專(zhuān)利名稱(chēng)：：非土壤桿菌屬細(xì)菌物種用于植物轉(zhuǎn)化的用途的制作方法非土壤桿菌屬細(xì)菌物種用于植物轉(zhuǎn)化的用途
背景技術(shù)：
：本申請(qǐng)要求于2006年5月16日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第60/800,872號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容以其整體在此引作參考。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。特別地本發(fā)明涉及用于通過(guò)用非土壤桿菌細(xì)菌菌種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法。2.相關(guān)領(lǐng)域說(shuō)明根瘤菌目(Rhizobiales)成員土》裏桿菌(Jgra6"c&n'wwspp.)連同根瘤菌(7/zizoWww^p.)、中間根瘤菌(Masc^WzoWwwspp.)、中華才艮瘤菌(57"o^^o&'zw2spp.)和相關(guān)種屬是常見(jiàn)的土壤細(xì)菌。荷有Ti或Ri質(zhì)粒的才艮癌土；t裏4干菌(」gra6(3cten'w附fw附ey^c/e"力和發(fā)才艮土^泉才干菌C4gra6a"en'wmr/zfeoge恥s)的許多野生型和卸曱(非致病性)菌4朱可用于將基因轉(zhuǎn)移到植物中。位于荷有Ti或Ri質(zhì)粒的野生型土壤桿菌T-DNA中的植物激素合成基因在轉(zhuǎn)化后于植物細(xì)胞中表達(dá)，并視土壤桿菌(y^ra^cten'ww)菌株或菌種而定《1起腫瘤形成或發(fā)根表型。重要的是，可對(duì)土壤桿菌T-DNA進(jìn)行遺傳改造以用"目標(biāo)基因"取代其多種毒力和致病性決定子，同時(shí)保留被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并整合到植物基因組的能力。含有這樣的"卸甲"Ti質(zhì)粒的菌抹廣泛用于植物轉(zhuǎn)化。T-DNA通過(guò)土壤桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的機(jī)理已有充分的記載。簡(jiǎn)言之，通過(guò)兩個(gè)稱(chēng)為右邊界(rightborder,RB)和左邊界(leftborder,LB)的邊界區(qū)來(lái)劃定T-DNA界限。毒力蛋白VirD2在所述邊界制造切口，由此產(chǎn)生在5，末端共價(jià)連接有VirD2的單鏈轉(zhuǎn)移DNA("T-鏈")。也包括土壤桿菌VirE2蛋白在內(nèi)的蛋白-DNA復(fù)合體通過(guò)所謂的4型分泌系統(tǒng)(T4SS，既是毒力蛋白又是ssDNA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)脫離土壤桿菌細(xì)胞，在土壤桿菌毒力蛋白和植物因子二者的幫助下被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并整合于植物基因組。用土壤桿菌介導(dǎo)的載體將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞為本領(lǐng)域所熟知。參見(jiàn)例如由Fraley等(1985)、Rogers等(1987)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第5,563，055號(hào)(以其整體在此明確引作參考)闡述的方法。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在包括擬南芥(Jra6!Wo;w&)、煙草和番茄在內(nèi)的很多雙子葉植物中有效。也已經(jīng)設(shè)計(jì)了用于土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化其它物種的方法(例如涉及大豆轉(zhuǎn)化的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第6,384，301號(hào))。雖然土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最初僅用于雙子葉植物，但土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)步使得該技術(shù)也可應(yīng)用于單子葉植物。例如，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化^f支術(shù)業(yè)已應(yīng)用于水稻(Hiei等，1997;Zhang等，1997;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第5,591,616號(hào)，以其整體在此明確引作參考)、小麥(McCormac等，1998)、大麥(Tingay等，1997;McCormac等，1998)和玉米(Ishida等，1996)。然而，很多植物物種抗拒土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，以及在其它物種中效率低。另外，因?yàn)楦┩寥罈U菌在創(chuàng)傷部位進(jìn)入植物組織，并不天然感染非創(chuàng)傷組織，所以某些組織不可用作轉(zhuǎn)化靶標(biāo)。除了T4SS依賴(lài)性T-鏈遞送系統(tǒng)外，土壤桿菌還具有也可轉(zhuǎn)移和整合質(zhì)粒的另外的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，例如IncQ質(zhì)粒pRSF1010，其經(jīng)由4妄合轉(zhuǎn)移以較低頻率在細(xì)菌細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移并整合入植物基因組(Buchanan-Wollaston等，1987;Shadenkov等，1996;Chen等，2002)。例如，接合轉(zhuǎn)移蛋白MobA與RSF1010質(zhì)粒的MobB和MobC蛋白一起切割oWT(轉(zhuǎn)移起點(diǎn))位點(diǎn)，連接至5，末端并將ssDNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中而不依賴(lài)于T4SS系統(tǒng)(Bravo-Angd等，1999,和其中的參考文獻(xiàn))。接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌中，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞之間的遺傳信息交換。在與土壤桿菌屬在系統(tǒng)發(fā)生上相關(guān)但又不同的根瘤菌屬(i/^oWM附)中(Spaink等(編輯)，1998;Farrand等，2003),在某些物種8中已經(jīng)部分表征了接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Freiberg等，1997;Turner等，2002;Tun-Garrido等，2003;Perez-Mendoza等，2004)。結(jié)合系統(tǒng)需要作為切口位點(diǎn)的on'T和作為切割酶(nickingenzyme)的TraA或Mob，它們不同于用于T-DNA轉(zhuǎn)移的常規(guī)元件(分別為VirD2以及RB和LB位點(diǎn))。不象發(fā)現(xiàn)在其C-末端具有用于植物核靶向的植物NLS(核定位信號(hào))的VirD2，TraA或Mob并沒(méi)有明顯的NLS。TraA將DNA整合入植物中的準(zhǔn)確才幾制和位點(diǎn)尚不清楚。已知除了土壤桿菌(jgrakc&n'wwsp.)外的根瘤菌目成員例如根瘤菌，在專(zhuān)門(mén)的固氮根瘤中與植物根系共生聯(lián)合(例如Long,2001)。除了在植物(尤其是豆科植物)根系宿主特異性地形成根瘤外，已知根瘤菌目成員在無(wú)根瘤形成的情況下對(duì)某些植物還有生長(zhǎng)促進(jìn)作用(例如Noel等，1996)。最近已出版的報(bào)道闡述了通過(guò)非土壤桿菌細(xì)菌來(lái)轉(zhuǎn)化植物(例如Broothaerts等，2005;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20050289667號(hào)；第20050289672號(hào)；Weller等，2004;Weller等，2005)。Broothaerts等報(bào)道限于擬南芥、煙草和水稻的根瘤菌(i^/zoWi/wsp.)、百脈根根瘤菌(Mesor/^oWww/o"〕和草木樨中華根瘤菌(5V"or/z/zo6&mwe/zo")菌抹的轉(zhuǎn)化。Weller等(2004，2005)報(bào)告了包括根瘤菌和蒼白桿菌(Oc/zra^"nw7sp.)菌林在內(nèi)的荷有Ri質(zhì)粒的幾種細(xì)菌明顯轉(zhuǎn)化了水培生長(zhǎng)的黃瓜和番茄植物，導(dǎo)致發(fā)根表型。然而，在某些經(jīng)接種的植物中不排除存在土壤桿菌的可能性，這使得分析復(fù)雜化。尚無(wú)通過(guò)非土壤桿菌細(xì)菌菌抹將DNA轉(zhuǎn)移到大豆、玉米、棉花或油菜(canola)植物細(xì)胞的報(bào)道。另外，在水稻、煙草和擬南齊中用非土壤桿菌細(xì)菌菌株的轉(zhuǎn)化工作迄今還受到低轉(zhuǎn)化效率的阻礙。因此，一般而言，在本領(lǐng)域中非常需要開(kāi)發(fā)允許用非土壤桿菌細(xì)菌菌林轉(zhuǎn)化重要的農(nóng)作物物種并改進(jìn)轉(zhuǎn)化效率的改進(jìn)方法。附圖簡(jiǎn)述以下附圖是本說(shuō)明書(shū)的部分，包括這些附圖是為了進(jìn)一步論證本發(fā)明的某些方面?？赏ㄟ^(guò)參考附圖并結(jié)合本文所提供的具體實(shí)施方案的詳述，來(lái)更好地理解本發(fā)明。圖l:pMON96033示意圖。圖2:pMON96036示意圖。圖3:pMON101316示意圖。圖4:在大豆中用含任一種卸甲Ti-質(zhì)粒(pTiBo542G或pTi"(Mkan)的百脈才艮才艮瘤菌(ML)、豌豆才艮瘤菌(A/^oWww/egwm'"osanw2)(RL)、費(fèi)氏中華根瘤菌(5Vwor/n'zoZ)/wm戶(hù)e(i")(SF)、草木樨中華根瘤菌(SM)進(jìn)行的根瘤菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的瞬時(shí)GUS分析。RL4404:含pTi4404kan的豌豆根瘤菌菌抹Madison;ML542G:含pTiBo542G的百脈根根瘤菌USDA3471;ML4404:含pTi4404kan的百脈根根瘤菌USDA3471;2370LBA:含pTi4404kan的豌豆根瘤菌USDA2370;2370G:含pT舊o542G的豌豆根瘤菌USDA2370;SF4404:含pTi4404kan的費(fèi)氏中華根瘤菌USDA205;SM542C:含pTiBo542G的草木樨中華根瘤菌USDA1002;ABI:根癌土壤桿菌ABI菌抹對(duì)照。圖5:通過(guò)根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在大豆中產(chǎn)生的gw轉(zhuǎn)基因的種系傳遞。圖6:pMON96913示意圖。圖7:pMON96914示意圖。圖8:pMON96026示意圖。圖9:由GUS瞬時(shí)分析所示的用若干菌抹進(jìn)行的根瘤菌介導(dǎo)的油菜轉(zhuǎn)化。A)ML542C(22.4%);B)RL2370G(33.3Q/。)；C)RL2370LBA(20%);D)SF542C(30.5%);E)SF4404(20.6°/。)；和F)SM542C(13%)。具GUS陽(yáng)性扇形面(sector)的外植體的百分率示于括號(hào)中。10圖10:用若干根瘤菌菌林的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因油菜愈傷組織轉(zhuǎn)化。A)ML542C(50%);B)RL2370G(21%);C)RL2370LBA(67%);D)SF542C(36%);和E)SMM2C(73%)。具GUS陽(yáng)性扇形面的外植體的百分率示于括號(hào)中。圖ll:源自根瘤菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的油菜植物中的CP4轉(zhuǎn)基因的DNA印跡檢測(cè)。第l道BN—A22抹系；第2道BN—A24抹系；第3道BN—A28林系；和第4道BN一A35抹系。圖ll含有pMON1013M的根瘤菌的棉花轉(zhuǎn)化A)MLS42C(47.8%);B)RL2370G(56%);C)RL2370LBA(31.4%);D)SF542C(23.2%);E)SF4404(31.5%);和F)SM542C(44.4%)。將RL2370用作陰性對(duì)照；將根癌土壤桿菌ABI菌抹用作陽(yáng)性對(duì)照。GUS染色陽(yáng)性外植體的百分率寫(xiě)入上述括號(hào)中。圖13:幾種根瘤菌菌林的穩(wěn)定棉花愈傷組織轉(zhuǎn)化A)ML542C;B)SF542C;C)SM542C;D)SF4404;E)RL2370LBA;和F)RL2370G。圖14:在源自根瘤菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織中通過(guò)DNA印跡雜交檢測(cè)gus轉(zhuǎn)基因。RL2370LBA:含LBA4404Ti輔助質(zhì)粒的豌豆根瘤菌2370;SF542:含來(lái)自AGL0菌抹的pTiBo542輔助質(zhì)粒的費(fèi)氏中華根瘤菌205;和SF4404:含LBA4404Ti輔助質(zhì)粒的費(fèi)氏中華根瘤菌205。圖15:在玉米未成熟胚中通過(guò)gw基因瞬間表達(dá)所顯示的根瘤菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化。ABI:根癌土壤桿菌；RL2370LBA:含LBA4404Ti質(zhì)粒的豌豆根瘤菌USDA2370;SM542C:含pTiBo542的草木樨中華根瘤菌USDA1002;ML542G:含pTiBo542的百脈根根瘤菌；SF4404:含LBA4404Ti質(zhì)粒的費(fèi)氏中華根瘤菌USDA205;SF542C:^pTiBo542的費(fèi)氏中華根瘤菌USDA205。所有菌林都含有pMON96036，并在pH5.4的ATA培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)。圖16:用根瘤菌菌抹轉(zhuǎn)化后的表達(dá)她標(biāo)記的玉米愈傷組織。ii圖17:在源自根瘤菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的玉米植物中轉(zhuǎn)基因整合的DNA印跡雜交分析。用DIG-標(biāo)記的gw探針來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因。笫l-2道和第11-12道用百脈根根瘤菌ML542G/pMON96036轉(zhuǎn)化后得到的抹系；第3-9道用根癌土壤桿菌ABI對(duì)照轉(zhuǎn)化后得到的抹系；第13-17道用費(fèi)氏中華根瘤菌SF4404/pMON96033轉(zhuǎn)化后得到的林系；第18-19道用費(fèi)氏中華根瘤菌SF542C/pMON96036轉(zhuǎn)化后得到的林系。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明一方面提供用于用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，該方法包括(a)使至少第一植物細(xì)胞與非土壤桿菌的細(xì)菌接觸，所述細(xì)菌包含(i)包含Ti質(zhì)粒的vzV基因區(qū)的第一核酸，其中所述vzV基因區(qū)用來(lái)以VirD2依賴(lài)性方式將編碼目標(biāo)序列的核酸導(dǎo)入所述植物細(xì)胞中；和(ii)包含可操作地與目標(biāo)核酸連接的一個(gè)或多個(gè)T-DNA邊界序列的第二核酸；和(b)選擇被所述目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)化的至少第一植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞為大豆、油菜、玉米或棉花植物細(xì)胞。本發(fā)明另一方面提供用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，該方法包括(a)使至少第一植物細(xì)胞與非土壤桿菌的細(xì)菌接觸，所述細(xì)菌包含(i)不依賴(lài)VirD2功能的DNA序列接合轉(zhuǎn)移所需的第一核酸和(ii)包含目標(biāo)核酸的第二核酸；其中所述植物細(xì)胞為大豆、油菜、玉米或棉花;f直物細(xì)胞，其中由接合轉(zhuǎn)移所需的核酸所編碼的多肽用來(lái)將目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)移到所述植物細(xì)胞中；和(b)選擇被所述目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)化的至少第一植物細(xì)胞。在這樣的方法中，所述接合轉(zhuǎn)移可為fra丄fra/或moM依賴(lài)性的，所述第一核酸包含W7丁。所述第一核酸可缺乏左和右T-DNA邊界序列。在本發(fā)明方法中，所述細(xì)菌可為根瘤菌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，根瘤菌在合適條件下培養(yǎng)以將根瘤菌細(xì)胞的多糖產(chǎn)生減到最少。根瘤菌細(xì)胞在與植物細(xì)胞接觸之前可在乙酰丁香酮或誘導(dǎo)v/r基因功能的其它化合物例如酚類(lèi)化合物存在下生長(zhǎng)。所述根瘤菌細(xì)胞可選自根瘤菌(i/2z'zoWwwsp.)、中華根瘤菌CS/"orWzo&wwsp.)、中間才艮瘤菌、葉4亍菌(尸/^〃o6acten'wms/;.)、蒼白斥干菌(Oc/zra6a"nwzsp/.)和'l"曼生才艮瘤菌(5ra4^&oWwwspp.)。在具體實(shí)施方案中，所述根瘤菌細(xì)胞為豌豆根瘤菌細(xì)胞，并可進(jìn)一步為豌豆根瘤菌三葉草生物變異型(兄/egwwz'"orarawZv./n/o/")、豌豆才艮瘤菌菜豆生物變異型(兄/egw/w'"asarwwp/zaseo/()或豌豆沖艮瘤菌蠶豆生物變異型(i/n'zoWw附在由本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化方法的另一方面中，被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可包括在來(lái)自植物種子的外植體中，例如來(lái)自幼苗、愈傷組織、細(xì)胞懸液、子葉、分生組織、葉、根或莖。外植體可包括胚分生組織外植體；愈傷組織；細(xì)胞懸液；子葉；或來(lái)自葉、根或莖的組織。用于按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的細(xì)菌可包含導(dǎo)入的核酸，例如通過(guò)電穿孔導(dǎo)入的核酸。所述序列可包含不依賴(lài)VirD2功能的接合轉(zhuǎn)移所需的核酸。所述核酸可包括第一核酸和第二核酸。在本發(fā)明的另一方面，本文提供的轉(zhuǎn)化方法可包括在不存在選擇劑時(shí)選擇被目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。選擇被目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可包括在選擇劑存在下培養(yǎng)植物細(xì)胞，其中所述目標(biāo)核酸賦予對(duì)選擇劑的耐性，或可搡作地連接賦予選擇劑耐性的核酸。這樣的選擇劑實(shí)例包括草甘膦(glyphosate)、卡那霉素(kanamycin)、雙丙氨膦(bialaphos)或麥草畏(dicamba)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述目標(biāo)核酸或另外的核酸編碼EPSP合成酶，在另外的實(shí)施方案中，其編碼EPSP合成酶蛋白CP4。在另一實(shí)施方案中，選擇劑為草甘膦。在其它實(shí)施方案中，可將目標(biāo)核酸序列限定為物理上不與選擇標(biāo)記基因連接。例如，標(biāo)記基因和目標(biāo)核酸可在由被目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生的植物后代中遺傳分離。本發(fā)明細(xì)菌可包含至少第三核酸，所述第三核酸包含另外的目標(biāo)核酸，其中所述植物細(xì)胞用該第三核酸轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明方法中，可由轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生植抹，其中所述植林包含目標(biāo)序列。植抹再生可包括誘導(dǎo)包含所述植物細(xì)胞的外植體形成一個(gè)或多個(gè)幼苗(shoot)，并13將至少第一幼苗培育為可育全株。在某些實(shí)施方案中，所述檔^朱可為玉米或棉花植-f朱。在另外實(shí)施方案中，通過(guò)器官發(fā)生來(lái)進(jìn)行再生。在其它實(shí)施方案中，所述植林為大豆或油菜植抹。本發(fā)明另一方面提供選自以下的根瘤菌的細(xì)胞根瘤菌(i/z/加6/Mwsp.)、中華根瘤菌(5VwoA/zo6/wwsp.)、中間根瘤菌、葉桿菌、蒼白桿菌和慢生根瘤菌，所述細(xì)胞包含(i)包含Ti質(zhì)粒vzV基因區(qū)的第一核酸，其中所述^>基因區(qū)用來(lái)以VirD2依賴(lài)方式將編碼目標(biāo)序列的核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞中；和(ii)包含與編碼目標(biāo)序列的核酸可操作地連接的一個(gè)或多個(gè)T-DNA邊界序列的第二核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞進(jìn)一步限定為包含選擇標(biāo)記。在另一實(shí)施方案中，所述根瘤菌細(xì)胞選自以下的細(xì)胞根瘤菌(i^/zo6&msp.)、根瘤菌NGR234根瘤菌(i/izo6/wwsp.NGR234)、豌豆根瘤菌Madison>豌豆才艮瘤菌USDA2370、豌豆根瘤菌USDA2408、豌豆根瘤菌USDA2668、豌豆根瘤菌2370G、豌豆根瘤菌2370LBA、豌豆根瘤菌2048G、豌豆根瘤菌2048LBA、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型2668G、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型2668LBA、豌豆根瘤菌RL542C、豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型、豌豆根瘤菌三葉草生物變異型、埃特里根瘤菌(i/^oWwmUSDA9032、埃特里根瘤菌菜豆生物變異型(i^/zoZn'wwbv.p/2oyeo//)、熱帶根瘤菌(i/7feo^wmfropf"〕、中間根瘤菌、百脈根根瘤菌ML542G、百脈根根瘤菌ML4404、中華根瘤菌CS/"or/^oWwwsp.)、草木樨中華根瘤菌SD630、草木樨中華根瘤菌USDA1002、費(fèi)氏中華根瘤菌USDA205、費(fèi)氏中華根瘤菌SF542G、費(fèi)氏中華根瘤菌SF4404、費(fèi)氏中華根瘤菌SM542C、慢生根瘤菌(j5ra^r/zizoWwwsp.)、大豆慢生才艮瘤菌(萬(wàn)ra辦r/z/zoWww7'"Powz'cww)USDA6和大豆慢生根瘤菌USDA110。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為豌豆根瘤菌細(xì)胞，可進(jìn)一步為例如豌豆根瘤菌三葉草生物變異型、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型或豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型的細(xì)胞。14在本發(fā)明再一方面，提供能夠不依賴(lài)virD2而從根瘤菌轉(zhuǎn)移的能力并缺乏T-DNA邊界序列的DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含可操作地連接目標(biāo)核酸的onT序列和fraj或wo6序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供用例如權(quán)利要求35的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的根瘤菌細(xì)胞，其中所述根瘤菌選自根瘤菌、中華根瘤菌(&匿/z/油'膽sp.)、中間根瘤菌、葉桿菌、蒼白桿菌和慢生根瘤菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述根瘤菌細(xì)胞選自以下的細(xì)胞根瘤菌(及/h:zo6/mwsp.)、根瘤菌NGR234、豌豆根瘤菌Madison、豌豆根瘤菌USDA2370、豌豆根瘤菌USDA2408、豌豆根瘤菌USDA2668、豌豆根瘤菌2370G、豌豆根瘤菌2370LBA、豌豆根瘤菌2048G、豌豆根瘤菌2048LBA、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型2668G、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型2668LBA、豌豆根瘤菌RL542C、豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型、豌豆根瘤菌三葉草生物變異型、埃特里根瘤菌USDA9032、埃特里根瘤菌菜豆生物變異型、熱帶根瘤菌、中間根瘤菌、百月科艮根瘤菌ML542G、百脈根根瘤菌ML4404、中華根瘤菌CS/"w/2/zW/wwsp.)、草木樨中華根瘤菌SD630、草木樨中華才艮瘤菌USDA1002、費(fèi)氏中華根瘤菌USDA205、費(fèi)氏中華根瘤菌SF542G、費(fèi)氏中華根瘤菌SF4404、費(fèi)氏中華根瘤菌SM542C、慢生才艮瘤菌(Bra辦r/h'zoZ^wsp.)、大豆慢生才艮瘤菌USDA6和大豆慢生4艮瘤菌USDA110。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為豌豆根瘤菌細(xì)胞，在另外的實(shí)施方案中，細(xì)胞可為豌豆根瘤菌三葉草生物變異型、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型或豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型的細(xì)胞。發(fā)明詳述說(shuō)明。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可在不偏離本發(fā)明精神或范圍的情況下對(duì)本文所述實(shí)施方案進(jìn)行修改和改變。本發(fā)明提供用于通過(guò)根瘤菌對(duì)重要農(nóng)作物物種的植物細(xì)胞進(jìn)行有效遺傳轉(zhuǎn)化的方法和組合物。本發(fā)明克服了本領(lǐng)域的重要局限性，這些局限性包括有限的轉(zhuǎn)化效率和無(wú)法適合于用非土壤桿菌菌林轉(zhuǎn)化重要作物的技術(shù)。例如，盡管業(yè)已論述了用非土壤桿菌細(xì)菌轉(zhuǎn)化幾種植物品種，但轉(zhuǎn)化頻率一直低。就水稻而言，業(yè)已報(bào)道轉(zhuǎn)化頻率為0.6%和更低，從687個(gè)接種的愈傷組織中僅得到l個(gè)轉(zhuǎn)化植抹(Broothaerts等，2005)。這與用土壤桿菌的50-80°/。的轉(zhuǎn)化頻率形成對(duì)照。即使用容易被土壤桿菌轉(zhuǎn)化的模式生物，轉(zhuǎn)化頻率也僅為通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化獲得的頻率的一小部分。迄今在很多情況下一直需要大量研究以將即使是已充分開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)化方法(例如土Jt裏桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)應(yīng)用到不同植物種類(lèi)。不同物種的植物通常表現(xiàn)出顯著的生理學(xué)差異，這些差異影響遺傳轉(zhuǎn)化的適應(yīng)性。因此，轉(zhuǎn)化一種植物物種的方法通常不能對(duì)其它植物發(fā)揮有效作用(倘若不是根本不發(fā)生作用)，轉(zhuǎn)化植物的能力不一定預(yù)示著用同種方法轉(zhuǎn)化即使是近緣物種的能力。這對(duì)于涉及所用細(xì)菌菌林與目標(biāo)植物細(xì)胞之間復(fù)雜生化相互作用的細(xì)菌轉(zhuǎn)化尤其如此。才艮瘤菌與才直物在天然環(huán)境下相互作用，由此可表現(xiàn)宿主專(zhuān)一性，這種專(zhuān)一性對(duì)4艮多農(nóng)作物物種的影響尚不清楚。因此，鑒別適合于根瘤菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的植物并開(kāi)發(fā)提供提高的轉(zhuǎn)化效率的方法具有重大意義。有效轉(zhuǎn)化尤其重要，因?yàn)槿魏翁囟ㄞD(zhuǎn)化事件表達(dá)的程度可基本上根據(jù)植物基因組中的整合位點(diǎn)而變化。因此，選擇具有合適表達(dá)譜的轉(zhuǎn)化事件的能力取決于有效產(chǎn)生轉(zhuǎn)化株的能力。如以下在工作實(shí)施例中所闡明，本發(fā)明人轉(zhuǎn)化大豆獲得高至5%的瞬間轉(zhuǎn)化頻率(圖4)，在棉花(圖12)和油菜(圖9)情況下分別獲得56%和33%的頻率。本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中通過(guò)提供用根瘤菌轉(zhuǎn)化重要作物的技術(shù)克服本領(lǐng)域的局限性，這些重要作物先前已知不能被根瘤菌轉(zhuǎn)化，包括油菜、玉米、棉花和大豆。本發(fā)明還提供用根瘤菌有效轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)，包括已知適合于低頻率根瘤菌轉(zhuǎn)化的技術(shù)。本發(fā)明還提供用于轉(zhuǎn)化不同于土i裏桿菌轉(zhuǎn)化把的組織靶的方法。例如，土^裏^fr菌通常16需要?jiǎng)?chuàng)傷部位來(lái)感染植物，而包括根瘤菌科(Rhizobiaceae)例如根瘤菌屬(i/2izoWww)在內(nèi)的根瘤菌目的某些其它成員天然經(jīng)由穿透植物組織的感染線而感染植物根系，便于用非愈傷組織作為轉(zhuǎn)化耙。本文所用"植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑"或"植物激素"指影響植物生長(zhǎng)的化合物。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括但不限于植物生長(zhǎng)素(auxin)、細(xì)胞分裂素(cytokinin)、ABA、赤霉素(gibberellin)、乙烯、油菜素類(lèi)固醇(brassinosteroid)和聚胺類(lèi)。植物生長(zhǎng)素在低濃度時(shí)影響幼苗和根的延伸，但在高水平時(shí)抑制生長(zhǎng)。常用的植物生長(zhǎng)素包括毒莠定(picloram)(4-氨基-3,5，6-三氯吡啶羧酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)、IAA(口引哚-3-乙酸)、NAA(a-萘乙酸)和麥草畏(3》-二氯茴香酸)。細(xì)胞分裂素引起細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化和苗分化(shootdifferentiation^常用細(xì)胞分裂素包括激動(dòng)素(kinetin)、BA(6-芐氨基嘌呤)、2-ip(2-異戊烯基腺嘌呤)、BAP(6-節(jié)氨基噪呤)、噻苯隆(thidiazuron)(TDZ)、玉米素核苷(zeatinriboside)和玉米素(zeatin)。"編碼序列"、"編碼區(qū)"或"可讀框"指編碼蛋白質(zhì)、多肽或肽序列的連續(xù)有序的核酸三聯(lián)體區(qū)域。"雙子葉植物"或"雙子葉的"指具有兩片子葉的植物。實(shí)例包括但不限于植物以下植物例如紫花苜蓿、豆類(lèi)、椰菜(broccoli)、巻心菜、油菜、胡羅卜、花椰菜、芽菜、棉花、黃瓜、茄子、萵苣、甜瓜、豌豆、胡椒、馬鈴薯、西葫蘆(pumpkin)、羅卜、油菜籽、菠菜、大豆、南瓜(squash)、番茄和西瓜。"內(nèi)源性"指來(lái)源于生物體或細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)。"外源性"指來(lái)源于生物體或細(xì)胞外的物質(zhì)。本文所用外源性意;欲指來(lái)自并非受體細(xì)胞或組織的來(lái)源的任何核酸，而不管相似(但不同)的核酸是否可能已經(jīng)存在于受體細(xì)胞或組織中。17"外植體"指能夠被轉(zhuǎn)化并能隨后再生為轉(zhuǎn)基因植物的植物部分。實(shí)例包括胚、愈傷組織、細(xì)胞懸液、子葉、分生組織、幼苗、種子、葉、莖或根。"單子葉植物"或"單子葉的"指具有單片子葉的植物。實(shí)例包括但不限于洋蔥、玉米、水稻、高梁、小麥、黑麥、稷、甘蔗、燕麥、小黑麥、大麥和草碎草。"核酸"指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。"表型"指由基因組(包括非基因組DNA和RNA,例如質(zhì)粒和人造染色體)和/或生物體細(xì)胞器官中的核酸表達(dá)(或不表達(dá))而產(chǎn)生的生物體所表現(xiàn)的性狀。術(shù)語(yǔ)"植物"包括任何高等植物和其后代，包括單子葉才直物(例如玉米、水稻、小麥、大麥等)、雙子葉植物(例如大豆、棉花、番茄、馬鈴薯、擬南芥、煙草等)、棵子植物(松、杉、雪杠、等)；并包括植物部分，包括植物生殖單位(例如種子、鱗莖、塊莖、分生組織或來(lái)自可使植物繁殖的其它部分或組織)、果實(shí)和花。"聚腺苷酸化信號(hào)"或"polyA信號(hào)"指位于編碼區(qū)的3，端促進(jìn)將腺苷酸加到從該編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的mRNA的3，末端的核酸序列。"啟動(dòng)子"或"啟動(dòng)區(qū)"指通常在編碼序列的5，端發(fā)現(xiàn)的核酸序列，其通過(guò)為RNA聚合酶提供識(shí)別位點(diǎn)和/或?yàn)樗玫钠渌D(zhuǎn)錄相關(guān)因子提供其它識(shí)別位點(diǎn)以產(chǎn)生RNA和/或在DNA正確位點(diǎn)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，來(lái)改變編碼序列的表達(dá)。"重組核酸載體"或"載體"或"構(gòu)建體"指諸如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制序列、噬菌體或線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核酸片段等任何物質(zhì)，它們可源自任何來(lái)源，能夠進(jìn)行基因組整合或自主復(fù)制，包含其中業(yè)已以功能操作方式連4妄一個(gè)或多個(gè)核酸序列的核酸分子。這樣的重組核酸載體或構(gòu)建體通常包含5，調(diào)控序列或啟動(dòng)區(qū)和編碼所需基因產(chǎn)物的編碼序列。載體通常設(shè)計(jì)為一旦被遞送到細(xì)胞或組織中，即將所述編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，后者任選被翻譯為多肽或蛋白質(zhì)。"再生"指從植物細(xì)胞或組織培育植抹的過(guò)程。"根瘤菌"指(但不限于)可能歸于根瘤菌目但并非土壤桿菌菌抹廿)3jf4ri_iir丄A"tl"A丄(Ali厶l,一~T~丄aifrjf:l(■一_taH、J閨/丙、4丁4口罔4個(gè),六TlilW百刀—犬'于丄W'、J「:《^對(duì),4T('I"瘤菌(/^/zo6/wwsp.)、中華根瘤菌0S/wor/^oWwwsp.));葉桿菌科(Phyllobacteriumceae)(例如中間根瘤菌，葉桿菌)；布魯氏菌科(5rwce〃aceae)(例如蒼白桿菌)；慢生才艮瘤菌科(5ra辦r/^o6/aceae)(例如慢生根瘤菌)和黃色桿菌科(義a"欲oZ^cferaceae)(例如固氮才艮瘤菌(Aor/7/zoZ)/Mmw/.))。對(duì)本申請(qǐng)而言，"4艮瘤菌"不包括生物變異型或物種?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域所知進(jìn)行分類(lèi)，例如通過(guò)比較16SrDNA序列或其它分類(lèi)方法。很多根瘤菌屬物種的野生型菌抹通常能夠在宿主植物例如豆科植物(豆科(Fabaceae))的根組織中誘導(dǎo)固氮根瘤的形成。然而，特定植物種使根生瘤的能力對(duì)于根瘤菌介導(dǎo)將DNA轉(zhuǎn)移到植物種細(xì)胞中并不是必需的。"選擇標(biāo)記，，或"篩選標(biāo)記"指這樣的核酸序列，其表達(dá)所賦予的表型有助于鑒別含有該核酸序列的細(xì)胞、組織或植物。"轉(zhuǎn)錄"指從DNA模板產(chǎn)生RNA拷貝的過(guò)程。"轉(zhuǎn)化"指將外源性核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞或組織內(nèi)的過(guò)程。所述轉(zhuǎn)化可為瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中，外源核酸部分或全部摻入(例如整合或穩(wěn)定保留)到核基因組DNA、質(zhì)體DNA中，或能在細(xì)胞核或質(zhì)體中自主復(fù)制。"轉(zhuǎn)基因的"指外源核酸序列已穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到其中的生物體。在設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)化過(guò)程的載體時(shí)，選擇將被導(dǎo)入到植物細(xì)胞或組織中的一種或多種遺傳組分。遺傳組分可包括用本發(fā)明方法-波導(dǎo)入到植物細(xì)胞或組織中的任何核酸。遺傳組分可包括非植物DNA、植物DNA或合成DNA。19在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳組分被摻入到DNA組合物中，DNA組合物為例如包含至少一個(gè)或多個(gè)以下遺傳組分類(lèi)型的重組雙鏈質(zhì)粒或載體分子(a)在植物細(xì)胞中起作用以導(dǎo)致產(chǎn)生RNA序列的啟動(dòng)子；(b)導(dǎo)致產(chǎn)生編碼農(nóng)學(xué)效用制品的RNA序列的結(jié)構(gòu)DNA序列；和(c)在植物細(xì)胞中起作用以導(dǎo)致將多聚腺苷?；塑账峒拥皆揜NA序列3，末端的3'非翻譯DNA序列。載體可含有多種遺傳組分以促進(jìn)植物細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)化，并調(diào)控結(jié)構(gòu)核酸序列的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述遺傳組分被定向以便表達(dá)mRNA，在任選實(shí)施方案中該mRNA可被翻譯為蛋白質(zhì)。以雙鏈形式存在的植物結(jié)構(gòu)編碼序歹'j(基因、cDNA、合成cDNA或其它DNA)的表達(dá)涉及通過(guò)RNA聚合酶從DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄信使RNA(mRNA)，隨后在細(xì)月包核內(nèi)加工該mRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物。該加工涉及將多聚腺苦酰化核苦酸力。到該mRNA的3，末端的3，非翻譯區(qū)。制備含有所期需遺傳組分的質(zhì)?；蜉d體的手段為本領(lǐng)域所熟知。載體通常由多種遺傳組分組成，這些組分包括但不限于調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子、前導(dǎo)區(qū)、內(nèi)含子和終止子序列。調(diào)控元件還稱(chēng)為順式調(diào)控元件或反式調(diào)控元件，視該元件與它們所控制的序列或基因的接近程度而定。將DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA由通常稱(chēng)為"啟動(dòng)子"的DNA區(qū)域來(lái)調(diào)控。啟動(dòng)區(qū)含有堿基序列，該序列向RNA聚合酶發(fā)出信號(hào)使其與該DNA結(jié)合，并用該DNA鏈之一作為模板制備對(duì)應(yīng)的RNA互補(bǔ)鏈來(lái)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄mRNA。文獻(xiàn)中業(yè)已闡述了很多在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子將包括但不限于胭脂石咸合成酶(NOS)和章魚(yú)-威合成酶(OCS)啟動(dòng)子，它們是根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒攜帶的啟動(dòng)子；花椰菜花葉病毒屬(caulimovirus)啟動(dòng)子,例如花椰菜花葉病毒(cauliflowermosaicvirus)(CaMV)19S和35S啟動(dòng)子和玄參花葉病毒(Figwortmosaicvirus)(FMV)35S啟動(dòng)子和增強(qiáng)型CaMV35S啟動(dòng)子(e35S)。響應(yīng)環(huán)境、激素、20化學(xué)和/或發(fā)育信號(hào)而受到調(diào)控的多種其它植物基因啟動(dòng)子也可用于在植物細(xì)胞中表達(dá)任何DNA構(gòu)建體，這些啟動(dòng)子包括例如由以下因素調(diào)控的啟動(dòng)子(l)熱(Callis等，1988);(2)光(例如豌豆RbcS-3A啟動(dòng)子,Kuhlemeier等，(1989);玉米R(shí)bcS啟動(dòng)子，Schaffner等，(1991));(3)激素，例如脫落酸(Marcotte等，1989);(4)創(chuàng)傷(例如Wuni，Siebertz等，1989);或其它信號(hào)或化學(xué)藥品。還知道有組織特異性表達(dá)。如下所述，優(yōu)選所選擇的特定啟動(dòng)子應(yīng)該能夠引起充分表達(dá)從而導(dǎo)致有效量的目標(biāo)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。闡述這樣的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利第6,437,217號(hào)(玉米R(shí)S81啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第5,641,876號(hào)(水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，OsActl)、美國(guó)專(zhuān)利第6，426,446號(hào)(玉米R(shí)S324啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第6，429,362號(hào)(玉米？11-1啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第6,232，526號(hào)(玉米A3啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第6，177,611號(hào)(組成型玉米啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第5,322，938號(hào)、第5,352，605號(hào)、第5，359，142號(hào)和第5，530,196號(hào)(35S啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第6,433,252號(hào)(玉米L3油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第6,429，357號(hào)(水稻肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子以及水稻肌動(dòng)蛋白2內(nèi)含子)、美國(guó)專(zhuān)利第5，837，848號(hào)(根特異性啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第6,294,714號(hào)(光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第6,140，078號(hào)(鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第6,252，138號(hào)(病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第6，175，060號(hào)(磷缺乏誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利第6,635，806號(hào)(y-coixin啟動(dòng)子)和美國(guó)專(zhuān)利第7,151，204號(hào)(玉米葉綠體醛縮酶啟動(dòng)子)?？蓱?yīng)用的另外的啟動(dòng)子為胭脂堿合成酶(NOS)啟動(dòng)子(Ebert等，1987);章魚(yú)堿合成酶(OCS)啟動(dòng)子(其由根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒攜帶)；花椰菜花葉病毒屬啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動(dòng)子(Lawton等，1987)、CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等，1985)、玄參花葉病毒35S-啟動(dòng)子(Walker等，1987;美國(guó)專(zhuān)利第6,051,753號(hào)；第5,378，619號(hào))；蔗糖合酶啟動(dòng)子(Yang等，1990);錄因復(fù)合體啟動(dòng)子(Chandler爭(zhēng)，1989)和葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子；PC1SV(美國(guó)專(zhuān)利第5,850，019號(hào))。在本發(fā)明中，如下啟動(dòng)子可特別有益含增強(qiáng)子序列的CaMV35S(e35S;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第5,322，938號(hào);第5，352，605號(hào)；第5，359，142號(hào)；和第5，530，196號(hào))、FMV35S(美國(guó)專(zhuān)利第6,051,753號(hào)；第5,378,619號(hào))、花生褪綠條紋病毒(peanutchloroticstreakcaulimovirus)(PC1SV;美國(guó)專(zhuān)利第5，850，019號(hào))、At.Act7(登錄號(hào)U27811)、At.ANTl(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20060236420號(hào))、FMV.35S-EFla(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第2005/0022261號(hào))、elF4A10(登錄號(hào)X79008)和AGRtu.nos(GenBank登錄號(hào)V00087;Depicker等198^Bevan等，l983)、水稻胞液磷酸丙糖異構(gòu)酶(OsTPI;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?bào)?，132,528號(hào))和水稻肌動(dòng)蛋白15基因(OsActl5;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第200&01W010號(hào))。在某些情況下(例如OsTPI和OsAct15)，啟動(dòng)子可包含5，UTR和/或第一內(nèi)含子。還可構(gòu)建啟動(dòng)子雜合體，以提高轉(zhuǎn)錄活性(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第5,106,739號(hào))，或以聯(lián)合所期需的轉(zhuǎn)錄活性、誘導(dǎo)性和組織特異性或發(fā)育特異性。在植物中起作用的啟動(dòng)子包括但不限于誘導(dǎo)型、病毒性、合成的、如所述組成型和時(shí)間調(diào)控型、空間調(diào)控型和時(shí)空調(diào)控型的啟動(dòng)子。其它的組織增強(qiáng)型、組織特異性或發(fā)育調(diào)控型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，并預(yù)想可用于本發(fā)明實(shí)施中。在本發(fā)明DNA構(gòu)建體(即嵌合/重組植物基因)中使用的啟動(dòng)子若需要可經(jīng)修飾，以影響其調(diào)控特性?？山柚c操縱基因區(qū)連接、隨機(jī)或受制誘變等來(lái)書(shū)f生啟動(dòng)子。此外，可改變啟動(dòng)子以含有幫助提高基因表達(dá)的多重"增強(qiáng)子序列"。由本發(fā)明DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的mRNA還可含有5，非翻譯前導(dǎo)序列。該序列可源自選擇用于表達(dá)所述基因的啟動(dòng)子，可經(jīng)特定修飾以便增加或減少mRNA的翻譯。5，非翻譯區(qū)還可從病毒RNA、從合適的真核生物基因或從合成基因序列獲得。為了提高或改變所得mRNA的翻譯效率，這樣的"增強(qiáng)子"序列可能是理想的。本發(fā)明并不限于其中非翻譯區(qū)源自伴隨啟動(dòng)子序列的5，非翻譯序列的構(gòu)建體。更合適的是，非翻譯前導(dǎo)序列可源自不相關(guān)啟動(dòng)子或基因(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第5,362，865號(hào))。非翻譯前導(dǎo)序列實(shí)例包括玉米和矮牽牛熱休克蛋白22前導(dǎo)序列(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第5,362,865號(hào))、植物病毒外被蛋白前導(dǎo)序列、植物l，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)前導(dǎo)序列、GmHsp(美國(guó)專(zhuān)利第5,659,122號(hào))、PhDnaK(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第5,362，865號(hào))、AtAntl、TEV(Carrington和Freed，19卯)、OsActl(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第5,641,876號(hào))、OsTPI(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第7,132，528號(hào))和OsAct15(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20060162010號(hào))和AGRtu,nos(GenBank登錄號(hào)V00087;Bevan等，1983)。也預(yù)想用來(lái)提高基因表達(dá)或影響基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它遺傳組分作為遺傳組分。本領(lǐng)域已知內(nèi)含子序列有助于在單子葉植物細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因。內(nèi)含子實(shí)例包括玉米肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子(美國(guó)專(zhuān)利第5，641，876號(hào))、玉米HSP70內(nèi)含子(ZmHSP70;美國(guó)專(zhuān)利第5,859,347號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,424,412號(hào))和水稻TPI內(nèi)含子(OsTPI;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第7,132，528號(hào))，它們?cè)诒景l(fā)明實(shí)施中都有益?？赏ㄟ^(guò)可操作地連接重組轉(zhuǎn)基因(例如目標(biāo)基因、包含可篩選基因的鑒別序列或植物選擇標(biāo)記基因)的3'非翻譯DNA序列完成轉(zhuǎn)錄終止。重組DNA分子的3'非翻譯區(qū)含有在植物中起導(dǎo)致將腺苷酸加到RNA3，末端作用的聚腺苷酸化信號(hào)。可從在植物細(xì)胞中表達(dá)的各種基因獲得3，非翻譯區(qū)。在該性能中常用胭脂堿合成酶3，非翻譯區(qū)(Fraley等，1983)。來(lái)自豌豆(尸/做m^"vwm)RbcS2基因的聚腺苷酸化分子(Ps.RbcS2畫(huà)E9;Coruzzi等，1984)、AGRtu.nos(Genbank登錄號(hào)E01312)、E6(登錄號(hào)U30508)、水稻谷蛋白(Okita等，1989)和TaHsp17(小麥低分子量熱休克蛋白基因；GenBank登錄號(hào)X13431)用于本發(fā)明可能特別有益。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體含有選擇標(biāo)記、篩選標(biāo)記或可計(jì)分標(biāo)記基因。這些遺傳組分在本文中還被稱(chēng)為功能性遺傳組分，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生在鑒別轉(zhuǎn)化植物中起作用的產(chǎn)物，或產(chǎn)生農(nóng)學(xué)效用產(chǎn)物。用作選擇或篩選組件的DNA可在可再生的才直物組織起作用，以產(chǎn)生i武予該植物組織對(duì)在其它情況下有毒性的化合物的抗性的化合物。本領(lǐng)域已知許多篩選標(biāo)記或選擇標(biāo)記基因，它們可用于本發(fā)明中。選擇標(biāo)記和對(duì)其提供抗性的基因?qū)嵗_(kāi)于Miki和McHugh,2004中。用作選擇標(biāo)記、篩選標(biāo)記或可計(jì)分標(biāo)記的目標(biāo)基因其中將包括但不限于^w;她(綠熒光蛋白)；熒光素酶(LUX);賦予對(duì)以下抗生素具抗性的基因例如卡那霉素(Dekeyser等，1989)、新霉素(neomycin),卡那霉素、巴龍霉素(paromomycin)、G418、氨基糖香類(lèi)(aminoglycosides)、壯觀霉素(spectinomycin)、t連霉素(streptomycin)、譯月霉素B(hygromycinB)、十專(zhuān)來(lái)霉素(bleomycin)、腐草霉素(phleomycin)、磺胺類(lèi)、鏈絲菌素(streptothricin)、氯霉素(chloramphenicol),曱氨蝶呤(methotrexate)、2-脫氧葡萄糖、甜菜堿醛、S-氨基乙基L-半胱氨酸、4-曱基色氨酸、D-木糖、D-甘露糖、千基腺噤呤-N-3-葡糖苷酸酶；編碼賦予對(duì)以下除草劑具抗性的酶的基因例如草甘膦(例如5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS):Della-Cioppa等，1987;美國(guó)專(zhuān)利第5,627,061號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5，633,435號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,040,497號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,094,945號(hào)；WO04074443和WO04009761;草甘膦氧化還原酶(GOX;美國(guó)專(zhuān)利第5,463,175號(hào))；草甘膦脫羧酶(WO05003362和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20040177399號(hào))；或草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT):Castle等，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20030083480號(hào)))、茅草枯(dalapon)(例如編碼賦予對(duì)2,2-二氯丙酸(茅草枯；W09927116)抗性的2,2-二氯丙酸脫面酶的&W)、溴苯腈(bromoxynil)(賦予對(duì)溴苯腈抗性的卣代芳基腈水解酶(Bxn)(WO8704181A1;US4,810,648;WO8900193A))、磺酰除草劑(例如賦予對(duì)乙酰乳酸合酶抑制劑(例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧咬、嘧啶氧基苯甲酸鹽和2-苯并[c]呋喃酮)抗性的乙酰羥酸合酶或乙酰乳酸合酶；(US6,225,105;US5,767,366，U.S.4,761,373;U.S.5，633，437;U.S.6,613,963;US5，013，659;US5,141,870;US5,378，824;US5，605,011));編碼ALS、GST-II)、雙丙氨膦或膦絲菌素(phosphinothricin)或衍生物(例如賦予對(duì)膦絲菌素或草銨膦(glufosinate)抗性的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶Oa。(US5，646，024;US5,561,236;EP275,957;US245,276,268;US5，637，489;US5,273,894))、莠去津(atrazine)(編碼GST-III)、麥草畏(麥草畏單加氧酶(DMO);美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20030115626號(hào)、第20030135879號(hào))或稀禾定(sethoxydim)(賦予對(duì)環(huán)己二酮(稀禾定)和芳氧基苯氧基丙酸酯/鹽(吡氟氯禾靈(haloxyfop))抗性的修飾型乙酰輔酶A羧化酶(U.S.6，414，222))。也可實(shí)施包括陽(yáng)性選擇機(jī)制(例如用大腸桿菌(五.co/0的wa"^基因，其允許在甘露糖存在下生長(zhǎng))在內(nèi)的其它選擇方法，這些方法仍將落在本發(fā)明范圍內(nèi)(還參見(jiàn)Miki和McHugh(2004》。本發(fā)明可使用含有所述選擇標(biāo)記或篩選標(biāo)記和相關(guān)調(diào)控元件、連同以足以賦予特定所期需性狀的方式表達(dá)的一種或多種核酸的任何合適的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或載體。本發(fā)明預(yù)想的農(nóng)用目的的合適結(jié)構(gòu)基因?qū)嵗龑ǖ幌抻诩膊?、昆蟲(chóng)或害蟲(chóng)耐性、除草劑耐性的基因；用于品質(zhì)改良的基因，這些品質(zhì)有例如產(chǎn)量、4是高營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境耐受或逆境耐受或在植物生理、生長(zhǎng)、發(fā)育、形態(tài)或植物制品方面的任何所期需的變化，包括淀粉生產(chǎn)(美國(guó)專(zhuān)利第6,538,181號(hào)；第6，538,179號(hào)；第6，538,178號(hào)；第5,750，876號(hào)；第6，476,295號(hào))、改性油生產(chǎn)(美國(guó)專(zhuān)利第6,444，876號(hào);第6，426,447號(hào)；第6，380,462號(hào))、高油生產(chǎn)(美國(guó)專(zhuān)利第6，495，739號(hào)；第5，608，149號(hào)；第6，483，008號(hào)；第6，476,295號(hào))、改性脂肪酸含量(美國(guó)專(zhuān)利第6,828,475號(hào)；第6,822，141號(hào)；第6,770,465號(hào)；第6,706，950號(hào)；第6，660,849號(hào)；第6，596，538號(hào)；第6，589，767號(hào)；笫6，537，750號(hào)；第6,489,461號(hào)；第6,459,018號(hào))、高蛋白生產(chǎn)(美國(guó)專(zhuān)利第6，380，466號(hào))、果實(shí)成熟(美國(guó)專(zhuān)利第5,512,466號(hào))、提高動(dòng)物和人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)(美國(guó)專(zhuān)利第6，723，837號(hào)；第6,653，530號(hào)；第6，5412,59號(hào)；第5,985，605號(hào);第6,171，640號(hào))、生物聚合物(美國(guó)專(zhuān)利第RE3,M3號(hào);第6,228,623號(hào)；第5,958,745號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第US20030028917號(hào))。還有環(huán)境逆境抗性(美國(guó)專(zhuān)利第6，072，103號(hào))、藥用肽和可分泌肽(美國(guó)專(zhuān)利第6,812,379號(hào)；第6,774，283號(hào)；第6,140,075號(hào)；第6，080,560號(hào))、改良的加工特性(美國(guó)專(zhuān)利第6,476,295號(hào))、改良25的消化性(美國(guó)專(zhuān)利第6,531,648號(hào))、低棉子糖(美國(guó)專(zhuān)利第6,166,292號(hào))、工業(yè)酶生產(chǎn)(美國(guó)專(zhuān)利第5，543,576號(hào))、改良風(fēng)味(美國(guó)專(zhuān)利第6,0U，199號(hào))、固氮(美國(guó)專(zhuān)利第5，229,114號(hào))、雜交種子生產(chǎn)(美國(guó)專(zhuān)利第5,689，041號(hào))、纖維生產(chǎn)(美國(guó)專(zhuān)利第6，576，818號(hào)；第6，271,443號(hào)；第5,981，834號(hào)；第5,8W,"0號(hào))和生物燃料生產(chǎn)(美國(guó)專(zhuān)利第5,998,700號(hào))。如本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮到本說(shuō)明書(shū)應(yīng)該理解到的，任一種這些或其它遺傳元件、方法和轉(zhuǎn)基因可用于本發(fā)明?；蛘?，目標(biāo)DNA序列可通過(guò)例如共抑制、反義、RNAi、miRNA表達(dá)(天然或基因工程)、反式作用siRNA表達(dá)和核酶表達(dá)等基因沉默技術(shù)抑制外源基因表達(dá)來(lái)影響這些表型(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20060200878號(hào))?？捎冒诒景l(fā)明中的方法導(dǎo)入的例示性核酸包括例如來(lái)自另一物種的DNA序列或基因，或甚至源自或存在于同一物種、但通過(guò)基因工程方法而不是典型的繁殖或育種技術(shù)而被摻入到受體細(xì)胞的基因或序列。然而，術(shù)語(yǔ)"外源的"也意欲指正常情況下在待轉(zhuǎn)化細(xì)胞中不存在的基因，或也許僅僅是不以在轉(zhuǎn)化DNA片段或基因中發(fā)現(xiàn)的形式、結(jié)構(gòu)等存在的基因，或正常存在但人們期望例如過(guò)表達(dá)的基因。因此，術(shù)語(yǔ)"外源"基因或DNA意欲指被導(dǎo)入到受體細(xì)胞中的任何基因或DNA片段，而不管是否相似的基因可能已經(jīng)存在于這樣的細(xì)胞中。包括在外源DNA中的DNA類(lèi)型可包括已經(jīng)存在于植物細(xì)胞中的DNA;來(lái)自另一才直物的DNA;來(lái)自不同生物體的DNA;或外部產(chǎn)生的DNA,例如含有基因的反義信息的DNA序列、或編碼合成或修飾型基因的DNA^列。根據(jù)本說(shuō)明書(shū)，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然將明了大量其它可能的選擇標(biāo)記或篩選標(biāo)記基因、調(diào)控元件和其它目標(biāo)序列。因此，前述討論意欲為例示性，并不詳盡。對(duì)于根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，在構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體或構(gòu)建體后，將在體外作為DNA組合物制備的核酸分子導(dǎo)入到合適宿主例如大腸桿菌中，并交配到另一合適宿主例如包括根瘤菌屬的根瘤菌中，或直接轉(zhuǎn)化(例如電穿孔)到感受態(tài)根瘤菌中。Ti或Ri質(zhì)?？商烊晦D(zhuǎn)移到固氮根瘤菌屬，并可分別誘導(dǎo)胂瘤或發(fā)根(Hooykaas等，1977,Weller等，2004)。作為替代，這樣的Ti或Ri質(zhì)粒可被"卸甲"，因而不能引起植物細(xì)胞增殖。因?yàn)楦鼍鷮俸屯寥罈U菌屬具有不同的感染機(jī)理，所以在大豆轉(zhuǎn)化期間一旦導(dǎo)入Ti或Ri輔助質(zhì)粒，根瘤菌屬或其它根瘤菌通過(guò)其感染線的深部感染可提高目標(biāo)基因種系轉(zhuǎn)化的頻率。本發(fā)明包括使用細(xì)菌菌林將一種或多種遺傳組分導(dǎo)入到植物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主含有不含導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或生根的致癌基因的卸甲Ti或Ri質(zhì)粒，這些質(zhì)粒的衍生物被用作載體并含有隨后導(dǎo)入到植物中的目標(biāo)基因。在另一實(shí)施方案中，細(xì)菌借助不依賴(lài)T4SS的機(jī)理(也就是onT介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移)將DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。不依賴(lài)T4SS的DNA轉(zhuǎn)移所需的功能可存在于含有待轉(zhuǎn)移DNA的質(zhì)粒上，或可存在于在這樣的細(xì)菌細(xì)胞中也存在的染色體或另一質(zhì)粒上，包括Ti或Ri質(zhì)粒。細(xì)菌物種和菌林包括但不限于根瘤菌(i/^o6/wwsp.)、根瘤菌NGR234、豌豆根瘤菌Madison、豌豆根瘤菌USDA2370、豌豆根瘤菌USDA2408、豌豆根瘤菌USDA2668、豌豆根瘤菌2370G、豌豆根瘤菌2370LBA、豌豆根瘤菌2048G、豌豆根瘤菌2048LBA、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型2668G、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型2668LBA、豌豆根瘤菌RL542C、豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型、豌豆根瘤菌三葉草生物變異型、埃特里根瘤菌USDA9032、埃特里根瘤菌菜豆生物變異型、熱帶根瘤菌、中間根瘤菌、百脈根根瘤菌ML542G、百脈根根瘤菌ML4404、中華根瘤菌W"w/w:zo6/wwsp.)、草木樨中華根瘤菌SD630、草木樨中華根瘤菌USDA1002、費(fèi)氏中華根瘤菌USDA205、費(fèi)氏中華根瘤菌SF542G、費(fèi)氏中華根瘤菌SF4404、費(fèi)氏中華根瘤菌SM542C、慢生根瘤菌Cgra辦^^o&wmsp.)、大豆慢生根瘤菌USDA6、大豆慢生根瘤菌USDA110。任何合適的植物培養(yǎng)基皆可用于培育或維持植物組織培養(yǎng)物，這些培養(yǎng)基按需要可補(bǔ)充或不補(bǔ)充合適的膠凝劑，例如瓊脂形式，例如低熔點(diǎn)瓊脂糖或Gdrite,這些培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充另外的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，這些調(diào)節(jié)劑包括但不限于植物生長(zhǎng)素，例如毒莠定(4-氨基-3,5，6-三氯吡啶羧酸)、2,4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)和麥草畏(3，6-二氯茴香酸)；細(xì)胞分裂素，例如BAP(6-節(jié)氨基噪呤)和激動(dòng)素；ABA;和赤霉素。其它培養(yǎng)基添加劑可包括但不限于氨基酸、大量元素、鐵、微量元素、肌醇、維生素和有機(jī)物、碳水化合物、不明培養(yǎng)基組分例如酪蛋白水解物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉多種組織培養(yǎng)基，當(dāng)這些培養(yǎng)基被適當(dāng)添加添加物時(shí)，支持植物組織生長(zhǎng)和發(fā)育，適用于植物轉(zhuǎn)化和再生。這些組織培養(yǎng)基可作為商業(yè)制品購(gòu)買(mǎi)，或定制制備和改良。這樣的培養(yǎng)基實(shí)例將包括但不限于Murashige和Skoog(1962)、N6(Chu等，1975)、Linsmaier和Skoog(1965)、Uchimiya和Murashige(1962)、Gamborg培養(yǎng)基(Gamborg等，1968)、D培養(yǎng)基(Duncan等，1985)、McCown木本植物培養(yǎng)基(McCown和Lloyd,1981)、Nitsch和Nitsch(1969)、Schenk和Hildebrandt(1972)或由這些培養(yǎng)基添加后的派生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了用于轉(zhuǎn)化和再生的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加物(例如營(yíng)養(yǎng)素和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)和可對(duì)特定目標(biāo)品種優(yōu)化的其它培養(yǎng)條件(例如培育期間的光強(qiáng)度、pH和培育溫度)。在組織培養(yǎng)中分離或培育可轉(zhuǎn)化的植物組織后，或在植物體內(nèi)(/";/朋to)鑒別和/或制備植物組織后，所述方法的下一步驟是將遺傳組分導(dǎo)入到該植物組織。本文中該過(guò)程也被稱(chēng)為"轉(zhuǎn)化"。植物細(xì)胞被轉(zhuǎn)化，任選經(jīng)受選擇步驟。獨(dú)立的轉(zhuǎn)化林被稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因事件。業(yè)已報(bào)道使用土壤桿菌菌抹的多種方法，這些方法可用于將遺傳組分插入到可轉(zhuǎn)化植物組織中。然而，非土壤桿菌菌種通常不用于轉(zhuǎn)化才直物。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了植物轉(zhuǎn)化過(guò)程的典型步驟。可通過(guò)直接將甘油原種(stock)接種液體培養(yǎng)基例如TY或YEM培養(yǎng)基(Beringer等，1974)，或?qū)?lái)自甘油原種的細(xì)菌在固化培養(yǎng)基上劃線，使所述細(xì)菌在28合適的選擇條件下生長(zhǎng)，來(lái)制備待使用的根瘤菌。可通過(guò)在營(yíng)養(yǎng)或培養(yǎng)條件(包括存在可促進(jìn)轉(zhuǎn)化的量的乙酰丁香酮)下生長(zhǎng)來(lái)"預(yù)誘導(dǎo)"沖艮瘤菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于生長(zhǎng)的程序和細(xì)菌的合適培養(yǎng)條件以及隨后的接種程序。用于接種的細(xì)菌培養(yǎng)物的密度和細(xì)菌細(xì)胞數(shù)與外植體組織量的比率在不同系統(tǒng)間可變化，由此預(yù)期優(yōu)化用于任一轉(zhuǎn)化方法的這些參數(shù)。轉(zhuǎn)化過(guò)程的下一步驟是接種。在該步驟中，將合適地準(zhǔn)備好的植物、植物組織或外植體和細(xì)菌細(xì)胞懸液混合在一起。接種的持續(xù)時(shí)間和條件以及細(xì)菌細(xì)胞密度將視植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)而變化。轉(zhuǎn)化細(xì)菌的生長(zhǎng)或接種可在乙酰丁香酮或誘導(dǎo)位于Ti或Ri質(zhì)粒的毒力基因的表達(dá)的其它已知誘導(dǎo)劑存在下發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，非土壤桿菌細(xì)菌在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)期間使多糖產(chǎn)生最少的條件下生長(zhǎng)。在特定實(shí)施方案中，用于使根瘤菌于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)期間多糖產(chǎn)生最少的碳源為葡萄糖(AB-TY培養(yǎng)基)或L-阿拉伯糖和葡萄糖酸鉀(ATA培養(yǎng)基)。接種后可除去任何過(guò)量的細(xì)菌懸液，將細(xì)菌和目標(biāo)植物材料共培養(yǎng)。共培養(yǎng)指接種后和轉(zhuǎn)移到任選的延遲或選擇培養(yǎng)基之前的時(shí)間。許多植物組織培養(yǎng)基可用于共同培養(yǎng)步驟。用細(xì)菌接種后的植物組織可在液體或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通常進(jìn)行約l-4天共同培養(yǎng)。在與細(xì)菌共培養(yǎng)后，可任選將已接種的植物組織或外植體直接置于選擇培養(yǎng)基上。或者，在與細(xì)菌共培養(yǎng)后，可將它們置于不含選擇劑的培養(yǎng)基上，隨后置于選擇培養(yǎng)基上。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了選擇方案、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件的多種更改，這些可視植物系統(tǒng)和選擇劑而變化。典型的選4^劑包括但不限于抗生素，例如遺傳霉素(geneticin)(G418)、卡那霉素和巴龍霉素；或除草劑草甘膦、草銨膦和麥草畏。可將另外的合適的培養(yǎng)基組分加到選擇或延遲培養(yǎng)基以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。這樣的培養(yǎng)基組分可包括但不限于抗生素，例如羧芐青霉素(carbenicillin)或頭孑包p塞將(cefotaxime)。29隨后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到適于轉(zhuǎn)化小植林恢復(fù)的培養(yǎng)基中。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了讓轉(zhuǎn)化植物恢復(fù)的多種方法?？蓪?shí)現(xiàn)多種培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移需求，并使其對(duì)于植物轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物恢復(fù)的每種植物系統(tǒng)優(yōu)化。因此，可修改本發(fā)明揭示的這樣的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，或用營(yíng)養(yǎng)上等同的組分或用于選擇和恢復(fù)轉(zhuǎn)基因事件的相似的過(guò)程來(lái)取代，這些仍將落在本發(fā)明范圍內(nèi)。一旦接種了可轉(zhuǎn)化的植物組織，就可轉(zhuǎn)化組織中的植物細(xì)胞，并選擇獨(dú)立轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。獨(dú)立轉(zhuǎn)化抹被稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因事件。盡管已經(jīng)報(bào)道根瘤菌用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化僅用于煙草、擬南芥和水稻(Broothaerts等，2005)，但本領(lǐng)域已知用于很多單子葉植物和雙子葉植物物種的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和再生系統(tǒng)(例如Komari等，1998;Zhou等，1995;Hiei等，1994.PlantJ.;6:271—282;Ishida等，1996;Rogers等，1987;Schrammeijer等，1990;美國(guó)專(zhuān)利第6,384,301)。在轉(zhuǎn)化和再生后，鑒別轉(zhuǎn)基因植物。最后，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在表達(dá)盒穩(wěn)定地?fù)饺朕D(zhuǎn)基因植物并確證可操縱之后，可通過(guò)有性雜交將其導(dǎo)入其它植物。可使用多種標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)中的任一種，這視待雜交的物種而定?？呻S后分析所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化抹和其后代，以確定是否存在包含在轉(zhuǎn)化載體上的特定目標(biāo)核酸。分子分析可包括但不限于DNA印跡(Southern,l975)、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))分析、酶活性分析、免疫診斷方法和田間評(píng)價(jià)等等(也參見(jiàn)例如Sambrook等，1989)?？蓪?shí)施這些和其它熟知的方法以確證通過(guò)所揭示的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物的穩(wěn)定性。上述技術(shù)可適于任何植物，尤其可用于以下植物例如紫花苜蓿、大麥、蠶豆、甜菜、椰菜、巻心菜、胡羅卜、油菜、花椰菜、芹菜、大白菜、玉米、棉花、黃瓜、干菜豆、茄子、茴香、四季豆、葫蘆(gourd)、韭菜、萵苣、甜瓜、燕麥、秋葵、洋蔥、豌豆、胡椒、西葫蘆、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、水稻、高梁、大豆、菠菜、南瓜、甜玉米、糖甜菜、向日葵、番茄、西瓜和小麥。實(shí)施例本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明提供的方法和組合物的很多優(yōu)點(diǎn)。本申請(qǐng)包括以下實(shí)施例是為了證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，以下實(shí)施例中揭示的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的能很好實(shí)行本發(fā)明實(shí)施的技術(shù)，因此認(rèn)為其構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施模式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說(shuō)明書(shū)應(yīng)該了解，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，在所揭示的具體實(shí)施方案中可進(jìn)行很多變化，而仍可以獲得同樣或相似的結(jié)果。本文引用的所有參考資料以其補(bǔ)充、解釋、提供背景或教導(dǎo)本文所用的方法、技術(shù)或組合物的范圍在此引作參考。實(shí)施例1根瘤菌屬和土壤桿菌屬菌林從ATCC(ATCC編號(hào)BAA-100TM,Lazo等，1991)獲得根癌土壤桿菌AGL0。乂人美國(guó)威斯康星Madison的家庭花園野三葉草(weedclover)中分離了豌豆根瘤菌菌抹Madison和草木樨中華根瘤菌SD630,并通過(guò)對(duì)用以下引物擴(kuò)增16SrRNA的PCR產(chǎn)物測(cè)序得到了確證5，GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'(Xd578;SEQIDNO:l)和5，AAGGAGGTGATCCAGCCGCAG3，(Xd579;SEQIDNO:2)。其它根瘤菌屬菌抹從USDA(美國(guó)農(nóng)業(yè)部)的根瘤菌保藏中心獲得(表l)。根瘤菌菌株在TY或MAG培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，土壤桿菌在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。以下列出菌抹，在分離的菌林中擴(kuò)增的16srRNA序列以SEQIDNo:24-30提供。表l:土壤桿菌和纟艮瘤菌菌林菌才朱名Ti質(zhì)粒來(lái)源根癌土壤桿菌AGLOpTiBo542ATCC;Lazo等，1991才艮癌土壤桿菌BA4404pAL4404Hoekema等，1983根癌土壤桿菌AGLOCpTiBo542C(kanR)輛究根癌土壤桿菌AGLOGpTiBo542G(kanR)本研咒31菌抹名Ti質(zhì)粒來(lái)源根癌土壤桿菌4404TIKpTi4404kan(kanR)本研究根癌土壤桿菌ABIpTiC58(kanKgentR)Monsanto豌豆才艮瘤菌Macfoow無(wú)本研究草木樨中華根瘤菌SDMCl無(wú)本研究豌豆根瘤菌fTSiX42370無(wú)USDA根瘤菌保藏中心豌豆根瘤菌三葉草生物變無(wú)USDA根瘤菌保藏中心異型/7S1X42(WS豌豆根瘤菌菜豆生物變異無(wú)USDA根瘤菌保藏中心型,蕩6S費(fèi)氏中華根瘤菌無(wú)USDA根瘤菌保藏中心草木樨中華根瘤菌無(wú)USDA根瘤菌保藏中心百脈根根瘤菌OS/X4無(wú)USDA根瘤菌保藏中心大豆慢生根瘤菌無(wú)USDA根瘤菌保藏中心大豆'ft生纟艮瘤菌無(wú)USDA根瘤菌屬保藏中心c/迪，埃特里根瘤菌無(wú)USDA根瘤菌屬保藏中心豌豆根瘤菌"70GpTiBo542G本研究豌豆根瘤菌2370丄A4pTi4404kan本研究豌豆根瘤菌三葉草生物變pTiBo542G本研究豌豆根瘤菌三葉草生物變pTi4404kan本研究豌豆根瘤菌菜豆生物變異pTiBo542G本研究型2柳G豌豆根瘤菌菜豆生物變異pTi4404kan本研咒豌豆根瘤菌i丄5WCpTiBo542C本研咒費(fèi)氏中華根瘤菌SF542GpTiBo542G輛究費(fèi)氏中華根瘤菌SF"WpTi4404kan本研究草木樨中華根瘤菌pTiBo542C本研究百脈根根瘤菌MZJWGpTiBo542G本研咒百脈根根瘤菌MLWWpTi4404kan本研究32實(shí)施例2土壤桿菌轉(zhuǎn)化通過(guò)用冷去離子水和10%甘油洗滌LB培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物來(lái)制備土壤桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并儲(chǔ)存在-80。C。讓50微升解凍的感受態(tài)細(xì)胞與1或2piDNA在水上混合，用BIO-RADGenePulserII設(shè)備(BIO-RAD，Hercules,CA)以200歐姆電阻、25inF電容和1.8kv在lmm間隙的電擊杯中電穿孔實(shí)施例3構(gòu)建具有抗生素選擇標(biāo)記基因的Ti質(zhì)粒為了在根瘤菌中選擇Ti質(zhì)粒，從相應(yīng)的Ti質(zhì)粒擴(kuò)增同源序列并插入到卡那霉素抗性載體。該同源序列用于通過(guò)同源重組將卡那霉素抗性基因整合到Ti質(zhì)粒中。為了構(gòu)建pTiBo542C質(zhì)粒，用以下引物和戶(hù)/w聚合酶(STRATAGENE,LaJolk,CA)以PCR擴(kuò)增來(lái)自AGLO土壤桿菌菌抹的完整的v/rC基因(Genbank登錄號(hào)AB027257):5，ACAATAATGTGTGTTGTTAAGTCTTGTTGC3'(Xd683SEQIDNO:3)和5，CTCAAACCTACACTCAATATTTGGTGAG3，(Xd684SEQIDNO:4)，并將其插入到TOPO克隆平端載體(InvitrogenCarlsbad，CA),產(chǎn)生中間載體pMON67402。將該中間載體進(jìn)一步與來(lái)自用PvuII/MscI消化的pCGNl1206的fr/j片段連接，由此產(chǎn)生構(gòu)建體pMON96913(圖6)。然后經(jīng)過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)電穿孔將該載體導(dǎo)入AGLO土壤桿菌菌抹，置于含50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上以選擇單交換事件。由于整合載體不能保留在AGLO細(xì)胞中，因此推測(cè)抗性菌落因通過(guò)同源重組載體整合到Ti質(zhì)粒而產(chǎn)生。將得到的菌林命名為AGLOC。同樣地，為構(gòu)建pTi542G質(zhì)粒，用以下引物和尸/w聚合酶以PCR擴(kuò)增來(lái)自AGLO土壤桿菌菌抹的完整wH基因(Genbank登錄號(hào)AB027257):5，AGATCTGGCTCGCGGCGGACGCAC3，(Xd681;SEQIDNO:5)和5，CGCTCGCGTCATTCTTTGCTGGAG3'(Xd682;SEQIDNO:6),并插入到pMON67402，產(chǎn)生構(gòu)建體pMON96026(圖8)。經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)電穿孔將該載體導(dǎo)入AGLO菌林，置于含50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上以選擇單交換事件。將得到的菌林命名為AGL0G。為了構(gòu)建pTi4404kan輔助質(zhì)粒，用以下引物和戶(hù)/w聚合酶以PCR擴(kuò)增來(lái)自LBA4404的章魚(yú)堿Ti質(zhì)粒pAL4404(Genbank登錄號(hào)NC—002377)的/ra/和化6C五區(qū)5，TCAGCAGGATGACGCCGTTATCG3，(Xd695;SEQIDNO:7)和5，TCTCGCCCGACCAATACCAACAC3，(Xd696;SEQIDNO:8)(序列來(lái)自GenbankAF242881)，并插入到pMON67402。將該中間載體進(jìn)一步與來(lái)自用PvuII/MscI消化的pCGN11206的rr/4片段連接，由此產(chǎn)生構(gòu)建體pMON96914(圖7)。通過(guò)電穿孔將該質(zhì)粒載體導(dǎo)入LBA4404，在含50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇，以選擇單交換事件。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，將kanR抗性菌落轉(zhuǎn)移到含卡那霉素50mg/l的2ml液體LB培養(yǎng)基。根據(jù)廠商說(shuō)明，用YieldAce⑧Taq聚合酶(Stratagene)和以下引物直接擴(kuò)增1毫升過(guò)夜培養(yǎng)物5，GCTGACGGGCCCGGATGAATGTCAGCTACTG3'(Xd715;SEQIDNO:9)和5，GCTCTAGAAATTGTAAGCGTTAATAATTCAGAAGAACTCGTC3'(Xd716;SEQIDNO:IO)，并確證卡那霉素抗性基因整合到Ti質(zhì)粒中。將得到的菌林命名為4404TIK。實(shí)施例4從土壤桿菌提取Ti質(zhì)粒從分別含有相應(yīng)質(zhì)粒的修飾型土壤桿菌菌抹AGLOC、AGL0G、4404TIK和ABI中提取修飾型Ti質(zhì)粒-pTiBo542C、pTiBo542G、pTi4々(Mkan和pTiC58(ABI)。將含卡那霉素50mg/1的LB中的S毫升過(guò)夜培養(yǎng)物離心，重懸浮在400iidPl緩沖液中，與400plP2緩沖液混合，34用400filPS緩沖液(緩沖液來(lái)自QIAGENmaxi-prep試劑盒)中和。在室溫孵育5分鐘后，讓該混合物以12g在4。C離心10分鐘。讓大約1200]Lil上清液與800)il異丙醇混合，在4。C離心10分鐘。用70%乙醇洗滌沉淀一次，無(wú)需干燥重新懸浮于200piTE中。隨后將所述大質(zhì)粒(megaplasmid)儲(chǔ)存在4。C。實(shí)施例5根瘤菌感受態(tài)細(xì)胞和將#"飾型T說(shuō)粒導(dǎo)入纟艮瘤菌按照Garg等，1999加以改良，制備根瘤菌感受態(tài)細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，從冷凍甘油原種中取一環(huán)根瘤菌(例如根瘤菌屬)細(xì)胞使其在IOmlTY肉湯中生長(zhǎng)24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到500mlTY肉湯，在30。C劇烈振蕩，使其生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期(006()()=0.4-0.6)。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到2個(gè)250離心管中，在冰上冷卻15-30分鐘，于4。C以9,000rpm離心10分鐘以收獲細(xì)胞。用冷無(wú)菌去離子水和10%冷甘油洗滌細(xì)胞沉淀，重新懸浮于10%冷甘油中。以50i^l/管等份均分細(xì)胞懸液，立即使用或立即在液氮中冷凍并儲(chǔ)存于-80'C。將修飾型Ti質(zhì)粒電穿孔到根瘤菌菌林中在冰上解凍50微升感受態(tài)細(xì)胞，與l或2pl已準(zhǔn)備好的Ti質(zhì)?；旌希谒媳３?0分鐘。將該混合物轉(zhuǎn)移到冷卻的lmm縫隙的電穿孔電擊杯。電穿孔參數(shù)(BIO-RADGenePulserII)如下設(shè)置2KV/400D電阻/25juF電容、或1.5KV/400Q電阻/25pF電容、或1.5KV/800Q電阻/10(^F電容。電穿孔后，在加入lmlTY或MAG培養(yǎng)基之前讓電擊杯在冰上保持5-10分鐘，轉(zhuǎn)移到14-mlFalcon管中。于30。C培養(yǎng)該管3小時(shí)，在含50mg/l卡那霉素的TY或MAG固體培養(yǎng)基上涂平板，在30。C培養(yǎng)3天以恢復(fù)抗性菌落。確證被Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的根瘤菌將卡那霉素抗性菌落轉(zhuǎn)移到含50mg/l卡那霉素的3ml液體TY或MAG培養(yǎng)基并過(guò)夜培養(yǎng)。用YieldAce⑥Taq聚合酶按照廠商說(shuō)明(Stratagene)直接擴(kuò)增l微升培養(yǎng)物。為了檢測(cè)根瘤菌菌林中的pTiBo542C或pTiBo542G,將vK:引物5，ACAATAATGTGTGTTGTTAAGTCTTGTTGC3，(Xd683;SEQIDNO:3)和5，CAATTGCATTTGGCTCTTAATTATCTGG3，(Xd684a;SEQIDNO:ll)或virG引物5，AGATCTGGCTCGCGGCGGACGCAC3，(Xd681;SEQIDNO:5)和5，CGCTCGCGTCATTCTTTGCTGGAG3，(Xd682;SEQIDNO:6)分別用于擴(kuò)增2.35kb或1.2kb片段。對(duì)于pTi4404kan質(zhì)粒，使用引物5，GCATGCCCGATCGCGCTCAAGTAATC3，(Xd699;SEQIDNO:12)和5，TCTAGGTCCCCCCGCGCCCATCG3，(Xd700;SEQIDNO:13))擴(kuò)增章魚(yú)堿Ti質(zhì)粒的1274bp的WrD2編碼序列；使用引物5，CCATGGATCTTTCTGGCAATGAGAAATC3，(Xd701;SEQIDNO:14)和5，GTCAAAAGCTGTTGACGCTTTGGCTACG3，(Xd702:SEQIDNO:15)擴(kuò)增1602bp的WrE2片段；使用引物5，ACGGGAGAGGCGGTGTTAGTTGC3，(Xd703;SEQIDNO:16)和5，CGATAGCGACAATGCCGAGAACG3，(Xd704;SEQIDNO:17)擴(kuò)增大約0.9kb的virBl片段。為了鑒別來(lái)自ABI菌抹的pTiC58質(zhì)粒，使用以下3對(duì)引物5，ATGCCCGATCGAGCTCAAGTTATC3，(Xd685;SEQIDNO:18)和5，TGAAAGGACACCTCTCCGTTGCTG3，(Xd686;SEQIDNO:19)擴(kuò)增1247bp的vz>D2片段；5，CCATGGATCCGAAGGCCGAAGGCAATG3'(Xd687;SEQIDNO:20)和5，CTACAGACTGTTTACGGTTGGGC3，(Xd688;SEQIDNO:21)擴(kuò)增1670bp的WrE2完整編碼序歹'J;5，GTGAGCAAAGCCGCTGCCATATC3，(Xd689;SEQIDNO:22)和5，TAGAGCGTCTGCTTGGTTAAACC3，(Xd690;SEQIDNO:23)擴(kuò)增1102bp的部分re/^4片段。36細(xì)菌生長(zhǎng)用培養(yǎng)基用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，制備在用來(lái)開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)化植物的根瘤菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方案中根瘤菌生長(zhǎng)所用的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方如下TY培養(yǎng)基每L細(xì)菌用胰蛋白胨5g/L酵母抽提物3g/LCaCl2.2H200.87g/LpH7.0對(duì)于固體TY培養(yǎng)基，在高壓滅菌前加15g/l細(xì)菌用瓊月旨。MAG培養(yǎng)基液體(來(lái)自USDA根瘤菌保藏中心)HEPES1.3g/LMES1.1g/L酵母抽提物lg/LL-阿拉伯糖1g/L葡萄糖酸鉀lg/LKH2P040.22g/LNa2S040.25g/LKOH調(diào)pH6.6高壓滅菌并加入以下過(guò)濾除菌的儲(chǔ)液:NH4Cl(16g/100ml)2ml/1FeCl3(0.67g/l00ml,FS)1.0ml/1CaCl2(1.5g/100ml)1.0ml/1MgSO4(18g/100ml)1.0mlNaMo04.2H20(1g/100ml)1.0ml/1NiCl2.6H20(2.2g/100ml)0.1ml/1對(duì)于固體MAG培養(yǎng)基，在高壓滅菌前加入15g/l細(xì)菌用瓊月旨。用氫氧化鈉調(diào)pH到7.5高壓滅菌后，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)板(25ml/板)對(duì)于固體LB培養(yǎng)基，高壓滅菌前加入15g/l細(xì)菌用瓊脂。AB極限培養(yǎng)基20xAB緩沖液K2HP0460g/1NaH2P0420g/1分別高壓滅菌20xAB鹽(過(guò)濾除菌，避光保存)NH4C120g/1MgS04.7H206g/1KC13g/1CaCl20.2g/1FeS04.7H2050mg/1高壓滅菌前pH到7將50mlAB緩沖液和50mlAB鹽與900ml蔗糖-水(終濃度為1升中蔗糖為0.5°/。)合并。LB培養(yǎng)基細(xì)菌用胰蛋白胨細(xì)菌用酵母抽提物每升10g5g10g38lxAB-TY誘導(dǎo)培養(yǎng)基葡萄糖5g20xAB緩沖液50ml20XAB鹽儲(chǔ)液50mlTY培養(yǎng)基20ml加無(wú)菌水到1000ml用100mMMES調(diào)pH5.4力口100(iM乙酰丁香酮(存于DMSO中的1M儲(chǔ)液；在細(xì)菌懸浮后加1pi儲(chǔ)';^/10ml培養(yǎng)基)用于在根瘤菌中vir誘導(dǎo)的ATA培養(yǎng)基用阿拉伯糖和葡萄糖酸鉀取代葡萄糖，改良AB-TY培養(yǎng)基得到ATA(AB極限培養(yǎng)基+TY+阿拉伯糖)培養(yǎng)基。在該培養(yǎng)基中幾乎所有根瘤菌的生長(zhǎng)率都加倍。在該培養(yǎng)基中細(xì)菌產(chǎn)生的多糖少得多，細(xì)菌沉淀更結(jié)實(shí)。L-阿拉伯糖1g/L葡萄糖酸鉀lg/L20xAB緩沖液50ml20xAB鹽儲(chǔ)液50mlTY培養(yǎng)基20ml加無(wú)菌水到1000ml謹(jǐn)mMMES調(diào)pH5.4細(xì)菌懸浮后加200|uM乙酰丁香酮(存于DMSO中的1M儲(chǔ)液)。實(shí)施例7用于修飾型根瘤菌菌林的作物轉(zhuǎn)化栽體用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù)構(gòu)建根瘤菌屬轉(zhuǎn)化載體。采用質(zhì)粒構(gòu)建體pMON96033(圖l;用于大豆和油菜轉(zhuǎn)化)、39pMON96036(圖2;用于玉米轉(zhuǎn)化)或pMON101316(圖3;用于棉花轉(zhuǎn)化)。三種構(gòu)建體都含有pVS1復(fù)制起點(diǎn)以及GUS或GFP報(bào)告基因或GUS與GFP二者報(bào)告基因。通過(guò)電穿孔將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到各種l，務(wù)飾型根瘤菌菌林，通過(guò)限制酶消化小量制備的DNA得到了確證。在構(gòu)建質(zhì)粒中使用的FMVCP4基因具有來(lái)自玄參花葉病毒(FMV)的啟動(dòng)子，其后接CP4syn基因，CP4syn基因是編碼CP4EPSP合成酶的基因。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,633,435號(hào)，其在此引作參考。當(dāng)EPSP合成酶表達(dá)時(shí)，賦予植物細(xì)胞和由此形成的植抹顯著程度的草甘膦抗性。e35sGUS基因?yàn)镻-葡糖苷酸酶基因，其通常位于e35S啟動(dòng)子之后，用作組織化學(xué)標(biāo)記。FMVGUS基因?yàn)镕MV啟動(dòng)子和GUS。NOSNPTII基因具有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其位于胭脂堿合成酶基因(NOS)啟動(dòng)子后面，賦予對(duì)卡那霉素的抗性。ActlGFP基因具有來(lái)自水稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和綠熒光蛋白基因，為篩選標(biāo)記。e35sGFP基因?yàn)槲挥趀35S啟動(dòng)子后面的綠熒光蛋白基因。讓含有所用質(zhì)粒的根瘤菌菌林的過(guò)夜培養(yǎng)物生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，然后稀釋到最終光密度為0.3-0.6。實(shí)施例8根瘤菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化用Martinell等所述的器官形成方法(美國(guó)專(zhuān)利第7,002,058號(hào))并加以改良來(lái)實(shí)施轉(zhuǎn)化。通過(guò)電穿孔將含有GUS和CP4基因的pMON96033轉(zhuǎn)移到各種修飾型根瘤菌菌林(例如根瘤菌CR/z/加6/wwsp.)、中間根瘤菌(Mesor/z/zo6/wmsp.)、中華才艮瘤菌(5Vww/z&o6/wmsp.))。讓單菌落在含50mg/l壯觀霉素和50mg/l卡那霉素的MAG或TY培養(yǎng)基上恢復(fù)，接種到30。C200rpm的振蕩器中的具同樣選擇的20-50ml液體TY培養(yǎng)基中。通過(guò)限制酶消化從IOml培養(yǎng)物小量制備的質(zhì)粒證實(shí)了根瘤菌培養(yǎng)物中質(zhì)粒的存在。剩下的液體培養(yǎng)物與甘油混合到終濃度20%，等分并儲(chǔ)存于-80。C作為種子培養(yǎng)物。為制備根瘤菌接種物，將0.25-lml冷凍種子培養(yǎng)物接種于具有與上述相同的抗生素選擇的250ml或500mlTY培養(yǎng)基中，在28。C以200rpm振蕩生長(zhǎng)過(guò)夜到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期。將培養(yǎng)物離心，以O(shè)D66o約0.3的濃度直接懸浮于接種培養(yǎng)基(INO培養(yǎng)基)。經(jīng)誘導(dǎo)的根瘤菌培養(yǎng)物也用于大豆轉(zhuǎn)化。為了誘導(dǎo)根瘤菌，將過(guò)夜培養(yǎng)物以O(shè)D66。約0.3的濃度重新懸浮于AB-TY培養(yǎng)基，加入乙酰丁香酮到終濃度100pM。在28。C讓該培養(yǎng)物進(jìn)一步振蕩過(guò)夜，離心并重新懸浮于接種培養(yǎng)基(INO培養(yǎng)基)到OD柳約03的濃度。將大豆栽培變種A3525(美國(guó)專(zhuān)利第7,002，058號(hào))用于^f艮瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。對(duì)所述方法如下改良以用于根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。讓大豆種子在室溫于BGM培養(yǎng)基中萌發(fā)，由機(jī)器切下來(lái)自大豆成熟種子的分生組織外植體(美國(guó)申請(qǐng)第20050005321號(hào))。PLANTCONlid中的大豆分生組織外植體與懸浮于INO培養(yǎng)基中的根瘤菌混合，在W-113超聲儀(HondaElectronicsCo.,Ltd,Aichi,Japan)中進(jìn)行超聲處理。超聲處理后外植體在同一個(gè)PLANTCON中于23°C以16/8小時(shí)的光照-黑暗光周期共培養(yǎng)1-11天。然后將外植體轉(zhuǎn)移到含有75iaM草甘膦的WPM選擇培養(yǎng)基表面。2周后將外植體再次轉(zhuǎn)移到75^iM草甘膦固體WPM培養(yǎng)基。接種6-10周后具完全伸展開(kāi)的三葉苗恢復(fù)了，并在含有O.lmg/lIAA和25(JM草甘膦選擇的BRM培養(yǎng)基(任選含殺真菌劑)中生根。將生根的'J、植林轉(zhuǎn)移到溫室中讓其成熟。表2:用于大豆轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基組分用于大豆種子萌發(fā)的BGM培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>2.58mg硫酸鋅0.249mg石典化鐘0.216mg鉬酸鈉0細(xì)8mg硫酸銅0細(xì)8mg氯化鈷儲(chǔ)液3.36mgEDTA二鈉2.49mg硫酸亞鐵1.34mgHC1硫胺0.5mg煙酸0.82mg鹽酸吡。多醇20g/L蔗糖(超級(jí)純)125mg頭孢漆肝pH5.6用于大豆共培養(yǎng)的INO培養(yǎng)基量/L化合物1/10x的GamborgB5培養(yǎng)基《鼓量營(yíng)養(yǎng)和維生素組分；2/5x的大量營(yíng)養(yǎng)素lg硝酸鉀(KN03)30g葡萄糖3.9gMES(pH5.4)高壓滅菌后，將疏辛酸加入4妄種物到終濃度250大豆WPM苗培養(yǎng)基量/L化合物2.41gWPM粉末(PhytoTechLaboratories)20g蔗糖(超級(jí)純)1.29g葡萄糖酸鈣(Sigma)4.0g瓊脂凝膠(AgarGel,pH5.6)mL/L高壓滅菌后的成分4mL頭孢蓬肝(50mg/mL)1ml替卡西林(Ticarcillin)(100mg/ml)5mL羧芐青霉素(40mg/mL)0.15mE草甘膦(0.5FS儲(chǔ)液)(0.075mM)BRM生根培養(yǎng)基量/L化合物2.15gMS粉末(Phytotech)0.1g肌醇甘氨酸0.5mg煙酸0.5mg鹽酸吡眵醇0.1mg鹽酸硫胺30g蔗糖(超級(jí)純)10mlL-半胱氨酸(IOmg/ml)8g洗過(guò)的瓊脂mL/L高壓滅菌后的成分5.0IAA(在lmMKOH中0.033mg/ml)1mL替卡西林(100mg/ml)0,05mL草甘膦(0.5FS儲(chǔ)液)(0.025mM)將二元載體pMON96033轉(zhuǎn)移到根瘤菌菌林中并與大豆分生組織外植體共培養(yǎng)，觀察到GUS陽(yáng)性結(jié)果(表3和圖4)。GUS活性的小藍(lán)色斑點(diǎn)證明了所示草木樨中華根瘤菌、費(fèi)氏中華根瘤菌、百脈根根瘤菌和1種豌豆根瘤菌的T-DNA遞送到了大豆外植體中。從用各種菌抹進(jìn)行的根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得了轉(zhuǎn)基因大豆植林(表4)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)測(cè)定證實(shí)了這些大豆植株的轉(zhuǎn)基因特性，其中大部分轉(zhuǎn)化抹顯示1-2拷貝的簡(jiǎn)單整合模式(表5)。表3:在大豆分生組織外植體中采用根瘤菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)移的g附基因的瞬間表達(dá)*菌林來(lái)源瞬間GUS測(cè)定RL4404豌豆根瘤菌菌林Madison+pAL4404+2370LBA豌豆根瘤菌菌抹USDA2370+pTiBo542C+2370G豌豆根瘤菌菌林USDA2370+pTiBo542G+SF4404費(fèi)氏中華根瘤菌USDA205+pAL4404+SF542C費(fèi)氏中華根瘤菌USDA205+pTiBo542C+SM542C百月'財(cái)艮根瘤菌USDA3471+pAL4404+ML4404百脈根根瘤菌USDA3471+pAL4404+ML542G百脈根根瘤菌USDA3471+pTiBo542G+*共培養(yǎng)時(shí)期4天后實(shí)施瞬時(shí)測(cè)定43表4:根瘤菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化概述菌林大豆外植體生才隊(duì)林TFRL4404370520.05%SF4404555320.04%SM542C255510.04%表5:來(lái)自根瘤菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的拷貝數(shù)測(cè)定*NOS拷貝RL4404SF4404SM542CO拷貝001l-2拷貝120〉2拷貝000植林總數(shù)121承通過(guò)INVADER法(ThirdWaveTechnologies,Madison,WI)用朋s探針來(lái)分析拷貝數(shù)并與內(nèi)部基因組對(duì)照比較。為了測(cè)試gus轉(zhuǎn)基因是否被傳遞到種子后代，用GUS溶液對(duì)源自根瘤菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的2個(gè)大豆轉(zhuǎn)基因株系的種子進(jìn)行染色(圖5)。通過(guò)INVADER法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)GlVLA9196D抹系有l(wèi)個(gè)連接的ww基因的拷貝。在吸漲并除掉種皮后，通過(guò)組織化學(xué)染色測(cè)定了來(lái)自該林系的12粒R1種子的GUS,9粒為GUS陽(yáng)性，說(shuō)明對(duì)1個(gè)拷貝插入來(lái)說(shuō)分離比率為3:1。實(shí)施例9根瘤菌介導(dǎo)的油菜轉(zhuǎn)化A.根瘤菌接種物制備使用含pMON96033的根瘤菌菌抹進(jìn)行油菜轉(zhuǎn)化。將來(lái)自甘油原種的含載體根瘤菌菌林接種到50mlFalcon試管中含50mg/l卡那霉素和50mg/l壯觀霉素的10mlTY培養(yǎng)基，在28。C以200rpm振蕩過(guò)夜。通過(guò)離心沉淀過(guò)夜的根瘤菌培養(yǎng)物，并重新懸浮于MG/L液體培養(yǎng)基(MG/L肉湯甘露醇5g/1、L-谷氨酸lg/1、KH2PO4250mg/l、NaC1100mg/1、MgS047H20100mg/l、生物素l|ug/l、酵母抽提物2.5g/l、pH7.0)。OD600在0.05-0.1之間。44B.油菜外植體制備和共培養(yǎng)按照美國(guó)專(zhuān)利第5，750,871號(hào)和Radke等，1992進(jìn)行油菜轉(zhuǎn)化。將約0.25g油菜種子栽培變種Ebony轉(zhuǎn)移到1.5-mlEppendorf管中，用95%乙醇潤(rùn)濕。為了給種子消毒，加入lml的P/。次氯酸鈉溶液30分鐘。用蒸餾水替換該漂白液，將種子漂洗若干次。將種子播撒到1/10MS萌發(fā)培養(yǎng)基中，在Percival培養(yǎng)箱中于24"保持16小時(shí)光照周期。種子萌發(fā)培養(yǎng)基(1/10MS培養(yǎng)基)1/10XMS極限有機(jī)物培養(yǎng)基(GibcoBRL;最終蔗糖0.3%)、吡噴醇50iug/1、煙酸50]ug/1、甘氨酸200|ig/l、PHYTAGR(GibcoInvitrogen)6g/1、pH5.8;20)。將來(lái)自7-14曰齡培養(yǎng)物的黃化幼苗用作外植體來(lái)源。以lxl()S個(gè)細(xì)菌/ml接種外植體。撤走根瘤菌懸液，將已接種的外植體置于共培養(yǎng)平板上的濾紙上面，在連續(xù)光照中于24。C孵育約2天。測(cè)定共培養(yǎng)外植體的g^表達(dá)，發(fā)現(xiàn)含有表明油菜細(xì)胞轉(zhuǎn)化的藍(lán)色斑點(diǎn)(圖9)。共培養(yǎng)基(MS-1):MS鹽(CaissonLaboratories,Logan,UT)、肌醇100mg/l、硫胺-HCl1.3mg/l、KH2P04200mg/l、2,4-D1mg/l、蔗糖30/0、PHYTAGAR(GibcoInvitrogen)7g/1、pH5.8。C.愈傷組織誘導(dǎo)將經(jīng)共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到愈傷組織誘導(dǎo)(B5-1)培養(yǎng)基。以~100^E/m々s連續(xù)光照于24。C6天。來(lái)自百^M艮根瘤菌、豌豆根瘤菌、費(fèi)氏中華根瘤菌和草木樨中華根瘤菌的5個(gè)菌林顯示基因有效轉(zhuǎn)移到油菜外植體中，且gi^陽(yáng)性外植體的頻率介于21。/。-73。/。之間(圖10)。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(B5-1):Gamborg，sB5鹽(CaissonLabs)、B5維生素(lmg/l煙酸、1mg/l吡哆醇-HCI、10mg/l硫胺-HCl)、100mg/1肌醇、lmg/12,4-D、蔗糖3%、最終效價(jià)調(diào)整到325mg/l的羧千青霉素(PhytoTechnology,ShawneeMission,KS)、50mg/l特美、汀(Timentin)、7g/1PHYTAGAR(GibcoInvitrogen)、pH5.8。45D.苗再生和選擇將具有愈傷組織的外植體轉(zhuǎn)移到含AgN03的苗再生培養(yǎng)基(B5BZ),在24。C以100iiE/mVs連續(xù)光照孵育14天。接著將外才直體轉(zhuǎn)移到不含AgNCb的苗再生培養(yǎng)基(B5BZ)。約每2周收獲再生自經(jīng)草甘膦選擇的愈傷組織的苗。顯示g^表達(dá)的早期苗實(shí)例示于圖11中。含硝酸銀的苗再生培養(yǎng)基(B5BZ+3Ag):Gamborg，sB5鹽(CaissonLabs)、B5維生素(1mg/l煙酸、1mg/l吡P多醇-HCl、10mg/l硫胺-HCl)、100mg/l肌醇、BAP3mg/1(Sigma)、玉米素lmg/1(Sigma)、AgN033mg/1(Sigma)、45mg/l草甘膦(Monsanto，96.5%干燥酸)、蔗糖1%、最終效價(jià)調(diào)整到325mg/l的羧節(jié)青霉素(PhytoTechnology)、50mg/l特美汀、PHYTAGAR(GibcoInvitrogen)7mg/1、pH5.8。苗再生培養(yǎng)基(B5BZ):Gamborg，sB5鹽(CaissonLabs)、B5維生素(lmg/l煙酸、1mg/l吡,醇-HCl、10mg/l硫胺-HCl)、100mg/l肌醇、BAP3mg/1(Sigma)，玉米素lmg/1(Sigma)、45mg/l草甘膦、蔗糖1%、最終效價(jià)調(diào)整到325mg/l的羧芐青霉素(PhytoTechnology)、特美汀50mg/1、PHYTAGAR(GibcoInvitrogen)7mg/1、pH5.8。E.苗收獲將至少0.5cm長(zhǎng)的綠色苗修整以分離主莖。將修整的苗置于苗收獲培養(yǎng)基(B5-0)。2周后將苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基。苗收獲培養(yǎng)基(B5-0):Gamborg，sB5鹽(CaissonLabs)、B5維生素(1mg/l煙酸、1mg/l吡哆醇-HCl、10mg/l硫胺-HCl)、100mg/l肌醇、最終效價(jià)調(diào)整到195mg/l的羧芐青霉素(PhytoTechnology)、蔗糖1%、PHYTAGAR(GibcoInvitrogen)6g/1、pH5.8。F.苗生長(zhǎng)和生根將綠色苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(B5-0+2IBA)。將苗保持在生根培養(yǎng)基上直到其形成根。苗于24。C以100uE/mVs的16小時(shí)光照/天下保持。生根培養(yǎng)基(B5-0+2IBA):Gamborg，sB5鹽(CaissonLabs)、B5維生素(lmg/l煙酸、1mg/l吡哆醇-HCl、10mg/l硫胺-HCl)、100mg/l肌醇、IBA2mg/1(吲咮-3-丁酸，Sigma)、150mg/l頭孢p塞厲(PhytoTechnology)、蔗糖1%、PHYTAGAR(GibcoInvitrogen)6g/1、pH5.8。G.轉(zhuǎn)基因檢測(cè)和轉(zhuǎn)化頻率從溫室生長(zhǎng)的油菜植林提取總基因組DNA,用單一切點(diǎn)酶Sg/11消化，與DIG-標(biāo)記的CP4探針雜交。確證了4個(gè)抹系為轉(zhuǎn)基因(圖11)。轉(zhuǎn)化頻率在表6中概述。表6:用根瘤菌菌林的油菜轉(zhuǎn)化頻率(TF)菌林外植體GUS/CP4陽(yáng)性TFRL2370G15021.33SF54212010.83SM542C12010.83實(shí)施例10通過(guò)胚胎形成的4艮瘤菌介導(dǎo)棉花轉(zhuǎn)化A.根瘤菌接種物制備將pMON101316電穿孔到根瘤菌菌林中，通過(guò)限制酶消化小量制備的DNA得到了證實(shí)并儲(chǔ)存于-80。C。將來(lái)自甘油原種的含載體根瘤菌菌4朱接種到于50mlFalcon試管內(nèi)的10ml含卡那霉素(50mg/l)和壯觀霉素(50mg/l)的TY培養(yǎng)基中，于28°C以200rpm振蕩過(guò)夜。通過(guò)離心沉淀過(guò)夜的根瘤菌培養(yǎng)物，重新懸浮于20ml的MS0液體培養(yǎng)基中，再次離心。將沉淀重新懸浮于20ml的MS0培養(yǎng)基中。用MS0稀釋洗滌過(guò)的根瘤菌到OD66o約l.O用于接種。B.外植體制備基本上按照美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第2004087030號(hào)進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)化。在幼苗萌發(fā)后7天，從暗Percival培養(yǎng)箱取出來(lái)自栽培變種Coker的黃化棉花幼苗。收獲來(lái)自PHYTATRAY的胚軸，置于含有無(wú)菌MSO的無(wú)菌培養(yǎng)joi中以防止組織枯萎。將胚軸切為小外植體。C.接種和共培養(yǎng)用無(wú)菌鑷子將外植體轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入根瘤菌接種物。將外植體留在無(wú)菌罩中20分鐘，旋渦振蕩以確保所有外植體與根瘤菌接種物很好地接觸。然后吸出根瘤菌接種物溶液，用無(wú)菌濾紙輕輕吸干外植體。將接種過(guò)的胚軸塊置于培養(yǎng)平板上。用塑料袋蓋上的外植體平板在設(shè)置為約22-24°C、10小時(shí)光照/14小時(shí)黑暗的光周期的Percival培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2天。D.通過(guò)胚胎形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化接種后2天用X-gluc染色棉花外植體塊，以檢測(cè)GUS瞬間表達(dá)(圖12)。胚軸中的藍(lán)色斑點(diǎn)指示gw基因表達(dá)和棉花細(xì)胞轉(zhuǎn)化。為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，將胚軸外植體轉(zhuǎn)移到含有UMSEL1629選擇培養(yǎng)基(含有合適選擇劑)的平板中。然后用PARAFILM覆蓋該平板，在28。C以16/8小時(shí)(日/夜)光周期培養(yǎng)。4周后在選擇培養(yǎng)基上通過(guò)X-Gluc染色確證了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織的g^表達(dá)(圖13)。在初次轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基4周后，將所有胚軸轉(zhuǎn)移到UMSEL1788培養(yǎng)基，用PARAFILM覆蓋，培養(yǎng)7天。然后將外植體轉(zhuǎn)移回UMSEL1629于28°C以16/8小時(shí)(日/夜)光周期培養(yǎng)4周。在第二次轉(zhuǎn)移到UMSEL1629上后大約4周，這要視愈傷組織的生長(zhǎng)速率而定，讓愈傷組織塊恢復(fù)并轉(zhuǎn)移到UMO平板。然后標(biāo)記單個(gè)平板，用PARAFILM覆蓋，在28。C連續(xù)黑暗中培養(yǎng)。在愈傷組織位于UMO上后6-8周，讓愈傷組織在新鮮UMO培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，于28。C連續(xù)黑暗中培養(yǎng)。在UMO上6-10周后，準(zhǔn)備從UMO上的獨(dú)立愈傷組織林系收獲胚胎發(fā)生性愈傷組織(EC)，并轉(zhuǎn)移到TRP+培養(yǎng)基。大約3個(gè)月內(nèi)每3-5周將TRP+平板上的活躍生長(zhǎng)的組織和小胚轉(zhuǎn)移到新鮮TRP+培養(yǎng)基中，并在28。C以連續(xù)黑暗培48的SHSU培養(yǎng)基，用PARAFILM覆蓋。使平板在Percival中于28°C以16/8(曰/夜)光照周期且用最大光照(架上的光和側(cè)光)培養(yǎng)。胚可在相同的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)一次以上直到發(fā)芽?；謴?fù)的小檔j朱在Percival或溫室中于28°C以16/8(日/夜)光周期培養(yǎng)。E.源自根瘤菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織的轉(zhuǎn)基因特性的分子分析從愈傷組織提取基因組DNA，用單一切點(diǎn)酶BamHI消化，在1%瓊脂糖凝膠中分級(jí)分離，轉(zhuǎn)移到HybondTM膜(例如Appligen-Oncor，Illkirch,France;或Amersham-PharmaciaBiotech)上。用DIG才示i己6勺g^探針來(lái)檢測(cè)作為轉(zhuǎn)化指示的轉(zhuǎn)基因是否存在。發(fā)現(xiàn)源自用Ti輔助質(zhì)粒j進(jìn)行的苜蓿中華根瘤菌(S.me///W)、費(fèi)氏中華根瘤菌和豌豆根瘤菌轉(zhuǎn)化的6個(gè)棉花愈傷組織林系含有g(shù)us基因(圖14)。F.用于棉花培養(yǎng)的培養(yǎng)基lLUMSEL的配方-4.33gMS鹽、2ml500XB5維生素、0.1ml2，4畫(huà)D(1mg/ml)、1ml激動(dòng)素(0.5mg/ml)、30g葡萄糖、pH5.8、2.5gPHYTAGEL、1.7ml羧千青霉素(250mg/ml)、1ml頭孢p塞肝(100mg/ml)、加選擇劑卡那霉素40mg/L終濃度。在高壓滅菌后加入羧芐青霉素、頭孢噻肟和選擇劑。1LUMSEL1788的配方-4.33gMS鹽、2ml500XB5維生素、0.1ml2，4隱D(1mg/ml)、1ml激動(dòng)素(0.5mg/ml)、30g葡萄糖、pH5.8、2.5gPHYTAGEL、1.7ml(250mg/ml)羧芐青霉素、1ml(100mg/ml)頭孢p塞肟、加選擇劑卡那霉素40mg/L終濃度和0.1g蔗糖溶于100ml水中。—在高壓滅菌后加入羧節(jié)青霉素、頭孢噻肟和選擇劑。1LUMSEL1629的配方-4.33gMS鹽、2ml500XB5維生素、0.1ml2,4-D(1mg/ml)、lml激動(dòng)素(0.5mg/ml)、30g葡萄糖、pH5.8、2.5gPHYTAGEL、1.7ml(250mg/ml)羧千青霉素、lml(100mg/ml)頭49孢噻肟、加選擇劑卡那霉素40mg/L終濃度。在高壓滅菌后加入羧千青霉素、頭孢p塞將和選擇劑。1LUMO的配方-4.33gMS鹽、2ml500XB5維生素、30g葡萄糖、pH5.8、3.5gGELRITE、1.7ml(250mg/ml)羧節(jié)青霉素、1ml(100mg/ml)頭孢p塞肝、100mg/l抗壞血酸、加選擇劑卡那霉素50mg/L終濃度。1LTRP+的西己方—4.33g/lMS鹽、2ml500XB5維生素、1.9g/1KN03、30g/l葡萄糖、0.1g/l酪蛋白水解物、3.5gGELRITE、pH5.8。1LSHSU的配方—100mlStewart&HsuMajors(lOx)、10mlStewart&HsuMinors(lOOx)、1.5mH失(100x)、10mlStewart&HsuOrgranics(lOOx)、5g葡萄糖、50mg/1benlate、2.2gGELRITE、pH6.8(Stewart&Hsu,1977)。實(shí)施例11根瘤菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化A.根瘤菌接種物制備和培養(yǎng)基組成將含有CP4、GUS和她表達(dá)盒的pMON96036用于玉米轉(zhuǎn)化。將載體電穿孔到各種修飾型根瘤菌菌抹中，得到了證實(shí)并儲(chǔ)存于-80'C。將含載體根瘤菌的甘油原種在添加抗生素(卡那霉素40mg/L和壯觀霉素31mg/L)的固體TY培養(yǎng)基上劃線，在28。C酵育2天。在將根瘤菌接種玉米未成熟胚之前2天，從4艮瘤菌培養(yǎng)平板取一環(huán)細(xì)胞接種到250mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的25mL添加62mg/L壯觀霉素和40mg/L卡那霉素的液體TY培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)瓶置于振蕩器上以大約150-200rpm和27-28。C過(guò)夜。然后用同樣的液體培養(yǎng)基稀釋(1比5)根瘤菌培養(yǎng)物，放回到振蕩器中。幾小時(shí)后，在接種之前l(fā)天，以3500rpm將根瘤菌細(xì)胞離心15分鐘。將細(xì)菌細(xì)胞沉淀重新懸浮于含200jtiM乙酰丁香酮和50mg/L壯觀霉素和25mg/L卡那霉素的AB-TY或ATA誘導(dǎo)肉湯中，將細(xì)胞密度調(diào)整到OD66o為0.2。然后將細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物(每一250mL培養(yǎng)瓶中50mL)放回振蕩器中并過(guò)夜生長(zhǎng)。在接種當(dāng)天早上，將細(xì)菌細(xì)胞離心，用添加200jaM乙酰丁香酮的液體1/2MSVI培養(yǎng)基(美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20040244075號(hào))洗滌。讓該細(xì)菌培養(yǎng)物離心，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于含200,乙酰丁香酮的1/2MSPL培養(yǎng)基(美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20040244075號(hào))，將細(xì)胞密度調(diào)整到0066。為l.O用于接種。試劑可市購(gòu)并可購(gòu)自多家供應(yīng)商(參見(jiàn)例如SigmaChemicalCo.,St.Louis,Mo.)。B.玉米胚分離和根瘤菌共培養(yǎng)為了進(jìn)行根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將含有玉米(Zeamqy力未成熟胚的花穗分離，并通過(guò)細(xì)菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化，除了未成熟胚分離自表面消毒的花穗并直接置于已制備的根瘤菌細(xì)胞懸液中之外，其大體如Cai等(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20040244075號(hào))所述。在除掉根瘤菌細(xì)胞懸液后，將未成熟胚轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第200術(shù)44075號(hào))。為了調(diào)查GFP瞬間表達(dá)，將共培養(yǎng)的玉米胚直接置于熒光顯微鏡下用于觀察GFP。或者，在共培養(yǎng)后將IO個(gè)隨機(jī)挑選的胚轉(zhuǎn)移到1.5mlEppendorf管中，用X-gluc溶液在37。C染色過(guò)夜以檢查gw瞬間表達(dá)。圖15代表與用根癌土壤桿菌菌林ABI轉(zhuǎn)化相比較，采用用ATA誘導(dǎo)培養(yǎng)基的用豌豆根瘤菌、百脈根根瘤菌、費(fèi)氏中華根瘤菌和草木樨中華根瘤菌的5種根瘤菌菌株轉(zhuǎn)化，的玉米未成熟胚的GUS瞬間表達(dá)。注意到用于土壤桿菌生長(zhǎng)和誘導(dǎo)的常規(guī)AB極限培養(yǎng)基不能有效支持根瘤菌生長(zhǎng)。根瘤菌接種物在沒(méi)有任何選擇的AB極限培養(yǎng)基中于28。C以220rpm振蕩1周后并未顯示出顯著生長(zhǎng)。在AB極限培養(yǎng)基包含20mlTY培養(yǎng)基顯著改善根瘤菌生長(zhǎng)速率；同時(shí)用ATA培養(yǎng)基中的L-阿拉伯糖和葡萄糖酸鉀取代AB-TY培養(yǎng)基中的葡萄糖減少多糖產(chǎn)生，導(dǎo)致沉淀更緊密。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中碳源的改變顯著改進(jìn)玉米中根瘤菌菌林的瞬間表達(dá)。51C.愈傷組織誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因植林再生在共培養(yǎng)后，基本上如美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20040244075號(hào)所述且適當(dāng)?shù)馗牧歼x擇條件繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將胚轉(zhuǎn)移到改良的添加250mg/L羧千青霉素和O.lmM草甘膦的MS培養(yǎng)基(美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20040244075號(hào))中。在該階IS:,由瞬時(shí)測(cè)定中所用的百脈才艮^f艮瘤菌、費(fèi)氏中華根瘤菌和草木樨中華根瘤菌菌抹觀察到具她表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織(圖16)。代表性轉(zhuǎn)化頻率示于表7中。表7:用不同根瘤菌菌林的玉米轉(zhuǎn)化頻率誘導(dǎo)培養(yǎng)基根瘤菌菌抹胚轉(zhuǎn)基因植物TFML4頓17731.69%AB誘導(dǎo)ML542G15421.30%扁8378.40%ML542G11221.78%SF440411665.17%SF542C12421.61%SM542C13410.75%2370LBA13900%ATA誘導(dǎo)ABI10011%D.源自根瘤菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植林的分子分析從溫室生長(zhǎng)的玉米植抹中分離總基因組DNA,用單一切點(diǎn)酶^wzHI消化以評(píng)估轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。用DIG標(biāo)記的gus探針與基因組DNA雜交。除了l抹外所有抹系的推定的轉(zhuǎn)化組織的轉(zhuǎn)基因特性都得到確證(圖17)。E.轉(zhuǎn)基因玉米植抹中轉(zhuǎn)基因的品系轉(zhuǎn)移讓開(kāi)花的轉(zhuǎn)基因玉米植株自花授精或與用于轉(zhuǎn)化的玉米基因型的親本抹系(LH244抹系)異型雜交。為了gw染色讓干種子于水中吸水l天，或?yàn)榱怂?jì)數(shù)吸水2天。在轉(zhuǎn)基因Rl種子中確證了gw或她的表達(dá)和分離(表8)。52表8:在轉(zhuǎn)基因玉米R(shí)1種子中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因抹系種子#GFP+種子/檢測(cè)的種子Gus+種子/檢測(cè)的種子根瘤菌菌林ZMA82321129/206〃ML542GZMA8232/LH2441124/20ML542GZMA8234480/100/20ML542GZMA824613312/205/5ML542GZMA82471484/201/3SF4404LH244/ZMA824715013/20SF4404ZM一A8248750/204/6SF4404LH244/ZMA824910413/20SF4404LH244/ZMA82492759/20SF4404LH244/ZMA82511487/20SF4404LH244/ZMA82511235/20SF4404LH244/ZMA82511084/20SF4404ZMA82521379/204/6SF4404ZMA82557810/20SM542CLH244/ZMA8245312/10ML542GLH244/ZMA825313810/20SF542CLH244/ZMA8253675/20SF542CLH244/ZMA8254728/20SF542CLH244/ZMA82541006/20SF542CLH244/ZMA82358112/20ABILH244/ZMA823511613/20ABILH244/ZMA82351618/20ABIZMA8237/LH2442947/205〃ABIZMA8244/LH2442504/20ABIZMA8240143/4ABIZMA8240/LH244867/20ABIZMA82383110/10ABILH244/ZMA8238卯10/20ABIZMA8256533/10ABILH244/ZMA8256558/20ABI實(shí)施例12通過(guò)接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的根瘤菌介導(dǎo)的作物轉(zhuǎn)化在根瘤菌屬和近緣物種中on'r-依賴(lài)性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)也可用于將目標(biāo)基因(GOI)遞送到植物細(xì)胞中，并隨后整合到植物基因組。同源或異源接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可用于該基因轉(zhuǎn)移。然后可用選擇標(biāo)記通過(guò)已建立的組織培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)再生轉(zhuǎn)基因植抹。根瘤菌菌株其中可包括中華根瘤菌、百脈根根瘤菌、豌豆根瘤菌和根瘤菌NGR234。參考文獻(xiàn)上的或其它的詳細(xì)資料補(bǔ)充的程度在此明確地引作參考。美國(guó)專(zhuān)利第4,761,373號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第4,810,648號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,013，659號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第5,094,945號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,106,739號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5，107，065號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,141,870號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第5,229,114號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,273,894號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,276,268號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5，322,938號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,352,605號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,359,142號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,362,865號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,378,619號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,378,824號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,424,412號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,463,175號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,512，466號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,530,196號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,543,576號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,561,236號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5，563，055號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,591,616號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5，605，011號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,608,149號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,627,061號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,633,435號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,633,437號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5，637，489號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,641,876號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,646,024號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,659,122號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,689,041號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,750,871號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第5,750,876號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,767,366號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,837,848號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,850,019號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5，859，347號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,869,720號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,958,745號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,981,834號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第5,985,605號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5,998,700號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,011,199號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6，040，497號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第6,051,753號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,072,103號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,080,560號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,140,075號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,140,078號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,166,292號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,171,640號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第6,175,060號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第6,177,611號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,225,105號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,228,623號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6，232，526號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6，252，138號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,271,443號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,294,714號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6，380，462號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,380,466號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,384,301號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,414,222號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,426,446號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,426,447號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,429,357號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6，429，362號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,433,252號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,437,217號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,444,876號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,459,018號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,476,295號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第6,483,008號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,489,461號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,495,739號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6，506，559號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,531,648號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,537,750號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,538,178號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,538,179號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,538,181號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,541,259號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,576,818號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第6，589，767號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第6，596，538號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6，635,806號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,613,963號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,653,530號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第6,660,849號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,706,950號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,723,837號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6，770，465號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,774,283號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,812,379號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6，822，141號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,828,475號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第7,002,058號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第7,132,528號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第7,151,204號(hào);美國(guó)專(zhuān)利第RE37,543號(hào)美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20020168707號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20030028917號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20030083480號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20030115626號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20030135879號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20040177399號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20040244075號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20050005321號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20050022261號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20050289667號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20050289672號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20060200878號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20060162010號(hào)；美國(guó)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)第20060236420號(hào)；Beringer,J!M/craWo/"84:188-198,1974.Bevan等,A^we,304:184-187,1983.Bird等，萬(wàn)/0/ec/2Tev.，9:207-227,1991.55Bravo-Angel等，J萬(wàn)a"eWo/.,181:5758—5765,1999.Broothaerts等，A^wm,433:629-633,2005.Bucha腿-Wollaston,淑,，328:172-175，1987.Callis爭(zhēng)，P/慮尸—.o/"88:965-968，1988.Carrington和Freed,J:K^o/.，64(4):1590-1597，1990.Chandler等，尸teCW/，1:1175-1183，1989.Chen等，J^zcten.o/.184:4838-4845,2002.Chu等，6We"""/"/ca18:659，1975.Corruzzi爭(zhēng)，EM萬(wàn)O丄3:1671-1679，1984.Dekeyser等，P/a"fP/^w'o/.,90:217-223,1989.Della隱Cioppa等，萬(wàn)/o/Tec/z"o/ogy,5:579-584，1987.Depicker等，《/^fo/.jp;3/.1:561-573,1982.Dube和Thomson,Plasmid.,50:1-11，2003.Dube等，尸/a"fMo/.所o,"55(4):531-539,2004.Duncan等，尸/a"to，165:322-332,1985.Ebert等,尸度淑Jcad5W.腦84:5745-5749，1987.歐洲申請(qǐng)0385962;歐洲申請(qǐng)275957Farrand等，/"f.￡vo/.M/craWo/.,53:1681-1687,2003.Fraley等，說(shuō)o/rec/wo/ogv，3:629-635,1985.Fraley爭(zhēng)，iVoc.iVaf/.Jc^/.t/SA,80:4803—4807,1983.Freiberg等，胸群，387:394-401,1997.Gamborg等，五x/.Ce〃L,50:151,1968.Garg等，jp//.￡"v.M/cro^'o/.,65:2802-2804，1999.Gibson和Shillitoe，Mo/.7:125-137,1997.Hiei等，尸/a"fj:;6:271-282，1994.Hiei等，P/am.Mo/.歷o/"35(1-2):205-218,1997.Hoekema等,脂臟，303:179,1983.56Hooykaas等，/M/cayWo/.98:477-484，1977.Ishida等，胸匿腸&c/2"o/"14:745-750，1996.Komari等，Cwr.(9p/".尸/a"fAo/"1:161-165，1998.Kuhlemeier等，尸/a"/Ce〃，1:471-478，1989.Lawton等，7Va^Mo/.5z'o/.9:315-324,1987.Lazo等，及'o/Tec/wo/.，9:963-967，1991.Linsmaier禾口Skoog,尸/jyWo/.戶(hù)/an/"18:100，1965.Long，尸te尸—b/"125:69-72,2001.Marcotte等，尸/a"/Ce〃，1:969-976，1989.McCormac等，五t^/^"ca，99(1):17-25,1998.McCown和Lloyd,^SWe"ce，16:453,1981.Miki和McHugh，《/所o&c/7"o/.107193—232，2004.Murashige和Skoog，戶(hù)/2;w'0/.尸/"W，15:473-497，1962.Nitsch和Nitsch,6We"ce,163:85-87，1969.Noel等，C肌《/M/cra嵐42:279-283，1996.Odell等，iVa^re313:810-812,1985.Okita等,J編C72亂264:12573,1989.PCT申請(qǐng)WO87/04181;PCT申請(qǐng)WO89/00193;PCT申請(qǐng)WO99/027116;PCT申請(qǐng)WO04/009761;PCT申請(qǐng)WO04/074443;PCT申請(qǐng)WO05/003362Perez-Mendoza等，/J5acfenb/"186(17):5753-5761，2004.Radke等，尸/"WCW/11:499-505，1992.Rogers等，飽/W五"，oZ.153:253-277，1987.Sambrook夢(mèng),MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,1989Schaffoer等,尸/a"fCW/，3:997-1012，1991.Schenk和Hildebrandt,Ca"./萬(wàn)ot，50:199-204,1972.Schrammeijer等，尸taCe〃ie戸to，9:55-60,1990.Shadenkov等，Mo/.歷o/"30:272-275，1996.Southern,Mo/.B/o/"98:503-517,1975Spaink,H.P.等(編輯)，Thei始o(jì)Waceae.KluwerAcademicPublishers,Dordrecht,TheNetherlands,1998.Stewart和Hsu，尸/朋械137:113-117,1977.Tingay等,尸/a""，11(6):1369-1376,1997.Tun-Garrido等，/Bacfen.o/"185(5):1681-1692,2003.Turner等，F(xiàn)五MSM,cra歸.￡c。/"42(2):227-234,2002.Uchimiya和Murashige,尸/a"fP一/o/"15:473,1962.Walker等，iVoc.A^/.6W,t75^，84:6624,1987.Weller等尸/.Paf/zo/.54:799-805,2005.Weller等，^;/.￡"v.M/cra6/o/"70:2779-2785,2004.Wuni等，/Va"fCW/,1:961-968，1989.Yang等，/Voc.Ato/.JcW.87:4144-4148,1990.Zhang和Meyer,Mo/.M/craWo/"25:509-516,1997.Zhou等，P/"WCe〃i印.，15:159-163,1995.58權(quán)利要求1.用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，該方法包括(a)讓至少第一植物細(xì)胞與非土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)的細(xì)菌接觸，所述細(xì)菌包含(i)包含Ti質(zhì)粒vir基因區(qū)的第一核酸，其中所述vir基因區(qū)用于以VirD2依賴(lài)方式將目標(biāo)核酸導(dǎo)入所述植物細(xì)胞；和(ii)包含可操作地連接目標(biāo)核酸的一個(gè)或多個(gè)T-DNA邊界序列的第二核酸；和(b)選擇被目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)化的至少第一植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞為大豆、油菜、玉米或棉花植物細(xì)胞。2.用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，該方法包括(a)使至少第一植物細(xì)胞與非土壤桿菌的細(xì)菌接觸，所述細(xì)菌包含(i)為不依賴(lài)VirD2功能的DNA序列接合轉(zhuǎn)移所需的第一核酸，和(ii)包含目標(biāo)核酸的第二核酸；其中所述植物細(xì)胞為大豆、油菜、玉米或棉花植物細(xì)胞，其中由接合轉(zhuǎn)移所需核酸編碼的多肽起著將所述目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)移到所述植物細(xì)胞中的作用；和(b)選擇被所述目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)化的至少第一植物細(xì)胞。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述接合轉(zhuǎn)移為？ra/或woZ)v4依賴(lài)性的。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述第一核酸包含W7丁。5.權(quán)利要求2的方法，其中所述第一核酸缺乏左T-DNA邊界序列和/或右T-DNA邊界序列。6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)菌為根瘤菌細(xì)胞。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述根瘤菌細(xì)胞在與所述植物細(xì)胞接觸之前，在乙酰丁香酮或誘導(dǎo)v/r基因功能的其它化合物存在下生長(zhǎng)。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述根瘤菌細(xì)胞選自根瘤菌(i/7/zo&w附spp.)、中華才艮瘤菌0S/wor/n'zo6z'w附spp.)、中間根瘤菌(Afeso尸/n!zo6/wwspp.)、pi"才干菌(戶(hù)/^〃o6a"en.wmspp.)、蒼白#干菌(Oc/zraZac/rwmspp.)和'l"曼生才艮瘤菌(Sra(i^r/2feo6/Mmspp.)。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述根瘤菌細(xì)胞為豌豆根瘤菌10.權(quán)利要求9的方法，其中所述根瘤菌細(xì)胞為豌豆根瘤菌三葉草生物變異型(兄/egwm'wosanwz6v.fn/o/〃)、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型p/2ase0//)或豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型11.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述植物細(xì)胞包含在來(lái)自植物種子、幼苗、愈傷組織、細(xì)胞懸液、子葉、分生組織、葉、根或莖的外植體中；并且讓所述外植體與所述細(xì)菌接觸。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述外植體包括胚分生組織；愈傷組織；細(xì)胞懸液；子葉；或來(lái)自葉、根或莖的組織。13.權(quán)利要求2的方法，其中所述不依賴(lài)VirD2功能的接合轉(zhuǎn)移所需要的核酸通過(guò)電穿孔導(dǎo)入所述細(xì)菌中。14.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一核酸和第二核酸通過(guò)電穿孔導(dǎo)入所述細(xì)菌中。15.權(quán)利要求1或2的方法，其中選擇被所述目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在缺乏選擇劑時(shí)進(jìn)行。16.權(quán)利要求1或2的方法，其中選擇被所述目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞包括在選擇劑存在下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞，其中所述目標(biāo)核酸賦予對(duì)所述選擇劑的耐性，或可操作地連接另外的賦予對(duì)所述選擇劑耐性的核酸。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述選擇劑為草甘膦、卡那霉素、雙丙氨膦或麥草畏。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述目標(biāo)核酸或另外的核酸編碼EPSP合酶。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述EPSP合酶蛋白為CP4。20.權(quán)利要求16的方法，其中所述選擇劑為草甘膦。21.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述目標(biāo)核酸物理上不與選擇標(biāo)記基因連接。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述標(biāo)記基因和所述目標(biāo)核酸在由被所述目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生的植林的后代中遺傳分離。23.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)菌包含至少第三核酸，所述第三核酸包含另外的目標(biāo)核酸，其中所述植物細(xì)胞用所述第三核酸轉(zhuǎn)化。24.權(quán)利要求1或2的方法，其進(jìn)一步包括從所述植物細(xì)胞再生植林，其中所述植林包含所述目標(biāo)核酸。25.權(quán)利要求24的方法，其中從所述植物細(xì)胞再生植株包括誘導(dǎo)從包含所述植物細(xì)胞的外植體形成一株或多抹苗，并將至少第一苗培養(yǎng)為可育的全林。26.權(quán)利要求24的方法，其中再生通過(guò)器官形成發(fā)生。27.權(quán)利要求24的方法，其中所述植物或植林選自玉米植物或植林、棉花植物或植抹、大豆植物或植林和油菜植物或植株。28.選自以下的根瘤菌細(xì)胞根瘤菌(i/z/zo&'wmsp.)、中華才艮瘤菌0S7noW^oWwwsp.)、中間根瘤菌、葉桿菌、蒼白桿菌和慢生4艮瘤菌，所述細(xì)胞包含(i)包含Ti質(zhì)粒的v/r基因區(qū)的第一核酸，其中所述Wr基因區(qū)用來(lái)以VirD2依賴(lài)方式將編碼目標(biāo)序列的核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞；和(ii)包含可操作地連接編碼目標(biāo)序列的核酸的一個(gè)或多個(gè)T-DNA邊界序列的第二核酸。29.權(quán)利要求28的根瘤菌，其進(jìn)一步限定為包含選擇標(biāo)記。30.權(quán)利要求28的根瘤菌，其中所述根瘤菌細(xì)胞選自根瘤菌(i^izoWwwsp.)、才艮瘤菌NGR234(7/^o&wwsp.NGR234)、3宛豆才艮瘤菌(A./egwm/"oy"rww)Madison、豌豆才艮瘤菌USDA2370、3宛豆才艮瘤菌三葉草生物變異型USDA2408、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型USDA2668、豌豆根瘤菌2370G、豌豆根瘤菌2370LBA、豌豆根瘤菌2048G、豌豆根瘤菌2048LBA、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型2668G、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型2668LBA、豌豆根瘤菌RL542C、豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型、豌豆根瘤菌三葉草生物變異型、埃特里根瘤菌(//7/^6&附"http://)1;30八9032、埃特里根瘤菌菜豆生物變異型(W/:zo6/ww"/z'bv.p/zoseo/O、熱帶根瘤菌(i^izo6/ww/ra//c/)、中間根瘤菌、百脈根根瘤菌(Mmw/2/zo6/ww/o")ML542G、百脈根根瘤菌ML4404、中華根瘤菌(67wor/z/zoWwmsp.)、草木樨中華根瘤菌GS/"or/zizoWwwSD630、草木樨中華根瘤菌USDA1002、費(fèi)氏中華根瘤菌(&'打orWzoWwm/rW")USDA205、費(fèi)氏中華根瘤菌SF542G、費(fèi)氏中華根瘤菌SF4404、費(fèi)氏中華根瘤菌SM542C、慢生才艮瘤菌(5ra<i>r/^2o6/wwsp.)、大豆'f曼生才艮瘤菌(5ra<i>T/z/zoZ)/wwj'"pow'cwm)USDA6和大豆慢生根瘤菌USDA110。31.權(quán)利要求30的根瘤菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為豌豆根瘤菌細(xì)胞。32.權(quán)利要求31的根瘤菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為豌豆根瘤菌三葉草生物變異型、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型或豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型的細(xì)胞。33.能夠用于從根瘤菌進(jìn)行不依賴(lài)virD2轉(zhuǎn)移并缺乏T-DNA邊界序列的DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含可操作地連接目標(biāo)核酸的onT序列。34.權(quán)利要求33的DNA構(gòu)建體，其進(jìn)一步包含加"或mo6序列。35.用權(quán)利要求33的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的根瘤菌細(xì)胞，其中所述才艮瘤菌選自4艮瘤菌(i/^oZ/wwspp.)、中華4艮瘤菌(5V"oWn'zrc)Wwmsp.)、中間根瘤菌、葉桿菌、蒼白桿菌和慢生根瘤菌(Sra4r/n'zoWwmspp.)。36.權(quán)利要求35的根瘤菌細(xì)胞，其中所述根瘤菌細(xì)胞選自根瘤菌(i/^oWwmspp.)、才艮瘤菌NGR234、豌豆根瘤菌Madison、S宛豆根瘤菌USDA2370、豌豆根瘤菌三葉草生物變異型USDA2408、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型USDA2668、豌豆根瘤菌2370G、豌豆根瘤菌2370LBA、豌豆根瘤菌2048G、豌豆根瘤菌2048LBA、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型2668G、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型2668LBA、豌豆根瘤菌RL542C、豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型、豌豆根瘤菌三葉草生物變異型、埃特里根瘤菌USDA9032、埃特里根瘤菌菜豆生物變異型、熱帶根瘤菌、中間根瘤菌、百&M艮根瘤菌ML542G、百務(wù)M艮根瘤菌ML4404、中華根瘤菌(&VzoWz&oWwmsp.)、草木樨中華根瘤菌SD630、草木樨中華根瘤菌USDA1002、費(fèi)氏中華根瘤菌USDA205、費(fèi)氏中華根瘤菌SF542G、費(fèi)氏中華根瘤菌SF4404、費(fèi)氏中華根瘤菌SM542C、慢生根瘤菌(5ra4r/^oWwwsp.)、大豆慢生根瘤菌USDA6和大豆慢生根瘤菌USDA110。37.權(quán)利要求36的根瘤菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為豌豆根瘤菌細(xì)胞。38.權(quán)利要求36的根瘤菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為豌豆根瘤菌三葉草生物變異型、豌豆根瘤菌茱豆生物變異型或豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型的細(xì)胞。39.權(quán)利要求1或2的方法，其進(jìn)一步包括讓所述非土i裏桿菌細(xì)菌在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)期間在使多糖產(chǎn)生最小化的條件下生長(zhǎng)。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)期間用于使多糖產(chǎn)生最小化的碳源為AB-TY培養(yǎng)基中的葡萄糖或ATA培養(yǎng)基中的L-阿拉伯糖和葡萄糖酸鉀。全文摘要本發(fā)明涉及用于根瘤菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化包括大豆、油菜、玉米和棉花細(xì)胞在內(nèi)的植物細(xì)胞的方法。這些方法包括依賴(lài)VirD2和不依賴(lài)virD2的方法。使用的細(xì)菌物種包括根瘤菌(Rhizobiumsp.)、中華根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)和中間根瘤菌菌株(Mesorhizobiumspp.)的菌株。本發(fā)明還揭示了用于這樣的轉(zhuǎn)化的載體。文檔編號(hào)C12N15/82GK101490266SQ200780026752公開(kāi)日2009年7月22日申請(qǐng)日期2007年5月16日優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日發(fā)明者E·威廉斯,J·沈,X·葉申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司