這類分子也逐漸清晰起來。具體而言，業(yè)已揭示，CTL通過T細(xì)胞受體(TCR)識別一種被稱作癌抗原肽的肽與主要組織相容性復(fù)合物I類抗原(MHC-I類抗原，也稱作HLA抗原)之間的復(fù)合物，并由此攻擊自體腫瘤細(xì)胞。癌抗原肽是通過癌特異性抗原蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成后的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體降解而生成的。這樣生成的癌抗原肽結(jié)合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的MHC-I類抗原(HLA抗原)，形成復(fù)合物，該復(fù)合物被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面，作為抗原被提呈。抗原特異性CTL識別作為抗原被提呈的復(fù)合物，并通過細(xì)胞毒活性或者產(chǎn)生淋巴因子而表現(xiàn)出抗癌作用。由于這一系列作用的闡明，有可能通過使用癌抗原蛋白或者癌抗原肽作為通常所說的癌癥疫苗來增強(qiáng)癌癥患者體內(nèi)的癌特異性CTL，從而治療癌癥。就腫瘤抗原蛋白而言，T.Boon等人于1991年首次從人黑色素瘤細(xì)胞中鑒定出一種名為MACE的蛋白(非專利文獻(xiàn)6)。隨后，主要由黑色素瘤細(xì)胞中鑒定出幾種其它的腫瘤抗原蛋白。為了將腫瘤抗原蛋白和肽應(yīng)用于腫瘤治療或診斷，必須鑒定可廣泛應(yīng)用于腺癌如肺癌的新腫瘤抗原蛋白和肽，所述腺癌遠(yuǎn)比黑素瘤更頻繁發(fā)生。Lengsin(含谷氨酸-氨連接酶(谷氨酰胺合酶)結(jié)構(gòu)域1(GLULD1)UniGeneHs.l49585)被鑒定為在人晶狀體中高度表達(dá)的新基因，根據(jù)氨基酸序列的相似性已報(bào)告其為谷氨酰胺合酶家族的可能成員。然而，該基因的生理功能仍是未知的(非專利文獻(xiàn)7)。BJ-TSA-9(假定蛋白MGC14128)(UniGeneHs.379821)是一種在國立衛(wèi)生研究院哺乳動物基因采集(MGC)計(jì)劃中克隆的新基因，其生理功能仍是未知的(非專利文獻(xiàn)8)。C20orf42(或URP1,Kindlerin)作為在肺癌和結(jié)腸癌中高度表達(dá)的基因被克隆(非專利文獻(xiàn)9),與秀麗線蟲(C.e/ega"s)UNC-112具有高度相似性。業(yè)已報(bào)道，C20orf42和UNC-112—樣與整聯(lián)蛋白相互作用，C20orf42的表達(dá)由TGF-P誘導(dǎo)(非專利文獻(xiàn)10)。C20orf42還被鑒定為在Kindler綜合征中突變的Kindlerin基因，Kindler綜合征是一種罕見的常染色體隱性皮膚病(非專利文獻(xiàn)11、12)。BUB1是涉及細(xì)胞周期M期的紡錘體關(guān)卡的絲氨酸/蘇氨酸激酶，沒有功能性BUB1導(dǎo)致異常染色體分離。另外，BUB1磷酸化Cdc2，并抑制APC/Ced^的泛素連接酶活性，對異常染色體分離產(chǎn)生預(yù)防作用(非專利文獻(xiàn)13)。已報(bào)告BUB1在癌癥組織中的表達(dá)和突變下降(非專利文獻(xiàn)14、15)。C10orf3是一種在國立衛(wèi)生研究院哺乳動物基因采集(MGC)計(jì)劃中克隆的新基因，其生理功能仍是未知的(非專利文獻(xiàn)16)。HIFPH3(egl9同源物3(eglninehomolog3),EGLN3)作為具有egl9類似活性的3種分子中的1種被克隆，其被鑒定為在秀麗線蟲中調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF1)活性的加雙氧酶(非專利文獻(xiàn)17)。8其被認(rèn)為在缺氧條件下通過HIF1調(diào)節(jié)活性，但3種egl9同源物之間的差異是未知的。非專利文獻(xiàn)l:Arch.Surg.，126:200(1990)非專利文獻(xiàn)2:Immunol.Today,8:385(1987)非專利文獻(xiàn)3:J.Immunol.,138:989(1987)非專利文獻(xiàn)4:Int.J.Cancer，52:52(1992)非專利文獻(xiàn)5:J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159(1994)非專利文獻(xiàn)6:Science,254,1643-1647(1991)非專利文獻(xiàn)7:Mol.Vis.Jun.15;8:185-95(2002)非專利文獻(xiàn)8:Proc.Natl.Acad.Sci.USA"99(26):16899-903(2002)非專利文獻(xiàn)9:Biochim.Biophys.Acta1637:207-216(2003)非專利文獻(xiàn)10:J.Biol.Chem.，F(xiàn)eb20;279(8):6824畫33(2004)非專利文獻(xiàn)11:Hum.Molec.Genet,12:925-935(2003)非專利文獻(xiàn)12:Am.J,Hum.Genet.,73:174-187(2003)非專利文獻(xiàn)13:Mol.Cell.,Nov5;16(3):387-97(2004)非專利文獻(xiàn)14:OncogeneJul11;21(30):4673-9(2002)非專利文獻(xiàn)15:Leuk.Lymphoma.Feb;43(2):385-91(2002)非專利文獻(xiàn)16:Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Dec24;99(26):16899-903(2002)非專利文獻(xiàn)17:Cell107:43-54(2001)發(fā)明公開本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目標(biāo)是提供新腫瘤抗原蛋白和肽以及它們在癌癥免疫領(lǐng)域的用途。解決問題的方法本發(fā)明人深入地嘗試發(fā)現(xiàn)與正常組織相比在癌癥組織中顯示出表達(dá)水平和頻率增加的基因，并選定6個(gè)基因Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因，由此發(fā)現(xiàn)這些基因和由其表達(dá)的產(chǎn)物(即蛋白)可以用作癌癥的疾病標(biāo)志物。然后，本發(fā)明人由Lengsin、BJ-TSA畫9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因編碼蛋白(Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3)的氨基酸序列選擇可能結(jié)合HLA分子的部分肽，并檢查它們與HLA分子的結(jié)合親和力和CTL誘導(dǎo)活性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這6種蛋白(尤其是BJ-TSA-9、C20orf42和C10orf3)為腫瘤抗原蛋白，得自它們的部分肽為腫瘤抗原肽。因此，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3以及由它們獲得的肽被認(rèn)為可以用作癌癥疫苗，用于表現(xiàn)出這些蛋白表達(dá)(尤其是表達(dá)增加)的多種癌癥。由如上所述的發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。因此，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容(1)含有來源于Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分肽、能夠結(jié)合HLA抗原并被CTL識別的肽；(2)以上(l)的肽，其中HLA抗原為HLA-A24或HLA-A2抗原；(3)以上(2)的肽，其含有SEQIDNO:13-201中任一項(xiàng)的M酸序列；(4)含有與SEQIDNO:13-31、42-49、59-78、89-117、158-165、176-183和195-201中任一項(xiàng)的氨基,列相同的氨基齡列的肽，只是2位的氨基酸被酪氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸取代，所述肽能夠結(jié)合HLA-A24抗原，并被CTL識別；(5)含有與SEQIDNO:32-41、50-58、79-88、118-157、166-175和184-194中任一項(xiàng)的氨基^^列相同的氨基^列的肽，只是2位的氨基酸被亮氨酸、曱硫氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端氨基酸被纈氨酸或亮氨酸取代，所述肽能夠結(jié)合HLA-A2抗原，并被CTL識別；(6)含有以上(1)-(5)中任一項(xiàng)的肽的表位肽；(7)含有以上(l)-(6)中任一項(xiàng)的肽和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物；(8)含有編碼以上(l)-(6)中任一項(xiàng)的肽的多核苷酸的核酸；(9)含有以上(8)的核酸和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物；(10)含有Lengsin、BJ畫TSA-9、C20orf42、BUBl、C10orf3或HIFPH3和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物；(11)以上(10)的藥物組合物，其中Lengsin含有SEQIDNO:2的氨基酸序列；(12)以上(10)的藥物組合物，其中BJ-TSA-9含有SEQIDNO:4的氛基^f列；(13)以上(10)的藥物組合物，其中C20orf42含有SEQIDNO:6的氨基酸序列；(14)以上(10)的藥物組合物，其中BUB1含有SEQIDNO:8的氨基酸序列；(15)以上(10)的藥物組合物，其中C10orf3含有SEQIDNO:10的氨基酸序列；(16)以上(10)的藥物組合物，其中HIFPH3含有SEQIDNO:12的氨基,列；(17)—種含有核酸和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，所述核酸包含編碼Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核普酸；(18)以上(17)的藥物組合物，其中編碼Lengsin的多核苷酸包含SEQIDNO:1的堿基序列，或編碼SEQIDNO:2的氨基酸序列；(19)以上(17)的藥物組合物，其中編碼BJ-TSA-9的多核苦酸包含SEQIDNO:3的堿基序列，或編碼SEQIDNO:4的氨基酸序列；(20)以上(17)的藥物組合物，其中編碼C20orf42的多核苦酸包含SEQIDNO:5的堿基序列，或編碼SEQIDNO:6的氨基酸序列；(21)以上(17)的藥物組合物，其中編碼BUB1的多核苷酸包含SEQIDNO:7的堿基序列，或編碼SEQIDNO:8的氨基酸序列；(22)以上(17)的藥物組合物，其中編碼C10orf3的多核普酸包含SEQIDNO:9的堿基序列，或編碼SEQIDNO:10的氨基酸序列；(23)以上(17)的藥物組合物，其中編碼HIFPH3的多核苦酸包含SEQIDNO:11的堿基序列，或編碼SEQIDNO:12的氨基酸序列；(24)—種制備抗原提呈細(xì)胞的方法，其中使具有抗原提呈能力的細(xì)胞在體外與以下的任一種接觸(a)以上(lH6)中任一項(xiàng)的肽，(b)以上(8)的核酸，Cc)Lengsin、BJ-TSA畫9、C20orf42、BUB1、C10orf3或MFPH3,和(d)含有編碼Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的核酸；(25)—種通過以上(24)的方法制備的抗原提呈細(xì)胞；(26)—種含有以上(25)的抗原提呈細(xì)胞和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物；(27)—種誘導(dǎo)CTL的方法，其中使外周血淋巴細(xì)胞在體外與以下的任一種接觸(a)以上(l)-(6)中任一項(xiàng)的肽，(b)以上(8)的核酸，Cc)Lengsin、BJ畫TSA隱9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3,和(d)含有編碼Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的核酸；(28)通過以上(27)的方法誘導(dǎo)的CTL;(29)—種含有以上(28)的CTL和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組12合物；(30)以上(7)、(9)-(23)、(26)或(29)中任一項(xiàng)的藥物組合物，其用作CTL誘導(dǎo)物；(3l)以上(7)、(9)-(23)、(26)或(29)中任一項(xiàng)的藥物組合物，其用作癌癥疫苗；(32)—種特異性結(jié)合以上(l)-(5)中任一項(xiàng)的肽的抗體；(33)—種含有以上(l)-(5)中任一項(xiàng)的肽和HLA抗原的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體；(34)—種用于^:測對腫瘤抗原肽特異性的CTL的試劑，所述腫瘤抗原肽來源于Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3,所述試劑含有作為組分的以上(33)的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體；(35)—種由多核苷酸和/或其互補(bǔ)多核苷酸組成的疾病標(biāo)志物，其中所述多核香酸含有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的堿基序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸；(36)以上(35)的疾病標(biāo)志物，其用作檢測癌癥的探針或引物；(37)以上(35)或(36)的疾病標(biāo)志物，其中來源于Lengsin基因的疾病標(biāo)志物用于肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌或胃癌；(38)以上(35)或(36)的疾病標(biāo)志物，其中來源于BJ-TSA-9基因的疾病標(biāo)志物用于白血病、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌或淋巴瘤；(39)以上(35)或(36)的疾病標(biāo)志物，其中來源于C20orf42基因的疾病標(biāo)志物用于肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肝癌、胃癌、白血病、惡性淋巴瘤組織、直腸癌、結(jié)腸癌或胰腺癌；(40)以上(35)或(36)的疾病標(biāo)志物，其中來源于BUB1基因的疾病標(biāo)志物用于乳腺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、大腸癌(結(jié)腸癌、直腸癌)、胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤；(41)以上(35)或(36)的疾病標(biāo)志物，其中來源于C10orf3基因的疾病標(biāo)志物用于乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、腎癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌或黑素瘤；(42)以上(35)或(36)的疾病標(biāo)志物，其中來源于HIFPH3基因的疾病標(biāo)志物用于乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、胰腺癌、肝癌、肺腺癌或肺鱗狀細(xì)胞癌；(43)—種用于檢測癌癥的方法，所述方法包括以下步驟(a)、(b)和(c):(a)使由受試者的生物樣品制備的RNA或由其轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)多核苷酸與以上(35)-(42)中任一項(xiàng)的疾病標(biāo)志物雜交；(b)通過使用所述疾病標(biāo)志物作為指示劑檢測與疾病標(biāo)志物雜交的、由生物樣品制備的RNA或由其轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)多核苷酸；和(c)基于(b)中的檢測結(jié)果確定受試者是否患有癌癥；(44)以上(43)的方法，其中在步驟(C)中，將受試者的檢測結(jié)果與健康個(gè)體的結(jié)果進(jìn)行比較且在受試者中觀察到的與疾病標(biāo)志物的雜交水平高于在健康個(gè)體中觀察到的該水平時(shí)，則確定受試者患有癌癥；(45)—種用于癌癥的疾病標(biāo)志物，所述疾病標(biāo)志物含有特異性識別Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的抗體；(46)以上(45)的疾病標(biāo)志物，所述疾病標(biāo)志物用作4企測癌癥的〗笨針；(47)—種用于檢測癌癥的方法，所述方法包括以下步驟(a)、(b)和(c):(a)使由受試者的生物樣品制備的蛋白與以上(45)或(46)的疾病標(biāo)志物結(jié)合；(b)通過使用所述疾病標(biāo)志物作為指示劑檢測與疾病標(biāo)志物結(jié)合的、由生物樣品制備的蛋白或得自該蛋白的部分肽；和(c)基于(b)中的檢測結(jié)果確定受試者是否患有癌癥；(48)以上(47)的方法，其中在步驟(C)中，對受試者的檢測結(jié)果與健康個(gè)體的結(jié)果進(jìn)行比較且在受試者中觀察到的與疾病標(biāo)志物的結(jié)合水平高于在健康個(gè)體中觀察到的該水平時(shí)，則確定受試者患有癌癥。本發(fā)明的作用本發(fā)明的新腫瘤抗原肽、編碼其的核酸等可以用作癌癥疫苗。此外，所述胂瘤抗原肽還可以用作HLA四聚體等的組分，以檢測CTL。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本文使用的氨基酸、(多)肽、(多)核苷酸等的縮寫依照IUPAC-IUB(IUPAC-IUBCommunicationonBiologicalNomenclature,Eur.J.Biochem.,138:9(1984))的頭見則、"撰寫含有石威基序列或氨基酸序列的說明書的指南，，(日本特許辦公室)和本領(lǐng)域常用的符號。l)本發(fā)明的蛋白本發(fā)明的蛋白為Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3。本發(fā)明的蛋白Lengsin含有SEQIDNO:2的氨基酸序列或類似于上述氨基酸序列的氨基酸序列。本發(fā)明的蛋白Lengsin可以為來源于天然來源(例如肺腺癌細(xì)胞系l-87)的蛋白或重組蛋白。在此，SEQIDNO:2的氨基酸序列以登錄號NM_016571、登錄號NP—057655向GenBank數(shù)據(jù)庫登記，并代表人Lengsin(含谷氨酸-氨連接酶(谷氨酰胺合酶)結(jié)構(gòu)域l，也稱為GLULD1)。人Lengsin公開于非專利文獻(xiàn)7(Mol.Vis.Jun.15;8:185-95(2002》。本發(fā)明的蛋白BJ-TSA-9含有SEQIDNO:4的氨基酸序列或類似于上述氨基酸序列的氨基酸序列。本發(fā)明的蛋白BJ-TSA-9可以為來源于天然來源(例如肺腺癌細(xì)胞系l-87)的蛋白或重組蛋白。在此，SEQIDNO:4的氨基酸序列以登錄號NM—032899、登錄號NP一116288向GenBank數(shù)據(jù)庫登記，并代表人BJ-TSA-9(假定蛋白MGC14128)。人BJ-TSA-9公開于非專利文獻(xiàn)8(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(26):16899曙903(2002》。本發(fā)明的蛋白C20orf42含有SEQIDNO:6的氨基#列或類似于上述氬基酸序列的氨基酸序列。本發(fā)明的蛋白C20orf42可以為來源于天然來源(例如結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480)的蛋白或重組蛋白。在此，SEQIDNO:6的氨基酸序列以登錄號NM—017671、登錄號NP—060141向GenBank數(shù)據(jù)庫登記，并代表人C20orf42(URP1，也稱為Kindlerin)。人C20orf42公開于非專利文獻(xiàn)9(Biochim.Biophys.Acta1637:207-216(2003》。本發(fā)明的蛋白BUB1含有SEQIDNO:8的氨基酸序列或類似于上述氨基酸序列的氨基酸序列。本發(fā)明的蛋白BUB1可以為來源于天然來源(例如胰腺癌細(xì)胞系PUN)的蛋白或重組蛋白。在此，SEQIDNO:8的氨基酸序列以登錄號NM—004336、登錄號NP—004327向GenBank數(shù)據(jù)庫登記，并代表人BUB1。人BUB1公開于文獻(xiàn)(Genomics46:379-388(1997》。本發(fā)明的蛋白C10orf3含有SEQIDNO:10的氨基酸序列或類似于上述氨基酸序列的氨基酸序列。本發(fā)明的蛋白C10orf3可以為來源于天然來源(例如肺腺癌細(xì)胞系l-87)的蛋白或重組蛋白。在此，SEQIDNO:10的氨基酸序列以登錄號NM_018131、登錄號NP—060601向GenBank數(shù)據(jù)庫登記，并代表人C10orf3。人C10orf37>開于非專利文獻(xiàn)16(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Dec24;99(26):16899-903(2002))。本發(fā)明的蛋白HIFPH3含有SEQIDNO:12的氨基斷列或類似于上述氨基^列的氨基,列。本發(fā)明的蛋白HIFPH3可以為來源于天然來源(例如腎癌細(xì)胞系SMKTR-1)的蛋白或重組蛋白。在此，SEQIDNO:12的氨基酸序列以登錄號NM—022073、登錄號NP—071356向GenBank數(shù)據(jù)庫登記，并代表人HIFPH3(egl9同源物3，也稱為EGLN3)。人HIFPH3公開于非專利文獻(xiàn)17(Cell107:43-54(2001》。Lengsin、BJ畫TSA-9、C20orf42、BUBl、C10orf3和HIFPH3中的每一種在本文都還被稱為"本發(fā)明的蛋白"。具體地說，"含有SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基,列的蛋白"包括由SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列組成的蛋白，以及由包含在N和/或C末端連接額外的氨基酸序列的SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的氨基餅列組成的蛋白。"額外的氨基^列"可為來源于和本發(fā)明蛋白不同的其它結(jié)構(gòu)基因的氨基酸序列。具體地i兌，"含有與SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基,列類似的氨基^列的蛋白"包括以下的蛋白(a)-(c):(a)含有除缺失、取代和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸以外與SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列相同的氨基酸序列、并具有作為腫瘤抗原蛋白的活性的蛋白；(b)含有與SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列、并具有作為腫瘤抗原蛋白的活性的蛋白；(c)由能夠在嚴(yán)格條件下與編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼、并具有作為胂瘤抗原蛋白的活性的蛋白。優(yōu)選的實(shí)例包括由與SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列類似的氨基酸序列組成的蛋白。該蛋白的實(shí)例包括以下的蛋白(a'Hc'):(a')由除缺失、取代和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸以外與SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列相同的氨基酸序列組成、并具有作為腫瘤抗原蛋白的活性的蛋白；17(b')由與SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列組成、并具有作為腫瘤抗原蛋白的活性的蛋白；(c')由能夠在嚴(yán)格條件下與編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼、并具有作為腫瘤抗原蛋白的活性的蛋白。在以上(a)中"含有除缺失、取代和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸以外與SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白"是指人工生產(chǎn)的蛋白，即例如在活體中存在的修飾過的(變體)蛋白或等位基因變體。在這方面，關(guān)于蛋白中的修飾(突變)的數(shù)量或位置沒有限制，只要保持本發(fā)明蛋白的活性。標(biāo)準(zhǔn)(人們可基于其確定要缺失、取代和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)量或位置而不降低活性)可使用本領(lǐng)域眾所周知的計(jì)算機(jī)程序獲得，例如DNAStar軟件。例如，突變數(shù)通常應(yīng)在總氨基酸殘基的10%之內(nèi)，優(yōu)選應(yīng)在總氨基酸殘基的5%之內(nèi)。而且，考慮到保持結(jié)構(gòu)，通過取代引入的氨基酸優(yōu)選與被取代的氨基酸具有類似特征，所述特征包括極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、兩親性等。例如，Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp被分類為非極性氨基酸；Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln被分類為不帶電的氨基酸；Asp和Glu被分類為酸性氨基酸；而Lys、Arg和His被分類為堿性氨基酸。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以基于這些標(biāo)準(zhǔn)選擇屬于相同類別的適宜氨基酸。在以上(b)中"含有與SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列的蛋白"包括含有的氨基酸序列與SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的^J^酸序列具有至少約70%、優(yōu)選約80%、更優(yōu)選約90%、再更優(yōu)選約95%的序列同一性的蛋白，具體地說，為由SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的部分M酸序列組成的蛋白。本文使用的術(shù)語"序列同一性"是指兩種蛋白之間的同一性和同源性。"序列同一性"通過比較兩個(gè)在待比較序列區(qū)域內(nèi)最優(yōu)比對的序列來確定。在本文中，待比較的最優(yōu)比對的蛋白可具有添加或缺失(例如"空位")?？赏ㄟ^使用例如VectorNTI、ClustalW算法(NucleicAcidRes.,22(22):4673-4680(1994))進(jìn)行比對計(jì)算序列同一性。序列同一性可使用用于序列分析的軟件(具體地說為VectorNTI或GENETYX-MAC)或由公共數(shù)據(jù)庫提供的測序工具來確定。這樣的公共數(shù)據(jù)庫通常可在Web站點(diǎn)(11://^\￥.(1(^.1^￡.3(;^)獲得。在以上(c)中"能夠在嚴(yán)格條件下與編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多核普酸的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸"包括含有的堿基序列與編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多核苷酸具有至少約40%、優(yōu)選約60%、更優(yōu)選約70%、再更優(yōu)選約80%、甚至更優(yōu)選約90%以及最優(yōu)選約95%的序列同一性的多核苦酸。具體地說，例舉的多核苷酸含有的堿基序列與SEQIDNO:1、3、5、7、9或11的堿基序列具有至少約40%、優(yōu)選約60%、更優(yōu)選約70%、再更優(yōu)選約80°/。、甚至更優(yōu)選約90%以及最優(yōu)選約95%的序列同一性。更具體地說，例舉的多核苷酸由SEQIDNO:1、3、5、7、9或11的堿基序列的部分序列組成?？梢园凑兆陨硪阎姆椒ɑ蚺c其等效的方法進(jìn)行雜交，例如在^出教科書如"MolecularCloning,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)"等中描述的方法。另外，可使用市售可得的文庫按照其隨附的說明書進(jìn)行雜交。本文使用的"嚴(yán)格條件"可如在文獻(xiàn)(Berger和Kimmel,1987,"GuidetoMolecularCloningTechniquesMethodsinEnzymology",152巻，AcademicPress,SanDiegoCalif.;或"MolecularCloning"第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989),出處同上)中所述基于形成復(fù)合物的核酸或結(jié)合探針的核酸的解鏈溫度(Tm)來確定。例如，雜交可在含有6xSSC(20xSSC表示333mM檸檬酸鈉、333mMNaCl)、0.5%SDS和50%曱酰胺的溶液中于42°C進(jìn)行或在含有6xSSC的溶液(無50%曱酰胺)中于65。C進(jìn)行。雜交后的洗滌可在約"lxSSC、0.1%SDS、37°C"的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，在這樣的洗滌條件下洗滌時(shí)，互補(bǔ)鏈保持與靶正向鏈結(jié)合。更嚴(yán)格的雜交條件可包括約"0.5xSSC、0.1%SDS、42。C，'的洗滌條件，再更嚴(yán)格的雜交條件為約"0.1xSSC、0.1%SDS、65。C，'，但其不限于此。本發(fā)明的蛋白具有作為腫瘤抗原蛋白的活性。術(shù)語"作為腫瘤抗原蛋白的活性"是指通過用于腫瘤抗原蛋白活性的常規(guī)測定檢測的活性。具體地說，其是指表達(dá)Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的細(xì)胞被CTL識別的特征，即細(xì)胞顯現(xiàn)出對CTL的反應(yīng)性，換句話說，本發(fā)明的蛋白或由其獲得的的抗原肽活化或誘導(dǎo)CTL。在該方面，"細(xì)胞"優(yōu)選表達(dá)HLA抗原。因此，更具體地說，"作為腫瘤抗原蛋白的活性，，是指以下特征當(dāng)本發(fā)明的蛋白在表達(dá)HLA抗原如HLA-A24或HLA-A2的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，源自本發(fā)明蛋白的腫瘤抗原肽和HLA抗原之間的復(fù)合物被提呈至細(xì)胞表面上，從而使該細(xì)胞被CTL識別，換句話說，CTL被活化(誘導(dǎo))。如上陳述的本發(fā)明蛋白的特征可易于通過已知方法或其等效方法確定，例如"Cr釋放測定(J.Immunol.,159:4753,1997)、使用LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒的LDH釋放測定(TakaraBio，Inc.)、細(xì)胞因子檢測等。詳細(xì)測定方案將在后文闡述。首先，用含編碼本發(fā)明蛋白的DNA的表達(dá)載體和含編碼HLA抗原的DNA的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如293-EBNA細(xì)胞(Invitrogen)。編碼HLA抗原的DNA包括編碼HLA-A24抗原或HLA-A2抗原的DNA。編碼HLA-A24抗原的DNA的實(shí)例包括HLA-A2402cDNA(CancerRes.，55:4248-4252(1995),Genbank登錄號M64740)。編碼HLA-A2抗原的DNA的實(shí)例包括HLA-A0201cDNA(GenBank登錄號M84379)。如上所述的轉(zhuǎn)染可通過^f吏用脂轉(zhuǎn)染胺試劑(GIBCOBRL)的脂轉(zhuǎn)染法等進(jìn)行。然后，加入限于HLA抗原所用的CTL,并使其反應(yīng)，之后例如通過諸如ELISA的方法檢測活化的(反應(yīng)性)CTL產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子(例如IFN-力。本文能夠使用的CTL可通過用本發(fā)明的蛋白刺激外周血淋巴細(xì)胞制備，或者按照Int.J.Cancer,39，390-396，1987,N.Eng.J.Med,333，1038-1044,1995的方法等建立。本發(fā)明蛋白的CTL誘導(dǎo)活性還可以通過其中使用針對人的模型動物的測定在體內(nèi)才企驗(yàn)(WO02/47474;Int.J.Cancer.100,565-570(2002》。本發(fā)明的蛋白可通過用于由天然產(chǎn)物(例如癌細(xì)胞系)純化蛋白的自身已知的方法制備，或通過后文所述方法制備，該方法包括培養(yǎng)攜帶核酸的轉(zhuǎn)化體，所述核酸包含編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸。2)來源于本發(fā)明蛋白的肽本發(fā)明的肽可被稱為"本發(fā)明的肽"或"本發(fā)明的腫瘤抗原肽"，是含有Lengsin、BJ陽TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分肽的腫瘤抗原肽，能夠結(jié)合HLA抗原，并被CTL識別。因此，本發(fā)明的肽可以包含對應(yīng)于本發(fā)明蛋白的氨基酸序列的任何位置的肽，并為任何長度，只要該肽含有如上文定義的本發(fā)明蛋白的部分氨基酸序列，并可以與HLA抗原形成被CTL識別的復(fù)合物?？扇缦妈b定本發(fā)明的肽合成候選肽，其為Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分片段，并對候選肽進(jìn)行測定，以檢驗(yàn)CTL是否識別候選肽與HLA抗原之間的復(fù)合物，也就是說，候選肽是否具有作為腫瘤抗原肽的活性?？砂凑找话阌糜陔幕瘜W(xué)領(lǐng)域的方法進(jìn)行該肽的合成。這樣的方法可見于文獻(xiàn)，包括PeptideSynthesis,Interscience，NewYork,1966;TheProteins,第2巻，AcademicPressInc.,NewYork,1976;Peptide畫Gosei,Maruzen，Inc.,1975;Peptide-GoseinoKisotoJikken,Maruzen,Inc.,211985;和IyakuhinnoKaihatsu(Zoku),第14巻,Peptide-Gosei,Hirokawa-syoten,1991。鑒定本發(fā)明的腫瘤抗原肽的方法將在后文詳述。針對某些HLA類型，例如HLA-Al、-A0201、陽A0204、陽A0205、-A0206、-A0207、-All、-A24、-A31、-A6801、畫B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602，已闡述了被提呈的、結(jié)合HLA抗原的腫瘤抗原肽的氨基酸序列的規(guī)律性(基序)。參見Immunogenetics,41:178頁，1995等。例如，HLA-A24的基序已知具有8-11個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其中在2位的氨基酸為酪氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，C末端氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸(J.Immunol"152,3913頁，1994,Immunogenetics，41:178頁，1995.J,Immunol.,155:4307頁，1994)。對于HLA-A2的基序，列于表1的那些是已知的(Immunogenetics,41，178頁，1995,J.Immunol.,155:4749頁，1995)。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*所有肽都為8-11個(gè)氨基酸長。最近，已有可能使用NIH的BIMAS軟件(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla—bind/)經(jīng)互聯(lián)網(wǎng)檢索預(yù)期能夠結(jié)合HLA抗原的肽序列。關(guān)于肽的長度，結(jié)合多種HLA分子的抗原肽的分析揭示，其一般為約8-14個(gè)氨基酸(Immunogenetics,41:178，1995)。然而，對于HLA-DR、-DP和-DQ而言，還已知由14個(gè)以上的氛基酸組成的肽?？紤]到所述基序，易于由本發(fā)明蛋白的氨基酸序列選擇對應(yīng)于該肽的部分。例如，利用BIMAS軟件，可容易地選擇預(yù)期能夠結(jié)合HLA抗原的序列?？扇缦妈b定本發(fā)明的肽通過上述方法合成選定的候選肽，并檢驗(yàn)該候選肽是否結(jié)合HLA抗原并被CTL識別，即該候選肽是否具有作為腫瘤抗原肽的活性。具體地說，可通過在J,Immunol"154,2257頁，1995中所述的方法進(jìn)行鑒定。因此，加入候選肽，以在體外刺激分離自人類受試者的外周血淋巴細(xì)胞，所述人類受試者對預(yù)期提呈所述候選肽的HLA抗原為陽性。在特異性識別用候選肽脈沖的HLA陽性細(xì)胞的CTL被誘發(fā)時(shí)，該候選肽可能為腫瘤抗原肽。例如，通過使用ELISA等檢測CTL響應(yīng)于抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子(例如IFN-力的量，可以檢驗(yàn)是否發(fā)生CTL誘導(dǎo)?；蛘撸€可以通過"Cr釋放測定檢驗(yàn)CTL誘導(dǎo)，在"Cr釋放測定中，檢測CTL針對用"Cr標(biāo)記的抗原提呈細(xì)胞的細(xì)胞毒性(Int.J.Cancer,58:317頁，1994)。此外，可通過用候選肽脈沖諸如293-EBNA細(xì)胞(Invitrogen)的細(xì)胞檢驗(yàn)CTL的誘導(dǎo)，其中所述細(xì)胞已導(dǎo)入編碼預(yù)期存在候選肽的HLA抗原類型的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒，使細(xì)胞與限于預(yù)期提呈候選肽的前述類型的HLA抗原的CTL反應(yīng)，并檢測由CTL產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子(例如IFN-力(J.Exp.Med.，187:277,1998)。HLA抗原的實(shí)例包括HLA-A24抗原和HLA-A2抗原。為選擇限于HLA-A24的腫瘤抗原肽，可使用HLA-A2402cDNA(CancerRes.，55:4248-4252(1995),Genbank登錄號M64740)作為編碼HLA抗原的cDNA。為選擇限于HLA-A2的腫瘤抗原肽，可使用HLA-A0201cDNA(GenBank登錄號M84379)作為編碼HLA抗原的cDNA。對于CTL，除了通過用肽刺激人外周血淋巴細(xì)胞獲得的那些以外，還可以使用通過在文獻(xiàn)(Int.J.Cancer,39,390-396,1987;N.Eng.J.Med,333,1038-1044，1995)中描述的方法建立的CTL。本發(fā)明肽的體內(nèi)活性可通過使用針對人的動物模型的測定(WO02/47474,IntJ.Cancer100，565-570(2002))來確定。在以上情況中，腫瘤抗原肽序列的規(guī)律性(基序)是已知的；然而，當(dāng)肽的基序?yàn)槲粗獣r(shí)，HLA-B55或HLA-A26就是這種情況，本發(fā)明的腫瘤抗原肽可按照例如描述于W097/46676的方法鑒定，只有能夠識別HLA抗原和腫瘤抗原肽之間的復(fù)合物的CTL細(xì)胞系是可用的。本發(fā)明肽的具體實(shí)例包括來源于以下的部分肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成的Lengsin、由SEQIDNO:4的氨基齡列組成的BJ-TSA-9、由SEQIDNO:6的氨基酸序列組成的C20orf42、由SEQIDNO:8的氨基酸序列組成的BUB1、由SEQIDNO:10的氨基酸序列組成的C10orf3或由SEQIDNO:12的氨基酸序列組成的HIFPH3，其能夠結(jié)合HLA抗原，并被CTL識別?？紤]到本發(fā)明肽結(jié)合的HLA抗原，優(yōu)選實(shí)例包括能夠結(jié)合HLA-A24或HLA-A2抗原的肽。肽的長度可優(yōu)選為8-14個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為8-11個(gè)氨基酸。具體地說，本發(fā)明的肽包括含SEQIDNO:13-201中任一個(gè)的氨基酸序列、能夠結(jié)合HLA抗原并被CTL識別的肽。該肽的長度可優(yōu)選為9-14個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為9-11個(gè)氨基酸。更具體地說，作為結(jié)合HLA-A24的肺瘤抗原肽，例舉的肽由SEQIDNO:13-31、42-49、59-78、89-117、158-165、176-183和195-201中的任一個(gè)^J^酸序列組成，能夠結(jié)合HLA-A24抗原，并被CTL識另iJ(參見以下的表5、7、9、11、13和15)。優(yōu)選地，例舉的肽由SEQIDNO:42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列組成。更優(yōu)選地，例舉的肽由SEQIDNO:158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列組成。此外，作為結(jié)合HLA-A2的腫瘤抗原肽，例舉的肽由SEQIDNO:32-41、50-58、79-88、118-157、166-175和184-194中的任一個(gè)氨基酸序列組成，能夠結(jié)合HLA-A2抗原，并被CTL識別(參見以下的表6、8、10、12、14和16)。在本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明的肽不僅包括由SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的部分氨基酸序列組成的肽，而且包括通過部分修飾前述肽產(chǎn)生的變體(修飾)肽，只要該變體肽具有能夠結(jié)合HLA抗原并被CTL識別的特征。具體地說，所包含的氨基酸序列除了已引入的至少一個(gè)氨基酸修飾以外與本發(fā)明肽的氨基酸序列(由Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分氨基酸序列組成，具體地說是SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的^J^酸序列)相同，且具有作為腫瘤抗原肽的活性(即能夠結(jié)合HLA抗原并被CTL識別)的變體肽，屬于本發(fā)明的范圍。氨基酸殘基的"修飾"是指氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加，包括向肽的N-和/或C-末端添加，優(yōu)選為氨基酸殘基的取代。當(dāng)該修飾包括氨基酸殘基取代時(shí)，可隨意選擇要取代的氨基酸殘基的數(shù)量或位置，只要保持作為腫瘤抗原肽的活性；然而，優(yōu)選所述取代包括1至數(shù)個(gè)氨基酸殘基，因?yàn)槟[瘤抗原肽一般為如上提及的約8-14個(gè)氨基酸長。本發(fā)明的變體肽優(yōu)選為8-14個(gè)氨基酸長(然而，就HLA-DR、-DP或-DQ而言，可接受由14個(gè)以上的氨基酸組成的肽)。如上所述，對于某些HLA類型，例如HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-All、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602,已知結(jié)合HLA抗原并被提呈的抗原肽中的基序。此外，有可能經(jīng)由互聯(lián)網(wǎng)(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla—bind/)檢索預(yù)期能夠結(jié)合HLA抗原的肽序列。因此，人們可以基于該基序等制備以上的變體肽。例如，如上文所述，能夠結(jié)合HLA-A24并被提呈的抗原肽的基序已知為特征如下的序列在8-11個(gè)氨基酸的肽中，2位的氨基酸為酪氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，C末端氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸(J.Immunol.,152:3913頁，1994;Immunogenetics，41:178頁，1995;J.Immunol"155:4307頁，1994)。對于HLA-A2，基序已知為特征如下的序列在8-11個(gè)氨基酸的肽中，2位的氨基酸為亮氨酸、甲疏氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺，C末端氨基酸為纈氨酸或亮氨酸(Immunogenetics，41:178頁，1995;J.Immunol.,155:4749頁，1995)。此外，預(yù)期能夠結(jié)合HLA抗原的某些肽序列經(jīng)由互聯(lián)網(wǎng)(httt:〃bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hlabind/)公開。與以上基序的可用氨基酸具有類似特征的氨基酸也是可接受的。因此，本發(fā)明包括這樣的變體肽其含有的M酸序列與本發(fā)明肽的氨基酸序列相同，只是根據(jù)基序在可用于取代的位置(就HLA-A24和HLA-A2而言，為2位和C-末端)的氨基酸被另一個(gè)氨基酸取代，優(yōu)選被來自例如上述互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)的預(yù)期提供結(jié)合活性的氨基酸取代，具有結(jié)合HLA抗原的活性，并被CTL識別。更優(yōu)選地，本發(fā)明包括這樣的變體肽其在上述位置的氨基酸殘基被根據(jù)基序已知可用的另一個(gè)氨基酸取代，并具有作為腫瘤抗原肽的活性。因此，對于如示于SEQIDNO:13-31、42-49、59-78、89-117、158-165、176-183和195-201的HLA-A24結(jié)合肽，變體肽的實(shí)例包括這樣的肽其含有的氨基酸序列與SEQIDNO:13-31、42-49、59-78、89-117、158-165、176-183和195-201中的任一個(gè)氨基酸序列相同，只是在2位的氨基酸被酪氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸取代，能夠結(jié)合HLA-A24抗原，并被CTL識別。尤其是，更優(yōu)選其2位的氨基酸被酪氨酸取代的肽。更優(yōu)選地，變體肽由這樣的氨基酸序列組成其與SEQIDNO:42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、26198、199、200、201、177、178、179和183中的任一個(gè)氨基酸序列相同，只是2位的氨基酸被酪氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸取代，該變體肽能夠結(jié)合HLA-A24抗原，并被CTL識別。更優(yōu)選地，變體肽由這樣的氨基酸序列組成其與SEQIDNO:158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179和183中的任一個(gè)^ij^酸序列相同，只是在2位的氨基酸和/或C末端的氨基酸如上所述被取代，該變體肽能夠結(jié)合HLA-A24抗原，并被CTL識別。就示于SEQIDNO:32-41、50-58、79-88、118-157、166-175和184-194的HLA-A2結(jié)合肽而言，優(yōu)選的變體肽含有的氨基酸序列與SEQIDNO:32-41、50-58、79-88、118-157、166-175和184-194中的任一個(gè)氨基酸序列相同，只是2位的氨基酸被亮氨酸、曱硫氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端氨基酸被纈氨酸或亮氨酸取代，能夠結(jié)合HLA-A2抗原，并被CTL識別。本發(fā)明的肽還包括含有如上所述的本發(fā)明腫瘤抗原肽的表位肽。最近，業(yè)已表明，由連接在一起的多個(gè)(多于1個(gè))CTL表位(抗原肽)組成的肽("表位肽，，)有效誘導(dǎo)CTL。例如，業(yè)已報(bào)道，由源自腫瘤抗原蛋白PSA(各自限于HLA-A2-、-A3、-All或B53)的CTL表位連接在一起組成的肽(約30聚體)在體內(nèi)誘導(dǎo)對各自的CTL表位特異性的CTL(JournalofImmunology1998，161:3186-3194)。另外，業(yè)已表明，由CTL表位和輔助表位連接在一起組成的肽(表位肽)有效誘導(dǎo)CTL。在本文中，"輔助表位"是指能夠激活CD4陽性T細(xì)胞的肽(Immunity.,1:751,1994),其實(shí)例包括乙型肝炎病毒來源的HBVcl28-140、破傷風(fēng)毒素來源的TT947-967等。由輔助表位激活的CD4+T細(xì)胞表現(xiàn)出一些活性，包括誘導(dǎo)并維持CTL,以及活化諸如巨噬細(xì)胞的效應(yīng)子，并因此被認(rèn)為在免疫學(xué)抗腫瘤應(yīng)答中有重要作用。作為由輔助表位與CTL表位連接在一起組成的肽的具體實(shí)例，有報(bào)道指出，由6種HBV來源的HLA-A2限制性抗原肽、3種HLA-A11限制性抗原肽及輔助表位組成的DNA(微基因)在體內(nèi)有效誘導(dǎo)針對各自表位的CTL(JournalofImmunology1999，162:3915-3925)。實(shí)際上，由CTL表位(對應(yīng)于黑色素瘤抗原gpl00的280-288位的腫瘤抗原肽)和輔助表位(來源于破傷風(fēng)毒素的T輔助表位)連接組成的肽已進(jìn)行臨床試驗(yàn)(ClinicalCancerRes.，2001,7:3012-3024)。因此，本發(fā)明的腫瘤抗原肽還包括由含有連接在一起的本發(fā)明肽并具有CTL誘導(dǎo)活性的多個(gè)表位組成的肽(表位肽)。在這方面，"表位肽，，被定義為(l)由2個(gè)或多個(gè)CTL表位(腫瘤抗原肽)連接在一起組成的肽，或(2)由CTL表位和輔助表位連接在一起組成的肽，其在抗原提呈細(xì)胞中被加工，產(chǎn)生腫瘤抗原肽，然后被細(xì)胞提呈，并誘導(dǎo)CTL。當(dāng)CTL表位與本發(fā)明的肽連接時(shí)，CTL表位可來源于示于SEQIDNO:2的Lengsin、示于SEQIDNO:4的BJ-TSA-9、示于SEQIDNO:6的C20orf42、示于SEQIDNO:8的BUB1、示于SEQIDNO:10的C10orf3或示于SEQIDNO:12的HIFPH3的^tj^^列，并限于HLA國A1、畫A0201、陽A02(H、-A0205、-A0206、-A0207、-All、-A24、-A31、-A6801、畫B7、-B8、-B2705、-B37、-B55、-Cw0401、-Cw0602等。來源于其它腫瘤抗原蛋白的CTL表位也是可用的。多個(gè)CTL表位可以連接在一起，基于結(jié)合多種HLA分子的抗原肽的分析，CTL表位的長度可為約8-14個(gè)氨基酸(Immunogenetics，41:178，1995)。當(dāng)輔助表位連接本發(fā)明的肽時(shí)，輔助表位可為前述乙型肝炎病毒來源的HBVcl28-140、破傷風(fēng)毒素來源的TT947-967等。輔助表位長度可為約13-30個(gè)氨基酸，優(yōu)選為約13-17個(gè)氨基酸。由多個(gè)表位連接在一起組成的肽(表位肽)可通過前述的常規(guī)肽合成方法來制備。也可以通過常規(guī)DNA合成方法以及基于多核苷酸(其編碼由多個(gè)表位連接在一起組成的表位肽)的序列信息進(jìn)行基因工程來制備。也就是說，可通過將編碼表位肽的多核苦酸插入已知的表達(dá)載體，使用獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子并從培養(yǎng)物中回收目的表位肽，制備由多個(gè)表位連接在一起組成的表位肽。這些方法可以根據(jù)例如文獻(xiàn)中描述的方法(MolecularCloning,T.Maniatis等，CSHLaboratory(1983)，DNACloning,DM.Glover,IRLPRESS(1985))進(jìn)行。如上所述產(chǎn)生的由多個(gè)表位連接在一起組成的表位肽，可通過如上所述的測定檢驗(yàn)體外CTL誘導(dǎo)活性，或者利用WO02/47474或IntJ.Cancer.100，565-570(2002)中描述的測定使用針對人的模型動物檢驗(yàn)體內(nèi)CTL誘導(dǎo)活性。另外，可以修飾本發(fā)明的腫瘤抗原肽的N-末端氨基酸的氨基或C-末端氨基酸的羧基。經(jīng)歷此修飾的肽也屬于本發(fā)明的范圍。N-末端氨基酸氨基的修飾包括1-3個(gè)選自例如Cw烷基、苯基、環(huán)烷基和?；幕鶊F(tuán)。具體地說，酰基包括Cw烷?；⒈槐交〈腃L6烷?；?、被C5-7環(huán)烷基取代的羰基、d-6烷基磺?；?、苯基磺?；?、C2—6烷氧基羰基、被苯基取代的烷氧基羰基、被Cw環(huán)烷氧基取代的羰基、苯氧基羰基等。在C-末端氨基酸的羧基被修飾的肽可以為酯或酰胺形式。具體地說，所述酯包括Cw烷基酯、被苯基取代的Co—6烷基酯、Cw環(huán)烷基酯等。具體地說，所述酰胺包括酰胺、被l個(gè)或2個(gè)C"烷基取代的酰胺、被1個(gè)或2個(gè)0).6烷基(其中烷基被苯基取代)取代的酰胺、形成5-元至7-元氮雜環(huán)烷(包含酰胺基團(tuán)的氮原子)的酰胺等。3)本發(fā)明的核酸具體地說，本發(fā)明的核酸是指(1)包含編碼Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的核酸，和(2)包含編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的核酸。(l)編碼Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸以及含有該多核苷酸的核酸編碼Lengsin、BJ畫TSA國9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸可以為多種細(xì)胞或組織的cDNA或mRNA、cRNA或基因組DNA(例如來源于前列腺癌的那些)，或合成DNA。其可為單鏈的或雙鏈的。具體地說，所述多核香酸包括以下的(a)含有SEQIDNO:1、3、5、7、9或11的堿基序列的多核苷酸；(b)含有編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸；和含有的堿基序列類似于多核苷酸(a)或(b)的石成基序列的多核苷酸。在這方面，SEQIDNO:1的堿基序列對應(yīng)于人Lengsin基因的堿基序列，其以登錄號NM—016571向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。SEQIDNO:2的氨基酸序列對應(yīng)于人Lengsin的氨基酸序列，其以登錄號NM一016571、登錄號NP—057655向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。人Lengsin基因公開于非專利文獻(xiàn)7(Mol.Vis.Jun.15;8:185-95(2002))。SEQIDNO:3的堿基序列對應(yīng)于人BJ-TSA-9基因的堿基序列，其以登錄號NM—032899向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。SEQIDNO:4的氨基酸序列對應(yīng)于人BJ-TSA-9的氨基酸序列，其以登錄號NM—032899、登錄號NP—116288向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。人BJ-TSA-9基因公開于非專利文獻(xiàn)8(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(26):16899-903(2002))。SEQIDNO:5的堿基序列對應(yīng)于人C20orf42基因的堿基序列，其以登錄號NM—017671向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。SEQIDNO:6的氨基酸序列對應(yīng)于人C20orf42的氨基酸序列，其以登錄號NM—017671、登錄號NP—060141向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。人C20orf42基因公開于非專利文獻(xiàn)9(Biochim.Biophys.Acta1637:207-216(2003))。SEQIDNO:7的堿基序列對應(yīng)于人BUB1基因的堿基序列，其以登錄號NM—004336向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。SEQIDNO:830的氨基酸序列對應(yīng)于人BUB1的氨基酸序列，其以登錄號NM—004336、登錄號NP—004327向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。人BUB1基因公開于文獻(xiàn)(Genomics46:379-388(1997))。SEQIDNO:9的堿基序列對應(yīng)于人C10orf3基因的堿基序列，其以登錄號NM—018131向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。SEQIDNO:10的氨基酸序列對應(yīng)于人C10orf3的氨基酸序列，其以登錄號NM—018131、登錄號NP—060601向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。人C10orf3基因/>開于非專利文獻(xiàn)16(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Dec24;99(26):16899-903(2002》。SEQIDNO:11的堿基序列對應(yīng)于人HIFPH3基因的堿基序列，其以登錄號NM—022073向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。SEQIDNO:12的氨基酸序列對應(yīng)于人HIFPH3的氨基酸序列，其以登錄號NM—022073、登錄號NP—071356向GenBank數(shù)據(jù)庫登記。人HIFPH3基因公開于非專利文獻(xiàn)17(Cell107:43-54(2001))。具體地說，前述的(a)含有SEQIDNO:1、3、5、7、9或11的堿基序列的多核苷酸和(b)含有編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸包括由SEQIDNO:1、3、5、7、9或11的石威基序列組成的多核苷酸和由編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的g序列組成的多核苷酸。其它實(shí)例包括由含有SEQIDNO:1、3、5、7、9或11的堿基序列或編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基齡列的4^序歹寸(在其5'-和/或3'-末端添加額外的堿基序列)組成的多核香酸。"額外的堿基序列"可以為編碼非Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。此編碼Lengsin、BJ國TSA畫9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的特征在于由該多核苷酸編碼的蛋白具有作為腫瘤抗原蛋白的活性。其活性和測定方法描述于"l)本發(fā)明的蛋白"。可使用在GenBank登錄號NMJ)16571中公開的或本文31在SEQIDNO:1中公開的堿基序列的適宜部分作為雜交探針或PCR引物，通過篩選由例如肺腺癌細(xì)胞系(如l-87)獲得的cDNA文庫，克隆含有SEQIDNO:1的堿基序列的多核苦酸?？墒褂迷贕enBank登錄號NM_032899中公開的或本文在SEQIDNO:3中公開的堿基序列的適宜部分作為雜交探針或PCR引物，通過篩選由例如肺腺癌細(xì)胞系(如l-87)獲得的cDNA文庫，克隆含有SEQIDNO:3的堿基序列的多核苷酸?？墒褂迷贕enBank登錄號NM—017671中公開的或本文在SEQIDNO:5中公開的堿基序列的適宜部分作為雜交探針或PCR引物，通過篩選由例如結(jié)腸癌細(xì)胞系(例如SW480(ATCC編號CCL-228))獲得的cDNA文庫，克隆含有SEQIDNO:5的堿基序列的多核苦酸?？墒褂迷贕enBank登錄號NM_004336中公開的或本文在SEQIDNO:7中公開的堿基序列的適宜部分作為雜交探針或PCR引物，通過篩選由例如胰腺癌細(xì)胞系(如PUN)獲得的cDNA文庫，克隆含有SEQIDNO:7的堿基序列的多核苷酸?？墒褂迷贕enBank登錄號NM_018131中公開的或本文在SEQIDNO:9中公開的堿基序列的適宜部分作為雜交探針或PCR引物，通過篩選由例如肺腺癌細(xì)胞系(如l-87)獲得的cDNA文庫，克隆含有SEQIDNO:9的石威基序列的多核苷酸?？墒褂迷贕enBank登錄號NM_022073中公開的或本文在SEQIDNO:11中公開的堿基序列的適宜部分作為雜交探針或PCR引物，通過篩選由例如腎癌細(xì)胞系(如SMKTR-l)獲得的cDNA文庫，克隆含有SEQIDNO:11的堿基序列的多核苷酸。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可按照MolecularCloning,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)等中所述方法容易地進(jìn)行克隆。具體地說，所含堿基序列與以上(a)或(b)的多核苷酸的堿基序列類似的多核香酸包括以下的(c)在嚴(yán)格條件下能夠與多核苷酸(a)或(b)的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸，其編碼的蛋白具有作為腫瘤抗原蛋白的活性；(d)含有的堿基序列與多核苷酸(a)或(b)具有至少70%序列同一性的多核苷酸，其編碼的蛋白具有作為胂瘤抗原蛋白的活性；和(e)—種多核苷酸，其編碼蛋白含有的氨基酸序列與多核苷酸(a)或(b)編碼的氨基酸序列相同，只是缺失、取代和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其中所述蛋白具有作為腫瘤抗原蛋白的活性。優(yōu)選實(shí)例包括由與以上的多核苦酸(a)或(b)的堿基序列類似的4tt序列組成的多核苷酸。由與以上的多核苷酸(a)或(b)的堿基序列類似的堿基序列組成的多核苷酸包括以下的多核苷酸(c')-(e'):(c')在嚴(yán)格條件下能夠與多核苷酸(a)或(b)的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸，其編碼的蛋白具有作為腫瘤抗原蛋白的活性；(d')由與多核苷酸(a)或(b)具有至少70%序列同一性的堿基序列組成的多核苷酸，其編碼的蛋白具有作為腫瘤抗原蛋白的活性；和(e')—種多核苷酸，其編碼蛋白由與多核苷酸(a)或(b)編碼的氨基酸序列相同的氨基酸序列組成，不同的是其中缺失、取代和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其中所述蛋白具有作為腫瘤抗原蛋白的活性。"在嚴(yán)格條件下能夠與以上多核苷酸(a)或(b)的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸"的實(shí)例包括含有以下堿基序列的多核苷酸其與以上多核苷酸(a)或(b)的堿基序列具有至少約40%、優(yōu)選約60%、更優(yōu)選約70%、再更優(yōu)選約80%、還更優(yōu)選約90%、最優(yōu)選約95%的序列同一性，具體地說，包括由以上多核苷酸(a)或(b)的部分序列組成的多核香酸?？梢园凑兆陨硪阎姆椒ɑ蚺c其等效的方法進(jìn)行雜交，例如在基礎(chǔ)教科書"MolecularCloning,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)"中描述的方法等。另外，可使用市售可得的文庫按照其隨附的說明書進(jìn)行雜交。本文使用的"嚴(yán)格條件"可如在文獻(xiàn)(Berger和Kimmel，1987,"GuidetoMolecularCloningTechniquesMethodsinEnzymology"，152巻，AcademicPress,SanDiegoCA;或"MolecularCloning"第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))中所述基于形成復(fù)合物的核酸或結(jié)合探針的核酸的解鏈溫度(Tm)確定。例如，雜交可在含有6xSSC(20xSSC對應(yīng)于333mM檸檬酸鈉、333mMNaCl)、0.5%SDS和50%曱酰胺的溶液中于42。C進(jìn)行，或在含有6xSSC的溶液(無50%曱酰胺)中于65°C進(jìn)行。雜交后的洗滌可在約"lxSSC、0.1%SDS、37°C"的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，在這樣的洗滌條件下洗滌時(shí)，互補(bǔ)鏈保持與靶正向鏈結(jié)合。更嚴(yán)格的雜交條件可包括在約"0.5xSSC、0.1%SDS、42。C"的條件下洗滌，再更嚴(yán)格的雜交條件為約"0.1xSSC、0.1%SDS、65。C，'，但其不限于此。"含有的堿基序列與以上(a)或(b)的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸"包括含有的堿基序列與以上(a)或(b)的多核苷酸的堿基序列具有至少約70%、優(yōu)選約80%、更優(yōu)選約90%和最優(yōu)選約95%的序列同一性的多核苷酸，具體地說，包括由以上(a)或(b)的多核苷酸的部分序列組成的多核苷酸。本文使用的術(shù)語"序列同一性"是指兩個(gè)多核苷酸之間的同一性或同源性。通過比較兩個(gè)在對應(yīng)于待比專交序列的區(qū)域內(nèi)最優(yōu)比對的序列確定"序列同一性"。在本文中，待比較的兩個(gè)多核苷酸的最佳比對可具有添加或缺失(例如"空位")。可通過使用例如VectorNTI、ClustalW算法(NucleicAcidRes"22(22):4673-4680(1994))進(jìn)行比對計(jì)算此序列同一性。序列同一性可使用序列分析軟件(具體地說為VectorNTI或GENETYX-MAC)或由公共數(shù)據(jù)庫提供的測序工具來測定。這樣的公共數(shù)據(jù)庫通?？稍赪eb站點(diǎn)(http:〃www.ddbj.nig.ac.ip)獲得。具有此序列同一性的多核苷酸可按照前述雜交方法或常規(guī)PCR反應(yīng)或后文描述的用于修飾多核脊酸的反應(yīng)(缺失、添加或取代)制備。"多核苦酸，其編碼蛋白含有的M酸序列與以上的多核苷酸(a)或(b)編碼的蛋白的氨基酸序列相同，只是缺失、取代和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸"包括編碼人工產(chǎn)生的變體蛋白或活體中存在的等位基因變體的核酸。在這方面，對于氨基酸修飾(突變)的數(shù)目或位置沒有限制，只要保持本發(fā)明蛋白的活性。標(biāo)準(zhǔn)(人們可基于其確定要缺失、取代和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)量或位置而不降低活性)可使用本領(lǐng)域眾所周知的計(jì)算機(jī)程序獲得，例如DNAStar軟件。例如，突變數(shù)通常應(yīng)在總氨基酸殘基的10%之內(nèi)，優(yōu)選應(yīng)在總氨基酸殘基的5%之內(nèi)。而且，考慮到結(jié)構(gòu)保持，通過取代引入的氨基酸優(yōu)選與被除去的氨基酸具有類似特征，所述特征例如為極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、兩親性等。例如，Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp被分類為非極性氨基酸；Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln被分類為不帶電的氨基酸；Asp和Glu被分類為酸性氨基酸；而Lys、Arg和His被分類為堿性氨基酸。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以基于這些標(biāo)準(zhǔn)選擇相同類別內(nèi)的適宜M酸。編碼這些變體蛋白的多核苦酸可通過多種方法制備，例如在MolecularCloning,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中描述的定點(diǎn)誘變和PCR技術(shù)。其還可以使用市售可得的試劑盒通過已知方法"渚如Gappedduplex或Kunkel法制備。編碼如上所述的本發(fā)明蛋白的多核苷酸編碼具有作為肺瘤抗原蛋白活性的蛋白。"具有作為腫瘤抗原蛋白的活性"是指蛋白在用于腫瘤抗原蛋白活性的常規(guī)測定中為陽性。具體地說，其是指以下特征表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸的細(xì)胞被CTL識別，即細(xì)胞表現(xiàn)出對CTL的反應(yīng)性，換句話說，本發(fā)明的蛋白或由其獲得的腫瘤抗原肽活化或誘導(dǎo)CTL。其活性和測定方法描述于以上的"l)本發(fā)35明的蛋白"。含有本發(fā)明多核苷酸的核酸可以為單鏈的或雙鏈的，并可以為DNA或RNA。當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸為雙鏈時(shí)，可以通過將上述多核苷酸摻入表達(dá)載體中構(gòu)建用于表達(dá)本發(fā)明蛋白的表達(dá)載體。因此，本發(fā)明的核酸包括通過將本發(fā)明的雙鏈多核苦酸插入表達(dá)載體構(gòu)建的重組表達(dá)載體。適宜的表達(dá)載體可以根據(jù)要使用的宿主、用途等選擇，并包括質(zhì)粒、噬菌體載體、病毒載體等。當(dāng)宿主為大腸桿菌時(shí)，載體可以為質(zhì)粒載體，如pUC118、pUC119、pBR322和pCR3;或噬菌體載體，如XZAPII和入gtll。當(dāng)宿主為酵母時(shí)，載體可以為pYES2、pYEUra3等。當(dāng)宿主為昆蟲細(xì)胞時(shí)，載體可以為pAcSGHisNT-A等。當(dāng)宿主為動物細(xì)胞時(shí)，載體可以為質(zhì)粒載體，例如pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV和pRc/CMV;或者為病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。表達(dá)載體可以任選地包含諸如能夠誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子、編碼信號序列的基因、用于選擇的標(biāo)記基因和終止子的因子。此外，表達(dá)載體可以含有額外的序列，用于將蛋白表達(dá)為具有硫氧還蛋白、His-標(biāo)簽、GST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)等的融合蛋白，以便有利于蛋白的分離和純化。在此情況下能夠使用的載體包括含有在宿主細(xì)胞如pGEX4T中有功能的適宜啟動子(lac、tac、trc、trp、CMV、SV40早期啟動子等)的GST融合蛋白載體；含有Tag序列(Myc、His等)的載體，如pcDNA3.1/Myc-His;以及能夠表達(dá)具有石克氧還蛋白和His的融合蛋白的載體，如pET32a。通過用在以上獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，可以制備含有本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)化體。本文可以使用的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和動物細(xì)胞。大腸桿菌的實(shí)例包括大腸桿菌K-12的菌抹，例如HBIOI、C600、JM109、DH5a和AD494(DE3)。酵母的實(shí)例包括釀酒酵母(Sacc/zaramycescaev/w'ae)。動物細(xì)胞的實(shí)例包4舌L929、BALB/c3T3、C127、CHO、COS、Vero、Hela和293-EBNA細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞的實(shí)例包括sf9。導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。具體地說，其可以用磷酸4丐法、DEAE-葡聚糖法、電穿孔法或使用用于基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)(Lipofectamine,Lipofectin;Gibco-BRL)的方法進(jìn)行。在導(dǎo)入后，在含有選擇標(biāo)記的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，由此可以選擇含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體?？梢酝ㄟ^在合適的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白。產(chǎn)生的蛋白可以按照標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)方法進(jìn)一步分離并純化。純化方法包括鹽析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、凝膠過濾層析等。當(dāng)本發(fā)明的蛋白表達(dá)為如上所述的具有硫氧還蛋白、His標(biāo)簽、GST等的融合蛋白時(shí)，其可以通過利用這些融合蛋白或標(biāo)簽的特征的適宜純化方法分離和純化。(2)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸和含有該多核苷酸的核酸如上所述，含有編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的核酸屬于本發(fā)明核酸的范圍。編碼本發(fā)明肽的多核苷酸可以為DNA或RNA，并可以為單鏈的或雙鏈的。編碼本發(fā)明肽的多核苦酸可以基于關(guān)于肽的氨基酸序列或編碼其的DNA的信息容易地制備。具體地說，其可以通過常規(guī)方法如DNA合成或PCR擴(kuò)增來制備。具體地說，編碼本發(fā)明肽的多核苷酸包括編碼如上所述的表位肽的多核苷酸。含有編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的核酸可以為單鏈的或雙鏈的，并還可以為DNA或RNA。當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸為雙鏈時(shí)，用于表達(dá)本發(fā)明肽(表位肽)的重組表達(dá)載體可以通過將上述多核苷酸導(dǎo)入表達(dá)載體中構(gòu)建。本文使用的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法等類似于以上(l)中所述的那些。4)本發(fā)明的抗原提呈細(xì)胞可通過使具有抗原提呈能力的細(xì)胞在體外與上述的任一種本發(fā)明的蛋白、肽和核酸接觸來制備抗原提呈細(xì)胞。具體地說，本發(fā)明提供制備抗原提呈細(xì)胞的方法，其特征在于使分離自腫瘤患者的具有抗原提呈能力的細(xì)胞在體外與任一種本發(fā)明的蛋白、肽和核酸接觸，并由此制備抗原提呈細(xì)胞。在本文中，"具有抗原提呈能力的細(xì)胞"不限于具體的細(xì)胞，可為任何在表面上表達(dá)能夠提呈本發(fā)明肽的HLA抗原的細(xì)胞；然而，優(yōu)選已知具有特別高的抗原提呈能力的樹突細(xì)胞。此外，本發(fā)明的任何蛋白、肽和核酸均可用于由具有抗原提呈能力的細(xì)胞制備本發(fā)明的抗原提呈細(xì)胞。本發(fā)明的抗原提呈細(xì)胞可以如下制備由腫瘤患者分離具有抗原提呈能力的細(xì)胞，用本發(fā)明的蛋白或肽在體外脈沖所述細(xì)胞，并使所述細(xì)胞提呈HLA抗原和本發(fā)明肽之間的復(fù)合物(CancerImmunol.Immunother.,46:82，1998;J.Immunol.158:1796頁，1997;CancerRes.,59:1184，1999)。在使用樹突細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明的抗原提呈細(xì)胞例如可如下制備使用Ficoll法由腫瘤患者的外周血分離淋巴細(xì)胞，除去非粘附細(xì)胞，在GM-CSF和IL-4存在下溫育粘附細(xì)胞，以誘導(dǎo)樹突細(xì)胞，并用本發(fā)明的蛋白或肽溫育和脈沖所述樹突細(xì)胞。提呈能力的細(xì)胞中制備時(shí)，核酸可為DNA或RNA形式。具體地說，可以按照在CancerRes.，56:5672,1996或J.Immunol.,161:5607頁,1998中的教導(dǎo)使用DNA,并按照例如J.Exp.Med.,184:465頁，1996中的教導(dǎo)使用RNA。本發(fā)明的抗原提呈細(xì)胞的特征在于，該細(xì)胞提呈本發(fā)明的肽和HLA抗原之間的復(fù)合物，具體地說，包括其為樹突細(xì)胞并且在細(xì)胞表面上提呈由以下M酸序列組成的肽和HLA-A24抗原之間的復(fù)合物的抗原提呈細(xì)胞，所述氨基酸序列如下SEQIDNO:42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列(優(yōu)選為158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列)。這樣的抗原提呈細(xì)胞可以如下制備由HLA-A24+前列腺癌患者分離具有抗原提呈能力的細(xì)胞，用由SEQIDNO:42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列(優(yōu)選為158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179或183的^J^酸序歹'J)組成的肽體外脈沖所述細(xì)胞，并使所述細(xì)胞提呈所述肽和HLA-A24抗原之間的復(fù)合物。5)本發(fā)明的CTL任一種本發(fā)明的蛋白、肽和核酸在與外周血淋巴細(xì)胞接觸時(shí)均可以用于在體外誘導(dǎo)CTL。具體地說，本發(fā)明提供誘導(dǎo)CTL的方法，其中使得自腫瘤患者的外周血淋巴細(xì)胞與任一種本發(fā)明的蛋白、肽和核酸在體外接觸，并由此誘導(dǎo)CTL。對于黑素瘤，過繼免疫治療已顯示出療效，其中大量離體培養(yǎng)得自患者的腫瘤浸潤t細(xì)胞，并返回到同一患者中(j.Natl.Cancer.Inst.，86:1159,1994)。此外，在小鼠黑素瘤中，通過用肺瘤抗原肽TRP-2在體外刺激脾細(xì)胞，以誘導(dǎo)對腫瘤抗原肽特異性的CTL增殖，并將CTL給予黑素瘤移植小鼠，已觀察到轉(zhuǎn)移抑制(J.Exp.Med.,185:453,1997)。這由特異性識別抗原提呈細(xì)胞上的HLA抗原和腫瘤抗原肽之間的復(fù)合物的CTL的體外增殖產(chǎn)生。因此，一般認(rèn)為這樣的治療方法是有效的該方法包括用本發(fā)明的蛋白、肽或核酸在體外刺激患者的外周血淋巴細(xì)胞，以增殖胂瘤特異性CTL,并將CTL返回患者中。用于過繼免疫治療的CTL可以如下制備由患者分離外周血淋巴細(xì)胞，并用本發(fā)明的蛋白、肽或核酸在體外刺激淋巴細(xì)胞(JournalofExperimentalMedicine1999，190:1669)。本發(fā)明的CTL的特征在于其通過使外周血淋巴細(xì)胞與任一種本發(fā)明的蛋白、肽和核酸體外接觸而被誘導(dǎo)，并可以為單個(gè)CTL克隆或由多個(gè)CTL克隆組成的CTL混合物(群)。此CTL的具體實(shí)例為特異性識別由SEQIDNO:42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列組成的肽和HLA-A24抗原之間的復(fù)合物的CTL。此CTL的更優(yōu)選的實(shí)例為特異性識別由SEQIDNO:158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列組成的肽和HLA-A24抗原之間的復(fù)合物的CTL。6)本發(fā)明的藥物組合物如上所述的本發(fā)明的蛋白、肽、核酸、抗原提呈細(xì)胞和CTL可以為對每種物質(zhì)適宜形式的藥物組合物的活性成分。本發(fā)明的藥物組合物可以為CTL誘導(dǎo)物的活性成分，即癌癥疫苗，詳見下文。(l)含有本發(fā)明的蛋白作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物本發(fā)明的蛋白(Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3、HIFPH3)具有誘導(dǎo)CTL的活性，因此，本發(fā)明的蛋白可以用作腫瘤治療或預(yù)防藥物的活性成分(癌癥疫苗)。因此，含有本發(fā)明的蛋白作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物針對腫瘤發(fā)揮治療或預(yù)防作用。所述蛋白在給予腫瘤患者時(shí)，被抗原提呈細(xì)胞摻入，并在胞內(nèi)降解；通過胞內(nèi)降解產(chǎn)生的腫瘤抗原肽結(jié)合HLA抗原，形成復(fù)合物；然后該復(fù)合物被提呈至抗原提呈細(xì)胞表面；對該復(fù)合物特異性的CTL在體內(nèi)有效增殖，并破壞肺瘤細(xì)胞。以此方式實(shí)現(xiàn)腫瘤的治療或預(yù)防?？梢詫⒑斜景l(fā)明蛋白作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物給予Lengsin、BJ-TSA國9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白為陽性的任何腫瘤患者。具體地說，含有Lengsin作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以用于預(yù)防或治療癌癥(腫瘤)，例如肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌或胃癌。含有BJ-TSA-9作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以用于預(yù)防或治療癌癥(腫瘤)，例如白血病、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌或淋巴瘤。含有C20orf42作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以用于預(yù)防或治療癌癥(腫瘤)，例如肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肝癌、胃癌、白血病、惡性淋巴瘤組織、直腸癌、結(jié)腸癌或胰腺癌。含有BUB1作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以用于預(yù)防或治療癌癥(腫瘤)，例如乳腺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、大腸癌(結(jié)腸癌、直腸癌)、胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤。含有C10orf3作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以用于預(yù)防或治療癌癥(腫瘤)，例如乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、腎癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌或黑素瘤。癥(腫瘤)，例如乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、胰腺癌、肝癌、肺腺癌或肺鱗狀細(xì)胞癌。含有本發(fā)明蛋白作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以作為與藥學(xué)可接受的載體(例如適宜的佐劑)的混合物給予，或與該載體一起給予，以便能有效建立細(xì)胞免疫。可用的佐劑的實(shí)例包括描述于文獻(xiàn)(Clin.Microbiol.Rev.，7:277-289，1994)中的那些。具體地說，包括以下的孩t生物來源的組分或其衍生物、細(xì)胞因子、植物來源的組分或其衍生物、海洋生41物來源的組分或其衍生物、諸如氬氧化鋁的礦物凝膠、表面活性劑(如溶血卵磷脂及Pluronic⑧多元醇、聚陰離子、肽、油乳化劑(乳化制劑))等。另外，還包括脂質(zhì)體制劑、其中成分結(jié)合在幾^irn直徑的珠子上的顆粒制劑、其中成分附著至油脂的制劑、微球制劑和微嚢。在本文中，"微生物來源的組分或其衍生物"可以被具體地分類為(l)被殺死的細(xì)菌，(2)來源于細(xì)菌的細(xì)胞壁骨架(后文為"CWS")，和(3)微生物來源的特定組分及其衍生物。(1)被殺死的細(xì)菌的實(shí)例包括粉狀溶血性鏈球菌(例如Picibanil,ChugaiCo.,Ltd.)、被殺死的細(xì)菌混懸液的混合物(例如BroncasmaBerna,SanwaKagakuKenkyushoCo.,Ltd)或被殺死的結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌。(2)細(xì)菌來源的CWS的實(shí)例包括得自分枝桿菌的CWS(例如牛分枝桿菌CWS)、得自諾卡氏菌的CWS(例如紅色諾卡氏菌cws)、棒狀桿菌cws。(3)微生物來源的具體組分及其衍生物的實(shí)例包括微生物來源的多糖，例如來自結(jié)核分枝桿菌的多糖(例如Ancer,ZeriaPharmaceuticalCo.，Ltd.);來自擔(dān)子菌類的多糖(Lentinan⑧，Ajinomoto,Co.,Ltd.,;Krestin,Sankyo,Co"Ltd.;Basidiomycetes,Coriolusversicolor(Fr)Quel);胞壁酰二肽(MDP)相關(guān)化合物；脂多糖(LPS);脂質(zhì)A(MPL)相關(guān)化合物；糖脂海藻糖二霉菌酸S旨(TDM);細(xì)菌DNA(例如CpG寡核苷酸)；及其衍生物。這些微生物來源的組分及其衍生物可得自商業(yè)來源，或者可以按照在已知文獻(xiàn)(例如CancerRes.,33,2187-2195(1973);J.Natl.CancerInst.,48，831-835(1972),J.Bacteriol.,94，1736-1745(1967);Gann,69,619-626(1978)，J.Bacteriol.,92，869-879(1966)或J.Natl.CancerInst"52，95-101(1974))中描述的方法生產(chǎn)和分離。術(shù)語"細(xì)胞因子"指例如IFN-a、IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN-y、IL-18或IL-15。細(xì)胞因子可以為天然產(chǎn)物或基因工程產(chǎn)物。當(dāng)細(xì)胞因子市售可得時(shí)，人們可以購買和使用該細(xì)胞因子?；蛘?，可如下重組制備細(xì)胞因子基于向數(shù)據(jù)庫如GenBank、EMBL或DDBJ登記的堿基序列以常規(guī)方式克隆所需基因，將該基因連接入適宜的表達(dá)載體中，用所獲重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并使所述細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)預(yù)期的細(xì)胞因子。"植物來源的組分或其衍生物"的實(shí)例包括鬼苷來源的組分QuilA(AccurateChemical&ScientificCorp)、QS-21(AquilaBiopharmaceuticalsInc.)或甘草甜素(SIGMA-ALDRICH等)。"海洋生物來源的組分或其衍生物"的實(shí)例包括海綿來源的糖脂a-半乳糖苷神經(jīng)酰胺。油乳化劑(乳化制劑)的實(shí)例包括油包水型(w/0)、水包油型(o/w)和水包油包水型(w/o/w)的乳化制劑。在油包水型(w/o)乳化制劑中，活性成分分散在用作分散相的水中。在水包油型(o/w)乳化制劑中，活性成分分散在用作分狀介質(zhì)的水中。此外，在水包油包水型(w/o/w)乳化制劑中，活性成分M在為最內(nèi)相的水中。這些乳化制劑可以按照在例如JP-A-8-985、JP-A-9-122476等中的教導(dǎo)生產(chǎn)。"脂質(zhì)體制劑"是指微粒，其中活性成分嚢化在具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體的水相中或脂質(zhì)雙層內(nèi)。用于制備脂質(zhì)體的代表性脂質(zhì)包括磷脂酰膽堿和神經(jīng)鞘磷脂。還可以加入賦予電荷的磷酸二鯨蠟酯、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸等，用于穩(wěn)定脂質(zhì)體。生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法包括超聲法、乙醇注入法、乙醚注入法、反相蒸發(fā)法、高壓破碎提取法(Frenchpressextractionmethod)等。"微球制劑"是指由均一聚合物基質(zhì)組成的微粒，其中活性成分分散在基質(zhì)中。該基質(zhì)可以由生物可降解的聚合物組成，所述生物可降解的聚合物例如為白蛋白、明膠、幾丁質(zhì)、殼聚糖、淀粉、聚乳酸、聚氰基丙烯酸烷基酯等。微球制劑可以通過任何已知的方法制備，所述方法包括但不限于在文獻(xiàn)(Eur.J.Pharm.Biopharm.50:129-146,2000;Dev.Biol.Stand.92:63-78，1998;Pharm.Biotechnol.10:1-43，1997等)中描述的那些。"微嚢制劑"是指含有活性成分作為用膜包封的核心物質(zhì)的微粒。用于膜的包衣物質(zhì)包括成膜聚合物，例如羧曱基纖維素、醋酸纖維素酞酸酯、乙基纖維素、明膠、明M7阿拉伯膠、硝酸纖維素、聚乙烯醇、羥丙基纖維素等。微嚢制劑可以通過凝聚法、表面聚合等制備。例如可以皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)實(shí)現(xiàn)給藥。盡管在要給予的制劑中的本發(fā)明蛋白的劑量可以根據(jù)例如要治療的疾病、患者的年齡和體重進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，但其通常在0.0001mg-1000mg、優(yōu)選0.001mg-100mg、更優(yōu)選0.01mg-10mg的范圍內(nèi)，其可以每幾天至每幾個(gè)月給藥一次。(2)含有本發(fā)明肽作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物本發(fā)明的肽具有誘導(dǎo)CTL的活性。誘導(dǎo)的CTL可以通過淋巴因子的細(xì)胞毒性作用或生產(chǎn)發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明的肽可以用作治療或預(yù)防胂瘤的藥物(癌癥疫苗)的活性成分。當(dāng)將含有本發(fā)明肽作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物給予腫瘤患者時(shí)，本發(fā)明的肽纟皮提呈至抗原提呈細(xì)胞中的HLA抗原。然后，所提呈的HLA抗原和本發(fā)明肽之間的結(jié)合復(fù)合物的特異性CTL增殖，其后破壞腫瘤細(xì)胞。以此方式可在患者中實(shí)現(xiàn)腫瘤的治療或預(yù)防。含有本發(fā)明肽作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以給予任何對本發(fā)明蛋白為陽性的腫瘤患者。具體地說，其可用于預(yù)防或治療如在以上6)-(1)中所述的癌癥(腫瘤)。包含本發(fā)明肽作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以包含單個(gè)CTL表位(本發(fā)明的肽)或由本發(fā)明肽和其它肽(CTL表位或輔助表位)連接在一起組成的表位肽作為活性成分。最近，業(yè)已表明，由多個(gè)(多于1個(gè))CTL表位(抗原肽)連接在一起組成的表位肽具有有效誘導(dǎo)CTL的活性。例如，已有報(bào)道指出，由起源于腫瘤抗原蛋白PSA、各44自限于HLA-A2-、-A3-、-All或B53的CTL表位相連接組成的約30聚體的表位肽誘導(dǎo)對各自的CTL表位特異性CTL(JournalofImmunology1998，161:3186-3194)。另外，業(yè)已報(bào)道，由相連的CTL表位和輔助表位組成的表位肽可以有效誘導(dǎo)CTL。當(dāng)本發(fā)明的肽以表位肽的形式給予時(shí)，該肽被摻入抗原提呈細(xì)胞中；然后通過胞內(nèi)降解產(chǎn)生的抗原肽結(jié)合HLA抗原，形成復(fù)合物；復(fù)合物被以高密度提呈至抗原提呈細(xì)胞表面；對該復(fù)合物特異性的CTL在體內(nèi)有效增殖，并破壞腫瘤細(xì)胞。以此方式實(shí)現(xiàn)腫瘤的治療或預(yù)防。包含本發(fā)明肽作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物的具體實(shí)例包括含有由SEQIDNOS:13-201的任一個(gè)氨基酸序列組成的腫瘤抗原肽作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物。CTL誘導(dǎo)物的優(yōu)選實(shí)例為含有由SEQIDNO:42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179和183的任一個(gè)氨基,列組成的肽作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物。CTL誘導(dǎo)物的更優(yōu)選實(shí)例為含有由SEQIDNO:158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179和183的任一個(gè)氨基酸序列組成的肽作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物。含有本發(fā)明肽作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以在與藥學(xué)可接受的載體(例如適宜的佐劑)的混合物中給予或與該載體一起給予，使得可有效建立細(xì)胞免疫?？捎玫淖魟┑膶?shí)例包括描述于文獻(xiàn)(Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289,1994)中的那些。具體地說，包括以下的微生物來源的組分或其衍生物、細(xì)胞因子、植物來源的組分或其衍生物、海洋生物來源的組分或其衍生物、諸如氬氧化鋁的礦物凝膠、表面活性劑(如溶血卵磷脂及Pluronic⑧多元醇、聚陰離子、肽、油乳化劑(乳化制劑))等。另外，還包括脂質(zhì)體制劑、其中成分結(jié)合在幾直徑的珠子上的顆粒制劑、其中成分附著至油脂的制劑、微球制劑和微嚢。這些佐劑的具體實(shí)例與在以上"6)-l)含有本發(fā)明蛋白作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物"中所述的那些相同。例如可以皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)實(shí)現(xiàn)給藥。盡管本發(fā)明肽在要給予的制劑中的劑量可以根據(jù)例如要治療的疾病、患者的年齡和體重進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，但其通常在o.OOOlmg-1000mg、優(yōu)選0.001mg-100mg、更優(yōu)選0.1mg-10mg的范圍內(nèi)，其可以每幾天至每幾個(gè)月給藥一次。(3)含有本發(fā)明的核酸作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物本發(fā)明的核酸具有誘導(dǎo)CTL的活性。由此可以為用作治療或預(yù)防腫瘤的藥物(癌癥疫苗)的活性成分。含有本發(fā)明核酸作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物在給予腫瘤患者時(shí)，可以通過表達(dá)所述核酸對腫瘤發(fā)揮治療性或預(yù)防性作用。例如，當(dāng)以下述方式將摻入到表達(dá)載體中的本發(fā)明核酸給予腫瘤患者時(shí)，肺瘤抗原蛋白在抗原提呈細(xì)胞中高度表達(dá)。此后，通過胞內(nèi)降解產(chǎn)生的胂瘤抗原肽與HLA抗原形成復(fù)合物；然后復(fù)合物以高密度被提呈至抗原提呈細(xì)胞的表面；腫瘤特異性CTL在體內(nèi)有效增殖，并破壞腫瘤細(xì)胞。以此方式實(shí)現(xiàn)胂瘤的治療或預(yù)防。含有本發(fā)明的核酸作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以給予任何對本發(fā)明蛋白為陽性的腫瘤患者。具體地說，其可用于預(yù)防或治療如在以上6)-(l)中所述的癌癥(腫瘤)?？梢酝ㄟ^使用病毒載體或通過其它程序(Nikkei-Science,April,1994，20-45頁；Gekkan-Yakuji，36(1),23-48(1994);Jikken-Igaku-Zokan,l2(15),l"4,以及其中提及的參考文獻(xiàn))實(shí)現(xiàn)將本發(fā)明的核酸給予和導(dǎo)入細(xì)胞中。導(dǎo)入病毒載體的方法可以包括將本發(fā)明的DNA摻入DNA或RNA病毒中，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰滲病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒或新培斯病毒，并將所述病毒導(dǎo)入細(xì)胞中。其中尤其優(yōu)選涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒或痘苗病毒的方法。除了以上方法，還例舉了其中直接肌內(nèi)注射表達(dá)質(zhì)粒的方法(DNA接種)、脂質(zhì)體法、脂轉(zhuǎn)染法、微注射、磷酸鉀法和電穿孔，在它們之中特別優(yōu)選DNA接種和脂質(zhì)體法。在實(shí)踐中，例如在其中將核酸直接導(dǎo)入體內(nèi)的體內(nèi)方法中，或在其中將核酸體外導(dǎo)入得自人類受試者的某些細(xì)胞中并將細(xì)胞再導(dǎo)入受試者體內(nèi)的離體方法中，本發(fā)明的核酸可以用作藥物(Nikkei-Science,April,1994，20-45頁；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994);Jikkenn-Igaku-Zokan,12(15),1994;以及其中提及的參考文獻(xiàn))。更優(yōu)選體內(nèi)方法。就體內(nèi)方法而言，根據(jù)要治療的疾病和癥狀以及其它因素，可通過任何適宜的途徑實(shí)現(xiàn)給藥。例如，其可以經(jīng)由靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)途徑等給予。當(dāng)以體內(nèi)方法給予時(shí)，本發(fā)明的核酸可以配制為液體制劑，通常配制為含有本發(fā)明核酸作為活性成分的可注射形式，如有需要，還可以向其加入在藥學(xué)上可接受的載體。對于含有本發(fā)明核酸的脂質(zhì)體或膜融合脂質(zhì)體(例如仙臺病毒(HVJ)-脂質(zhì)體)，可以接受混懸劑、冷凍制劑、離心濃縮的冷凍制劑等形式的脂質(zhì)體制劑。盡管在要給予的制劑中的本發(fā)明核酸的劑量可以根據(jù)例如要治療的疾病、患者的年齡和體重進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，但核酸中的多核苷酸的量通常在0.0001mg-100mg、優(yōu)選0.001mg-10mg的范圍內(nèi)，其可以每幾天至每幾個(gè)月給藥一次。最近，已表明編碼多個(gè)(l個(gè)以上)CTL表位(腫瘤抗原肽)相連接或者CTL表位與輔助表位相連接組成的表位肽的多核苷酸在體內(nèi)有效誘導(dǎo)CTL。例如，已報(bào)道一種編碼由6種HBV來源的HLA-A2限制性抗原肽、3種HLA-A11限制性抗原肽及輔助表位相連接組成的表位肽的DNA(微基因)在體內(nèi)有效誘導(dǎo)針對各自表位的CTL(JournalofImmunology1999,162:3915-3925)。因此，通過連接一個(gè)或多個(gè)各自編碼本發(fā)明肽的多核苷酸和任選的編碼不同肽的其它多核苷酸制備的多核香酸，在導(dǎo)入到適宜的表達(dá)載體中時(shí)，可以為CTL誘導(dǎo)物的活性成分。這樣的CTL誘導(dǎo)物可以以上述的相同給藥方式或形式施用。(4)含有本發(fā)明的抗原提呈細(xì)胞作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物本發(fā)明的抗原提呈細(xì)胞具有誘導(dǎo)CTL的活性，并因此可以為用于治療或預(yù)防腫瘤的藥物的活性成分(癌癥疫苗)。含有本發(fā)明的抗原提呈細(xì)胞作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以通過給予腫瘤患者抗原提呈細(xì)胞對腫瘤發(fā)揮治療性或預(yù)防性作用。含有本發(fā)明的抗原提呈細(xì)胞作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物可以給予對本發(fā)明蛋白為陽性的任何腫瘤患者。具體地說，其可用于預(yù)防或治療如以上6)-(l)所述的癌癥(腫瘤)。含有抗原提呈細(xì)胞作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物優(yōu)選含有生理鹽水、磷酸緩沖鹽水(PBS)、媒介物等，以穩(wěn)定保持抗原提呈細(xì)胞。其可以例如靜脈內(nèi)、皮下或皮內(nèi)給予。在先前的文獻(xiàn)中例舉了誘導(dǎo)物的劑量。將含有抗原提呈細(xì)胞作為活性成分的CTL誘導(dǎo)物再導(dǎo)入對本發(fā)明蛋白為陽性的患者中，可以在患者體內(nèi)產(chǎn)生特異性CTL的有效誘導(dǎo)，并產(chǎn)生腫瘤治療作用。(5)含有本發(fā)明的CTL作為活性成分的癌癥疫苗本發(fā)明的CTL具有抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，并因此可以為用于治療或預(yù)防腫瘤的藥物(癌癥疫苗)的活性成分。含有本發(fā)明的CTL作為活性成分、用于治療或預(yù)防腫瘤的藥物組合物可以給予對本發(fā)明蛋白為陽性的任何腫瘤患者。具體地說，其可用于預(yù)防或治療如以上6)-(l)中所述的癌癥(腫瘤)。含有本發(fā)明的CTL作為活性成分、用于治療或預(yù)防腫瘤的藥物組合物優(yōu)選含有生理鹽水、磷酸緩沖鹽水(PBS)、媒介物等，以穩(wěn)定保持CTL。其可以例如靜脈內(nèi)、皮下或皮內(nèi)給予。將含有本發(fā)明的CTL作為活性成分的藥物組合物再導(dǎo)入對本發(fā)明蛋白為陽性的患者中，可以對患者體內(nèi)抗腫瘤細(xì)胞的CTL的細(xì)胞毒活性產(chǎn)生促進(jìn)作用，之后破壞腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生腫瘤治療作用。7)針對本發(fā)明肽的抗體本發(fā)明提供特異性結(jié)合本發(fā)明肽的抗體。就形式而言，本發(fā)明的抗體不受限制，可以為針對本發(fā)明肽產(chǎn)生的多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明的抗體在任何意義上均可不受限制，只要其特異性結(jié)合如上所述的本發(fā)明肽，具體實(shí)例是特異性結(jié)合腫瘤抗原肽的抗體，所述腫瘤抗原肽由SEQIDNO:13-201中的任一個(gè)氨基酸序列組成，優(yōu)選由SEQIDNO:42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179或183的氨基財(cái)列組成，更優(yōu)選由158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列組成。制備抗體的方法在本領(lǐng)域眾所周知，本發(fā)明的抗體可以4安照、這些常夫見方法(CurrentprotocolsinMolecularBiology,Ausubel等人編輯，(1987)Publish,JohnWileyandSons.11.12-11.13章，Antibodies;ALaboratoryManual,Lane,H,D.等人編輯，ColdSpringHarberLaboratoryPress,NewYork1989)中的任一種制備。具體地說，可以通過使用本發(fā)明的肽(例如由SEQIDNO:42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179和183中的任一個(gè)氨基酸序列組成的肽)作為免疫原免疫非人動物如兔，并以常規(guī)方式由免疫動物血清回收抗體，獲得本發(fā)明的抗體。當(dāng)抗體為單克隆抗體時(shí)，其可如下獲得用本發(fā)明的肽(例如由SEQIDNO:42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179和183中的任一個(gè)氨基酸序列組成的肽)免疫非人動物如小鼠，使所獲脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，以制備雜交瘤細(xì)胞，并由雜交瘤細(xì)胞回收抗體(CurrentprotocolsinMolecularBiology,Ausubel等人編輯，(1987)Publish.JohnWileyandSons.11.4-11.11章)。針對本發(fā)明肽的抗體還可以在根據(jù)宿主使用不同佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答的同時(shí)生產(chǎn)。佐劑的實(shí)例包括弗氏佐劑；諸如氫氧化鋁的礦物凝膠；表面活性劑，如溶血卵磷脂及Pluronic⑧多元醇、聚陰離子、肽、油乳化劑、匙孔蜮血藍(lán)蛋白和二硝基苯酚；人用佐劑，如BCG(卡介苗)和棒狀桿菌。如上所述，識別本發(fā)明肽的抗體和中和該肽活性的抗體可易于通過以常規(guī)方式免疫動物制備。所述抗體可用于親和層析、免疫診斷方法等。免疫診斷方法可適當(dāng)?shù)剡x自免疫印跡、放射性免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、熒光或發(fā)光測定等。免疫診斷方法應(yīng)有效診斷表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白的基因的癌癥。8)本發(fā)明的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體和HLA五聚體本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的腫瘤抗原肽和HLA抗原的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體。在癌癥免疫療法中，可通過在治療前檢驗(yàn)患者中針對腫瘤抗原(腫瘤抗原肽)的CTL前體細(xì)胞的頻率和量，或在用腫瘤抗原(腫瘤抗原肽)進(jìn)行治療的患者中檢驗(yàn)CTL的頻率或量，獲得用于選擇對腫瘤抗原(腫瘤抗原肽)高度響應(yīng)的患者、監(jiān)測療效或評價(jià)治療適用性的主要指示劑。各自均含有胂瘤抗原肽和HLA抗原的HLA單體、HLA二聚50體、HLA四聚體和HLA五聚體可在對抗原(抗原肽)特異性的CTL檢測中用作試劑，具體地說，可用于檢測CTL的頻率和量。本文使用的HLA四聚體是指如下制備的四聚體生物素化由締合肽(抗原肽)的HLA抗原a-鏈和(32-微球蛋白組成的復(fù)合物(HLA單體)，并使其結(jié)合抗生物素蛋白，用于四聚化(Science279:2103-2106(1998);和Science274:94-96(1996》。HLA單體是用于制備上述HLA四聚體的單體，通過生物素化締合的HLA抗原a-鏈、p2-微球蛋白和抗原肽而形成。HLA二聚體是如下制備的二聚體融合HLA抗原a-鏈和Ig(免疫球蛋白，例如IgGl),并使所獲融合體與(32-微球蛋白和抗原肽結(jié)合(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6671-6675(1993))。對結(jié)合HLA二聚體的抗原肽特異性的CTL可通過例如使標(biāo)記的抗IgGl抗體結(jié)合IgGl來4全測。HLA五聚體是最近開發(fā)的技術(shù)，是指含有5個(gè)分子復(fù)合物的五聚體，該復(fù)合物為通過巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域聚合的HLA抗原和抗原肽的復(fù)合物。因?yàn)镠LA抗原和抗原肽的復(fù)合物可以用焚光等標(biāo)記，所以可以類似于HLA四聚體通過流式細(xì)胞術(shù)等進(jìn)行分析(參見http:〃www.proimmune.co.uk/)。如上所述的HLA單體、二聚體、四聚體和五聚體全部都可以通過向諸如Prolmmune或BDBiosciences的生產(chǎn)商定制生產(chǎn)而獲得。目前，含有不同抗原肽的HLA四聚體等市售可得(Medical&BiologicalLaboratoriesCo.，Ltd.等)。具體地說，本發(fā)明的HLA單體、二聚體、四聚體和五聚體的實(shí)例包括HLA單體、二聚體、四聚體和五聚體，其各自均含有由SEQIDNO:42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179和183的氨基,列、優(yōu)選158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179和183的氨基酸序列和HLA-A24抗原組成的肽。尤其優(yōu)選HLA四聚體或HLA五聚體來檢測CTL。優(yōu)選用熒光標(biāo)記HLA單體、HLA四聚體和HLA五聚體，使得結(jié)合的CTL可易于被分揀出來，或易于通過已知檢測方法(如流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡等)來檢測。實(shí)例包括用藻紅蛋白(PE)、異硫氰酸熒光素(FITC)、多曱藻葉綠素蛋白(PerCP)、別藻藍(lán)蛋白(APC)等標(biāo)記的HLA單體、四聚體和五聚體。在可以為本發(fā)明的HLA單體、二聚體、四聚體和五聚體的組分的HLA抗原中，HLA-A24抗原(HLA-A24抗原的a-鏈)可基于在Genbank登錄號M64740中公開的HLA-A2402的已知堿基序列通過常規(guī)方法如PCR容易地克隆。HLA-A2抗原(HLA-A2抗原的a-鏈)可基于在Genbank登錄號M84379中公開的HLA-A0201基因的已知堿基序列通過常規(guī)方法如PCR容易地克隆。為本發(fā)明的HLA單體、二聚體、四聚體和五聚體的組分的p2-微球蛋白優(yōu)選源于人。人p2-微球蛋白可基于在Genbank登錄號AB021288中公開的人卩2-微球蛋白的已知tt序列通過常規(guī)方法如PCR容易地克隆。由上述的對應(yīng)文獻(xiàn)公知用于制備HLA單體、二聚體、四聚體和五聚體的方法。有關(guān)HLA-A24的HLA四聚體的制備簡述如下。首先，用HLA-A24a-鏈表達(dá)載體和|32-微球蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞，如能夠表達(dá)蛋白的大腸桿菌或哺乳動物細(xì)胞，并使其表達(dá)它們。在本文優(yōu)選使用大腸桿菌(例如BL21)。然后將所獲的單體形式的HLA-A24復(fù)合物和本發(fā)明的肽混合，形成可溶性HLA-肽復(fù)合物。用BirA酶生物素化HLA-肽復(fù)合物的HLA-A24a-鏈的C-末端序列。當(dāng)生物素化的HLA-肽復(fù)合物和熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白以4:1的摩爾比率混合時(shí)，形成HLA四聚體。優(yōu)選通過凝膠過濾等純化以上每個(gè)步驟所獲的蛋白。上述HLA單體、二聚體、四聚體和五聚體可有效用作對來源于本發(fā)明蛋白的腫瘤抗原肽特異性的CTL的檢測試劑。本發(fā)明的CTL檢測試劑可以用于例如以下用途。1)在啟動采用本發(fā)明的蛋白、肽或核酸的治療之前抬、瞼本發(fā)明的腫瘤抗原肽的CTL前體的頻率和量。這樣，可以評價(jià)患者對腫瘤抗原肽的反應(yīng)性。2)4全驗(yàn)患者在本發(fā)明的蛋白、肽或核酸治療下CTL的頻率或量。這樣，可進(jìn)行療效監(jiān)測、評價(jià)治療的合適性、確證治療進(jìn)展良好等。具體地說，可如下進(jìn)行CTL的檢測由受試患者分離含有CTL的生物樣品(例如PBMC),使本發(fā)明的HLA四聚體等與該生物樣品接觸，并通過例如流式細(xì)胞術(shù);^測對結(jié)合HLA四聚體的本發(fā)明肽特異性的現(xiàn)有CTL的頻率和量。9)本發(fā)明的疾病標(biāo)志物本發(fā)明還提供利用Lengsin、BJ-TSA腸9、C20orf42、BUB1、C10orfi或HIFPH3基因或其表達(dá)產(chǎn)物的癌癥(腫瘤)的疾病標(biāo)志物。如上所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相比于正常組織，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因在癌組織中的表達(dá)水平和/或頻率顯著增加。因此，識別這些基因或其表達(dá)產(chǎn)物(即蛋白)的抗體可用作表達(dá)這些基因的癌癥的疾病標(biāo)志物。后文闡述了識別Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因的多核苷酸或其表達(dá)產(chǎn)物(即蛋白)的抗體作為疾病標(biāo)志物的用途。(l)癌癥疾病標(biāo)志物及其應(yīng)用(l畫l)多核苷酸如上所述，人Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因是本領(lǐng)域已知的。已經(jīng)提到，相比于正常組織，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因在癌癥患者組織中的表達(dá)水平和/或頻率明確增加，本發(fā)明基于這一發(fā)現(xiàn)，以下想法也基于此檢測這些基因是否表達(dá)或這些基因的表達(dá)水平可以對癌癥的有或無、嚴(yán)重性或康復(fù)提供明確測定，并因此提供對癌癥的精確診斷。因此，本發(fā)明提供可用作工具(即疾病標(biāo)志物)的多核苷酸，其可通過在受試者中檢測這些基因是否表達(dá)或這些基因的表達(dá)水平，診斷受試者中癌癥的有或無或嚴(yán)重性。本文使用的"多核苷酸"包括RNA和DNA,并可以為單鏈或雙鏈的。"DNA"包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。"RNA"包括總RNA、mRNA和合成RNA。本發(fā)明疾病標(biāo)志物的特征在于其由多核苷酸和/或其互補(bǔ)多核苷酸組成，其中多核苷酸包含Lengsin、BJ-TSA畫9、C20orf42、BUB1、C10orfi或HIFPH3基因的堿基序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。具體地i兌，本發(fā)明的疾病標(biāo)志物可以由多核香酸和/或其互補(bǔ)多核苷酸組成，其中多核苷酸含有Lengsin基因(SEQIDNO:1)、BJ-TSA-9基因(SEQIDNO:3)、C20orf42基因(SEQIDNO:5)、BUB1基因(SEQIDNO:7)、C10orf3基因(SEQIDNO:9)或HIFPH3基因(SEQIDNO:ll)的石威基序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。在本文中，術(shù)語"互補(bǔ)多核苷酸(互補(bǔ)鏈、反向鏈)"是指基于堿基配對原則(例如A:T、G:C)與以下互補(bǔ)的多核苷酸由以上SEQIDNO的任一個(gè)堿基序列組成的多核苷酸的完整序列，或其含有任一個(gè)這些石威基序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的部分序列，為方^f更起見，其在本文還被稱為"正向鏈"。"互補(bǔ)鏈，，可以為與目標(biāo)正向鏈的堿基序列完全互補(bǔ)的序列，或者為具有的互補(bǔ)性足以在嚴(yán)格條件下與目標(biāo)正向鏈的堿基序列雜交的序列。本文使用的嚴(yán)格條件可以基于如在文獻(xiàn)中所述的形成復(fù)合物或結(jié)合探針的核酸的解鏈溫度(Tm)來確定(Berger和Kimmel，1987，"GuidetoMolecularCloningTechniquesMethodsinEnzymology",152巻，AcademicPress,SanDiegoCA)。例如，雜交后的洗滌通常可以在約"lxSSC、0.1%SDS、37。C，，的條件下進(jìn)行?；パa(bǔ)鏈在這些洗滌條件下洗滌時(shí)優(yōu)選保持結(jié)合目標(biāo)正向鏈。更嚴(yán)格的雜交條件可以涉及在約"0.5xSSC、0.1%SDS、42。C，，的條件下洗滌，再更嚴(yán)格的雜交條件包括約"0.1xSSC、0.1%SDS、65°C"的洗滌條件，但其不限于此。具體地說，這樣的互補(bǔ)鏈可以由與目標(biāo)正向鏈的堿基序列相比具有完全互補(bǔ)性或至少90%、優(yōu)選95°/。的同源性的堿基序列組成。正鏈的多核苷酸可以具有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orfi或HIFPH基因的堿基序列的完整或部分序列，或者可以與上述互補(bǔ)鏈的堿基序列互補(bǔ)。如上所述的正向鏈或互補(bǔ)(反向)鏈的多核苷酸可以以單鏈或雙鏈形式用作疾病標(biāo)志物。具體地說，本發(fā)明的疾病標(biāo)志物可以為由Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的堿基序歹寸(完整序列)或其互補(bǔ)序列組成的多核苷酸?；蛘撸膊?biāo)志物可以為由如上所述的完整序列的部分序列或其互補(bǔ)序列組成的多核苷酸，只要該多核苦酸選擇性(特異性)識別Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或源自其的多核苷酸。部分序列可以為含有適宜地選自上述完整序列或其互補(bǔ)序列的石成基序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核普酸。本文使用的術(shù)語"選擇性(特異性)識別"意指就RNA印跡而言，可以特異性4企測Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或由其獲得的多核普酸，就RT-PCR方法而言，生產(chǎn)Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或由其獲得的的多核苷酸。然而，以上定義不是限制性的，可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)，只要本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以通過使用源自這些基因中的任一個(gè)的多核苷酸確定要檢測的物質(zhì)或產(chǎn)生的產(chǎn)物。例如，本發(fā)明的疾病標(biāo)志物可以利用引物355(http:〃www.genome.wi.mit.edu/cgi陽bin/primer/primer3.cgi)或載體NTI(Infomax)由Lengsin基因(SEQIDNO:1)、BJ-TSA-9基因(SEQIDNO:3)、C20orf42基因(SEQIDNO:5)、BUBl基因(SEQIDNO:7)、C10orf3基因(SEQIDNO:9)或HIFPH3基因(SEQIDNO:1l)的堿基序列設(shè)計(jì)。具體地說，通過使用引物3或載體NTI軟件由Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的堿基序列獲得的候選序列，或者至少含有候選序列一部分的序列，可以用作引物或探針。本發(fā)明的疾病標(biāo)志物含有如上所述的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸長度，根據(jù)標(biāo)志物的應(yīng)用，可以適宜地選擇和設(shè)計(jì)長度。(l-2)作為探針或引物的多核香酸通過在受試者的生物樣品中檢驗(yàn)Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因中的至少一種是否表達(dá)或其表達(dá)水平進(jìn)行本發(fā)明的癌癥檢測(診斷)。在此，本發(fā)明的疾病標(biāo)志物可以用作特異性識別和擴(kuò)增由任一個(gè)這些基因表達(dá)的RNA或由其獲得的的多核苷酸的引物，或者用作特異性檢測此RNA或由其獲得的的多肽的探針。當(dāng)本發(fā)明的疾病標(biāo)志物用作檢測癌癥(即用于遺傳診斷)的引物時(shí)，該引物一般可以含有15-100bp、優(yōu)選15-50bp、更優(yōu)選15-35bp的長度。在用作檢測癌癥的探針時(shí)，該探針一般可以含有15bp-lkp、優(yōu)選100bp-lkb的長度。本發(fā)明的疾病標(biāo)志物可以在特異性檢測特定基因的任何已知方法中以常規(guī)方式用作引物或探針，所述方法例如為RNA印跡、RT-PCR、原位雜交等。然后，可以檢驗(yàn)涉及癌癥的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因是否表達(dá)或其表達(dá)水平。待檢驗(yàn)的樣品可以為用常規(guī)方法由受試者的耙組織的生物樣品(例如活檢樣品)制備的總RNA，或由該總RNA制備的多核苷酸。在生物樣品中的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表達(dá)水平可以通過使用DNA芯片檢測或定量。在此，本發(fā)明的疾病標(biāo)志物可以用作DNA芯片的探針(就基因芯片人類基因組U95A、B、C、D、E(Affymetrix)而言，用作多核苷酸探針，其為25bp長度)。當(dāng)含有本發(fā)明的疾病標(biāo)志物作為其探針的DNA芯片與由生物樣品的RNA制備的標(biāo)記-DNA或RNA雜交時(shí)，本發(fā)明的疾病標(biāo)志物(即探針)和標(biāo)記的DNA或RNA形成復(fù)合物。通過利用標(biāo)記的DNA或RNA的標(biāo)記檢測復(fù)合物，可以檢驗(yàn)Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orfi或HIFPH3基因是否表達(dá)或其表達(dá)水平。DNA芯片可以含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的疾病標(biāo)志物，其可以結(jié)合Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因中的任一個(gè)。當(dāng)DNA芯片含有1個(gè)以上的標(biāo)志物時(shí)，可以在1個(gè)生物樣品中同時(shí)檢驗(yàn)1個(gè)以上的基因是否表達(dá)或其表達(dá)水平。本發(fā)明的疾病標(biāo)志物可用于診斷或4企測癌癥，也就是說，診斷癌癥是否存在或癌癥的嚴(yán)重性。具體地說，可以通過評價(jià)受試者和健康個(gè)體之間的組織生物樣品中的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表達(dá)水平差異，使用疾病標(biāo)志物進(jìn)4于癌癥i貪斷。在此，兩種受試者的表達(dá)水平之間的差異可以為有或無表達(dá)，或者在兩種受試者中均觀察到表達(dá)時(shí)，該差異可以為至少1.5倍，優(yōu)選2倍，更優(yōu)選3倍。具體地說，來源于Lengsin基因的多核苦酸可用作肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌或胃癌的疾病標(biāo)志物。具體地說，來源于BJ-TSA-9基因的多核苷酸可用作白血病、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌或淋巴瘤的疾病一示志物。具體地說，來源于C20orf42基因的多核苷酸可用作肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肝癌、胃癌、白血病、惡性淋巴瘤組織、直腸癌、結(jié)腸癌或胰腺癌的疾病標(biāo)志物。具體地說，來源于BUBl基因的多核苷酸可用作乳腺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、大腸癌(結(jié)腸癌、直腸癌)、胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤的疾病標(biāo)志物具體地說，來源于C10orf3基因的多核苷酸可用作乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、腎癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌或黑素瘤的疾病標(biāo)志物。具體地說，來源于HIFPH3基因的多核苦酸可用作乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、胰腺癌、肝癌、肺腺癌或肺鱗狀細(xì)胞癌的疾病標(biāo)志物。(l-3)抗體本發(fā)明提供特異性識別Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表達(dá)產(chǎn)物(即蛋白Lengsin、BJ-TSA畫9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3)的抗體，其可以用作癌癥的疾病標(biāo)志物。具體地說，本發(fā)明提供特異性識別分別具有SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白的抗體。已經(jīng)提到，相比于正常細(xì)胞或組織，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因在癌癥患者組織中的表達(dá)水平和/或頻率明確增加，本發(fā)明基于這一發(fā)現(xiàn)，以下想法也基于此檢測這些基因是否表達(dá)或其表達(dá)水平可以對癌癥的有或無、嚴(yán)重性或康復(fù)提供明確測定，并因此提供對癌癥的精確診斷。因此，所述抗體可用作工具(即疾病標(biāo)志物)，其可通過在受試者中^r測該蛋白是否表達(dá)或該蛋白的表達(dá)水平，診斷受試者是否存在癌癥或其嚴(yán)重性。如上所述，人Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3蛋白在本領(lǐng)域是已知的。就形式而言，本發(fā)明的抗體不受限制，可為針對Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3產(chǎn)生的多克隆抗體或單克隆抗體。此外，本發(fā)明的抗體包括對由任一個(gè)這些蛋白的氨基酸序列的一般至少8個(gè)、優(yōu)選15個(gè)、更優(yōu)選20個(gè)連續(xù)氨基酸組成的多肽具有親和力的抗體。制備此抗體的方法在本領(lǐng)域眾所周知，本發(fā)明的抗體可以按照任一個(gè)這些常規(guī)方法制備(CurrentprotocolsinMolecularBiology,Ausubel等人編輯，(1987)Publish.JohnWileyandSons.11.12-11.13章)。具體地說，當(dāng)抗體為多克隆抗體時(shí)，其可如下獲得用以常規(guī)方式在大腸桿菌中表達(dá)并由大腸桿菌純化的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白作為免疫原，或者用具有以常規(guī)方式合成的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分氨基酸序列的寡肽作為免疫原，免疫非人動物如兔，并以常規(guī)方式由免疫動物的血清回收抗體。當(dāng)抗體為單克隆抗體時(shí)，其可如下獲得用以常規(guī)方式在大腸桿菌中表達(dá)并由大腸桿菌純化的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白或者用具有以常規(guī)方式合成的任一種這些蛋白的部分氨基酸序列的寡肽免疫非人動物如小鼠，并使所獲脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，以制備雜交瘤細(xì)胞，并由雜交瘤細(xì)胞回收抗體(CurrentprotocolsinMolecularBiology,Ausubel等人編輯，(1987)Publish.JohnWileyandSons.11.4-11.11章)。可以通過諸如DNA克隆、構(gòu)建對應(yīng)質(zhì)粒、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中、培養(yǎng)所獲轉(zhuǎn)化體并由轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物回收蛋白的程序，由本文提供的SEQIDNO1、3、5、7、9和11中任一個(gè)的序列獲得在抗體制備中用作免疫原的蛋白Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUBl、C10orf3或HIFPH3。這些程序可以通過本領(lǐng)域:技術(shù)人員已知的或在文獻(xiàn)(MolecularCloning,T.Maniatis等，CSHLaboratory(1983)，DNACloning,DM.Glover，IRLPRESS(1985))中描述的任一種方法進(jìn)行。具體地說，用作制備本發(fā)明抗體的免疫原的蛋白可以如下獲得構(gòu)建在選定的宿主細(xì)胞中提供Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因表達(dá)的重組DNA(即表達(dá)載體)，將該DNA轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，以提供轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，由轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物回收目標(biāo)蛋白。另夕卜，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分肽可以基于本文提供的氨基酸序列(SEQIDNO:2、4、6、8、10或12)通過常用的化學(xué)(肽)合成方法制備。在此，本發(fā)明的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3不僅包括SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的蛋白，而且包括其同源物。同源物包括由以下氨基^列組成的蛋白該^J^酸序列與SEQIDNO:2、4、6、8、10或12的氨基酸序列相同，只是缺失、取代和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，并具有與該蛋白的已知免疫學(xué)活性等效的免疫學(xué)活性。具有與該蛋白的已知免疫學(xué)活性等效的免疫學(xué)活性的同源物為例如能夠在適宜的動物或其細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)并特異性結(jié)合抗Lengsin、BJ畫TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的抗體的蛋白。關(guān)于蛋白中的M酸突變的數(shù)量或位置沒有限制，只要保持該蛋白的免疫學(xué)活性。人們可基于其確定要缺失、取代和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)量或位置而不降低免疫學(xué)活性的標(biāo)準(zhǔn)可使用本領(lǐng)域眾所周知的計(jì)算機(jī)程序獲得，例如DNAStar軟件。例如，突變數(shù)通常應(yīng)在總氨基酸殘基的10%之內(nèi)，優(yōu)選應(yīng)在總氨基酸殘基的5%之內(nèi)，更優(yōu)選在總氨基酸殘基的1%之內(nèi)。要取代的氨基酸不受限制，只要所獲蛋白保持與Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3等效的免疫學(xué)活性?？紤]到保持結(jié)構(gòu)，通過取代引入的氨基酸優(yōu)選與被取代的氨基酸具有類似特征，其中所述特征包括極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、兩親性等。例如，Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp被分類為非極性氨基酸；Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln被分類為不帶電的氨基酸；Asp和Glu被分類為酸性氨基酸；而Lys、Arg和His被分類為堿性氨基酸。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以基于這些標(biāo)準(zhǔn)選擇屬于相同類別的適宜氨基酸?？赏ㄟ^使用具有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分氨基酸序列的寡肽獲得本發(fā)明的抗體。用于制備抗體的寡肽不一定具有功能性生物活性，但其需要具有與對應(yīng)蛋白類似的免疫原性。優(yōu)選地，寡肽具有這樣的免疫原性，并由BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的氨基酸序列的至少8個(gè)、優(yōu)選15個(gè)、更優(yōu)選20個(gè)連續(xù)氨基酸組成。為制備針對該寡肽的抗體，可將多種佐劑與免疫原一起同時(shí)給予宿主，以便增強(qiáng)免疫反應(yīng)性。佐劑的實(shí)例為(但不限于)弗氏佐劑；諸如氫氧化鋁的礦物凝膠；表面活性劑，如溶血卵磷脂、Pluronic⑧多元醇、聚陰離子、肽、油乳化劑、匙孔蜮血藍(lán)蛋白和二硝基苯酚；人用佐劑，如BCG(卡介苗)或棒狀桿菌。另外，本發(fā)明可以使用商品化抗體，包括抗Bubl抗體(Upstate)、抗-C10orf3抗體(Abnova)、抗-C20orf42抗體(Imgenex)和抗-HIFPH3抗體(Bethyl)。本發(fā)明的抗體具有特異性結(jié)合Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的特征，因此可特異性檢測在受試者的組織中表達(dá)的蛋白(及其同源物)。因此，本發(fā)明的抗體可以用作檢測Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3在受試者的組織中是否表達(dá)或其表達(dá)水平的探針。具體地說，Lengsin、BJ-TSA國9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3可如下檢測通過活檢等獲得患者靶組織的生物樣品，以常規(guī)方式制備組織提取物或由其獲得的的蛋白，并通過已知方法如蛋白質(zhì)印跡、ELISA等使用所述抗體作為探針以常規(guī)方式進(jìn)行檢測。通過檢驗(yàn)Lengsin、BJ陽TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3中的至少一種在受試者的組織中的水平，并與^fc康個(gè)體中的該水平相比較，可提供癌癥診斷。蛋白水平的差異可為有或無蛋白，或者可以為至少2倍，優(yōu)選3倍。特異性識別Lengsin的抗體尤其可用作肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌或胃癌的疾病標(biāo)志物。特異性識別BJ-TSA-9的抗體尤其可以用作白血病、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌或淋巴瘤的疾病標(biāo)志物。特異性識別C20orf42的抗體尤其可以用作肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肝癌、胃癌、白血病、惡性淋巴瘤組織、直腸癌、結(jié)腸癌或胰腺癌的疾病標(biāo)志物。特異性識別BUB1的抗體尤其可以用作乳腺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、大腸癌(結(jié)腸癌、直腸癌)、胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤的疾病標(biāo)志物。特異性識別C10orf3的抗體尤其可用作乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、腎癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌或黑素瘤的疾病標(biāo)志物。特異性識別HIFPH3的抗原尤其可以用作乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、胰腺癌、肝癌、肺腺癌或肺鱗狀細(xì)胞癌的疾病標(biāo)志物。(2)^r測(或it斷)癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種利用如上所述的本發(fā)明疾病標(biāo)志物檢測(或診斷)癌癥的方法。具體地說，本發(fā)明的檢測方法包括通過活檢等由受試者收集靶組織的生物樣品，檢測和測量Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表達(dá)水平(量)或由該基因編碼的蛋白的表達(dá)水平(量)，并檢測(或診斷)癌癥的有或無或嚴(yán)重性。本發(fā)明的檢測(診斷)方法可用于檢測(或診斷)為改善癌癥而給予癌癥患者的治療劑實(shí)際上是否可以改善疾病，和/或所述治療劑可以提供多大的改善。本發(fā)明的癌癥檢測方法包括以下的步驟(a)、(b)和(c):62(a)使由受試者制備的生物樣品與本發(fā)明的疾病標(biāo)志物接觸；(b)通過使用疾病標(biāo)志物作為指示劑，檢測樣品中Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表達(dá)水平，和(c)基于(b)的結(jié)果確定受試者是否患有癌癥。本文使用的生物樣品可以為由受試者的耙組織制備的樣品。具體地說，生物樣品可以為含有由(靶)組織制備的RNA的樣品、含有由該RNA制備的多核苷酸的樣品或含有由靶組織制備的蛋白的樣品。該含有RNA、多核苷酸或蛋白的樣品可在通過活檢等收集受試者的一部分組織后通過常規(guī)方法制備。本發(fā)明的診斷方法可根據(jù)要檢驗(yàn)的生物樣品如下所述進(jìn)行。Ol)當(dāng)要檢驗(yàn)的生物樣品為RNA時(shí)當(dāng)要檢驗(yàn)的生物樣品為RNA時(shí)，癌癥的檢測可通過含有以下步驟(a)、(b)和(c)的方法進(jìn)行(a)使本發(fā)明的疾病標(biāo)志物(即具有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的44&序列的至少15個(gè)連續(xù)核苦酸的多核苷酸和/或其互補(bǔ)多核苷酸)與由受試者的生物樣品制備的RNA或由其轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)多核香酸雜交；b)使用疾病標(biāo)志物作為指示劑檢測與疾病標(biāo)志物雜交的、由生物樣品制備的RNA或由其轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)多核苷酸；和(c)基于(b)中的檢測結(jié)果確定受試者是否患有癌癥。當(dāng)要檢驗(yàn)RNA時(shí)，本發(fā)明的檢測(診斷)方法可通過檢測和測量RNA中Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。具體地說，該方法可通過使用本發(fā)明的疾病標(biāo)志物(即含有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的堿基序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸和/或其互補(bǔ)多核苷酸)作為引物或探針，通過已知方法如RNA印跡、RT-PCR、DNA芯片分析、原位雜交等進(jìn)行。就RNA印跡而言，本發(fā)明的疾病標(biāo)志物用作探針，并可以檢測和測量RNA中Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUBl、C10orB或HIFPH3基因是否表達(dá)或其表達(dá)水平。例如，本發(fā)明的疾病標(biāo)志物(其為互補(bǔ)鏈)用放射性同位素(32P、33P等RI)或焚光物質(zhì)標(biāo)記。然后，標(biāo)記的疾病標(biāo)志物以常規(guī)方式與被轉(zhuǎn)移到尼龍膜等上的、由受試者的組織制備的RNA雜交。此后，可通過用放射性檢測器(BAS-1800H,FujiPhotoFilm.，Inc.)或熒光檢測器檢測和測量標(biāo)記(RI或熒光物質(zhì))的信號檢測在標(biāo)記的疾病標(biāo)志物(DNA)和RNA之間形成的雙鏈體?；蛘?，可以用AlkPhos直接標(biāo)記和檢測系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech)按照生產(chǎn)商的方案標(biāo)記疾病標(biāo)志物(即探針DNA)，并使其與由受試者的組織制備的RNA雜交，然后可以4吏用Multi-biomeasureSTORM860(AmershamPharmaciaBiotech)4企測和測量疾病標(biāo)志物上的標(biāo)記的信號。就RT-PCR而言，本發(fā)明的疾病標(biāo)志物用作引物，可以檢測和測量RNA中Lengsin、BJ國TSA國9、C20orf42、BUB1、C10orfi或HIFPH3基因是否表達(dá)或其表達(dá)水平。例如，以常規(guī)方式由來源于受試者的組織的RNA制備cDNA，該cDNA與由本發(fā)明的疾病標(biāo)志物制備的引物對(正向引物與為反向鏈的上述cDNA雜交,反向引物結(jié)合正向鏈)雜交，以便使用該cDNA作為模板擴(kuò)增對應(yīng)于Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的靶區(qū)域。然后，以常規(guī)方式進(jìn)行PCR，檢測所產(chǎn)生的已擴(kuò)增DNA雙鏈體。已擴(kuò)增DNA雙鏈體的檢測例如可通過以下方法實(shí)現(xiàn)其中采用先前用RI或熒光物質(zhì)標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR，檢測產(chǎn)生的標(biāo)記DNA雙鏈體；其中產(chǎn)生的DNA雙鏈體被轉(zhuǎn)移到尼龍膜等之上，然后由于與用作探針的標(biāo)記的疾病標(biāo)志物雜交而被檢測。所產(chǎn)生的標(biāo)記DNA雙鏈體可以使用Agilent2100Bioanalyser(YokogawaAnalyticalSystemsInc.)等檢測。檢測還可以如下實(shí)現(xiàn)使用SYBRGreenRT-PCR試劑(AppliedBiosystems)按照生產(chǎn)商的方案制備RT-PCR反應(yīng)溶液，使用ABIPRISM7700序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems)進(jìn)行反應(yīng)，并檢測反應(yīng)產(chǎn)物。就DNA芯片分析而言，例如，在其上連接本發(fā)明的疾病標(biāo)志物的DNA芯片被制備為DNA探針(其為單鏈的或雙鏈的DNA探針)，DNA芯片以常規(guī)方式與由來源于受試者組織的RNA制備的cRNA雜交。然后，由DNA和cRNA形成的雙鏈體通過使由本發(fā)明的疾病標(biāo)志物制備的標(biāo)記探針與該雙鏈體結(jié)合而被檢測。能夠檢測和測量Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表達(dá)水平的DNA芯片可用于本發(fā)明。這樣的DNA芯片的實(shí)例為基因芯片人類基因組U95A、B、C、D、E(Affymetrix)。在以下實(shí)施例中描述了使用這樣的DNA芯片檢測和測量Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orB或HIFPH3基因在受試者的RNA中的表達(dá)水平。(2-2)當(dāng)要檢驗(yàn)的生物樣品為蛋白時(shí)當(dāng)要檢驗(yàn)的生物樣品為蛋白時(shí)，本發(fā)明的檢測(診斷)方法通過檢測和測量生物樣品中的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orfi或HIFPH3的水平(量)進(jìn)行。具體地說，該方法可包含以下步驟(a)、(b)和(c):(a)使由受試者的生物樣品制備的蛋白與為抗體的本發(fā)明疾病標(biāo)志物(即識別Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的抗體)結(jié)合；b)通過使用疾病標(biāo)志物作為指示劑，檢測與疾病標(biāo)志物結(jié)合的、由生物樣品制備的蛋白或由其獲得的的部分肽；和(c)基于(b)中的檢測結(jié)果確定受試者是否患有癌癥。具體地說，該方法可為已知方法，例如蛋白質(zhì)印跡，用于通過使用為抗體的本發(fā)明疾病標(biāo)志物(即特異性識別Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的抗體)檢測和測量Lengsin、BJ畫TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3。65蛋白質(zhì)印跡可以通過使用抗體進(jìn)行，即本發(fā)明的疾病標(biāo)志物為一抗，用放射性同位素如1251、熒光物質(zhì)等標(biāo)記的抗體作為結(jié)合一抗的二抗，并使用放射性檢測器(BAS-1800n，F(xiàn)ujiPhotoFilm.,Inc.等)、熒光檢測器等檢測和測量所產(chǎn)生的標(biāo)記復(fù)合物中的放射性同位素或焚光物質(zhì)的信號?；蛘?，在使用本發(fā)明的疾病標(biāo)志物作為一抗后，可以用ECLPlus蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech)按照生產(chǎn)商的方案和用Multi-biomeasureSTORM860(AmershamPharmaciaBiotech)進(jìn)行檢測和測量。(2-3)癌癥的it斷癌癥的診斷可如下進(jìn)行比較受試者組織中Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表達(dá)水平或Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白的表達(dá)水平(或量)和正常組織中的該水平，并評價(jià)二者之間的差異。由所需的正常組織收集或制備的生物樣品(RNA或蛋白)可以通過活檢或在其同意的情況下通過收集死后組織得自無癌癥的受試者的組織或癌癥患者的非癌性的正常組織。"無癌癥的受試者"是指至少無癥狀的受試者，優(yōu)選為任何其它診斷方法如X-射線檢查結(jié)果未被診斷為癌癥的受試者。"無癌癥的受試者"在本文可被簡稱為"健康個(gè)體"?？梢酝ㄟ^在受試者和健康個(gè)體二者的平行生物樣品中測量，對受試者組織中的基因或蛋白的表達(dá)水平與正常組織(即沒有癌癥的受試者的組織或癌癥患者的非癌性正常組織)中的該表達(dá)水平進(jìn)行比較。健康個(gè)體中的基因或蛋白的表達(dá)水平不一定是平行檢測的水平，在恒定條件下可以使用通過檢測多個(gè)(至少2個(gè)，優(yōu)選等于或多于3個(gè)，更優(yōu)選等于或多于5個(gè))正常組織確定的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或蛋白表達(dá)水平的平均值或統(tǒng)計(jì)學(xué)中值。當(dāng)Lengsin、BJ畫TSA畫9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或其表達(dá)產(chǎn)物(即Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白)在受試者組織中的表達(dá)水平為健康個(gè)體水平的2倍、優(yōu)選3倍高時(shí)，受試者被確定為患有癌癥。當(dāng)受試者中的所述基因或蛋白的表達(dá)水平高于健康個(gè)體中的該水平時(shí)，受試者^t確定為患有癌癥或疑似患有癌癥。具體地說，在以上的基因和蛋白中，當(dāng)Lengsin基因或蛋白的表達(dá)水平在受試者的肺和胃中比在對應(yīng)的正常組織中高時(shí)，受試者疑似患有癌癥。此外，當(dāng)BJ-TSA-9基因或蛋白的表達(dá)水平在受試者的白細(xì)胞、肺、口腔、胃、胰腺或淋巴結(jié)中比在對應(yīng)的正常組織中高時(shí)，受試者疑似患有癌癥。此外，當(dāng)C20orf42基因或蛋白的表達(dá)水平在受試者的肺、肝臟、胃、白細(xì)胞、淋巴結(jié)、直腸、結(jié)腸或胰腺中比在對應(yīng)的正常組織中高時(shí)，受試者疑似患有癌癥。此外，當(dāng)BUB1基因或蛋白的表達(dá)水平在受試者的乳腺、肺、卵巢、口腔、腎臟、大腸(結(jié)腸、直腸)、胃、胰腺、肝臟、白細(xì)胞、淋巴結(jié)或皮膚中比在對應(yīng)的正常組織中高時(shí)，受試者疑似患有癌癥。此外，當(dāng)C10orf3基因或蛋白的表達(dá)水平在受試者的乳腺、結(jié)腸、直腸、腎臟、胃、卵巢、肝臟、胰腺、肺或皮膚中比在對應(yīng)的正常組織中高時(shí)，受試者疑似患有癌癥。此外，當(dāng)HIFPH3基因或蛋白的表達(dá)水平在受試者的乳腺、結(jié)腸、胃、腎臟、胰腺、肝臟、肺中比在對應(yīng)的正常組織中高時(shí)，受試者疑似患有癌癥。本發(fā)明由以下實(shí)施例具體解釋，但不能在任何意義上認(rèn)為所述實(shí)施例限制本發(fā)明。實(shí)施例1由人組織樣品和人癌細(xì)胞系制備總RNA通過常規(guī)方法由如下的人主要器官的癌癥組織和正常組織的樣品制備總RNA:肺腺癌(57個(gè)樣品)、正常肺(得自肺腺癌患者)(46個(gè)樣品)、肺鱗狀細(xì)胞癌(48個(gè)樣品)、正常肺(得自肺鱗狀細(xì)胞癌患者)(18個(gè)樣品)、結(jié)腸癌(108個(gè)樣品)、正常結(jié)腸(得自結(jié)腸癌患者)(114個(gè)樣品)、直腸癌(43個(gè)樣品)、正常直腸(得自直腸癌患者)(31個(gè)樣品)、胃癌(38個(gè)樣品)、正常胃(得自胃癌患者)(13個(gè)樣品)、乳腺癌(237個(gè)樣品)、正常乳腺(得自乳腺癌患者)(39個(gè)樣品)、卵巢癌(37個(gè)樣品)、正常卵巢(得自卵巢癌患者)(5個(gè)樣品)、肝癌(19個(gè)樣品)、正常肝臟(得自肝癌患者)(8個(gè)樣品)、腎癌(89個(gè)樣品)、正常腎臟(得自腎癌患者)(64個(gè)樣品)、胰腺癌(55個(gè)樣品)、正常胰腺(得自胰腺癌患者)(16個(gè)樣品)、白血病(6個(gè)樣品)、淋巴瘤(90個(gè)樣品)、正常骨髓(2個(gè)樣品)、黑素瘤(10個(gè)樣品)和正常皮膚(72個(gè)樣品)。實(shí)施例2DNA芯片分析使用由實(shí)施例1中所述的樣品制備的總RNA進(jìn)行DNA芯片分析。對于DNA芯片分析，使用基因芯片人類基因組U133套件(Affymetrix)。具體地說，分析包含以下步驟(l)由總RNA制備cDNA，(2)由cDNA制備標(biāo)記的cRNA,(3)片段化標(biāo)記的cRNA,(4)使片段化的cRNA與探針陣列雜交，(5)染色探針陣列，(6)篩選探針陣列，和(7)分析基因表達(dá)。(l)由總RNA制備cDNA將含有在實(shí)施例1中制備的每種總RNA(10pg)和T7-(dT)24引物(Amersham)(lOOpmol)(llial)的混合物加熱至70°C達(dá)IO分鐘，并在冰上冷卻。在冷卻后，加入5x首鏈cDNA緩沖液(4pL)、0.1MDTT(二硫蘇糖醇)(2ili1)和10mMdNTPMix(1pl)(用于cDNA合成的Superscript選擇系統(tǒng)(Gibco-BRL)),將混合物加熱至42。C達(dá)2分鐘。然后，加入SuperScriptlIRT(2nl，400U)(包含在上述試劑盒中)，將混合物加熱至42°C達(dá)1小時(shí)，然后在冰上冷卻。在冷卻后，加入用DEPC(nacalaitesque)(91iul)處理的無菌蒸餾水和5x第二鏈反應(yīng)緩沖液(30HL)、10mMdNTPMix(3|til)、大腸桿菌DNA連接酶(lIOU)、大腸桿菌DNA聚合酶I(4pl，40U)和大腸桿菌RNaseH(1pl，2U)(包括在如上所述的試劑盒中)，將混合物于16°C溫育2小時(shí)。在加入T4DNA聚合酶(2IOU)(包括在如上所述的試劑盒中)之后，將混合物再于16°C溫育5分鐘，然后添加0.5MEDTA(10pl)。加入苯酚/氯仿/異戊醇溶液(NIPPONGENECO.,LTD.)(162jil)并混合。將混合物移至預(yù)先于室溫以14,000rpm離心30秒的PhaseLockGelLight(Eppendorf),并于室溫以14,000rpm離心2分鐘，將其水相(145pl)移至Eppendorf管。向獲得的溶液添加7.5M乙酸銨溶液(72.5inl)和乙醇(362.5pl)，并混合，然后于4°C以14,000rpm離心20分鐘。在離心后，通過廢棄上清液獲得含有所制備的cDNA的沉淀。然后，向沉淀添加80%乙醇(0.5mL)，并于4。C以14,000rpm離心5分鐘，廢棄上清液。在重復(fù)相同的步驟后，干燥沉淀，用DEPC-處理的水(12iul)裂解。結(jié)果，由在實(shí)施例1中制備的每種總RNA獲得cDNA。(2)由cDNA制備標(biāo)記的cRNA將每種cDNA溶液(5pl)與DEPC-處理的水(17nl)和10xHY反應(yīng)緩沖液(4pl)、10x生物素標(biāo)記的核糖核苷酸(4|nl)、10xDTT(4|ul)、10xRNA酶抑制劑混合物(4jil)和20xT7RNA聚合酶(2nl)(BioArray高產(chǎn)RNA轉(zhuǎn)錄物標(biāo)記試劑盒(ENZO))混合，并于37°C溫育5小時(shí)，以制備標(biāo)記cRNA。在溫育后，向溶液加入DEPC-處理的水(60[il)，利用RNeasy小型試劑盒(GIAGEN)按照生產(chǎn)商的方案純化所制備的標(biāo)記cRNA。(3)片段化標(biāo)記的cRNA向5x片段化緩沖液(200mMTris-乙酸pH8.1(Sigma)、500mM乙酸鉀(Sigma)、150mM乙酸鎂(Sigma))(8W)加入含有每種標(biāo)記的cRNA(20iug)的溶液，加熱溶液(40pl)至94°C達(dá)35分鐘，并置于冰上。結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)記cRNA的片段化。(4)片段化的cRNA與探針陣列的雜交將每種片段化的cRNA(40iul)加入5nM對照寡聚物B2(Amersham)(4pl)、100x對照cRNA混合物(4pl)、緋魚精DNA(Promega)(40嗎)、乙酰化BSA(Gibco-BRL)(200嗎)、2xMES雜交緩沖液(200mMMES，2M[Na+]，40mMEDTA,0.02%吐溫20(Pierce),pH6.5-6.7)(200nl)和DEPC處理的水(144pl)，產(chǎn)生雜交混合物(400nl)。將獲得的每種雜交混合物加熱至99°C達(dá)5分鐘，然后于45。C達(dá)5分鐘。在加熱后，于室溫以14,000rpm離心雜交混合物5分鐘，以獲得上清液。同時(shí)，如下制備才t驗(yàn)陣列用lxMES雜交緩沖液裝載人類基因組U133探針陣列(Affymetrix)，在雜交烘箱中于45。C以60rpm旋轉(zhuǎn)該陣列IO分鐘，然后除去lxMES雜交緩沖液。將如上獲得的每種雜交混合物的上清液(200W)加入探針陣列，在雜交烘箱中于45°C以60rpm旋轉(zhuǎn)該探針陣列16小時(shí)，以使片段化的cRNA與探針陣列雜交。(5)探針陣列的染色在由每個(gè)與片段化的cRNA雜交的探針陣列除去雜交混合物之后，用非嚴(yán)格洗滌緩沖液(feSSPE(由20xSSPE(nacalaitesque)稀釋)、0.01%吐溫20和0.005%防沫劑0-30(Sigma)裝載探針陣列。然后，將與片段化的cRNA雜交的探針陣列置于裝載非嚴(yán)格洗滌緩沖液和嚴(yán)格洗滌緩沖液(IOOmMMES、0.1MNaCl、0.01%吐溫20)的GeneChipFluidicsStation400(Affymetrix)中的給定位置。此后，按照染色方案EuKGE-WS2，用第一染色溶液(IO嗎/mL鏈霉抗生物素蛋白藻紅蛋白(SAPE)(MolecuLarProbe)、2mg/mL乙酰化BSA、100mMMES、1MNaCl(Ambion)、0.05%吐溫20、0.005%防沫劑0-30)和第二染色溶液(100|ug/mL山羊IgG(Sigma)、3|tig/mL生物素化抗-鏈霉抗生物素蛋白70抗體(VectorLaboratories)、2mg/mL乙?；疊SA、100mMMES、1MNaCl、0.05%吐溫20、0.005%防沫劑0-30)染色探針陣列。(6)探針陣列的掃描和(7)基因表達(dá)水平分析將染色的探針陣列運(yùn)用于HP基因陣列掃描儀(Affymetrix)，并讀取染色模式?；谠撊旧Ｊ?，通過基因芯片工作站系統(tǒng)(Affymetrix)分析探針陣列上的基因表達(dá)。然后，在按照分析方案標(biāo)準(zhǔn)化后，計(jì)算每個(gè)樣品中每種探針(即每種基因)的表達(dá)水平(平均差異)以及是否存在表達(dá)。對于每種探針，計(jì)算不同種類樣品的每一種的基因表達(dá)水平的平均值，并獲得不同種類樣品之間的表達(dá)水平和頻率的差異。實(shí)施例3表達(dá)變異分析如下所述，選擇顯示出在源自多種主要器官(肺、結(jié)腸、直腸、胃、乳腺、肝臟、腎臟、卵巢、胰腺)中癌組織的表達(dá)水平和/或頻率比正常組織增加的基因。按照基因表達(dá)的DNA芯片分析結(jié)果，從一組其在癌組織中的表達(dá)水平和/或頻率相比于對應(yīng)的正常組織增加的探針中，選擇在許多癌組織中的表達(dá)水平和/或頻率顯示明確增加的探針。然后，檢查并選擇對應(yīng)于這些選定探針的基因。結(jié)果，選定6個(gè)基因BUB1、C10orf3、C20orf42、Lengsin、HIFPH3和BJ-TSA-9基因。這6種基因的表達(dá)變異比率描述于表2，表達(dá)頻率描述于表3。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>表2中的值指示與對應(yīng)的正常組織相比在多種癌癥組織中的表達(dá)變化比率，其中在每種癌癥組織中的表達(dá)水平相對于用人基因組U133芯片分析的在每種正常組織中的表達(dá)水平(被-魄為l)確定。表3中的值指示所述基因在多種癌癥組織和正常組織中的表達(dá)頻率(%)。BUB1基因顯示出在檢驗(yàn)的所有癌癥組織中的表達(dá)水平相比于正常組織增加，該增加在肺鱗狀細(xì)胞癌和卵巢癌中特別顯著。表達(dá)頻率也增加，該增加在肺鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌和黑素瘤組織中特別顯著。C10orf3基因顯示出在乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、直腸癌和黑素瘤組織中的表達(dá)水平相比于正常組織增加，該增加在卵巢癌、肝癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中特別顯著。如對表達(dá)水平所觀察到的一樣，表達(dá)頻率在除血癌之外的所有癌癥中也增加，該增加在肺鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌和卵巢癌中特別顯著。C20orf42基因顯示出在結(jié)腸癌、肝癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、胃癌、直腸癌、白血病和惡性淋巴瘤組織中的表達(dá)水平相比于正常組織增加，該增加在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌中特別顯著。表達(dá)頻率也增加，該增加在肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和胰腺癌中特別顯著。Lengsin基因顯示出在肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和胃癌中的表達(dá)水平相比于正常組織增加，該增加在肺腺癌中特別顯著。如對表達(dá)水平所觀察到的一樣，表達(dá)頻率在肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和胃癌中也增加，該增加在肺腺癌中特別顯著。HIFPH3基因顯示出在乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌和胃癌組織中的表達(dá)水平相比于正常組織增加，該增加在腎癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中特別顯著。如對表達(dá)水平所觀察到的一樣，表達(dá)頻率在乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺腺癌、74肺鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌和胃癌中也增加，該增加在腎癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和胰腺癌中特別顯著。BJ-TSA-9基因顯示出在肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和白血病中的表達(dá)水平相比于正常組織增加，該增加在白血病、肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中特別顯著。如對表達(dá)水平所觀察到的一樣，表達(dá)頻率在肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和白血病中也增加，該增加在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中特別顯著。如上所示，選定的6種基因顯示出在癌癥組織中的表達(dá)水平和頻率相比于對應(yīng)的正常組織明確增加。因此，發(fā)現(xiàn)這6種基因及其表達(dá)產(chǎn)物(即蛋白)可用作癌癥的疾病標(biāo)志物(尤其是對于以上提及的癌癥)。實(shí)施例4通過RT-PCR法對不同細(xì)胞和組織中的腫瘤抗原基因進(jìn)行表達(dá)分析通過RT-PCR法分析以上6種基因在不同的癌細(xì)胞系、癌癥組織和正常組織中的表達(dá)。使用Isogen試劑(NipponGene)或市售可得(clontech)的來源于正常組織的RNA，用寡dT引物由提取自不同癌細(xì)胞系和癌癥組織的RNA制備cDNA，并使用描述于表4的引物組合(BUB1基因，引物l:SEQIDNO:208，引物2:SEQIDNO:209;C10orf3基因，引物l:SEQIDNO:210，引物2:SEQIDNO:211;C20orf42基因，引物1:SEQIDNO:206,引物2:SEQIDNO:207;Lengsin基因，引物1:SEQIDNO:202，引物2:SEQIDNO:203;HIFPH3基因，引物l:SEQIDNO:212，引物2:SEQIDNO:213;BJ-TSA-9基因，引物l:SEQIDNO:204，引物2:SEQIDNO:205)通過PCR反應(yīng)(40個(gè)循環(huán))擴(kuò)增。此后，通過電泳分離擴(kuò)增的cDNA，以進(jìn)行分析。作為陽性對照，以和上述相同的方式通過RT-PCR法證實(shí)G3PDH基因的表達(dá)。所用的一部分癌癥和正常組織在得到知情同意后主要由手術(shù)樣品制備。結(jié)果示于圖1-6。[表4]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage76</formula>BUB1基因在大部分正常組織中不表達(dá)或以低水平表達(dá)，但在口腔鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、大腸癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤和黑素瘤細(xì)胞系中高度表達(dá)。C10orf3基因在除睪丸以外的大部分正常組織中不表達(dá)或以低水平表達(dá)，但在肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中高度表達(dá)。C20orf42基因在大部分正常組織中不表達(dá)，^E在結(jié)腸癌和胰腺癌細(xì)胞系中高度表達(dá)。Lengsin基因在大部分正常組織中不表達(dá)，但在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中高度表達(dá)。HIFPH3基因在大部分正常組織中表達(dá)，但在腎癌細(xì)胞系中以較高水平表達(dá)。另外，相比于正常組織，HIFPH3基因在源自腎癌患者的許多癌癥組織中以較高水平表達(dá)。BJ-TSA-9在大部分正常組織中不表達(dá)，但在肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌和淋巴瘤細(xì)胞系中高度表達(dá)?？傊?，這6種基因在多種癌細(xì)胞系和組織中高度表達(dá)，盡管癌癥的類型彼此不同，但不在正常組織中表達(dá)或以比在癌細(xì)胞或組織中低的水平在正常組織中表達(dá)，除了DNA芯片分析結(jié)果以外，這些結(jié)果強(qiáng)有力地提示，這6種基因及其表達(dá)產(chǎn)物(即蛋白)可以用作癌癥的疾病標(biāo)志物(尤其是用于如上所述的癌癥)。76實(shí)施例5候選肽的合成和選擇(l)候選肽的選擇根據(jù)Lengsin的氨基酸序列(SEQIDNO:2)，選擇由SEQIDNO:13-31和195-201的氨基酸序列以及SEQIDNO:32-41的氨基酸序列組成的肽，分別作為潛在結(jié)合HLA-A24和HLA-A2分子的候選肽。根據(jù)BJ-TSA-9的^J^酸序列(SEQIDNO:4)，選擇由SEQIDNO:42-49的氨基酸序列和SEQIDNO:50-58的氨基酸序列組成的肽分別作為潛在結(jié)合HLA-A24和HLA-A2分子的候選肽。根據(jù)C20orf42的氨基酸序列(SEQIDNO:6)，選擇由SEQIDNO:59-78的氨基酸序列和SEQIDNO:79-88的氨基酸序列組成的肽，作為分別潛在結(jié)合HLA-A24和HLA-A2分子的候選肽。根據(jù)BUB1的氨基酸序列(SEQIDNO:8),選擇由SEQIDNO:89-117的氨基瞎列和SEQIDNO:118-157的氨基酸序列組成的肽，作為分別潛在結(jié)合HLA-A24和HLA-A2分子的候選肽。根據(jù)C10orf3的氨基酸序列(SEQIDNO:IO),選擇由SEQIDNO:158-165的氨基酸序列和SEQIDNO:166-175的氨基酸序列組成的肽，作為分別潛在結(jié)合HLA-A24和HLA-A2分子的候選肽。根據(jù)HIFPH3的氨基酸序列(SEQIDNO:12),選擇由SEQIDNO:176-183的氨基酸序列和SEQIDNO:184-194的氨基酸序列組成的肽，作為分別潛在結(jié)合HLA-A24和HLA-A2分子的候選肽。得到所述肽的氨基酸序列上的位置以及所述肽的長度和氨基酸序列列于以下的表5-16。[Q235][表5]LengsinA24肽<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>[表6]LengsinA2肽<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>[表7]BJ-TSA-9A24肽<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>[表8]B.T-TSA-9A2肽<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>[表9]<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>[表16]HIFPH3A2肽<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>(2)肽合成在如上所述的肽(SEQIDNO:13-201)中，通過Fmoc法合成得自Lengsin的26種肽(表5)、得自BJ-TSA-9的7種肽(表7)、得自C20orf42的20種肽(表9)和得自C10orf3的4種肽(表13)。實(shí)施例6評價(jià)得自不同抗原的肽對HLA-A*2402和HLA-A*0201的結(jié)合親和性通過如在文獻(xiàn)(J.Immunol.164:2565,2000)中所述的方法，測定在實(shí)施例1中合成的肽對HLA-A*2402的結(jié)合親和性。通過將由HLA-A*2402和H-2Kb組成的嵌合MHC基因穩(wěn)定引入到?jīng)]有MHCI類分子的小鼠淋巴瘤細(xì)胞系RMA-S中獲得細(xì)胞系RMA-S-A*2402細(xì)胞，將該細(xì)胞于26。C溫育18小時(shí)。用PBS溶液洗滌RMA-S-A*2402細(xì)胞，懸浮在含有3^L/mL人(32-微球蛋白和100ML/mL每種肽的培養(yǎng)溶液OPTI-MEM(Invitrogen)中，并于26°C溫育3小時(shí)和于37°C溫育3小時(shí)。用PBS溶液洗滌細(xì)胞，并用抗-HLA-A24抗體于4。C處理30分鐘。此外，用PBS溶液洗滌細(xì)胞，并用PE-標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體于4°C處理30分鐘。洗滌細(xì)胞，并懸浮在含有1%福爾馬林的1mlPBS溶液中進(jìn)行固定。通過用于流式細(xì)胞術(shù)的裝置FACScan(BDBioscience)檢測細(xì)胞，由平均焚光強(qiáng)度獲得肽的結(jié)合親和力。在圖7-9中顯示了所檢驗(yàn)的31種肽的結(jié)合親和力。EB病毒來源的肽(EBV)和HIV病毒來源的肽(HIV)已被才艮告結(jié)合HLA-A*2402(分別為J.Immunol.158:3325，1997和J.Immunol.164:2565,2000)，用作陽性對照，表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合活性。卵清蛋白來源的肽(SL8)已被報(bào)告結(jié)合H2-Kb(EurJImmunol.21:2891,1991)，用作陰性對照，顯示出弱結(jié)合活性。所枱r驗(yàn)的31種肽都被證實(shí)全部以高度優(yōu)先的方式結(jié)合HLA-A42402。因此，發(fā)現(xiàn)這31種肽為腫瘤抗原肽，得自這些肽的蛋白BJ-TSA-9、C20orf42和C10orf3為腫瘤抗原蛋白。同樣，得自Lengsin的23種肽對HLA-A*2402的結(jié)合親和性示于圖10和11。SEQIDNO:15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200和201的肽顯示出對HLA-A*2402的顯著結(jié)合親和性。因此，發(fā)現(xiàn)這些肽為腫瘤抗原肽，得自這些肽的蛋白Lengsin為胂瘤抗原蛋白。對HLA-A*0201的結(jié)合親和性可以通過使用人淋巴瘤細(xì)胞系T2以相同方式證實(shí)。另外，可類似地證實(shí)得自BUB1和HIFPH3的肽對HLA的結(jié)合親和性。實(shí)施例7腫瘤抗原來源的肽的CTL誘導(dǎo)通過評價(jià)在實(shí)施例6中顯示出對HLA的結(jié)合親和性的肽誘導(dǎo)的CTL活性，可以證實(shí)以下事實(shí)蛋白BUB1、C10orf3、C20orf42、Lengsin、HIFPH3和BJ-TSA-9為腫瘤抗原蛋白，其部分肽為肺瘤抗原肽。肽的CTL誘導(dǎo)和所誘導(dǎo)CTL的活性評價(jià)可以如在文獻(xiàn)(J.Immunol.169:1611,2002,WO02/47474，IntJ.Cancer:100，565-570(2002))中所述使用人外周血單核細(xì)胞或用于人的模型動物按照已知測定進(jìn)行。就使用人外周血單核細(xì)胞的測定而言，在得到知情同意后由癌癥患者或健康個(gè)體收集外周血，通過密度梯度離心法分離單核細(xì)胞，并在AIM-V培養(yǎng)溶液(Invitrogen)中培養(yǎng)。在24小時(shí)培養(yǎng)后，收集非粘附細(xì)胞，并在含100U/mLIL-2的AIM-V中培養(yǎng)。為了制備抗原提呈細(xì)胞，在含有1000U/mLIL-4和1000U/mLGM-CSF的AIM-V培養(yǎng)物溶液中培養(yǎng)粘附細(xì)胞達(dá)5天，在加入每種不同的腫瘤抗原肽后再培養(yǎng)1天，在加入10ng/mLTNF和1000U/mLIFN-a后再培養(yǎng)1天。非粘附細(xì)胞與用所述肽脈沖的抗原提呈細(xì)胞一起培養(yǎng)。在通過使用肽脈沖的抗原提呈細(xì)胞進(jìn)行第一次肽刺激后的第7和14天，含有肽脈沖的CTL的非粘附細(xì)胞接受第二次和第三次肽刺激。在第三次刺激后1周，將細(xì)胞與用放射性物質(zhì)如"Cr或非;^射性物質(zhì)標(biāo)記的靶細(xì)胞(表達(dá)與要給予的肽結(jié)合的HLA此外還提供要給予的肽的腫瘤抗原或要給予的肽自身的細(xì)胞，或者預(yù)先用對應(yīng)肽脈沖的細(xì)胞)一起共培養(yǎng)，然后由在條件培養(yǎng)基中的放射性或非放射性物質(zhì)的量評價(jià)CTL對靶細(xì)胞的裂解，以確定CTL活性。還可以使用ELISA或ELISPOT,通過檢測在條件培養(yǎng)基中作為CTL和靶細(xì)胞之間響應(yīng)的結(jié)果而產(chǎn)生的IFN-y，評價(jià)CTL活性。在使用用于人的模型動物評價(jià)該活性時(shí)，將穩(wěn)定形成的腫瘤抗原肽給予表達(dá)人HLA的轉(zhuǎn)基因小鼠，在約1周后，獲得脾細(xì)胞或其它淋巴組織。用與給予肽相同的肽在體外刺激獲得的細(xì)胞，并培養(yǎng)約5天。所獲細(xì)胞被;現(xiàn)為對應(yīng)于CTL群體，CTL活性可如上所述評價(jià)。實(shí)施例8C10orf3來源的肽的CTL誘導(dǎo)如在實(shí)施例7中所述，用C10orf3來源的肽C10orf3—193(10)刺激HLA-A*2402-陽性的癌癥患者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以誘導(dǎo)CTL。通過使用T2A24細(xì)胞(通過將HLA-Af2402基因?qū)氩痪哂性摶虻腡2細(xì)胞(ATCC編號CRL-1992)中產(chǎn)生)以及對HLA-A*2402和C10orG為陽性的癌細(xì)胞系Sw480作為靶細(xì)胞測定CTL活性，結(jié)果示于表12。誘導(dǎo)的CTL克隆顯示出肽特異性細(xì)胞毒活性。另外，誘導(dǎo)的CTL克隆殺死HLA-A*2402和C10orf3陽性癌細(xì)胞系，但不殺死HLA陰性的K562細(xì)胞。該結(jié)果證實(shí)，肽C10orf3—193(10)(SEQIDNOS:158、162)是腫瘤抗原肽，C10orfi也是腫瘤抗原蛋白。實(shí)施例9Lengsin來源的肽的CTL誘導(dǎo)混合一些潛在結(jié)合HLA-Af2402的合成肽，并如在實(shí)施例7中所述，用于刺激見八-八*2402陽性的癌癥患者的PBMC，以誘導(dǎo)CTL。在誘導(dǎo)后，利用ELISPOT通過^r測IFN-Y來測量對每種肽的響應(yīng)，結(jié)果示于圖13。SEQIDNO:22、23、26、27、198、200和201的肽誘導(dǎo)肽特異性CTL。這些結(jié)果證實(shí)，SEQIDNO:22、23、26、27、198、200和201的肽為腫瘤抗原肽，還證實(shí)Lengsin為腫瘤抗原蛋白。然后，用SEQIDNO:22的肽刺激癌癥患者的PBMC,以誘導(dǎo)CTL，并檢測作為細(xì)胞毒活性的CTL誘導(dǎo)活性。結(jié)果示于圖14。CTL顯示出特異性針對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，所述靶細(xì)胞用與用于刺激相同的肽脈沖。實(shí)施例10HIFPH3來源的肽的CTL誘導(dǎo)混合SEQIDNO:177、178、179和183的肽，并如在實(shí)施例7中所述，用于刺激HLA-A*2402陽性的癌癥患者的PBMC，以誘導(dǎo)CTL。在誘導(dǎo)后，檢測針對不同腎癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性，結(jié)果示于圖15。用所述肽刺激的淋巴細(xì)胞顯示出針對HLA-A24+HIFPH3+SMKTR-l細(xì)胞但不針對HLA-A24-HIFPH3+SMKTR-4細(xì)胞、HLA-A24+fflFPH3-Caki-l細(xì)胞、HLA-A24-HIFPH3-ACHN細(xì)胞和HLA-K562細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。這些結(jié)果表明，針對HIFPH3的HLA-A24-限制性的CTL通過所述肽刺激誘導(dǎo)，然后證實(shí)肽fflFPH3_27(9)(SEQIDNO:177)、fflFPH3_92(10)(SEQIDNO:178)、HIFPH3—112(10)(SEQIDNO:179)和HIFPH3—295(9)(SEQIDNO:183)為腫瘤抗原肽，HIFPH3為腫瘤抗原蛋白。實(shí)施例11C20orf42來源的肽的CTL誘導(dǎo)將20種針對HLA-A*2402合成的肽分為5組，每組含有4種肽。將HLA-A*2402陽性的癌癥患者的PBMC鋪板在96孔板中，并按照實(shí)施例7用各組肽的每一種刺激，以誘導(dǎo)CTL。當(dāng)用各組刺激在384孔中的PBMC時(shí)，檢查針對用于刺激的各種肽的細(xì)胞毒活性，檢測8-14個(gè)孔中對所述肽特異性的細(xì)胞毒活性。該結(jié)果證實(shí)，C20orf42來源的肽為腫瘤抗原肽，C20orf42為腫瘤抗原蛋白。工業(yè)適用性本發(fā)明提供新的腫瘤抗原蛋白和肽及其在癌癥免疫領(lǐng)域中的用途。腫瘤抗原蛋白和由其獲得的的肽可以用于治療表達(dá)所述腫瘤抗原蛋白的癌癥患者。附圖簡述[圖l]圖1顯示了通過RT-PCR分析的Lengsin基因的mRNA在主要的不同正常組織和肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。在該圖中，Lengsin和G3PDH(陽性對照)的箭頭表示分別顯示所述基因的mRNA水平的條帶位置。不同的正常組織或癌癥組織如下心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、卯巢、小腸、大腸、PBMC、腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌。以下為不同肺癌細(xì)胞系的名稱LNY-1、A549、LHK2、1-87、LK79、Sq-l、LC817和Lu65。[圖2]圖2顯示了通過RT-PCR分析的BJ-TSA-9基因的mRNA在主要的不同正常組織以及肺、口腔和其它癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。在該圖中，BJ-TSA-9和G3PDH(陽性對照)的箭頭表示分別顯示所述基因的mRNA水平的條帶位置。不同的正常組織或癌癥組織如下心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、大腸、PBMC、腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌。以下為起源于不同器官的癌細(xì)胞系的名稱LNY-1、A549、LHK2、1-87、LK79、Sq國l、LC817、Lu65、OSC19、OSC20、OSC30、OSC40、OSC70、HSC2、HSC3、HSC4、KOSC3、HO-l-N-l、R3、SW450、SSTW、HS776、CHC20、CHC32、C1R、T2、888mel和LG2mel。[圖3]圖3顯示了通過RT-PCR分析的C20orf42基因的mRNA在主要的不同正常組織以及結(jié)腸和胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。在該圖中，C20orf42和G3PDH(陽性對照)的箭頭表示分別顯示所述基因的mRNA水平的條帶位置。不同的正常組織或癌癥組織如下心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、白細(xì)胞、結(jié)腸癌和胰腺癌。以下為不同的結(jié)腸和胰腺癌細(xì)胞系的名稱SW480、SW620、colo205、WiDR、CFPAC、PK8、SuSu86和PUN。[圖4]圖4顯示了通過RT-PCR分析的BUB1基因的mRNA在主要的不同正常組織和口腔鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、大腸癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤和黑素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平。在該圖中，BUB1和G!3PDH(陽性對照)的箭頭表示分別顯示所述基因的mRNA水平的條帶位置。以下為起源于不同器官的癌細(xì)胞系的名稱OSC19、HSC2、Cakil、R3、SW450、SSTW、HS776T、PUN、CHC20、CHC32、C1R、T2、888mel和LG2MEL。[圖5]圖5顯示了通過RT-PCR分析的C10orf3基因的mRNA在主要的不同正常組織和肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。在該圖中，C10orf3和G3PDH(陽性對照)的箭頭表示分別顯示所述基因的mRNA水平的條帶位置。不同的正常組織或癌癥組織如下心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、大腸、PBMC、腺癌和鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌。以下為起源于不同器官的癌細(xì)胞系的名稱LNY-1、A549、LHK2、1-87、LK79、Sq-l、LC817和Lu65。[圖6]圖6顯示了通過RT-PCR分析的HIFPH3基因的mRNA在主要的不同正常組織和腎癌組織以及腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。在該圖中，HIFPHB和GSPDH與P-肌動蛋白(陽性對照)的箭頭表示分別顯示所述基因的mRNA水平的條帶位置。不同的正常組織或癌癥組織如下心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、白細(xì)胞、RCC(腎細(xì)胞癌)。T和N分別意指腫瘤和正常組織。以下為腎癌細(xì)胞系的名稱SMKTR-1、SMKTR-2、SMKTR國3、SMKTR-4、Caki-l和ACHN。[圖7]圖7顯示了得自BJ-TSA-9的8種肽、EB病毒來源的肽(EBV)以及fflV來源的肽(fflV)(陽性對照)和卵清蛋白來源的肽(51^8)(陰性對照)對111^-八*2402的結(jié)合親和性。在該圖中，水平軸指示平均熒光強(qiáng)度(MFI，對應(yīng)于結(jié)合親和性)，垂直軸指示肽的名稱。未加入肽所獲得的結(jié)果記錄為(-)。[圖8]圖8顯示了得自C20orf42的20種肽、EB病毒來源的肽(EBV)以及HIV來源的肽(HIV)(陽性對照)和卵清蛋白來源的肽(SL8)(陰性對照)對HI^wV152402的結(jié)合親和性。在該圖中，水平軸指示平均熒光強(qiáng)度(MFI，對應(yīng)于結(jié)合親和性)，垂直軸指示肽的名稱。未加入肽所獲得的結(jié)果記錄為(-)。[圖9]圖9顯示了得自C10orf3的4種肽、EB病毒來源的肽(EBV)以及fflV來源的肽(HIV)(陽性對照)和卵清蛋白來源的肽(SL8)(陰性對照)對HLA-Af2402的結(jié)合親和性。在該圖中，水平軸指示平均熒光強(qiáng)度(MFI,對應(yīng)于結(jié)合親和性)，垂直軸指示肽的名稱。未加入肽所獲得的結(jié)果記錄為(-)。90[圖IO]圖IO顯示了得自Lengsin的16種肽、fflV來源的肽(fflV)(陽性對照)和卵清蛋白來源的肽(SL8)(陰性對照)對HLA-A*2402的結(jié)合親和性。在該圖中，水平軸指示平均熒光強(qiáng)度(MFI，對應(yīng)于結(jié)合親和性)，垂直軸指示肽的名稱。未加入肽所獲得的結(jié)果記錄為(-)。[圖ll]圖ll顯示了得自Lengsin的7種肽、EB病毒來源的肽(EBV)(陽性對照)和卵清蛋白來源的肽(SL8)(陰性對照)對HLA-A*2402的結(jié)合親和性。在該圖中，水平軸指示平均熒光強(qiáng)度(MFI，對應(yīng)于結(jié)合親和性)，垂直軸指示肽的名稱。未加入肽所獲得的結(jié)果記錄為(-)。[圖12]圖12顯示了通過用C10orf3—193(10)肽刺激HLA-A*2402陽性的癌癥患者的PBMC誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。在該圖中，"肽2"和"Sw480"分別表示使用以所述肽脈沖的T2-A24細(xì)胞以及對HLA-A申2402和C10orf3為陽性的癌細(xì)胞系Sw480作為耙細(xì)胞的結(jié)果。同樣，"K562"和"(-)，，分別表示使用HLA-陰性的K562細(xì)胞和未加入肽的T2-A24細(xì)胞作為耙細(xì)胞的結(jié)果。[圖13]圖13顯示了用ELOSPOT通過檢測INF-Y測量用Lengsin來源的肽刺激HLA-A*2402陽性的癌癥患者的PBMC誘導(dǎo)的CTL響應(yīng)。[圖14]圖14顯示了通過用Lengsin—142(9)肽刺激癌癥患者的PBMC誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。在該圖中，"T2A24+肽"和"T2A24"分別表示使用所述肽脈沖和未脈沖的T2-A24細(xì)胞作為靶細(xì)胞的結(jié)果。同樣，"T2A24+fflV"和"K562"分別表示使用HIV來源的肽和HLA陰性K562細(xì)胞脈沖的T2-A24細(xì)胞作為耙細(xì)胞的結(jié)果。[圖15]圖15圖示了通過用HIFPH3來源的肽(SEQIDNO:177、178、179和183)的混合物刺激HLA-A*2402陽性的癌癥患者的PBMC誘導(dǎo)CTL的結(jié)果。垂直軸指示細(xì)胞毒活性。在該圖中，"E:TlCr%"、"E:T3Cr%"和"E:T10Cr%"意指所述肽刺激的PBMC和癌細(xì)胞之間的比率分別為1、3和10。序列表自由文本SEQIDNO:13-201的氨基酸序列是合成肽。SEQIDNO:202-213的堿基序列是引物。權(quán)利要求1.一種含有來源于Lengsin(含谷氨酸-氨連接酶(谷氨酰胺合酶)結(jié)構(gòu)域1，也稱為GLULD1)、BJ-TSA-9(假定蛋白MGC14128)、C20orf42(URP1，也稱為Kindlerin)、BUB1、C10orf3或HIFPH3(egl9同系物3，也稱為EGLN3)的部分肽、能夠結(jié)合HLA抗原并被CTL識別的肽。2.權(quán)利要求1的肽，其中所述HLA抗原為HLA-A24或HLA-A2抗原。3.權(quán)利要求2的肽，所述肽含有SEQIDNO:13-201中任一項(xiàng)的M酸序列。4.一種肽，所述肽^^有一種氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:13-31、42-49、59-78、89-117、158-165、176-183和195-201中任一項(xiàng)的氨基酸序列相同，只是2位的氨基酸被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸取代，所述肽能夠結(jié)合HLA-A24抗原，并被CTL識別。5.—種肽，所述肽^^有一種氛基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:32-41、50-58、79-88、118-157、166-175和184-194中任一項(xiàng)的氨基酸序列相同，只是2位的M酸被亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端氨基酸被纈氨酸或亮氨酸取代，所述肽能夠結(jié)合HLA-A2抗原，并被CTL識別。6.—種表位肽，所述表位肽含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的肽。7.—種含有權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。8.—種^^有編碼權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽的多核苷酸的核酸。9.一種含有權(quán)利要求8的核酸和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。10—種含有Lengsin、BJ-TSA畫9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3和在藥學(xué)上可"t妄受的載體的藥物組合物。11.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中Lengsin含有SEQIDNO:2的氛基酸序列。12.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中BJ-TSA-9含有SEQIDNO:4的氨基酸序列。13.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中C20orf42含有SEQIDNO:6的氛基酸序列。14.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中BUB1含有SEQIDNO:8的氣基酸序列。15.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中C10orfi含有SEQIDNO:10的氛基酸序列。16.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中HIFPH3含有SEQIDNO:12的氛基酸序列。17.—種含有核酸和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，所述核酸包含編碼Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、Cl0orf3或HIFPH3的多核苷酸。18.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中編碼Lengsin的多核苷酸包含SEQIDNO:1的堿基序列，或編碼SEQIDNO:2的絲酸序列。19.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中編碼BJ-TSA-9的多核苷酸包含SEQIDNO:3的堿基序列，或編碼SEQIDNO:4的氨基酸序列。20.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中編碼C20orf42的多核苷酸包含SEQIDNO:5的石tt序列，或編碼SEQIDNO:6的氨基酸序列。21.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中編碼BUB1的多核苷酸包含SEQIDNO:7的堿基序列，或編碼SEQIDNO:8的氨基酸序列。22.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中編碼C10orf3的多核普酸包含SEQIDNO:9的堿基序列，或編碼SEQIDNO:10的氨基酸序列。23.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中編碼HIFPH3的多核苷酸包含SEQIDNO:11的堿基序列，或編碼SEQIDNO:12的氨基酸序列。24.—種制備抗原提呈細(xì)胞的方法，其中使具有抗原提呈能力的細(xì)胞在體外與以下的任一種接觸(a)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽，(b)權(quán)利要求8的核酸，(c)Lengsin、BJ國TSA國9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3，和(d)含有編碼Lengsin、BJ-TSA國9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的核酸。25.—種通過權(quán)利要求24的方法制備的抗原提呈細(xì)胞。26.—種含有權(quán)利要求25的抗原提呈細(xì)胞和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。27.—種誘導(dǎo)CTL的方法，其中使外周血淋巴細(xì)胞在體外與以下的4壬一種4妄觸(a)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽，⑨權(quán)利要求8的核酸，(c)Lengsin、BJ畫TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3,和(d)含有編碼Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的核酸。28.通過權(quán)利要求27的方法誘導(dǎo)的CTL。29.—種含有權(quán)利要求28的CTL和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。30.權(quán)利要求7、9-23、26或29中任一項(xiàng)的藥物組合物，所述藥物組合物用作CTL的誘導(dǎo)物。31.權(quán)利要求7、9-23、26或29中任一項(xiàng)的藥物組合物，所述藥物組合物用作癌癥疫苗。32.—種特異性結(jié)合權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的肽的抗體。33.—種含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的肽和HLA抗原的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體。34.—種用于^r測對腫瘤抗原肽特異性的CTL的試劑，所述腫瘤抗原肽來源于Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3，所述試劑含有作為組分的權(quán)利要求33的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體。35.—種由多核苷酸和/或其互補(bǔ)多核苷酸組成的疾病標(biāo)志物，其中所述多核苷酸含有Lengsin、BJ-TSA畫9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的堿基序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。36.權(quán)利要求35的疾病標(biāo)志物，所述疾病標(biāo)志物用作^r測癌癥的探針或引物。37.權(quán)利要求35或36的疾病標(biāo)志物，其中來源于Lengsin基因的疾病標(biāo)志物用于肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌或胃癌。38.權(quán)利要求35或36的疾病標(biāo)志物，其中來源于BJ-TSA-9基因的疾病標(biāo)志物用于白血病、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌或淋巴瘤。39.權(quán)利要求35或36的疾病標(biāo)志物，其中來源于C20orf42基因的疾病標(biāo)志物用于肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肝癌、胃癌、白血病、惡性淋巴瘤組織、直腸癌、結(jié)腸癌或胰腺癌。40.權(quán)利要求35或36的疾病標(biāo)志物，其中來源于BUB1基因的疾病標(biāo)志物用于乳腺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、大腸癌(結(jié)腸癌、直腸癌)、胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤。41.權(quán)利要求35或36的疾病標(biāo)志物，其中來源于C10orf3基因的疾病標(biāo)志物用于乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、腎癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌或黑素瘤。42.權(quán)利要求35或36的疾病標(biāo)志物，其中來源于HIFPH3基因的疾病標(biāo)志物用于乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、胰腺癌、肝癌、肺腺癌或肺鱗狀細(xì)胞癌。43.—種用于檢測癌癥的方法，所述方法包括以下步驟(a)、(b)和(c):(a)使由受試者的生物樣品制備的RNA或由其轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)多核脊酸與權(quán)利要求35-42中任一項(xiàng)的疾病標(biāo)志物雜交；(b)通過使用所述疾病標(biāo)志物作為指示劑檢測與疾病標(biāo)志物雜交的、由生物樣品制備的RNA或由該RNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)多核苦酸；和(c)基于(b)中的檢測結(jié)果確定受試者是否患有癌癥。44.權(quán)利要求43的方法，其中步驟(C)中，對受試者的檢測結(jié)果與健康個(gè)體的結(jié)果進(jìn)行比較且在受試者中觀察到的與疾病標(biāo)志物的雜交水平高于在健康個(gè)體中觀察到的水平時(shí)，則確定受試者患有癌癥。45.—種用于癌癥的疾病標(biāo)志物，所述疾病標(biāo)志物包含特異性識別Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的抗體。46.權(quán)利要求45的疾病標(biāo)志物，所述疾病標(biāo)志物用作4企測癌癥的探針。47.—種用于檢測癌癥的方法，所述方法包括以下步驟(a)、(b)和(c):(a)使由受試者的生物樣品制備的蛋白與權(quán)利要求45或46中的疾病標(biāo)志物結(jié)合；(b)通過使用所述疾病標(biāo)志物作為指示劑檢測與疾病標(biāo)志物結(jié)合的、由生物樣品制備的蛋白或得自該蛋白的部分肽；和(c)基于(b)中的檢測結(jié)果確定受試者是否患有癌癥。48.權(quán)利要求47的方法，其中步驟(C)中，對受試者的檢測結(jié)果與健康個(gè)體的結(jié)果進(jìn)行比較且在受試者中觀察到的與所述疾病標(biāo)志物的結(jié)合水平高于在健康個(gè)體中觀察到的水平時(shí)，則確定受試者患有癌癥。全文摘要本發(fā)明涉及新腫瘤抗原蛋白、腫瘤抗原肽以及這些物質(zhì)在癌癥免疫領(lǐng)域中的用途。更具體地說，本發(fā)明涉及含有來源于Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分肽、能夠結(jié)合HLA抗原并因此被CTL識別的肽，以及包含上述肽和在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物等。文檔編號C12N15/00GK101448938SQ200780018810公開日2009年6月3日申請日期2007年3月27日優(yōu)先權(quán)日2006年3月28日發(fā)明者佐藤升志,原田健司,廣橋良彥,鳥越俊彥申請人:佐藤升志;大日本住友制藥株式會社